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Como as proteínas migram em MES vs. MOPS

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Meus géis parecem significativamente diferentes em MES (ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico) e MOPS (ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico). Isso era de se esperar. O que não entendo é por que a simples presença do contra-íon altera significativamente a velocidade de certas proteínas.

Isso é devido ao pH diferente (MES geralmente é executado em pH 8,0, MOPS geralmente é executado em pH 7,0) ou é a distribuição de carga no contra-íon responsável por tudo?


Bem, para racionalizar os comentários de todos, acho que @leonardo está certo.

Este é um gel SDA PAGE desnaturante. A migração das Micelas SDS que são carregadas negativamente, depende da blindagem da solução ao seu redor. A diferença na mobilidade é porque as micelas de SDS experimentarão um campo ligeiramente diferente em pH ~ 6,2 (MES) vs 7,2 (MOPS).

Pensar que eles têm a mesma carga estaria exatamente no pH correspondente ao pKa. Para esses dois íons, as proporções não serão as mesmas ao executar 0,8 unidades de pH de seus respectivos pKas. a concentração de íons vai como +/- log ([BH] / [B-]) e o ambiente de carga do buffer não deve ser o mesmo. Eu acho que o pH mais alto para a execução de MOPS tenderá a criar mais carga negativa na solução de MOPS- mas também OH- na solução, retardando a mobilidade das micelas e favorecendo a resolução das proteínas maiores com MOPS.

Isso tudo é dado mesmo se a concentração de íons de tamponamento for a mesma.

Tenho certeza de que os detalhes sangrentos estão enterrados nos tomos mofados de alguns periódicos de bioquímica física nas profundezas da biblioteca, mas é assim que parece para mim.


Estante

NCBI Bookshelf. Um serviço da National Library of Medicine, National Institutes of Health.

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. 4ª edição. Nova York: W. H. Freeman 2000.

  • Por acordo com a editora, este livro pode ser acessado pelo recurso de pesquisa, mas não pode ser navegado.


Fazendo a taxa de migração de proteínas proporcional ao peso molecular

O movimento de qualquer espécie carregada através de um campo elétrico é determinado por sua carga líquida, seu raio molecular e a magnitude do campo aplicado. Mas o problema com proteínas nativamente dobradas é que nem sua carga líquida nem seu raio molecular são dependentes do peso molecular. Em vez disso, sua carga líquida é determinada pela composição de aminoácidos, ou seja, a soma dos aminoácidos positivos e negativos na proteína e o raio molecular pela estrutura terciária da proteína.

Portanto, em seu estado nativo, proteínas diferentes com o mesmo peso molecular migrariam em velocidades diferentes em um campo elétrico, dependendo de sua carga e forma 3D.

Para separar proteínas em um campo elétrico com base apenas em seu peso molecular, precisamos destruir a estrutura terciária reduzindo a proteína a uma molécula linear e, de alguma forma, mascarar a carga líquida intrínseca da proteína. É aí que entra o SDS.


Introdução

Na microscopia de expansão (ExM), as amostras biológicas preservadas são incorporadas em um hidrogel expansível e fisicamente expandidas isotropicamente, levando a amostras opticamente transparentes que permitem resolução em nanoescala e imagem de microscopia livre de aberrações em microscópios convencionais limitados por difração (Chen, Tillberg, & Boyden , 2015). Recentemente, duas novas versões do ExM foram desenvolvidas, denominadas microscopia de expansão de retenção de proteína (proExM Tillberg et al., 2016) e fluorescência de expansão no local hibridização (ExFISH Chen et al., 2016), em que moléculas de proteína (proExM) e RNA (ExFISH) são quimicamente ancoradas ao hidrogel e sondadas durante a expansão. Esta unidade descreve os cenários mais comuns para a preparação de amostras proExM e ExFISH, bem como diretrizes gerais para o manuseio de amostras e aquisição de imagens.

No proExM, as proteínas são covalentemente ancoradas a uma matriz de hidrogel com uma pequena molécula comercialmente disponível (Acryloyl-X SE, ou AcX para abreviar Tillberg et al., 2016) que se liga a grupos de amina primária em proteínas (Fig. 1E, à esquerda) e é então incorporado ao polímero de hidrogel durante o processo de polimerização (também conhecido como gelificação de um hidrogel esquematizado na Fig. 1A a 1C). Uma digestão enzimática usando proteinase K (ProK) ou um tratamento de alta temperatura com detergente interrompe mecanicamente a amostra incorporada, permitindo a expansão isotrópica na água. Pode-se ancorar proteínas nativas ao gel usando AcX e aplicar anticorpos fluorescentes pós-expansão (coloração pós-expansão, Fig. 1C). Esta versão utiliza método de homogeneização mecânica empregando alta temperatura e detergente, sem protease. Pode-se, alternativamente, aplicar AcX a espécimes fixos que expressam proteínas fluorescentes e / ou já marcados com anticorpos fluorescentes, incorporando-os diretamente no gel (coloração de pré-expansão, Fig. 1A, ou expressão de proteína fluorescente de pré-expansão, Fig. 1B). Proteínas fluorescentes e anticorpos são suficientemente resistentes à proteólise para sobreviver amplamente à aplicação de ProK. Utilizando uma lente com resolução limitada por difração de 300 nm, a expansão linear de ∼4,5 × das amostras incorporadas (∼90 × expansão volumétrica) permite a imagem da amostra com resolução efetiva de ∼300 nm / 4,5∼60 a 70 nm .

No ExFISH, os RNAs são covalentemente ancorados à matriz do hidrogel com uma pequena molécula, que chamamos de LabelX (que pode ser facilmente sintetizada pela reação de duas moléculas comercialmente disponíveis), que se liga à guanina (no RNA e no DNA, Fig. 1E, à direita) e também para o polímero hidrogel (Chen et al., 2016). O pipeline ExFISH é mostrado na Figura 1D: as amostras são tratadas com LabelX, o polímero de hidrogel dilatável é formado, ProK é aplicado e, em seguida, a amostra é lavada com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Posteriormente, as sondas de RNA-FISH são aplicadas à amostra em um tampão de hibridização para marcar as moléculas de RNA de interesse. A amostra é então expandida e fotografada em um buffer de baixo teor de sal. Esta concentração de sal diferente de zero, que permite que as sondas de RNA-FISH permaneçam ligadas de forma estável, resulta em uma expansão linear de ∼3 × (∼27 × expansão volumétrica), ou uma resolução efetiva para uma lente limitada por difração de 300 nm de ∼300 nm / 3∼100 nm.

Esta unidade está estruturada nas seguintes seções. Nos Protocolos Básicos 1 e 2, descrevemos os protocolos proExM para células e tecidos intactos (de & lt200 μm de espessura de pré-expansão) que foram imunocolorados antes da expansão (coloração de pré-expansão proExM) ou têm proteínas fluorescentes expressas antes da expansão, conforme ilustrado em Figura 1A, B. Esses dois protocolos básicos são escritos independentemente, para que os leitores possam começar com um dos dois, com uma referência mínima ao outro. A próxima seção, Protocolo Básico 3, descreve as etapas que ajudam no processamento de tecidos grossos ou fatias de tecido (por exemplo, 200 a 500 μm de espessura ou potencialmente mais espessos), que foram imunocoradas ou tinham proteínas fluorescentes expressas antes da expansão (conforme ilustrado na Fig. . 1A, B). O Protocolo de suporte 1 descreve o protocolo para imunocoloração após expansão (coloração pós-expansão proExM, conforme ilustrado na Fig. 1C). Também discutimos brevemente as principais considerações ao escolher anticorpos e corantes para proExM no protocolo de suporte 2. Nos protocolos básicos 4 e 5, descrevemos a metodologia ExFISH para células em cultura e tecidos intactos, respectivamente. No último protocolo, Protocolo Básico 6, descrevemos diferentes estratégias de montagem para a preparação de amostras ExM expandidas para geração de imagens em microscópios confocais invertidos e no microscópio de folha de luz Zeiss Z.1. Esta seção sobre imagens se aplica a todas as amostras processadas com ExM, incluindo produtos dos protocolos proExM e ExFISH aqui descritos.

Pode ser útil observar que a preparação da amostra e a imagem com proExM e ExFISH requerem apenas produtos químicos e microscópios encontrados em um laboratório de biologia típico ou instalação de imagem, com exceção de reagentes de ancoragem e acrilato de sódio, que estão disponíveis comercialmente a um custo modesto. Quase todas as etapas do protocolo podem ser realizadas à temperatura ambiente em uma bancada de wetlab (a menos que indicado de outra forma no protocolo). O equipamento básico necessário inclui um misturador vórtice de bancada, um agitador, uma incubadora de 37 ° C (e uma incubadora de 60 ° C para ExFISH de células em cultura), um dessecador, um refrigerador de 4 ° C e um freezer de –20 ° C. Todos os materiais e suprimentos usados ​​nesta unidade estão disponíveis comercialmente. Salvo indicação em contrário, nesta unidade, "água" significa especificamente "água bidestilada".

1: proExM para células cultivadas

Materiais

  • Hidróxido de potássio 1 M (KOH) em água
  • 30% (v / v) de etanol em água
  • Fibronectina estéril 10 mg / ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS Current Protocols, 2001)
  • Células de interesse, por exemplo, células de rim embrionário humano (HEK)
  • Meio de cultura de células adequado para o tipo de célula de escolha (por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) para células de rim embrionário humano (HEK))
  • 4% (w / v) paraformaldeído (PFA) em PBS ou, para uma fixação mais forte, uma mistura de 4% (w / v) PFA e 0,1% (w / v) glutaraldeído em PBS
  • Glicina 100 mM em PBS
  • 0,1% (w / v) Triton X-100 em PBS
  • Tampão de bloqueio: 5% (v / v) soro normal de burro em 0,1% (p / v) Triton X-100 em PBS (armazenar até 1 mês ou mais a 4 ° C) o soro deve ser do animal hospedeiro do anticorpos secundários, portanto, outros tipos de soro devem ser usados ​​em vez do soro normal de burro se os anticorpos secundários forem de outros animais
  • Anticorpos primários e secundários para imunocoloração
  • Solução estoque AcX / DMSO (ver receita)
  • Solução de gelificação para proExM de células em cultura (ver receita)
  • Tampão de digestão (ver receita)
  • Substratos de cultura de células (por exemplo, lamínulas de tamanhos, formas e modificações de superfície adequadas para o protocolo de cultura de escolha), tais como lamínulas redondas de 12 mm ou uma tampa de vidro de câmara removível, por exemplo, Sigma, cat. não. GBL 112358
  • Ferramenta de remoção de vidro da tampa da câmara (Sigma, catálogo no. GBL 103259)
  • Placas de petri de 35 mm
  • Tubos de microcentrífuga
  • Shaker
  • 22 × 22 mm No. 1.5 lamínulas (0,15 a 0,19 mm de espessura)
  • 22 × 22 mm No. 2 lamínulas (0,19 a 0,23 mm de espessura)
  • Lâminas de microscópio
  • Banho de gelo ou bloco frio resfriado a 4 ° C
  • Parafilme
  • Lâmina de barbear
  • Fórceps
  • Placa retangular de 4 poços Nunc (Thermo Fisher, cat. Nº 267061)
  • pincel
  • Escriba de diamante para cortar (traçar) vidro fino
  • Microscópio de dissecção

Cultura de células

As células podem ser cultivadas de acordo com os protocolos de sua escolha. No entanto, se não houver uma preferência forte, recomendamos a cultura de células em um substrato separável do poço de cultura (por exemplo, em lamínulas) ou em uma tampa de vidro de câmara removível (por exemplo, Sigma, nº cat. GBL 112358) para fácil gelificação e manuseio de amostras em etapas posteriores.

O protocolo de cultura de células descrito abaixo usa linhas de células aderentes (por exemplo, HEK ou COS7) e demonstrou resultados consistentes. Se os vidros da câmara removível forem usados ​​para cultura de células, comece com a modificação da superfície do vidro de fibronectina na etapa 2.

1. Trate as lamelas redondas de 12 mm com KOH 1 M em água por 30 min, enxágue com água três vezes e armazene em etanol 30% (v / v) em água.

2. Seque ao ar as lamínulas redondas de 12 mm limpas em um ambiente estéril (isto é, cabine de biossegurança), coloque em uma placa de petri de 35 mm e, subsequentemente, trate com 10 mg / ml de fibronectina estéril em PBS por 30 min a 37 ° C. Remova a solução de fibronectina imediatamente antes do plaqueamento celular.

3. As células são semeadas e cultivadas na superfície das lamelas de 12 mm ou da tampa de vidro da câmara removível até uma confluência de 50% a 80% em uma incubadora umidificada ajustada para 5% de CO2 e 37 ° C.

Fixação de células

As células podem ser corrigidas usando protocolos de sua escolha. Por exemplo, 4% (p / v) paraformaldeído (PFA) em PBS pode ser usado. Para uma fixação mais forte que preserva mais ultraestrutura, você pode tentar usar uma mistura de PFA e uma pequena porcentagem de glutaraldeído (por exemplo, 4% (p / v) de PFA mais 0,1% (p / v) de glutaraldeído em PBS), embora contendo glutaraldeído fixadores têm sido raramente usados ​​em estudos de microscopia de expansão até o momento. O PFA a 4% (p / v) em PBS é tipicamente preparado de fresco antes da fixação.

O protocolo de fixação descrito abaixo demonstrou resultados consistentes. Observe que todas as etapas de lavagem devem ser realizadas rapidamente para evitar a desidratação da amostra.

4. Substitua o meio de cultura de células com 4% (w / v) PFA em PBS e incube por 10 min em temperatura ambiente.

CUIDADO: Isso deve ser feito em uma capela química, pois o PFA é considerado um carcinógeno potencial.

5. Remova a solução de PFA e lave as células por 5 min com glicina 100 mM em PBS para extinguir a fixação.

6. Remova a solução de glicina e lave as células duas vezes por 5 minutos cada com PBS.

7. Recomendamos passar para as próximas etapas do protocolo imediatamente.

Se necessário, as células fixas podem ser armazenadas no escuro a 4 ° C em PBS por até várias semanas antes das próximas etapas do protocolo.

Imunocoloração / imunohistoquímica (opcional)

Para imunomarcação após a fixação, siga os protocolos de sua escolha, você pode realizar essencialmente a histologia convencional. O protocolo descrito abaixo demonstrou resultados consistentes com células fixas preparadas pelos protocolos descritos anteriormente.

8. Permeabilizar as células fixadas aplicando Triton X-100 a 0,1% (p / v) em PBS à temperatura ambiente durante 15 min. Para reduzir a ligação de anticorpos inespecíficos, aplique tampão de bloqueio em temperatura ambiente por 15 min.

9. Incube as células com os anticorpos primários no tampão de bloqueio, na concentração apropriada. A incubação pode ser feita em agitador em baixa velocidade por um período que varia de 1 hora a durante a noite, em temperatura ambiente ou a 4 ° C, dependendo das especificações do anticorpo.

10. Remova a solução de anticorpo e lave quatro vezes, cada vez por 5 min com tampão de bloqueio.

11. Incube as células com anticorpos secundários em tampão de bloqueio em um agitador em baixa velocidade por 2 a 4 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Se estiver usando anticorpos conjugados com corantes, consulte o Protocolo de Suporte 2 para uma discussão sobre compatibilidade de corantes com coloração de pré-expansão proExM.

12. Remova a solução de anticorpo e lave quatro vezes, cada vez por 5 min com tampão de bloqueio.

13. Recomendamos passar para as próximas etapas do protocolo imediatamente.

Se necessário, as amostras podem ser armazenadas no escuro a 4 ° C em PBS por até várias semanas antes das próximas etapas do protocolo.

Gelificação

14. Prepare a solução estoque de Acryloyl-X SE (AcX) / DMSO, solução estoque de monômero (estoque X) TEMED e solução estoque de persulfato de amônio (APS) conforme instruído em Reagentes e Soluções.

15. Substitua o tampão de amostra (por exemplo, o tampão de bloqueio se imunocorado seguindo os protocolos acima) com 0,1 mg / ml de Acriloil-X SE (AcX) em PBS.

Esta solução AcX é preparada diluindo a solução estoque 10 mg / ml AcX / DMSO 1: 100 em PBS.

16. Deixe as células na solução de AcX 0,1 mg / ml durante 2 a 3 horas à temperatura ambiente.

Protocolos anteriores sugeriam & gt6 horas ou durante a noite, mas rotineiramente descobrimos que 2 a 3 horas são mais do que tempo suficiente sem agitação.

17. Quando as células são cultivadas em uma placa de Petri, a câmara de gelificação pode ser construída enquanto isso, colocando dois espaçadores em uma lâmina, separados um do outro por uma distância grande o suficiente para que a tampa de vidro da amostra possa caber no meio (Fig. . 2A). Objetos finos e planos, como pilhas de lamínulas, podem servir como espaçadores. Por exemplo, uma pilha de duas lamelas No. 1.5 tem uma altura de cerca de 0,30 a 0,38 mm, mudando o número ou tipos de lamínulas, a altura dos espaçadores pode ser ajustada de acordo para corresponder ao substrato de cultura celular (ou seja, a amostra vidro de cobertura) altura. A altura do espaçador deve ser mantida próxima à altura do substrato da cultura de células para evitar deixar gel excessivo no topo da amostra, mas a espessura total do gel [ou seja, (altura do espaçador) - (altura do substrato da cultura de células)] deve ser de pelo menos 0,15 mm para facilitar o manuseio do gel nas etapas posteriores. Uma gota de água (por exemplo, alguns µl) pode ser aplicada aos espaçadores para aderir à lâmina (e, se espaçadores múltiplos, uns aos outros). Se uma tampa de vidro com câmara removível for usada para a cultura de células durante as etapas 2 a 3, a própria tampa de vidro e a gaxeta podem servir como a câmara de gelificação e o espaçador, respectivamente. Neste caso, a estrutura superior da tampa de vidro da câmara removível pode ser removida por meio de uma ferramenta de remoção (Sigma, cat. No. GBL 103259). Para a tampa da câmara de gelificação, uma lamela espessa e robusta (por exemplo, uma lamela No. 2) envolta em Parafilm pode ser usada, com o Parafilm evitando que o gel grude na lamela ao remover a tampa em etapas posteriores. Certifique-se de que a superfície do Parafilm esteja plana, limpa e sem dobras. Recomendamos terminar a preparação da câmara de gelificação e da tampa antes de passar para a próxima etapa.

18. Depois de incubar as células em solução AcX, lave as células duas vezes, cada vez por 15 min, com PBS. Comece a descongelar os componentes da solução de gelificação para proExM - as soluções Stock X, APS e TEMED. Manter as soluções resfriadas em banho de gelo ou em bloco frio (resfriado a 4 ° C).

19. Crie a solução de gelificação para proExM agora misturando Stock X, água, solução de estoque TEMED e solução de estoque APS em uma proporção de 47: 1: 1: 1 (a solução de gel também veja as receitas em Reagentes e Soluções), nesta ordem ( isto é, o APS durar) em um tubo de microcentrífuga e agitar no vórtex por alguns segundos.

A quantidade de solução de gelificação deve ser aumentada ou diminuída de acordo com o tamanho da câmara de gelificação. Por exemplo, 200 µl de solução de gelificação é suficiente para preencher uma câmara de gelificação com um vazio de 22 × 22 × 0,38 mm. A solução gelificada misturada deve ser mantida em um banho de gelo ou em um bloco frio (refrigerado a 4 ° C). Evite o aquecimento excessivo da solução de gel, por exemplo, segurando a tampa do tubo de microcentrífuga em vez do corpo do tubo. Assim que a solução de gelificação estiver preparada, recomendamos concluir as próximas etapas (até colocar a câmara de gelificação em uma incubadora a 37 ° C na etapa 24) em 5 minutos para evitar a gelificação prematura.

20. Imediatamente após a etapa anterior, remova o PBS das células usando uma pipeta e adicione uma pequena quantidade da solução gelificada misturada às células no substrato de cultura celular. Se uma tampa de vidro de câmara removível for usada, remova o PBS e adicione a solução de gel para preencher a câmara e, em seguida, continue para a etapa 22.

21. Use um par de fórceps para pegar e colocar o substrato de cultura de células (isto é, a lamela na qual as células são cultivadas) com as células cultivadas entre os espaçadores na câmara de gelificação. Certifique-se de que as células estejam voltadas para cima. Pressione levemente o substrato de cultura de células para baixo, para mantê-lo no lugar. Se a solução de gelificação sair, reaplique uma pequena quantidade da solução de gel nas células.

22Adicione uma gota (∼20 µl) de solução gelificante em um lado da tampa coberta de Parafilm e vire-a de modo que a gota fique pendurada na superfície devido à tensão superficial (Fig. 2A). Abaixe lentamente a tampa para que a gota se funda com a solução de gelificação na lamela de amostra (Fig. 2B). Depois de fundido, continue abaixando a tampa para que ela se apoie nos espaçadores. Certifique-se de que nenhuma bolsa de ar seja introduzida na solução durante este processo.

23. Usando uma pipeta de ponta fina, continue adicionando solução gelificante adicional em ambos os lados abertos da câmara até que o espaço entre a tampa, os espaçadores e a lâmina seja preenchido com a solução gelificante (Fig. 2C).

As forças capilares devem fazer com que a solução de gelificação preencha o espaço vazio por igual.

24. Coloque a câmara de gelificação em uma incubadora a 37 ° C por 1 hora para polimerização. Tenha cuidado para não inclinar ou agitar a câmara durante a transferência e a gelificação.

Digestão

25. Retire a câmara de gelificação da incubadora.

26. Insira lentamente uma lâmina de barbear na lateral entre a tampa e os espaçadores e retire a tampa. Uma vez que a tampa é separada do gel, use a lâmina de barbear para remover os espaçadores (Fig. 2D). Se uma tampa de vidro com câmara removível for usada, remova a tampa e use uma pinça para retirar a junta preta sem remover o gel da tampa de vidro.

27. Usando uma lâmina de barbear, corte o gel até um pequeno volume ao redor da amostra. Isso manterá o gel compacto e ajudará a encontrar células em etapas posteriores. Use a lâmina de barbear para remover o substrato da cultura de células e o gel, juntos, da lâmina de vidro. Se uma lamela de vidro com câmara removível for usada, corte o gel, mas não remova o gel da lamínula.

Você pode querer aparar o gel para ter uma forma assimétrica para que sua orientação possa ser facilmente medida em etapas posteriores simplesmente examinando a forma [veja nosso vídeo em https://www.youtube.com/watch?v=OksNCAJwxVI ( proExM para tecidos: demonstração de gelificação)].

28. Prepare o tampão de digestão conforme descrito em Reagentes e Soluções (concentração final de ProK: 8 U / ml).

29. Uma vez que o gel se expandirá cerca de 1,5 × durante a digestão, escolha um recipiente grande adequado (por exemplo, placa de Petri) para a digestão. Além disso, use um recipiente separado para cada amostra para evitar confusão da amostra. Coloque o substrato de cultura de células com o gel no recipiente e encha-o com tampão de digestão de volume pelo menos 10 vezes superior ao do gel (Fig. 2E). Mergulhe o gel no tampão de digestão por pelo menos 2 a 3 horas até que se solte naturalmente da lamela de amostra (Fig. 2F). Se for usada uma lamela de vidro com câmara removível, use um estilete de diamante para separar cada amostra e seu pedaço correspondente da lamínula, riscando cuidadosamente a lamínula e quebrando cada pedaço de vidro contendo seu pedaço de gel. Coloque cada pedaço de lamínula com o gel em um recipiente e mergulhe no tampão de digestão conforme descrito acima. Uma placa retangular Nunc de 4 poços, por exemplo, é conveniente para conter vários pedaços de lamínula para digestão. O substrato celular destacado pode ser removido usando uma pinça, para deixar apenas o gel que contém a célula no tampão de digestão.

30. Deixe o gel imerso no tampão de digestão durante a noite em temperatura ambiente no escuro.

Armazenamento e expansão

31. Se não for feito anteriormente, remova o substrato celular agora destacado (por exemplo, lamínula) do recipiente de digestão com cuidado usando uma pinça sem perturbar o gel de amostra. Remova o tampão de digestão e adicione PBS, e armazene o gel a 4 ° C no escuro se o armazenamento para imagens posteriores for desejado.

Tenha cuidado para não sugar o gel durante a pipetagem. O gel espalha a luz ligeiramente neste estágio, portanto, alterar o ângulo de incidência da luz pode ajudar a localizá-la dentro da solução.

32. Se o gel precisar ser transferido para outro recipiente (por exemplo, um recipiente maior para aparar ou o suporte de amostra para geração de imagens), você pode usar um pincel de tamanho adequado para pegar e mover o gel. Para evitar a desidratação do gel, adicione um pouco de PBS ao recipiente.

33. Antes de expandir a amostra, recomendamos aparar o gel até o tamanho mínimo necessário. Você pode usar um microscópio de dissecção ou um microscópio de campo amplo de baixa ampliação para localizar a região de interesse. Para minimizar o movimento da amostra, a maior parte do líquido circundante pode ser removido temporariamente durante o corte. Sob o microscópio, use uma lâmina de barbear para cortar e remover o gel fora da região de interesse. Aconselhamos aparar o gel em uma forma assimétrica para deduzir facilmente a orientação. Certifique-se de cortar o gel para um tamanho razoável para manuseio e imagem, pois a expansão irá introduzir um aumento linear adicional de 2 a 2,5 × (para um total de cerca de 4,5 ×) no tamanho. Transfira o gel com as regiões de interesse para um recipiente (por exemplo, uma placa de Petri de tamanho adequado para expansão ou o suporte de amostra para geração de imagens) que é grande o suficiente para conter o gel expandido.

34. Encha o recipiente e mergulhe o gel em água e aguarde 20 min. Troque a água e aguarde mais 20 min. Refaça a troca mais uma vez (20 min em água doce, três vezes no total).

A amostra deve ser totalmente expandida e opticamente limpa como na Figura 3 e pronta para geração de imagens (esses tempos são mais curtos do que em publicações anteriores, mas refletem números que funcionam para uso de rotina em nosso laboratório). Para imagens de longo prazo, por exemplo, ao obter imagens de um grande volume de espécime, a montagem da amostra é necessária após a expansão e antes da imagem (ver Protocolo Básico 6). A montagem da amostra fixa a amostra ao suporte de amostra e, portanto, evita que ela se desvie, e também pode ajudar a manter a amostra dentro da distância de trabalho da lente objetiva. Para uma verificação rápida da amostra expandida ao microscópio (& lt5 min), normalmente não há necessidade de montagem de amostra. Em um microscópio invertido, por exemplo, você pode usar uma pipeta para remover temporariamente (& lt5 min) a água ao redor do gel para evitar que ele escorregue.

35. Se você precisar transferir o gel expandido para um novo recipiente, ele precisa ser manuseado com cuidado, pois é um tanto delicado no estado expandido. Primeiro remova a maior parte da água ao redor e, em seguida, use um pincel para mover o gel para uma lamela de vidro limpa colocada no mesmo recipiente. Em seguida, levante suavemente a lamínula (com o gel por cima) para fora do recipiente com uma pinça. O gel pode ser transferido escovando-o lentamente da lamínula para o novo recipiente. Este método também pode ser usado para virar o gel invertendo a lamela que contém o gel, caso o gel esteja voltado para a direção errada.

2: proExM para tecidos intactos

O protocolo básico para tecidos intactos difere ligeiramente daquele para células em cultura. Devido à espessura das amostras, os tecidos intactos requerem um tempo maior para a difusão do AcX. Além disso, a solução de gelificação é suplementada com um inibidor de polimerização para permitir uma difusão mais longa da solução de gelificação através das amostras antes do início da polimerização.

Materiais

  • Solução salina tamponada com fosfato (PBS Current Protocols, 2001)
  • 4% (w / v) paraformaldeído (PFA) em PBS ou, para uma fixação mais forte, uma mistura de 4% (w / v) PFA e 0,1% (w / v) glutaraldeído em PBS
  • Solução de afundamento (ver receita)
  • Gelo seco
  • 2-metilbutano
  • Composto de temperatura de corte ideal (OCT), M-1 ou outra matriz de incorporação
  • 0,1% (w / v) Triton X-100 em PBS
  • Tampão de bloqueio: 5% (v / v) soro normal de burro em 0,1% (p / v) Triton X-100 em PBS (armazenar até 1 mês ou mais a 4 ° C): o soro deve ser do animal hospedeiro de os anticorpos secundários, então outros tipos de soro devem ser usados ​​em vez do soro normal de burro se os anticorpos secundários forem de outros animais
  • Anticorpos primários e secundários para imunocoloração
  • Solução estoque AcX / DMSO (ver receita)
  • Solução de gelificação para expansão de tecidos intactos (ver receita)
  • Tampão de digestão (ver receita)
  • Vibratome ou micrótomo criostato
  • 22 × 22 mm No. 1.5 lamínulas (0,15 a 0,19 mm de espessura)
  • 22 × 22 mm No. 2 lamínulas (0,19 a 0,23 mm de espessura)
  • Lâminas de microscópio
  • Parafilme
  • Tubos de microcentrífuga
  • pincel
  • Banho de gelo ou bloco frio resfriado a 4 ° C
  • Lâmina de barbear
  • Fórceps
  • Placas de petri
  • Microscópio de dissecção

Preparação de tecido

Neste protocolo de tecido ProExM básico, a espessura do tecido ou a fatia do tecido é considerada como sendo & lt200 µm em sua dimensão mais fina. Para amostras de tecido com espessura acima de 200 μm, consulte o Protocolo Básico 3.

Os tecidos podem ser corrigidos usando protocolos de sua escolha. Por exemplo, a fixação por imersão ou perfusão com 4% (p / v) paraformaldeído (PFA) em PBS pode ser usada. Para uma fixação mais forte que preserva mais ultraestrutura, você pode tentar uma mistura de PFA e uma pequena porcentagem de glutaraldeído (por exemplo, 4% (p / v) de PFA mais 0,1% (p / v) de glutaraldeído em PBS), embora fixadores contendo glutaraldeído têm sido menos usados ​​em protocolos de microscopia de expansão até o momento. A solução de PFA a 4% (p / v) em PBS é tipicamente preparada de fresco antes da fixação.

1. Após a fixação, se os tecidos forem mais grossos do que 200 µm, corte-os em fatias & lt200 µm usando um vibratome. Alternativamente, para fatiar em um criostato, o tecido precisa primeiro ser crioprotegido por imersão em solução de afundamento até que o tecido afunde para o fundo. O tecido é então retirado e congelado usando gelo seco e 2-metilbutano. Depois de incorporar em OCT, M-1 ou outra matriz de incorporação, a amostra está pronta para ser fatiada usando um criotomo.

Após qualquer método de fatiamento, recomendamos passar para as próximas etapas do protocolo imediatamente.

Se necessário, tecidos fixos ou fatias de tecido podem ser armazenados no escuro a 4 ° C em PBS por até várias semanas antes das próximas etapas do protocolo.

Imunocoloração / imunohistoquímica (opcional)

Para imunomarcação após a fixação, siga os protocolos de sua escolha. O protocolo descrito abaixo demonstrou resultados consistentes com tecidos cerebrais fixos preparados pelos protocolos descritos anteriormente.

2. Permeabilizar o tecido fixado aplicando 0,1% (p / v) de Triton X-100 em PBS à temperatura ambiente por 15 min e, em seguida, em tampão de bloqueio à temperatura ambiente por 6 h.

3. Incube os tecidos com os anticorpos primários no tampão de bloqueio. A incubação pode ser feita em um agitador em baixa velocidade durante a noite em temperatura ambiente ou a 4 ° C.

4. Remova a solução de anticorpo e lave quatro vezes, cada vez por 30 min com tampão de bloqueio, para remover os anticorpos primários não ligados.

5. Incube os tecidos com anticorpos secundários no tampão de bloqueio em um agitador em baixa velocidade durante a noite em temperatura ambiente ou a 4 ° C. Se estiver usando anticorpos conjugados com corantes, consulte o Protocolo de Suporte 2 para uma descrição do desempenho do corante e compatibilidade com a coloração de pré-expansão proExM.

6. Remova a solução de anticorpo e lave quatro vezes, cada vez por 30 min com tampão de bloqueio para remover os anticorpos secundários não ligados.

7. Recomendamos passar para as etapas de gelificação imediatamente.

Se necessário, as amostras podem ser armazenadas no escuro a 4 ° C em PBS por até várias semanas antes da gelificação.

Gelificação

8. Prepare a solução estoque de Acryloyl-X SE (AcX) / DMSO, solução de monômero (estoque X), solução estoque TEMED, estoque de persulfato de amônio (APS) e solução 4-hidroxi-TEMPO (4HT) conforme instruído em Reagentes e Soluções.

9. Substitua o tampão de amostra (por exemplo, o tampão de bloqueio se imunocorado seguindo os protocolos acima) com 0,1 mg / ml de Acriloil-X SE (AcX) em PBS.

A solução AcX é preparada diluindo a solução estoque 10 mg / ml AcX / DMSO 1: 100 em PBS.

10. Deixe os tecidos em solução AcX por & gt6 horas (durante a noite é bom) em temperatura ambiente sem agitação.

11. Enquanto isso, para construir a câmara de gelificação, coloque dois espaçadores em uma lâmina, separados um do outro (Fig. 4A). Objetos finos e planos, como pilhas de lamínulas, podem servir como espaçadores. Por exemplo, uma pilha de duas lamínulas No. 1.5 tem uma altura variando de 0,30 a 0,38 mm e, alterando o número ou tipos de lamínulas, a altura dos espaçadores pode ser ajustada para acomodar a espessura do tecido. A altura do espaçador deve ser mantida próxima à espessura do tecido para evitar deixar gel excessivo no topo da amostra, mas a espessura total do gel (isto é, a altura do espaçador) deve ser de pelo menos 0,15 mm para facilitar o manuseio do gel em etapas posteriores. Uma gota de água (por exemplo, alguns µl) pode ser aplicada a espaçadores para aderir à lâmina (e, se vários espaçadores, uns aos outros). Para a tampa da câmara de gelificação, uma lamela espessa e robusta (por exemplo, uma lamela No. 2) envolta em Parafilm pode ser usada, com o Parafilm evitando que o gel grude na lamela ao remover a tampa em etapas posteriores. Certifique-se de que a superfície do Parafilm esteja plana, limpa e sem dobras. Recomendamos terminar de preparar a câmara de gelificação e a tampa antes de passar para a próxima etapa.

12. Após incubar os tecidos na solução AcX, lave os tecidos duas vezes, cada vez por 15 min, com PBS. Comece a descongelar os componentes da solução de gelificação para proExM: Stock X, 4HT, APS e soluções de estoque TEMED. Manter as soluções resfriadas em banho de gelo ou em bloco frio (resfriado a 4 ° C).

13. Adicione Stock X, 4HT, TEMED e APS em uma proporção de 47: 1: 1: 1 nesta ordem (ou seja, último APS) em um tubo de microcentrífuga (solução de gelificação também consulte a receita em Reagentes e Soluções), e vortex para um alguns segundos. A quantidade de solução de gelificação deve ser aumentada ou diminuída de acordo com o tamanho da câmara de gelificação e o tamanho do tecido ou fatia de tecido e deve ter pelo menos 100 vezes o volume em excesso. Por exemplo, pelo menos 400 µl de solução de gelificação são usados ​​para incubar uma única fatia coronal de 100 μm de cérebro de camundongo, o suficiente para preencher uma câmara de gelificação com um vazio de 22 × 22 × 0,38 mm, que pode caber em uma fatia coronária completa de cérebro de camundongo . Para evitar a polimerização prematura da solução de gelificação, o APS deve ser adicionado à solução por último, antes de agitar no vórtex. Além disso, a solução gelificada misturada deve ser mantida em um banho de gelo ou em um bloco frio (refrigerado a 4 ° C). Evite o aquecimento excessivo da solução de gel, por exemplo, segurando a tampa do tubo de microcentrífuga em vez do corpo do tubo. Finalmente, recomendamos concluir as próximas etapas (até colocar o tubo de microcentrífuga com a solução de gelificação e a amostra a 4 ° C na etapa 15) dentro de 5 minutos para evitar a gelificação prematura.

14. Imediatamente após a etapa anterior, use um pincel macio para transferir e mergulhar os tecidos na solução de gelificação no tubo de microcentrífuga.

15. Mantenha o tubo de microcentrífuga contendo a amostra e a solução de gel a 4 ° C no escuro por 30 min. Após a incubação de 30 min, recomendamos completar as próximas etapas (até colocar a câmara de gelificação em uma incubadora a 37 ° C na etapa 19) em 5 min para evitar a gelificação prematura.

16. Use o pincel para transferir e colocar a fatia de tecido entre os espaçadores na câmara de gelificação. Certifique-se de que a fatia esteja plana, sem rugas ou distorções. Recomendamos primeiro adicionar uma gota de 20 µl da solução de gel entre os espaçadores, transferindo a fatia de tecido para a gota e usando o pincel para achatar lentamente o tecido dentro do ambiente líquido, pressionando-o suavemente sobre a superfície do vidro.

17. Adicione uma gota de 20 µl da solução gelificante a um lado da tampa e vire-a de modo que a gota fique pendurada na superfície devido à tensão superficial (Fig. 4A). Abaixe lentamente a tampa para que a gota se funda com a solução de gel na lamela de amostra (Fig. 4B). Depois de fundido, continue abaixando a tampa para que ela se apoie nos espaçadores. Certifique-se de que nenhuma bolsa de ar seja introduzida na solução durante este processo.

18. Usando um pipetador e uma ponta de pipeta fina, continue adicionando solução gelificante adicional em ambos os lados abertos da câmara até que o espaço entre a tampa, os espaçadores e a lâmina seja preenchido (Fig. 4C).

Forças capilares farão com que a solução de gelificação encha uniformemente a câmara.

19. Coloque a câmara de gelificação em uma incubadora a 37 ° C por 2 horas para polimerização. Tenha cuidado para não inclinar ou agitar a câmara durante a transferência e a gelificação.

Digestão

20. Retire a câmara de gelificação da incubadora.

21. Insira lentamente uma lâmina de barbear do lado entre a tampa e os espaçadores e force a tampa aberta. Assim que a tampa estiver separada do gel, continue a usar a lâmina de barbear para remover os espaçadores de maneira semelhante (Fig. 4D).

22. Usando uma lâmina de barbear, retire o excesso de gel.

Aparar o gel o manterá compacto e ajudará a encontrar as regiões de interesse em etapas posteriores. Você pode querer aparar o gel para ter uma forma assimétrica para que sua orientação possa ser facilmente medida em etapas posteriores simplesmente examinando a forma [veja nosso vídeo em https://www.youtube.com/watch?v=OksNCAJwxVI ( proExM para tecidos: demonstração de gelificação)].

23. Prepare o tampão de digestão conforme descrito em Reagentes e Soluções (a concentração final de ProK é 8 U / ml).

Recomendamos preparar tampão de digestão suficiente para ter pelo menos um excesso de 10 vezes em volume em comparação com o do gel.

24. Use um pincel para molhar o gel e suas laterais com o tampão de digestão. Espere de 10 a 30 segundos, até que o tampão de digestão encharque a borda do gel.

Isso ajudará a acessar o fundo do gel com o pincel, para que o gel possa ser mais facilmente removido do substrato de vidro.

25. Retire o gel sondando suavemente o espaço entre o gel e a superfície do vidro com um pincel fino. Como o gel se expandirá cerca de 1,5 × durante a digestão, escolha um recipiente grande adequado, como uma placa de Petri, para a etapa de digestão. Para pequenos tecidos e amostras de fatias de tecido, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml podem ser usados ​​como recipiente. Use recipientes separados com tampão de digestão para cada amostra. Deixe os géis imersos em tampão de digestão por & gt8 horas (durante a noite é bom) em temperatura ambiente no escuro (Fig. 4E, F).

Armazenamento e expansão

26. Remova o tampão de digestão e adicione PBS, e armazene o gel a 4 ° C no escuro se o armazenamento para imagens posteriores for desejado. Tenha cuidado para não sugar o gel durante a pipetagem.

O tecido incorporado está ligeiramente espalhado neste estágio, portanto, alterar o ângulo de incidência da luz pode ajudar a localizá-lo dentro da solução.

27. Se o gel precisar ser transferido para outro recipiente (por exemplo, um recipiente maior para aparar ou o suporte de amostra para geração de imagens), você pode usar um pincel de tamanho adequado para pegar e mover o gel. Para evitar a desidratação da amostra, adicione um pouco de PBS ao novo recipiente.

28. Antes de expandir a amostra, recomendamos aparar o gel até o tamanho mínimo necessário. Você pode usar um microscópio de dissecção ou um microscópio de campo amplo de baixa ampliação para localizar a região de interesse. Para minimizar o movimento da amostra, a maior parte do líquido circundante pode ser removido temporariamente durante o corte. Sob o microscópio, use uma lâmina de barbear para cortar e remover o gel fora da região de interesse. Aconselhamos aparar o gel em uma forma assimétrica para deduzir facilmente a orientação.Certifique-se de aparar o gel em um tamanho razoável para manuseio e imagem, pois a expansão irá introduzir um aumento linear adicional de 2 × a 2,5 × (para um total de cerca de 4,5 ×) no tamanho. Transfira o gel com as regiões de interesse para um recipiente (por exemplo, uma placa de Petri de tamanho adequado para expansão ou o suporte de amostra para geração de imagens) que é grande o suficiente para conter o gel expandido.

29. Encha o recipiente, mergulhe o gel em água e espere 20 min. Substitua a água por água doce e aguarde mais 20 min. Refaça a troca mais uma vez (20 min em água doce para três mudanças no total). A amostra deve ser totalmente expandida e opticamente limpa (ver Fig. 3 para uma hemi-fatia expandida do cérebro de camundongo) e pronta para a geração de imagens (esses tempos são mais curtos do que em publicações anteriores, mas refletem números que funcionam para uso de rotina em nosso laboratório). Um exemplo de imagens de pré-expansão e pós-expansão de uma fatia do cérebro contendo neurônios expressando Brainbow 3.0 é mostrado na Figura 5. Para imagens de longo prazo, por exemplo, ao obter imagens de um grande volume de amostra, a montagem da amostra é necessária após a expansão e antes da imagem (consulte o Protocolo Básico 6). A montagem da amostra fixa a amostra ao suporte de amostra e, portanto, evita que ela se desvie, e também pode ajudar a manter a amostra dentro da distância de trabalho da lente objetiva. Para uma verificação rápida da amostra expandida ao microscópio (& lt5 min), normalmente não há necessidade de montagem de amostra. Em um microscópio invertido, por exemplo, você pode usar uma pipeta para remover temporariamente (& lt5 min) a água ao redor do gel para evitar que ele escorregue.

30. Se você precisar transferir o gel expandido para um novo recipiente, deve ser manuseado com cuidado, pois é um tanto delicado no estado expandido. Primeiro, remova a maior parte da água ao redor e, em seguida, use um pincel para mover o gel para uma lamela de vidro limpa colocada no mesmo recipiente. Em seguida, levante suavemente a lamínula (com o gel por cima) para fora do recipiente com uma pinça. O gel pode ser transferido escovando-o lentamente da lamínula para o novo recipiente. Este método também pode ser usado para virar o gel invertendo a lamela que contém o gel, caso o gel esteja voltado para a direção errada.

3: proExM para amostras de tecido intacto espesso (200 a 500 μm)

Para tecidos e fatias de tecido de 200 a 500 μm de espessura, o protocolo básico do tecido (Protocolo Básico 2) precisa ser modificado para permitir uma penetração mais profunda dos reagentes. Além disso, o tempo de digestão precisa ser prolongado. Usamos com sucesso este protocolo para expandir amostras de até 500 μm de espessura. A expansão de amostras com mais de 500 μm também pode ser possível.

Materiais Adicionais (veja também o Protocolo Básico 2)

  • 2-(N-morfolino) ácido etanossulfônico (MES) - solução salina tamponada (MBS): MES 100 mM / NaCl 150 mM em água, ajustado para pH 6

1. A geração de amostra de tecido é descrita nas etapas 1 a 7 do Protocolo Básico 2 e pode ser usada para amostras de tecido mais espesso.

2. Para a etapa AcX (protocolo básico 2, etapa 9), um tampão levemente ácido deve ser usado para suprimir a reatividade do éster NHS da molécula de AcX para permitir uma penetração mais profunda no tecido. Normalmente usamos solução salina tamponada com MES (MBS) para este tampão ligeiramente ácido. Diluir a solução estoque 10 mg / ml AcX / DMSO 1: 100 no MBS. Deixe o tecido no AcX em solução MBS por até 24 horas em temperatura ambiente, dependendo da espessura da amostra. Normalmente, reservamos mais tempo para tecidos mais espessos. Por exemplo, deixamos uma fatia do cérebro de 500 μm em solução AcX / MBS por 24 horas.

3. Para a preparação da solução de gelificação (Protocolo Básico 2, etapa 13), aumente a quantidade de 4HT em 50% (isto é, proporção de 47: 1,5 entre o estoque X e 4HT) para uma inibição mais longa da polimerização durante a incubação. Para a incubação (Protocolo Básico 2, etapa 15), mergulhe a amostra na solução de gelificação por 45 a 60 min (em vez de 30 min) a 4 ° C antes de transferi-la para a câmara de gelificação.

4. Para a digestão (Protocolo Básico 2, etapa 25), uma digestão mais longa e mais forte é necessária. A digestão do ProK pode ser realizada por mais tempo e / ou em temperatura mais elevada (até 50 ° a 60 ° C), dependendo da composição biológica do tecido e da força de sua reticulação após a fixação. Para uma fatia do cérebro de camundongo de 250 μm de espessura, por exemplo, uma digestão de 2 dias em temperatura ambiente resultou na digestão adequada da amostra. Neste caso, a fatia do cérebro gelificada foi digerida em tampão de digestão (com ProK) à temperatura ambiente por 1 dia, então o tampão antigo foi trocado por tampão de digestão fresco (com ProK) e digerido por outro dia.

1: Imunocoloração pós-expansão para proExM

A imunocoloração pode ser realizada após a expansão, conforme ilustrado na Figura 1C. Pode-se realizar a etapa de homogeneização mecânica usando ProK e, em seguida, adicionar anticorpos. No entanto, apenas alguns epítopos, como YFP, podem sobreviver ao tratamento com ProK e podem ser corados após a expansão, a maioria dos epítopos não.

Para preservar a maioria dos epítopos, um método mais suave, como desnaturação de proteínas por autoclavagem em um tampão rico em detergente alcalino (ou, alternativamente, o tratamento com uma protease suave que corta apenas um pequeno número de locais dentro de proteínas, como LysC), pode ser usado para homogeneização mecânica (Fig. 1C, veja também a Figura Suplementar 1 de Tillberg et al., 2016). Descrevemos o protocolo para interrupção mediada por autoclave abaixo. Para exemplos de uso de vários anticorpos, consulte a Figura Suplementar 1 de Tillberg et al., 2016.

O protocolo a seguir refere-se ao Protocolo Básico 2, e um exemplo usando fatias de cérebro de camundongo Thy1-YFP e coloração anti-GFP pós-expansão está incluído (Fig. 6).

Materiais Adicionais (veja também o Protocolo Básico 2)

1. Infundir uma fatia do cérebro de camundongo com AcX e incorporar em um hidrogel, conforme descrito no Protocolo Básico 2.

Após a gelificação, a amostra pode ser removida do substrato de vidro e temporariamente armazenada em solução de NaCl 1M (por exemplo, por períodos de minutos a horas) antes da próxima etapa.

2. Mergulhe a amostra no tampão alcalino por 15 min e, a seguir, substitua a solução por tampão alcalino novo da mesma composição. Coloque a amostra, imersa no tampão, em um recipiente autoclavável (por exemplo, garrafa de polipropileno), deixando a tampa ligeiramente aberta para permitir o alívio da pressão. Autoclave as amostras no tampão alcalino no modo de esterilização líquida, a uma temperatura de 121 ° C, por 1 hora. Durante esta e as etapas subsequentes, a amostra se expandirá visivelmente.

3. Deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente e lave duas vezes, cada vez por 15 min, com PBS.

4. Incube a amostra com anticorpos primários em 0,1% (p / v) Triton X-100 mais 5% (v / v) de soro normal de burro em PBS (tampão de bloqueio) em um agitador em baixa velocidade durante a noite em temperatura ambiente ou 4 ° C.

O soro no tampão de bloqueio deve ser do animal hospedeiro dos anticorpos secundários, portanto, outros tipos de soro devem ser usados ​​em vez do soro normal de burro se os anticorpos secundários forem de outros animais.

5. Remova a solução de anticorpo primário e lave quatro vezes, cada vez por 30 min, com tampão de bloqueio.

6. Incube a amostra com anticorpo secundário marcado com fluorescência de escolha no tampão de bloqueio em um agitador em baixa velocidade durante a noite em temperatura ambiente ou 4 ° C.

7. Remova a solução de anticorpo secundário e lave quatro vezes, cada vez por 30 min, com tampão de bloqueio.

8. Substitua o tampão por PBS para armazenamento (por até várias semanas), se desejar. Expanda até o fator final de ± 4,5 × com três lavagens de 20 min em água e, em seguida, prossiga com a imagem (consulte o Protocolo Básico 6).

Para obter mais detalhes sobre como realizar as etapas específicas acima, por exemplo, em relação ao manuseio da amostra, consulte as etapas correspondentes no Protocolo Básico 2.

2: Proteínas fluorescentes, anticorpos e corantes para proexmo

Para a variação do proExM ilustrada na Figura 1C (coloração pós-expansão proExM), qualquer corante conjugado ao anticorpo secundário deve ser compatível com o protocolo, visto que o corante é administrado apenas no final do processo.

Para as variações de proExM ilustradas na Figura 1A, B (coloração de pré-expansão proExM), a maioria das proteínas fluorescentes são compatíveis com os protocolos básicos proExM descritos anteriormente (ver Fig. 1b de Tillberg et al., 2016). Por exemplo, proteínas fluorescentes β-barrel (por exemplo, GFP-like) são resistentes à protease e podem sobreviver à digestão de ProK muito bem (por exemplo, & gt50% de retenção de fluorescência para muitas proteínas fluorescentes), mas proteínas fluorescentes não-β-barrel (por exemplo, infravermelho proteínas fluorescentes baseadas em bacteriofitocromos) são degradadas pela etapa ProK. Para anticorpos conjugados com corantes fluorescentes, a maioria dos corantes é compatível com os protocolos proExM básicos (por exemplo, & gt40% de retenção de fluorescência), exceto para os corantes da família cianina (Fig. 1c de Tillberg et al., 2016). Os corantes da família da cianina, como Cy3, Cy5 e Alexa Fluor 647, são degradados durante as reações de polimerização. Para corantes vermelhos distantes, portanto, recomendamos Atto 647N ou CF 633.

4: Exfish para células cultivadas

O ExFISH permite a microscopia de expansão do RNA usando um ligante de molécula pequena, que chamamos de LabelX, para ancorar covalentemente moléculas de RNA endógenas dentro de espécimes ao gel expansível de ExM. O LabelX é análogo ao AcX no proExM, mas permite que as moléculas de RNA sejam interrogadas após a expansão usando RNA FISH. Para células em cultura processadas com ExFISH, FISH de molécula única (smFISH) é usado para corar moléculas de RNA pós-expansão.

Materiais

  • Solução salina tamponada com fosfato (PBS Current Protocols, 2001)
  • 10% de formalina tamponada neutra (NBF EMS, cat. No. 15742-10)
  • 70% (v / v) de etanol em água sem nuclease
  • Buffer MOPS (ver receita)
  • LabelX (ver receita)
  • Solução estoque VA-044 (ver receita)
  • Fonte de nitrogênio
  • Tampão de digestão (ver receita)
  • Água sem nuclease
  • Tampão de lavagem para smFISH (WA-10, ver receita)
  • Tampão de hibridização smFISH (ver receita)
  • Sondas smFISH: usamos principalmente sondas smFISH comercialmente disponíveis (por exemplo, sondas Stellaris ® RNA-FISH da LGC Biosearch Technologies). Alternativamente, é possível projetar sondas smFISH personalizadas conjugadas a um fluoróforo de sua escolha (Raj & Tyagi, 2010).
  • Parafilme
  • Recipiente Tupperware (modificado conforme descrito no texto abaixo) como uma câmara hermética
  • Vidros com tampa de câmara removível Culturewell de 16 poços da Grace Bio Labs (Sigma, cat. No. GBL112358)
  • Ferramenta de remoção da lamínula da câmara (Sigma, cat. No. GBL 103259)
  • Dessecador a vácuo e fonte de vácuo
  • Lâminas de vidro para microscópio, 1 mm de espessura
  • Kapton Tape ou Scotch Tape
  • Incubadora a 60 ° C
  • Lâminas de barbear
  • Escriba de diamante para cortar (traçar) vidro fino
  • Fórceps
  • Placas retangulares de 4 poços Nunc (por exemplo, Thermo Fisher, catálogo nº 267061)
  • Cola epóxi

Preparação de cultura celular

As células podem ser cultivadas conforme desejado para atender às necessidades experimentais. No entanto, para facilidade de gelificação e geração de imagens, bem como manuseio, descobrimos que os vidros de cobertura de câmara removível Culturewell de 16 poços da Grace Bio Labs (Sigma, cat. No. GBL112358) são convenientes para fluorescência de pré-expansão no local imagem de hibridização (ExFISH), bem como subsequente gelificação e digestão. Nos casos em que o FISH de molécula única (smFISH) é realizado antes da gelificação e expansão, descobrimos que é conveniente plaquear células em vidros com câmara Nunc Lab-Tek de 8 poços (Thermo Fisher, catálogo no.155411).

Fixação e permeabilização de células cultivadas

1. Lave as células uma vez com PBS aquecido a 37 ° C para evitar qualquer choque térmico.

2. Adicionar formalina tamponada neutra a 10% e fixar as células por 10 min em temperatura ambiente (todas as etapas são em temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma). Lave com PBS duas vezes, cada vez por 2 min em temperatura ambiente.

3. Substitua o tampão por etanol a 70% (v / v) em água sem nuclease para permeabilização. As células fixas podem ser armazenadas em etanol a 70% (v / v) em água sem nuclease a 4 ° C por até 2 semanas. Para uso imediato, as células fixas devem ser permeabilizadas com etanol 70% (v / v) em água sem nuclease por 1 hora em temperatura ambiente.

Tratamento LabelX de células em cultura

4. Reidrate as células permeabilizadas com 70% (v / v) de etanol em água sem nuclease lavando duas vezes com PBS por 5 min por lavagem à temperatura ambiente. Pré-incubar células cultivadas fixas com tampão MOPS 20 mM por 5 min.

5. Prepare o LabelX conforme descrito em Reagentes e soluções e, em seguida, dilua em tampão MOPS 20 mM até a concentração desejada.

Observamos a retenção de RNA quase completa ao usar LabelX em uma concentração final de amina Label-IT de 0,006 mg / ml. Para experimentos smFISH, recomendamos o uso de uma concentração final de amina Label-IT de 0,006 mg / ml (ou seja, uma diluição 1: 150 da solução estoque LabelX descrita na receita em Reagentes e Soluções).

6. Remova o tampão MOPS de pré-incubação e adicione LabelX no tampão MOPS às células cultivadas fixas. Para células cultivadas na tampa de vidro da câmara removível, use 80 μl de LabelX em tampão MOPS. Para células cultivadas em vidros com câmara Nunc Lab-Tek, use um volume de 120 μl. Incubar durante a noite a 37 ° C. Depois, lave duas vezes com PBS em temperatura ambiente por 5 min cada.

Nesse estágio, as células podem ser armazenadas temporariamente a 4 ° C em PBS por até uma semana.

Gelificação

A tampa de vidro da câmara removível Grace tem uma estrutura superior que pode ser removida com uma ferramenta de remoção de vidro da tampa da câmara (Sigma, cat. No. GBL 103259). Após a retirada da câmara, um espaçador de silicone de 1 mm permanece com a lamínula e pode ser utilizado para a moldagem do gel (protocolo descrito a seguir, bem como no Protocolo Básico 2). Se as células são cultivadas em uma lamela, uma câmara pode ser feita usando espaçadores de lamínula (ver Protocolo Básico 2). Se as células forem cultivadas em lamínulas com câmara Nunc Lab-Tek, descobrimos que a lamínula inferior junto com sua gaxeta de 1 mm podem ser removidas do resto da placa e usadas para moldar o gel.

A gelificação de células cultivadas fixas para ExFISH é diferente da de outras variantes de ExM porque VA-044, em vez de APS, é usado como um iniciador de polimerização. Descobrimos que o uso de APS / TEMED produz um fundo autofluorescente escuro que é significativo no contexto do smFISH, onde os próprios sinais são extremamente fracos. VA-044 é preferível porque seu uso resulta em autofluorescência mínima, o que é ideal para imagens smFISH. No entanto, VA-044 tem uma temperatura de decomposição mais alta e leva a um processo de polimerização mais lento. Como resultado, a inibição devido ao oxigênio ambiente pode afetar a formação do gel. Descobrimos que a desgaseificação seguida de perfusão com nitrogênio desloca o oxigênio dissolvido na solução de gel e facilita a formação do gel. Portanto, a gelificação é realizada sob atmosfera de nitrogênio em uma câmara umidificada, que fornece um ambiente cheio de nitrogênio e minimiza a evaporação.

Normalmente usamos um recipiente Tupperware, mas qualquer recipiente que forneça uma vedação hermética pode ser usado para a câmara umidificada (Fig. 7). Criamos dois orifícios na tampa do Tupperware usando uma agulha de seringa. Para umedecer a câmara, colocamos uma pequena quantidade de água no fundo da Tupperware. Posicionamos uma placa de fundo de plástico de 24 poços vazia bem no fundo do Tupperware para fornecer uma plataforma elevada sobre a qual colocamos a tampa de vidro com as células e solução de gelificação. O nível de água deve ser muito mais baixo do que a altura dos 24 poços placa de modo que a amostra sendo gelificada seja mantida bem acima da água.

7. Vidro da tampa da câmara removível For the Grace: Use a ferramenta de remoção de vidro da tampa da câmara para remover os poços superiores, deixando para trás a junta de silicone preta. Deixe 40 mL de PBS dentro do poço para manter as células hidratadas. Para a lamela de vidro com câmara Lab-Tek, primeiro cole o fundo da lamínula em uma lâmina de vidro de microscópio com 1 mm de espessura para suporte mecânico, usando cola epóxi. Após a cura da cola, use uma lâmina de barbear para separar a tampa de vidro dos poços superiores, deixando para trás a junta de plástico. Deixe 100 μl de PBS dentro do poço para manter as células hidratadas.

8. Prepare a solução de gelificação para ExFISH como segue.

Diluir o VA-044 para uma concentração final de 0,5% (p / v) em solução de monômero (ou seja, diluir o estoque 1:50 em solução de monômero). Por exemplo, para preparar 1 ml de solução de gelificação, adicione 20 μl de solução VA-044 e 40 μl de água a 940 μl de solução de monômero.

A solução de gelificação deve ser preparada a 4 ° C e usada na próxima etapa imediatamente.

9. Em um bloco frio ou em gelo, distribua a solução de gelificação para ExFISH em alíquotas de 200 μl em tubos de microcentrífuga. Desgaseifique por 10 min em um dessecador a vácuo.

10. Remova qualquer PBS restante dos poços nos vidros de cobertura e adicione a solução gelificante desgaseificada para ExFISH. Para a tampa de vidro da câmara removível Grace, adicione 40 μl de solução de gel. Adicione 200 μl de solução gelificante se estiver usando a tampa de vidro com câmara Lab-Tek. Coloque a tampa de vidro em um dessecador a vácuo e desgaseifique por mais 10 min. Nesse ínterim, prepare uma lâmina de vidro coberta com Parafilm como a tampa (ver Fig. 2 e texto associado, acima). Certifique-se de que a superfície do Parafilm esteja plana, limpa e sem dobras. O Parafilm evita que o gel grude na tampa ao removê-la em etapas posteriores. Remova a tampa de vidro do dessecador e coloque imediatamente a lâmina de vidro Parafilm diretamente em cima da tampa de vidro. Qualquer excesso de solução de gel pode espirrar para os lados. Prossiga para as etapas a seguir sem demora.

11. Coloque a tampa de vidro na plataforma de plástico da câmara umidificada. Vede a câmara (Fig. 7A, B).

12. Remova a fita que cobre os orifícios. Conecte a entrada da linha de nitrogênio a uma ponta da seringa e insira a ponta através de um orifício (Fig. 7C). Lentamente, ligue o regulador de fluxo de nitrogênio para liberar o nitrogênio na câmara. Aumente o fluxo até sentir o fluxo de ar saindo do outro orifício. Lave a câmara com nitrogênio por 10 min. Quando terminar, remova a entrada e sele imediatamente ambos os orifícios com fita novamente (por exemplo, fita Kapton ou fita adesiva).

13. Coloque a câmara em uma incubadora a 60 ° C por 2 horas para iniciar a gelificação (Fig. 7D). Tenha cuidado para não inclinar ou agitar a câmara durante a transferência e a gelificação.

Digestão

14. Quando a gelificação estiver concluída, retire a câmara umidificada da incubadora a 60 ° C e remova a tampa de vidro. Usando uma lâmina de barbear, levante suavemente a tampa coberta de Parafilm do topo dos poços. Para a tampa de vidro da câmara removível Grace Biolabs, remova com cuidado a junta de silicone preta, retirando-a com as mãos ou uma pinça. Para a tampa de vidro com câmara Lab-Tek, não tente remover a gaxeta de plástico. Neste ponto, você verá que os géis terão se formado nos poços individuais da tampa de vidro.

15. Para a digestão, coloque a tampa de vidro em uma placa retangular de 4 poços Nunc. Prepare o tampão de digestão com proteinase K conforme descrito em Reagentes e Soluções. Adicione 6 ml de tampão de digestão ao poço que contém a lamela de vidro (se estiver usando qualquer outro recipiente, adicione tampão de digestão pelo menos 10 vezes o volume do gel para cobrir completamente a lamínula e os géis).Certifique-se de que o gel esteja totalmente imerso por pelo menos 2 a 3 horas até que se solte naturalmente do vidro de cobertura da amostra (Fig. 2F). Se for usada uma lamela de vidro com câmara removível, use um estilete de diamante para separar cada amostra e sua peça correspondente da lamínula, riscando a lamínula e quebrando cada vidraça contendo seu pedaço de gel. Observe que o substrato da cultura de células é colocado de forma que o gel fique no topo do substrato e as células cultivadas na superfície inferior do gel. Opcionalmente, o substrato celular destacado pode ser removido com cuidado usando uma pinça, para apenas deixar o gel que contém a célula no tampão de digestão.

16. Deixe o gel imerso no tampão de digestão durante a noite em temperatura ambiente no escuro.

Armazenamento e expansão

17. Após a digestão, os géis podem ser expandidos (temporariamente, veja abaixo) em uma placa de Petri ou em qualquer recipiente grande o suficiente para conter os géis. Para expandir totalmente, lave os géis com volume em excesso de água livre de nuclease três vezes com pelo menos 1 hora por lavagem. Consulte também o Protocolo Básico 1.

Coloração smFISH de células em cultura após expansão

18. Uma vez que os géis formados em qualquer um dos vidros com câmara acima têm uma espessura de ± 1 mm antes da expansão, a espessura dos géis expandidos precisa ser reduzida para facilitar a difusão eficiente das sondas FISH através do gel. Para reduzir os géis totalmente expandidos a uma espessura de 1 mm, usamos lâminas de vidro de microscópio com 1 mm de espessura como espaçadores como segue. Prepare um prato grande de plástico para usar como tábua de cortar. Muitas vezes usamos as tampas de plástico de placas retangulares de 4 poços Nunc, embora qualquer superfície plana de plástico de tamanho semelhante funcione. Use uma pequena quantidade de epóxi para colar duas lâminas de microscópio de vidro de 1 mm de espessura em sua lâmina plana na superfície de plástico. Posicione as duas lâminas de vidro de forma que fiquem alinhadas ao longo de sua dimensão mais longa, com um espaço de 2,5 a 3 cm entre elas. Deixe o epóxi endurecer.

19. Posicione um gel totalmente expandido entre as duas lâminas de vidro na tampa de plástico. O gel expandido deve caber entre as duas lâminas de vidro. Caso contrário, corte o gel com uma lâmina de barbear. Posicione o gel de modo que o lado do gel com células em cultura fique voltado para o fundo.

20. Coloque uma lâmina de barbear sobre as lâminas de vidro de modo que ela faça uma ponte entre as lâminas. Deslize cuidadosamente a lâmina de barbear ao longo das lâminas de vidro e através do gel para raspar tudo, exceto o 1 mm inferior do gel que contém as células.

21. Com cuidado, colete o gel raspado na parte inferior contendo as células fixas e expandidas e mova-o para o PBS. Se necessário, neste ponto, os géis raspados podem ser armazenados em PBS a 4 ° C por até 1 mês.

22. Prossiga para a coloração smFISH, que pode ser realizada em qualquer recipiente, embora geralmente utilizemos placas de 24 poços com fundo de vidro para a conveniência da imagem logo após a coloração.

23. Prepare os géis incubando com tampão de lavagem (WA-10) por 30 min em temperatura ambiente.

24. Prepare as sondas diluindo em tampão de hibridização smFISH na concentração indicada pelo vendedor para smFISH. Normalmente realizamos a hibridização a uma concentração de sonda total de 100 nM. Vortex para misturar.

25. Remova o tampão de lavagem dos géis. Adicione o tampão de hibridização com sondas para os géis. Adicione volume suficiente para cobrir completamente o gel a ser tingido (para placas de 24 poços, recomendamos 300 µl). Incubar durante a noite (ou por & gt6 h) a 37 ° C.

26. Lave os géis duas vezes com volume em excesso (por exemplo, 500 μl para placas de 24 poços) de WA-10 a 37 ° C com 30 min por lavagem.

27. Lave uma vez com excesso de volume de PBS a 37 ° C por 30 min.

28. A imagem pode ser realizada em PBS ou qualquer outro tampão de escolha [o fator de expansão é determinado pela concentração de sal: o uso de PBS regular resulta em ∼2 × expansão usando 0,02 × PBS (diluído em água) resulta em ∼3 × expansão enquanto ainda preserva hibridização].

Um exemplo com células HeLa é mostrado na Figura 8. Consulte o Protocolo Básico 6 para saber como criar imagens de géis expandidos nas configurações de microscópio mais comuns. Embora a qualidade da imagem adquirida dependa da configuração da imagem, a imagem de campo amplo é geralmente recomendada em vez da imagem confocal devido ao fotobranqueamento de manchas smFISH observadas durante a imagem confocal.

O protocolo para realizar ExFISH em tecidos é diferente do protocolo de células em cultura em alguns aspectos importantes. Em primeiro lugar, o protocolo ExFISH de tecido requer amplificação de sinal após a realização de FISH, porque smFISH convencional é muito escuro para imagem confocal e técnicas de imagem 3-D semelhantes necessárias para tecidos. Como resultado, usamos a reação em cadeia de hibridização (HCR) para amplificar o sinal das sondas FISH. Em segundo lugar, o procedimento de gelificação é mais semelhante ao descrito no protocolo proExM para tecidos (Protocolo Básico 2) do que ao procedimento para células em cultura. Terceiro, concentrações mais altas de LabelX são usadas, porque melhores rendimentos de retenção de RNA são observados em tecidos em concentrações mais altas. Finalmente, após o tratamento com Label-X, é possível usar AcX para reter proteínas fluorescentes.

Materiais

  • Água sem nuclease
  • Solução salina tamponada com fosfato (PBS Current Protocols, 2001)
  • 4% (w / v) paraformaldeído (PFA) em PBS
  • 70% (v / v) de etanol em água sem nuclease
  • Buffer MOPS (ver receita)
  • LabelX (ver receita)
  • Tampão de lavagem para HCR-FISH (WA-20, ver receita)
  • Tampão de hibridização HCR-FISH (ver receita)
  • Projeto da sonda HCR-FISH: as sondas para HCR-FISH são projetadas usando o software Stellaris Probe Designer da LGC Biosearch Technologies. As sequências de ligação de 22 bp espaçadas de 2 bp são projetadas usando o software. Freqüentemente, buscamos pelo menos 20 sequências visando cada transcrição de interesse. Para projetar sondas HCR-FISH, sequências de iniciador HCR (Choi, Beck, & Pierce, 2014) são anexadas a cada sequência de ligação por meio de um espaçador de 2 bases (AA). As sequências de iniciador podem ser anexadas à extremidade 5 'ou 3' de cada sequência de ligação, dependendo da orientação das sequências de iniciador I1 iniciadores são anexados à extremidade 5 ', enquanto I2 iniciadores são anexados à extremidade 3'. As sondas HCR-FISH geradas por este procedimento têm 60 bp de comprimento final.
  • Tampão de amplificação (ver receita)
  • HCR Hairpins (adquirido na Molecular Instruments, cada hairpin vem em uma concentração de 3 µM em um tampão de armazenamento)
  • 5 × SSCT (ver receita) e 0,05 × SSCT (ver receita)
  • Vibratome
  • Placas de cultura de 24 poços
  • Reagentes e equipamentos adicionais para perfusão transcardial (Chen et al., 2015), corte vibratome (Chen et al., 2015) e proExM para tecidos intactos (Protocolo Básico 2)

Fixação de tecido e corte

Os tecidos podem ser corrigidos usando protocolos de sua escolha. Abaixo está uma fixação de perfusão e protocolo de corte para fatias de cérebro de camundongos que demonstrou resultados consistentes.

1. Perfundir transcardialmente o cérebro do camundongo (Chen et al., 2015) com PBS gelado (5 a 10 ml) seguido por paraformaldeído gelado a 4% (p / v) em PBS (∼30 ml).

2. Correção posterior do cérebro em paraformaldeído a 4% (p / v) em PBS durante a noite a 4 ° C.

3. Lave o cérebro com PBS por 30 min uma vez, antes de cortar as fatias.

4. Corte fatias do cérebro em um vibratome (Chen et al., 2015) em PBS.

A espessura das fatias deve ser inferior a 200 µm para permitir uma coloração eficiente com sondas FISH após a expansão.

5. As fatias podem ser armazenadas em PBS se forem usadas imediatamente (dentro de 1 a 2 dias), ou armazenadas em etanol 70% (v / v) em água sem nuclease por mais tempo a 4 ° C.

Tratamento LabelX, gelificação e digestão de tecidos e fatias de tecido

6. Se os tecidos ou fatias de tecido foram armazenados em 70% (v / v) de etanol em água sem nuclease, reidrate lavando duas vezes com PBS por 15 min por lavagem em temperatura ambiente. Caso contrário, prossiga com o resto do protocolo.

7. Pré-incubar tecidos ou fatias de tecido com tampão MOPS 20 mM por 30 min.

8. Prepare o LabelX diluindo em tampão MOPS 20 mM a uma concentração final de amina Label-IT de 0,1 mg / ml (ou seja, uma diluição de 1:10 da solução estoque de LabelX).

9. Remova o tampão MOPS de pré-incubação e adicione LabelX no tampão MOPS às fatias. Por conveniência, os tecidos ou fatias de tecido podem ser processados ​​em placas de 24 ou 48 poços. Use um volume suficiente para cobrir as fatias: por exemplo, em uma placa de 24 poços, quatro seções de 50 µm podem ser incubadas juntas em 250 µl de solução.

10. Incube os tecidos ou fatias de tecido com LabelX em MOPS durante a noite a 37 ° C. Depois, lave duas vezes com PBS por 15 min por rodada.

11. Opcional: Para reter proteínas fluorescentes em fatias de tecido de espécimes transgênicos, é possível fazer uma incubação adicional com AcX. Incubar fatias com 0,05 mg / ml de AcX em PBS em temperatura ambiente por pelo menos 6 horas. Lave duas vezes com PBS por 15 min por lavagem.

12. Prossiga para a gelificação e digestão conforme descrito no Protocolo Básico 2.

Ao contrário do procedimento de gelificação ExFISH para células em cultura, aqui, a gelificação com APS / TEMED pode ser realizada como no protocolo proExM porque a amplificação do sinal com HCR torna a autofluorescência fraca que surge de APS / TEMED insignificante.

13. Após a digestão, lave os géis com PBS duas vezes, cada vez por 30 min. Os géis podem ser armazenados no escuro em PBS a 4 ° C após esta etapa por até 2 meses.

Coloração de fatias gelificadas com HCR-FISH

Embora a coloração possa ser realizada em qualquer câmara, geralmente usamos placas de 24 poços.

14. Prepare os géis incubando com tampão de lavagem (WA-20) por 30 min em temperatura ambiente.

15. Prepare as sondas diluindo em tampão de hibridização HCR-FISH na concentração desejada (-1 nM por sonda). Vortex para misturar.

16. Remova o tampão de lavagem dos géis. Adicione o tampão de hibridização com sondas para os géis. Adicione volume suficiente para cobrir completamente o gel a ser corado (para placas de 24 poços, 300 µl por poço). Incubar durante a noite a 37 ° C.

17. Lave os géis duas vezes com volume em excesso (por exemplo, 500 µl para placas de 24 poços) de WA-20 a 37 ° C por 30 min por lavagem. Para fatias mais espessas do que 100 µm antes da gelificação, aumente os tempos de lavagem para 45 min por lavagem.

18. Lavar uma vez com excesso de volume de PBS a 37 ° C por 2 horas.

19. Lave uma vez com excesso de volume de PBS em temperatura ambiente por 2 horas. Para fatias mais espessas do que 100 µm antes da gelificação, aumente o tempo de lavagem para 4 horas. Se necessário, após esta etapa, os géis corados com sondas FISH podem ser armazenados durante a noite em PBS a 4 ° C antes da amplificação de HCR.

Amplificação HCR (adaptado de Choi et al., 2014)

20. Pré-incubar as fatias com tampão de amplificação por 30 min em temperatura ambiente.

21. Prepare grampos de cabelo marcados com fluorescência, resfriando rapidamente cada grampo (aqueça a 95 ° C por 90 segundos e, em seguida, resfrie à temperatura ambiente em uma gaveta por 30 min). Para cada 500 µl de tampão de amplificação total a ser usado (na próxima etapa, usamos 150 µl de tampão de amplificação por poço de uma placa de 48 poços ou 250 µl por poço de uma placa de 24 poços), são necessários 10 µl de cada grampo de cabelo .

22. Prepare a solução em grampo combinando todos os grampos resfriados em tampão de amplificação em temperatura ambiente, usando o volume correto de tampão de amplificação para obter o volume final desejado. Por exemplo, para preparar 500 µl de tampão de amplificação total com dois grampos de cabelo, adicione 10 µl de cada grampo a 480 µl de tampão de amplificação. Vortex para misturar.

23. Remova a solução de pré-amplificação, adicione a solução em grampo aos géis e incube por 3 a 6 horas em temperatura ambiente.

24. Pare a amplificação com quatro lavagens de 30 min com 5 × SSCT.

Expansão e imagem

25. Neste ponto, as amostras podem ser visualizadas. Para expandir as amostras, lave três vezes, cada vez por 10 min com 0,05 × SSCT. O fator de expansão pode ser ajustado alterando a concentração de sal. A imagem também pode ser realizada em PBS regular para ∼2 × expansão. Um exemplo de fatia do cérebro de camundongo é mostrado na Figura 9. Consulte o Protocolo Básico 6 para saber como criar imagens de géis expandidos nas configurações de microscópio mais comuns.

6: Amostras expandidas de imagem

Materiais

  • Amostra expandida (ver protocolos acima)
  • Etanol
  • Sondas FISH
  • 0,1% (w / v) de poli-L-lisina em água
  • Fonte de nitrogênio
  • Agarose de baixo ponto de fusão
  • Supercola
  • Microscópio de dissecação ou de campo amplo
  • Lâmina de barbear
  • Lamelas (por exemplo, 24 × 60 mm No. 1.5 (espessura: 0,15 a 0,19 mm))
  • Placas com fundo de vidro ou placas de múltiplos poços (por exemplo, Mattek, catálogo no. P35G-0.170-14-C)
  • pincel
  • Toalhetes de papel (por exemplo, Kimwipes)
  • Microscópio invertido, vertical ou de folha de luz

Expansão de amostra para imagem

1. Coloque a amostra digerida e incorporada em gel em PBS (por exemplo, etapa 30 no Protocolo Básico 1, final da etapa 25 no Protocolo Básico 2, etapa 17 no Protocolo Básico 4 ou etapa 13 no Protocolo Básico 5) em uma placa de Petri .

2. Use um microscópio de dissecção ou um microscópio de campo amplo com uma objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 4 × ou 10 ×) para encontrar a região de interesse.

Para amostras ExFISH, isso deve ser feito antes da coloração com sondas FISH (ou seja, antes da etapa 18 no Protocolo Básico 4, ou antes da etapa 14 no Protocolo Básico 5).

3. Sob o microscópio, use uma lâmina de barbear para remover o excesso de gel (por exemplo, longe da região de interesse).

As amostras de células cultivadas ExFISH também podem precisar ser aparadas axialmente para reduzir a espessura (consulte as etapas 18 a 21 no Protocolo Básico 4).

4. Expanda totalmente as amostras proExM com água. As amostras ExFISH devem ser coradas com sondas FISH e expandidas em PBS diluído para células em cultura ou tampão SSC diluído para tecidos, seguindo os protocolos descritos anteriormente (ou seja, etapas 22 a 28 no Protocolo Básico 4, ou etapas 14 a 25 no Protocolo Básico 5 )

Montagem de amostra

Montar uma amostra ExM expandida em uma superfície estável pode ajudar a evitar que a amostra se desvie durante a geração de imagens, o que é importante para a obtenção de imagens de alta qualidade. O melhor método de montagem dependerá das geometrias do seu microscópio e do porta-amostra (lamínula, placa de Petri ou poço de uma placa multipoços, por exemplo), bem como dos requisitos de imagem, como tempo de imagem e tipo de objetiva e ampliação.

Para uma inspeção rápida (& lt5 min) das amostras expandidas usando um microscópio invertido ou vertical com uma objetiva seca, normalmente não há necessidade de montagem de amostra. Você pode usar uma pipeta para remover temporariamente (& lt5 min) o líquido ao redor do gel para evitar que flutue ou deslize.

Para imagem de longo prazo (& gt5 min) ou imagem que requer desvio mínimo da amostra (por exemplo, obtenção de um z-stack), você pode querer montar a amostra anexando fisicamente as amostras expandidas ao suporte de amostra. Nas seções a seguir, descrevemos três métodos de montagem comuns: agarose, poli-L-lisina e supercola. Para microscópios invertidos, você pode usar poli-L-lisina para montar o gel em uma superfície estável. Para microscópios verticais, você pode usar agarose, poli-L-lisina ou supercola. Para microscópios de folha de luz, você pode usar supercola ou poli-L-lisina.

A vantagem do método poli-L-lisina é que ele fornece uma interface transparente entre o gel e a superfície do porta-amostra. Portanto, é adequado para configurações de microscópio que requerem imagens por meio do suporte de amostra, como um microscópio invertido. Em comparação, a agarose pode introduzir dispersão óptica e aberração, e a supercola não é transparente após a cura. A vantagem do método de agarose é que você pode recuperar sua amostra após a obtenção da imagem, pois a montagem da amostra é reversível. A amostra pode ser reduzida (e, em seguida, separada da agarose), colocando em tampão de alto teor de sal após a imagem. A vantagem do método da supercola é sua forte adesão em comparação com os outros métodos. É adequado para imagens de longo prazo em um microscópio vertical ou um microscópio de folha de luz, mesmo por dias.

Montagem de amostra com poli-L-lisina

5a. Lamelas, pratos com fundo de vidro e placas com vários poços com fundo de vidro podem ser usados ​​como porta-amostras. Lâminas ou placas de plástico com vários poços também podem ser usadas, mas a espessura do suporte de amostra pode limitar a escolha das objetivas e / ou causar aberrações em microscópios invertidos.

6a. Limpe a superfície do porta-amostras enxaguando com água e depois com etanol. Após o enxágue, deixe o suporte secar ao ar.

7a. Mergulhe a superfície do vidro com 0,1% (p / v) de poli-L-lisina em água por 20 min.

8a. Remova a solução de poli-L-lisina 0,1% (p / v) e enxágue a superfície de vidro revestida com água três vezes.

9a. Seque com ar a superfície de vidro por 1 hora em um ambiente limpo ou use gás nitrogênio para secar a superfície.

  1. Primeiro, remova a maior parte do líquido ao redor do gel. Em seguida, coloque uma lamela limpa ao lado do gel e use um pincel para deslizar o gel sobre a lamínula.
  2. Em seguida, retire a lamínula (com o gel por cima) de seu recipiente com uma pinça.
  3. Antes de transferir o gel para a superfície modificada com poli-L-lisina, a superfície do gel a ser fixada precisa ser seca para uma boa adesão. Você pode usar um pequeno pedaço de Kimwipe para remover o excesso de líquido. Comece absorvendo o excesso de líquido das laterais do gel e, em seguida, use com cuidado, por exemplo, a ponta do lenço de papel para absorver o líquido entre o fundo do gel e a lamela.

Use o pincel para deslizar o gel da lamela para a superfície modificada com poli-L-lisina. Esteja ciente da orientação do gel no contexto de seu trabalho de microscopia posterior: por exemplo, o lado voltado para o suporte de amostra será mais facilmente alcançado pela objetiva (por exemplo, dentro da distância de trabalho da objetiva) em uma configuração invertida. Em contraste, em uma configuração de microscopia vertical, o lado voltado para o lado oposto do suporte de amostra será mais acessível para a objetiva. Portanto, se a região de interesse estiver mais próxima de um lado específico do gel, coloque esse lado mais próximo da objetiva ao montar a amostra. Esta prática torna-se importante para amostras expandidas, pois a espessura da amostra e a espessura do gel são aumentadas pelo fator de expansão.

Esta transferência do gel deve ser realizada em tempo hábil para evitar a desidratação do gel: recomendamos terminar esta etapa em 5 min.

11a. Após a montagem, adicione imediatamente uma pequena quantidade de água (ou PBS diluído para amostras ExFISH) para manter o gel hidratado e evitar o encolhimento do gel.

Montagem de amostra com agarose

5b. Lamelas, pratos com fundo de vidro e placas com vários poços com fundo de vidro podem ser usados ​​como porta-amostras. Lâminas ou placas de plástico com vários poços também podem ser usadas, mas a espessura do suporte de amostra limitará a escolha das objetivas e / ou causará aberrações em microscópios invertidos.

6b. Prepare 0,5% (w / v) de solução de agarose de baixo ponto de fusão no meio de imagem correto. Por exemplo, para amostras proExM, prepare 0,5% (p / v) de agarose em água. Para amostras ExFISH, prepare 0,5% (p / v) de agarose em PBS diluído ou outros tampões de sua escolha. Manter a solução de agarose aquecida em banho-maria a 40 ° C para evitar o endurecimento prematuro. Se endurecido, use um ciclo de micro-ondas curto (10 a 20 segundos) para derreter a solução de agarose. Alternativamente, aquecê-lo a -60 ° C irá derretê-lo novamente.

7b. Transfira o gel expandido para o suporte de amostra de escolha (por exemplo, lamínulas e pratos com fundo de vidro). Durante a transferência, remova e seque o líquido do gel expandido (consulte a etapa 10a, acima).

8b. Usando uma pipeta, aplique cuidadosamente a solução de agarose derretida nas bordas do gel.Se necessário, você também pode incorporar o gel inteiro em agarose, usando a solução de agarose derretida.

9b. Espere que a agarose endureça à temperatura ambiente ou a 4 ° C e, em seguida, adicione uma pequena quantidade de água (ou PBS diluído para amostras ExFISH) para evitar a desidratação.

10b. Após a conclusão da imagem, você pode colocar a amostra montada em um tampão com alto teor de sal, como PBS. Isso encolherá o gel, mas não a agarose. Usando pincéis ou pinças, você pode separar o gel da agarose. O gel pode ser armazenado em PBS para uso posterior.

Montagem de amostra com supercola

5c. Lamelas, pratos com fundo de vidro e placas com vários poços com fundo de vidro podem ser usados ​​como porta-amostras. Lâminas ou placas de plástico com vários poços também podem ser usadas. No entanto, uma vez que a supercola se torna opaca após a cura, este método de montagem não é compatível com microscópios invertidos que requerem imagens através do suporte de amostra.

6c. Limpe a superfície do porta-amostras enxaguando com água e depois com etanol. Após o enxágue, deixe o suporte secar ao ar.

7c. Aplique supercola na superfície do porta-amostra. Aplique a cola apenas na área onde o gel deve ser fixado. Certifique-se também de que o excesso de cola seja removido com lenços de papel, deixando apenas uma camada fina.

8c. Transfira o gel expandido para o porta-amostras de sua escolha. Antes da transferência, remova e enxugue o líquido do gel expandido (consulte a etapa 10a).

9c. Uma vez que o gel é colocado na cola, aguarde 20 a 30 segundos para a supercola curar antes de adicionar água (ou PBS diluído para amostras ExFISH) para hidratar o gel.

Após a cura, deve haver uma interface opaca entre o gel e a supercola.

Imagens de amostras ExM com microscópios invertidos (por exemplo, microscópios confocais de disco giratório invertido)

Uma configuração típica de microscópio invertido é mostrada na Figura 10. O método de montagem de poli-L-lisina é recomendado para microscópios invertidos, uma vez que a interface transparente entre o gel e a superfície modificada de poli-L-lisina permitirá a geração de imagens através do porta-amostra.

Para imagens em um microscópio invertido, recomendamos começar com objetivas de baixa ampliação (4 × ou 10 ×) para encontrar a região de interesse primeiro e, em seguida, mudar para objetivas de alta ampliação. Objetivos aéreos são tipicamente objetivos de baixa ampliação (por exemplo, 4 × ou 10 ×) e podem ser usados ​​no início para encontrar as amostras e as regiões de interesse. Para imagens de alta ampliação (& gt20 ×), recomendamos o uso de objetivas de imersão em água para evitar aberrações causadas pela incompatibilidade do índice de refração entre o meio de montagem aquoso e a lamela ou óleo. Devido às distâncias de trabalho geralmente curtas, as objetivas de imersão em óleo podem ser consideradas para uso principalmente quando o gel expandido é montado perto (dentro de ∼10 μm) da lamela e quando a amostra ou objeto de interesse está perto da objetiva (como em células cultivadas ou tecidos finos). A distância de trabalho da objetiva normalmente não é um problema para amostras finas, como células em cultura, se o gel estiver devidamente montado no suporte de amostra (ou seja, o lado da amostra do gel é montado voltado para o lado objetivo usando o poli- L - método da lisina). Para algumas amostras de tecido, no entanto, a distância de trabalho torna-se um problema ao obter imagens profundamente no gel (por exemplo, & gt300 µm). Neste caso, objetivas de imersão em água de longa distância são recomendadas. Como em todos os experimentos de microscopia, certifique-se de que o colar de correção na objetiva (se aplicável) seja ajustado para coincidir com a espessura das lamelas.

Muitos dos microscópios confocais e de campo amplo usados ​​em laboratórios de biologia e instalações de imagem são microscópios invertidos. Descobrimos que os microscópios confocais de disco giratório oferecem uma boa combinação de resolução e velocidade e são altamente adequados para imagens em nanoescala rápidas de tecidos expandidos. Os microscópios confocais de varredura a laser podem ser usados ​​de maneira mais eficaz para imagens de alto sinal para fundo de amostras finas e pequenas, como células em cultura.

Imagem com microscópios verticais

Para microscópios verticais, qualquer um dos três métodos de montagem, poli-L-lisina, agarose ou supercola, pode ser usado. Se você planeja recuperar sua amostra após a obtenção de imagens, recomendamos o método de montagem com agarose. Nos outros dois métodos, o gel é fisicamente preso ao porta-amostra, mas pode potencialmente ser cortado usando uma lâmina de barbear se a amostra precisar ser recuperada (observe que este processo pode danificar a amostra, se você não tomar cuidado). Para imagens de longo prazo (por exemplo, ao longo de alguns dias), recomendamos o uso do método de montagem supercola, pois oferece a adesão mais forte ao suporte de amostra. O método poli-L-lisina fornece uma interface transparente entre o gel e o porta-amostra e, portanto, também pode ser visualizado em um microscópio invertido. Para imagens em um microscópio vertical, recomendamos começar com objetivas de baixa ampliação (4 × ou 10 ×) para encontrar a região de interesse primeiro e, em seguida, mudar para objetivas de alta ampliação, que é semelhante ao procedimento em um microscópio invertido. Para imagens de alta ampliação (& gt20 ×), recomendamos o uso de objetivas de imersão ou imersão em água, pois o gel é imerso em meio de montagem aquoso.

Imagem com microscópios com a amostra pendurada acima (por exemplo, microscópios de folha de luz)

Microscópios de folha de luz são adequados para imagens de amostras de tecido expandido em altas velocidades, usando objetivas de longa distância de trabalho. Para acomodar as objetivas, alguns microscópios de folha de luz penduram as amostras por cima. Por exemplo, uma configuração de imagem típica de um microscópio de folha de luz (microscópio de folha de luz Zeiss Z.1) é mostrado na Figura 11. O microscópio de folha de luz Z.1 usa uma haste para pendurar amostras acima das objetivas, perpendicular a o caminho da luz do microscópio. A amostra é então encerrada em uma câmara de imagem cheia com meio de montagem aquoso. Para amostras ExM expandidas, uma lamela fina pode ser usada como suporte para apoiar fisicamente o gel e, em seguida, o suporte da lamínula pode ser anexado à haste por meio de um pequeno adaptador impresso em 3-D, que está disponível para download em nosso recurso da Web http://expansionmicroscopy.org. Para prender o gel à cobertura da lamínula, recomendamos o método de montagem com supercola, pois ele fixa o gel à lamínula com mais força. A montagem de polilisina também pode ser usada para imagens de curto prazo, mas observamos o descolamento do gel se a montagem não for realizada corretamente (por exemplo, devido a polilisina expirada, movimentos de estágio rápido ou água inadequada remoção do gel antes da colocação). Depois de montar o gel no forro da lamínula, o forro da lamínula pode ser anexado ao adaptador com supercola. O adaptador é projetado para coincidir com os amassados ​​na extremidade da haste, para que possa ser fixado mecanicamente à haste.

No microscópio de folha de luz Zeiss Z.1, normalmente usamos uma objetiva de imersão em água 1,0 NA, 20 × de longa distância de trabalho para imagens de alta resolução. Se o volume de imagem for grande e exigir um longo tempo de imagem, podemos usar objetivas de menor ampliação (5 ×) para obter uma visão geral rápida e de baixa resolução da amostra. O microscópio de folha de luz Z.1 é adequado para a geração de imagens de grandes amostras multicoloridas com sua configuração de duas câmeras, aquisição rápida de imagens e capacidade de capturar dois canais de cores simultaneamente. Além disso, a longa distância de trabalho da objetiva pode ser usada para obter imagens de grandes amostras transparentes. Essas especificações do microscópio de folha de luz Z.1 são particularmente vantajosas para a geração de imagens de amostras ExM.

Nós primeiro demonstramos essas vantagens por imagem de um volume de ∼575 × 575 × 160 – µm (∼6 × 10 10 voxels em três cores) de uma amostra HCR-ExFISH em cerca de ∼3 horas, com uma resolução capaz de resolver pontos únicos de RNA dentro o tecido expandido (Fig. 11D-F Chen et al., 2016). Amostras ainda maiores na faixa de milímetros foram capturadas com sucesso com este sistema. Um exemplo é mostrado na Figura 11G, na qual uma sub-região de um hipocampo de camundongo infectado com um vírus Brainbow 3.0 AAV (Fig. 5) foi expandida com um protocolo proExM descrito anteriormente. O volume da imagem era de ∼1,5 × 0,8 × 0,1 mm em unidades de pré-expansão, e o conjunto de dados exigia a costura de 180 pilhas de imagens 3-D individuais, resultando em um conjunto de dados de 5 Terabytes, 0,7 Teravoxel com um tamanho de pixel lateral efetivo de cerca de 60 nm .


Preparação do lisado: Por que o RIPA Buffer é o melhor para Western Blot?

Em 1979, Jaime Renart et al. publicou um artigo intitulado “Transferência de proteínas de géis para papel diazobenziloximetil e detecção com anti-soros: um método para estudar a especificidade do anticorpo e a estrutura do antígeno”, o prelúdio da técnica moderna de Western blot (WB).

Logo depois, Harry Towbin et al. foi um passo além e publicou “Transferência eletroforética de proteínas de géis de poliacrilamida para folhas de nitrocelulose: procedimento e algumas aplicações”. Com isso, nasceu oficialmente a técnica WB.

Hoje, os experimentos do WB são a base da pesquisa biológica. Infelizmente, freqüentemente é um desafio obter bons resultados.

Um homem sábio disse uma vez:

Um WB bem-sucedido depende de:

Por falar em W B, como fabricante original de todos os nossos produtos, a equipe de P & ampD da Proteintech testa em média mais de 70 amostras para cada produto no WB. A equipe sênior de pesquisa e desenvolvimento da Proteintech compartilhará com você nossos anos de experiência com a WB para garantir que cada WB seja um sucesso.

O que entra em uma solução de lise?

Uma solução de lise contém os seguintes componentes:

1. o sistema de buffer

O pH da solução é crítico. As proteínas podem precipitar ou se tornar instáveis ​​quando o pH está fora da faixa fisiológica. Para evitar esta situação, um sistema tampão como o Tris-HCl é recomendado. Além de soluções tampão nesta faixa, um tampão Tris-HCl preserva a força iônica fisiológica e evita a formação de produtos insolúveis com outros íons. Um sistema de buffer HEPES é outra opção. Recomendamos evitar tampões com altas concentrações de potássio, porque eles podem precipitar proteínas quando o dodecil sulfato de sódio (SDS) está presente.

2. Íons de sal

Quando a concentração do íon sal é muito alta, algumas proteínas podem precipitar. Além disso, quando a concentração de íons é muito alta, pode ocorrer uma “cara sorridente” de migração de banda.

3. Agentes caotrópicos

Agentes caotrópicos enfraquecem a hidrofobicidade das proteínas para solubilizá-las. Existem dois tipos de agentes caotrópicos em um tampão de lise:

uma. Ureia / tioureia. Essas moléculas desvendam regiões hidrofóbicas interrompendo as ligações de hidrogênio entre os aminoácidos. Normalmente, ao fazer a extração de proteína para um WB, uréia 6–8 M e / ou tioureia 2 M podem ser usadas.

b. Detergentes. Trata-se de uma ampla classe de surfactantes. A chave para seu poder de solubilização é sua estrutura anfifílica. A extremidade hidrofóbica se liga às porções hidrofóbicas das proteínas, enquanto a extremidade hidrofílica interage com a água, resultando na solubilização.

Os detergentes iônicos podem ser divididos em detergentes catiônicos, aniônicos e anfotéricos. Os surfactantes iônicos comuns são SDS, DOC (desoxicolato de sódio) e SLS (lauril sarcosina de sódio). Os surfactantes anfotéricos comuns são CHAPS (3 - [(3-colamidopropil) dimetilamônio] -1-propanossulfonato) e CHAPSO (3 - [(3-colamidopropil) dimetilamônio] -2-hidroxi-1-propanossulfonato). Os surfactantes não iônicos comuns são Triton X-100, Triton X-114, Tween-20 e NP40.

Observação: É crítico em um WB que o número de moléculas de SDS carregadas negativamente que se ligam a uma proteína seja proporcional à massa da proteína, de modo que a taxa de migração seja influenciada apenas pela massa. Adicionar surfactantes catiônicos no tampão de lise interromperia a interação SDS-proteína e faria com que as proteínas migrassem na direção oposta.

Devido à complexidade da bioquímica de proteínas, é um desafio prever o surfactante ideal para extrair uma determinada proteína. Portanto, experimentar diferentes surfactantes é recomendado se você encontrar problemas. Isso é especialmente recomendado para proteínas de membrana.

Relacionado: Escadas de proteína pré-coradas
Protein Ladder (amostra grátis disponível) Escada de proteínas de ampla faixa
Catálogo nº : PL00001 Catálogo nº : PL00002
Cobertura de peso molecular: 10-180 kDa Cobertura de peso molecular: 3-245 kDa
Nº de marcadores: 10 proteínas pré-coradas Nº de marcadores: 13 proteínas pré-coradas
Resolução da escada de proteína pré-corada em um gel de Tris-glicina 10-20% (SDS-PAGE). Resolução da escada de proteína pré-corada em um gel de 4-12% Bis-Tris (SDS-PAGE)
4. Inibidores de protease

Tecidos e células geralmente contêm grandes quantidades de proteases. Durante a lise, eles são liberados e, por sua vez, podem digerir a proteína-alvo. Portanto, os inibidores da protease são essenciais para preservar a proteína alvo. Os inibidores de protease comuns são PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil), Aprotinina, Leupeptina, Pepstatina e AEBSF-HCL (cloridrato de fluoreto de 4-benzenossulfonil). PMSF é altamente eficaz e é a escolha mais popular para a preparação de lisados.

Muitos inibidores de protease requerem um íon metálico divalente para funcionar, portanto, um agente sequestrante também é frequentemente usado para inibir a atividade da protease, como o EDTA. Além disso, para proteínas alvo fosforiladas, um inibidor de fosfatase, como fluoreto de sódio ou ortovanadato de sódio, é necessário para preservar a forma fosforilada da proteína. O ortovanadato de sódio, em particular, é muito eficaz, mas precisa ser ativado ajustando o pH da solução para 10 e fervendo até que a solução fique incolor. Outros inibidores de fosfatase incluem pirofosfato de sódio e fosfato de β-glicerol.

5. Redutor

Muitas proteínas existem em multímeros por meio de ligações dissulfeto. Os redutores interrompem essas ligações de modo que as proteínas extraídas estão presentes na forma monomérica. Agentes redutores comuns são DTT (ditiotreitol) e BME (beta-mercaptoetanol). Tendo tudo isso em mente, o tampão RIPA é a melhor escolha para a preparação de lisado de amostra. Validamos mais de 13.000 anticorpos em WB e, repetidamente, experimentamos os melhores resultados usando o tampão RIPA. Ao longo dos anos, refinamos o buffer e abaixo você encontrará a versão otimizada da Proteintech:

Buffer RIPA Para 1000ml
Tris HCl 50 mM, PH 7,4 50ml
NaCl 150mM 8,76ml
1% Triton X-100 ou NP-40 10ml
0,5% de desoxilcolato de sódio 5g
0,1% SDS 1g
EDTA 1mM (estoque 0,5M) 2ml
10mM Naf 0,42g
Adicionar DDH2 O a 1000ml
Adicione PMSF a uma concentração final de 1 mM e quaisquer outros inibidores de protease imediatamente antes do uso.
4 x tampão de amostra SDS Para 1000ml
12% SDS 120g
25% de glicerol 250ml
Tris.HCl 150 mM (estoque de pH 7,0 1M) 150ml
0,03% de azul de bromofenol 300mg
20% de β-mercaptoetanol 200ml
Adicionar DDH2O a 50ml, alíquota e armazenar a -20 ° C
20% de β-mercaptoetanol, (ou 500 mM de DTT substituído), deve ser adicionado antes do uso.

Se você estiver tendo problemas para extrair a proteína de lisado convencional, recomendamos a leitura da literatura, em vez de tentar vários kits de extração aleatoriamente.

Relacionado: Carregando anticorpos de controle

GAPDH é comumente usado como um controle de carga de proteína no western blot devido à sua expressão consistentemente alta na maioria dos tipos de células. Essa enzima participa de vários eventos celulares, como glicólise, reparo de DNA e apoptose.

Os anticorpos monoclonais GAPDH da Proteintech são produzidos contra um antígeno de proteína inteira de origem humana e têm mais de 2.670 citações.

A beta-actina é geralmente usada como um controle de carga devido à sua expressão ampla e consistente em todos os tipos de células eucarióticas e ao fato de que os níveis de expressão desta proteína não são afetados pela maioria dos tratamentos experimentais.

66009-1-Ig foi citado em 1.135 publicações e tem ampla reatividade entre as espécies.

Os anticorpos de controle da Proteintech custam apenas US $ 99 cada (€ 150 na Europa) para um frasco de 150ul.


Conclusões

O direcionamento de proteínas MCF sintetizadas recentemente é obviamente uma questão de etapas consecutivas: uma primeira decisão já foi obtida na ligação a proteínas chaperonas distintas. Se uma proteína sintetizada recentemente se liga a Pex19p, ela pode ser direcionada a peroxissomos, conforme demonstrado por Ant1p. As preproteínas ligadas a Hsp70 sem um local de interação de Pex19p de alta afinidade podem entrar em contato com Tom70 mitocondrial e se ligar no local marcado pela cisteína C141. No entanto, seu destino subsequente é determinado principalmente por interações com Tom40 que serve tanto como um poro de importação geral e como um filtro de seletividade geral: proteínas MCF que expõem um loop de matriz carregada positivamente, bem como pré-proteínas contendo uma pré-sequência carregada positivamente, serão reconhecidas por Tom40 e insira no poro de importação. Proteínas ligadas a Tom70 contendo uma alça carregada negativamente, como Ugo1, podem ser expelidas do canal de importação Tom40 e inseridas na fase lipídica da membrana externa mitocondrial, outras proteínas podem ser liberadas e permanecer no citosol. Novos estudos sobre a seleção e translocação de proteínas transportadoras devem ser facilitados pelos novos dados sobre as estruturas de alta resolução da maquinaria de importação que se tornaram recentemente disponíveis e pela identificação da sequência bipartida de direcionamento MCF.


Qual é a transição epitelial para mesenquimal (EMT)?

A transição epitelial para mesenquimal (EMT) é o processo pelo qual as células epiteliais são transformadas em células mesenquimais. As células epiteliais formam o tecido epitelial que cobre a superfície interna e externa do corpo de um organismo. Essas células são polarizadas e formam extensas adesões célula-célula, incluindo junções aderentes e junções estreitas, umas com as outras [1] [2]. Uma das funções fundamentais do tecido epitelial é atuar como uma barreira protetora para os tecidos e órgãos subjacentes. As células mesenquimais, entretanto, não são bem organizadas em uma matriz extracelular tridimensional [3]. Durante o desenvolvimento, as células mesenquimais podem ganhar a capacidade de migrar e se diferenciar em outros tipos de células. Isso dá origem à formação de estruturas definidas, como a crista neural [3].

Durante a EMT, as células epiteliais perdem sua polaridade, bem como suas adesões célula-célula, e ganham a capacidade de migrar, proliferar, se diferenciar e se desenvolver em tecidos e órgãos específicos. EMT é classificado em 3 tipos principais:

  • EMT tipo 1 está associado ao desenvolvimento, como formação de embriões e desenvolvimento de órgãos
  • EMT tipo 2 está associada a processos de reparo, como cicatrização de feridas, regeneração de tecidos e fibrose de órgãos
  • EMT tipo 3 está associada à metástase tumoral [3] [4].

Aqui, consideraremos apenas o EMT em desenvolvimento, onde ele desempenha papéis importantes na produção de vários tecidos e órgãos e na definição de sua disposição no corpo.

A matriz rígida promove o agrupamento de integrinas que promove o recrutamento de Rac1b para a membrana, facilitando sua interação com NADPH oxidase e a produção subsequente de ROCs que promovem a expressão de Snail e, portanto, EMT. Por outro lado, Rac1b tem menos probabilidade de ser recrutado para a membrana das células em uma matriz mais macia.EMT é menos provável de ocorrer nesta situação.

É importante ressaltar que a EMT é reversível, o que significa que pode ocorrer uma transição mesenquimal para epitelial (MET). Na verdade, vários ciclos de EMT e MET são necessários antes que a arquitetura final do órgão seja estabelecida. Essas rodadas de EMT são conhecidas como EMT primária, secundária e terciária [3]. Um exemplo de EMT primária ocorre durante a gastrulação, onde o epitélio embrionário sofre EMT para formar o mesoderma. Em vertebrados, a gastrulação é induzida por proteínas da superfamília do fator transformador de crescimento e beta (TGF e beta), especialmente Nodal e Vg1 [5] [6]. Essas proteínas TGF e beta, juntamente com o auxílio da sinalização do fator de crescimento de fibroblastos (FGFs), induzem o gene Snail [7] [8] [9], que é um fator de transcrição chave para a EMT [10]. Snail promove a separação das células epiteliais da membrana basal antes de sua EMT, reprimindo a expressão da caderina-E [11] e ativando metaloproteinases [8]. Isso cliva os complexos de adesão celular e degrada a matriz extracelular, respectivamente, para auxiliar a migração celular [10]. Nodal e Vg1 também promovem sinalização Wnt [6] [12], que coopera com FGF e Snail para orquestrar EMT [9].

Propriedades físicas regulam EMT

Os mecanismos moleculares que impulsionam a EMT são complexos e envolvem muito mais componentes bioquímicos. Estes foram revisados ​​extensivamente em [10]. Além dos sinais bioquímicos, os sinais mecânicos, como a rigidez do microambiente celular, também desempenham papéis na regulação da EMT. Lee et al. observaram que células epiteliais mamárias foram submetidas a EMT quando colocadas em substratos duros e tratadas com metaloproteinase-3 de matriz (MMP3). Isso não foi observado em células cultivadas em substratos moles [13]. Além disso, o tratamento com MMP3 fez com que as células em ambos os substratos aumentassem sua expressão de Rac1b. No entanto, apenas as células no substrato rígido produziram espécies reativas de oxigênio (ROS) [13], que estão a jusante de MMP3 e Rac1b [14]. Curiosamente, em células em substratos rígidos, Rac1b é recrutado para a membrana celular através do agrupamento de integrinas. Isso permite que Rac1b se reúna com a NADPH oxidase e contribua para a produção de ROS. Foi determinado, portanto, que as células que crescem em substratos rígidos sofrerão EMT após a expressão de Snail ser aumentada após estimulação de ROS mediada por Rac1b [14]. Foi demonstrado que substratos mais rígidos promovem agrupamento de integrinas [14] e formação de adesão focal [15], e é esse processo que leva ao recrutamento de Rac1b e sua interação com NADPH oxidase que produz ROS, que por sua vez promove EMT. Como os substratos moles não promovem o agrupamento de integrinas, essa cascata de eventos não ocorre e as células que crescem em substratos moles não sofrem EMT.

Além da rigidez do microambiente celular, outros estresses mecânicos colocados nas células epiteliais de suas células vizinhas estão implicados no início da EMT. Isso foi descrito por Gomez et al. que usaram técnicas de microfabricação para gerar uma folha quadrada confluente de células epiteliais mamárias. Após tratá-los com TGF & beta (um indutor de EMT), a equipe observou que as células foram submetidas a EMT preferencialmente no canto e borda do quadrado, que correspondem às regiões de maior estresse mecânico [16]. Altos níveis de fatores de transcrição relacionados à miocardina A (MRTFA) também foram encontrados no núcleo das células localizadas em regiões de maior tensão mecânica [16].

Quando a tensão mecânica é menor, o MRTFA se liga aos monômeros de actina e é retido no citoplasma [17]. No entanto, quando o estresse mecânico aumenta, a tensão do citoesqueleto aumenta e isso ativa a via de sinalização de Rho-actina, que reduz a quantidade de actina monomérica no citoplasma, fazendo com que o MRTFA se transloque para o núcleo [17] [18]. Aqui, o MRTFA forma um complexo com o Smad3, que se liga à região promotora do gene SNAI2, ativando sua transcrição e, posteriormente, dissolvendo os contatos célula-célula [19]. MRTFA é um co-ativador do fator de resposta do soro (SRF) que regula positivamente as proteínas actinas do citoesqueleto, levando à remodelação do citoesqueleto [19]. Essa via dupla é ativada após a localização nuclear do MRTFA e promove a EMT das células epiteliais.

A aplicação direta de força biomecânica também foi considerada suficiente para induzir EMT. Zhou et al. alongou os queratinócitos humanos aplicando um alongamento de 10% a essas células, e observou que a força aplicada pode ativar diretamente o NF- & kappaB, que por sua vez promove a EMT [20] [21] [22]. Da mesma forma, a aplicação de força compressiva às células HEK-293 mostrou induzir a expressão dos reguladores EMT SNAI2 e ZEB1, juntamente com o marcador messenquimal VIM, através da via RhoA / ROCK [23]. Juntos, esses resultados experimentais destacam que a EMT subjacente é uma rede complexa de sinalização que envolve não apenas sinais bioquímicos, mas também uma variedade de pistas mecânicas.


Como funciona o ensaio de proteína de Bradford

O ensaio de proteína de Bradford é um ensaio colorimétrico testado ao longo do tempo. Quando o reagente de Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250 acidificado) se liga às proteínas, o corante sofre uma mudança de cor no espectro visível, com a absorbância máxima passando de 470 para 595 nm. A absorbância a 595 nm é então lida em um espectrofotômetro ou em um leitor de microplaca e é diretamente proporcional à quantidade de proteína ligada. A concentração exata de proteína da amostra é determinada por interpolação de uma curva padrão feita medindo a absorbância de uma série de diluição de padrões de proteína de concentrações conhecidas dentro da faixa de resposta linear do ensaio de proteína de Bradford. As proteínas comumente usadas como padrões incluem albumina de soro bovino (BSA) e gamaglobulina bovina (BGG).

Existem dois tipos de kits de ensaio de proteína de Bradford. Um contém reagente pronto para uso e padrões BSA ou BGG pré-diluídos para um ensaio de proteína de Bradford simples e rápido. O outro kit fornece mais flexibilidade com 5x reagente concentrado e BSA liofilizado ou padrões de globulina bovina, permitindo ao usuário preparar reagentes e padrões em qualquer concentração.


Reticulação UV e imunoprecipitação (CLIP)

O interesse nas interações RNA-proteína está crescendo à medida que começamos a apreciar o papel do RNA, não apenas em processos bem estabelecidos, como transcrição, splicing e tradução, mas também em campos mais novos, como interferência de RNA e regulação gênica por não codificação RNAs.

CLIP é uma técnica baseada em anticorpos usada para estudar interações RNA-proteína relacionadas à imunoprecipitação de RNA (RIP), mas difere do RIP no uso de radiação UV para reticular proteínas de ligação de RNA ao RNA ao qual estão ligadas. Esta ligação covalente é irreversível, permitindo condições de purificação rigorosas. Ao contrário do RIP, o CLIP fornece informações sobre o local real de ligação da proteína no RNA.

Existem diferentes tipos de CLIP, sequenciamento de alto rendimento-CLIP (HITS-CLIP), CLIP fotoativável-ribonucleosídeo aprimorado (PAR-CLIP) e CLIP individual (iCLIP).

Aqui está um resumo do protocolo iCLIP adaptado do Konig et al. J. Vis. Exp. 2011. “iCLIP -Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.”

Adaptado de Huppertz et al. Métodos. 2014. “iCLIP: Interações proteína-RNA na resolução de nucleotídeos.”

Tampão de lise

Inibidores de protease (adicionar novos a cada vez)

Lavagem com alto teor de sal

Diluição de RNase baixa Diluição de RNase alta

Diluições de 1/500 RNase I para preparação de biblioteca Diluições de 1/50 RNase I para controle de anticorpo

Mistura de tampão de lavagem PNK

4 μL 5x PNK tampão pH 6,5 [350 mM Tris-HCl, pH 6,5 50 mM MgCl 2 5 mM de ditiotreitol]

Mistura de ligadura Uma mistura PNK quente

4 μL de tampão de ligação 4x [200 mM Tris-HCl 40 mM MgCl 2 4 mM de ditiotreitol]

1,5 μL de ligante pré-adenilado L3 [20 μM]

Tampão PK Tampão PKurea

RNA / mistura de primer RT mix

0,5 μL Rclip primer [0,5 pmol / μL]

0,25 μL de transcriptase reversa Superscript III

Mistura de ligadura B Mistura de recozimento de oligo

0,8 μL 10x CircLigase Buffer II

1 μL de mistura de primer P5 / P3 solexa

20 μl de enzima Accuprime Supermix 1

1. Reticulação UV de células de cultura de tecidos

1.1. Remova a mídia e adicione PBS gelado às células (por exemplo, use células cultivadas em uma placa de 10 cm para três experimentos e adicione 6 ml de PBS).

1.2. Retire a tampa, coloque no gelo e irradie uma vez com 150 mJ / cm 2 a 254 nm usando um Stratalinker.

Um ou mais controles negativos devem ser mantidos durante todo o experimento. Células ou tecido nocaute, bem como células não reticuladas, são bons controles negativos, enquanto células nocaute não são recomendadas.

Observação. A pré-incubação opcional de 4-tiouridina e a reticulação UV-A podem ser usadas para certas proteínas. 4-tiouridina aumenta a reticulação de algumas proteínas. (Para esta etapa opcional, siga as instruções abaixo).

Opcional - rotulagem com tiouridina e reticulação UV-A (alternativa à etapa 1.2)

• Adicione 50 μL de 4SU (concentração de estoque: 100 mM 4SU) a uma placa de 10 cm de células cultivadas em 10 ml de DMEM suplementado com FBS e pen strep para obter uma concentração final de 500 μM 4SU. Alternativamente, adicione 10 μL de 4-tiouridina (concentração de estoque: 100 mM) para obter uma concentração final de 100 μM de 4SU.

• Incube as células com 4-tiouridina por 60 min a 500 μM ou 8 h a 100 mM. Verifique a viabilidade celular.

• Aspire o meio e adicione 6 mL de PBS gelado às células que crescem em uma placa de 10 cm (o suficiente para três imunoprecipitações). Retire a tampa e coloque no gelo.

• Irradie uma vez com 2 × 400 mJ / cm 2 em um Stratalinker 2400 com lâmpadas de 365 nm ou um instrumento equivalente.

1.3. Colher as células com um raspador de células e transferir a suspensão de células para os microtubos (por exemplo, 2 mL para cada um dos três microtubos).

1.4. células sedimentadas (giram em velocidade máxima por 10 segundos a 4 ° C) e, em seguida, remova o sobrenadante.

1,5. Congele rapidamente os pellets de células em gelo seco e armazene a -80 ° C até o uso.

O experimento pode levar até uma semana. Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento.

1.6 Preparação do grânulo

1.6.1 Adicionar grânulos de proteína A ou proteína G (por exemplo, 100 μl de grânulos magnéticos por experimento) a um microtubo fresco e lave os grânulos 2x com tampão de lise.

1.6.2 Ressuspender os grânulos em tampão de lise (100 μL), adicionar anticorpo (2-10 μg) e girar os tubos em temperatura ambiente por 30–60 min.

A quantidade de anticorpos necessária pode precisar ser otimizada. Uma amostra sem anticorpos é um bom controle negativo.

1.6.3. Lave as contas 3x com tampão de lise (900 μL) e deixe na última lavagem até que esteja pronto para prosseguir com a imunoprecipitação (etapa 3.1).

Se um anticorpo funcionar no IP, é uma boa indicação de que funcionará no CLIP.

2. Lise celular e digestão de RNA parcial

2.1. Ressuspenda o pellet celular em tampão de lise com inibidores de protease (1 mL) e transfira para microtubos de 1,5 mL.

Observação. Aqui você pode tentar uma etapa opcional de sonicação. A sonicação corta o DNA, que libera proteínas da cromatina, aumentando a recuperação dos complexos proteína-RNA.

Opcional - Sonicação de amostras

Sonicate a amostra no gelo usando um sonicador de sonda. A sonda não deve tocar nas laterais do tubo para evitar a formação de espuma. Sonicate duas vezes com rajadas de 10 segundos a cinco decibéis. Limpe a sonda sonicando H 2 O antes e depois do tratamento da amostra.

Use o Bioruptor plus por cinco ciclos alternando 30 seg ligado / 30 seg desligado em baixa intensidade.

2.2. Adicione a diluição de RNase baixa (10 μL) e Turbo DNase (2 μL) ao lisado celular e incube por exatamente 3 min a 37 ° C, agitando a 1.100 rpm e, em seguida, transfira imediatamente para o gelo.

2.3. Girar a 4 ° C a 22.000 g por 10 min e coletar cuidadosamente o sobrenadante limpo (deixar cerca de 50 mL de lisado com o pellet).

Cada membro do laboratório deve usar seu próprio conjunto de tampões e reagentes para facilitar a identificação de fontes potenciais de contaminação. As condições ideais para as digestões de RNase podem precisar ser otimizadas para cada novo lote de RNase.

3. Imunoprecipitação e desfosforilação das extremidades 3 'do RNA

3.1. Remova o tampão de lise das esferas (etapa 1.1.3) e adicione o lisado celular (a partir da etapa 2.3).

3.2. Faça a rotação das amostras por 2 h a 4 ° C.

3.3. Descarte o sobrenadante, lave as contas 2x com tampão de alto teor de sal (900 μL) e, em seguida, 2x com tampão de lavagem (900 μL). Faça a rotação dessas lavagens por pelo menos 1 minuto a 4 ° C.

A otimização e as condições de lavagem rigorosas são muito importantes.

Observação. No caso de as condições iCLIP padrão não serem rigorosas o suficiente para purificar especificamente a proteína de interesse, uma imunoprecipitação dupla com desnaturação de ureia pode ser usada em vez do protocolo descrito aqui. Para obter mais informações, consulte Huppertz et al. Métodos. 2014. “iCLIP: Interações proteína-RNA na resolução de nucleotídeos.”

3.4. Descarte o sobrenadante, ressuspenda os grânulos na mistura PNK (20 μL) e incube por 20 min a 37 ° C em um termomixer.

3,5. Adicione tampão de lavagem (500 μL), lave 1x com tampão de alto teor de sal e, a seguir, 2x com tampão de lavagem.

4. Ligação do ligante às extremidades 3 'do RNA e marcação da extremidade 5' do RNA

4.1. Remova cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda os grânulos na mistura de ligação A (20 μL) e incube durante a noite a 16 ° C em um termomixer.

4.2. Adicionar tampão de lavagem (500 μL), lavar 2x com tampão de alto teor de sal (1 mL) e, em seguida, 2x com tampão de lavagem (1 mL). Realize essas lavagens com rotação a 4 ° C por 5 minutos cada.

4.3. Remova o sobrenadante, ressuspenda os grânulos na mistura PNK quente (4 μL) e incube por 5 min a 37 ° C.

4,4. Remova a mistura PNK quente e ressuspenda os grânulos em tampão de carregamento 1x SDS-PAGE (20 μL).

4.5. Incubar em um termomixer a 70 ° C por 10 min.

4,6. Imediatamente coloque em um ímã para precipitar as contas vazias e carregar o sobrenadante no gel (veja a etapa 5).

5. Ligante SDS-PAGE e transferência de membrana

5.1. Carregue as amostras, bem como um marcador de tamanho de proteína pré-corado (5 μL) em um gel pré-moldado de 4-12% Bis-Tris e execute o gel por 50 min a 180 V em tampão de corrida 1x MOPS (de acordo com as instruções do fabricante).

Géis com pH constante 7 são recomendados.

5,2 Remova a frente do gel e descarte como resíduo sólido (contém ATP radioativo livre).

5.3. Transfira os complexos de proteína-RNA do gel para uma membrana de nitrocelulose usando um aparelho de transferência úmida (transferência de 1 h a 30 V dependendo das instruções do fabricante).

5,4 Após a transferência, enxágue a membrana em tampão PBS, em seguida, embrulhe em filme aderente e exponha a um filme a -80 ° C por 30 min, 1h e depois durante a noite.

Um adesivo fluorescente próximo à membrana permite posteriormente alinhar o filme e a membrana. O sucesso da experiência pode ser monitorado na autorradiografia do complexo proteína-RNA após a transferência da membrana.


Palavras finais

Neste capítulo (Enzimas envolvidas na replicação do DNA) e no próximo, examinaremos o processo de replicação.

Depois de descrever o mecanismo básico da replicação do DNA, discutiremos as várias técnicas que os pesquisadores usaram para obter uma compreensão completa da replicação.

Na verdade, um tema deste capítulo é a combinação de abordagens genéticas e bioquímicas que nos permitiram descobrir o mecanismo e fisiologia da replicação do DNA.


Assista o vídeo: POLACY O MASECZKACH (Agosto 2022).