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16.9: Introdução às tecnologias-chave - Biologia

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Liste as principais tecnologias que permitem usos modernos da biologia

A biotecnologia é o uso de agentes biológicos para o avanço tecnológico. A biotecnologia também tem muitas aplicações industriais, como fermentação, tratamento de derramamentos de óleo e produção de biocombustíveis (Figura 1).

Neste resultado, aprenderemos sobre algumas tecnologias modernas usadas na biologia hoje.

O que você aprenderá a fazer

  • Liste as técnicas básicas de manipulação de informações genéticas (DNA e RNA)
  • Reconhecer tecnologias usadas para clonagem molecular, celular e reprodutiva
  • Compreenda os fundamentos da engenharia genética

Aprendendo atividades

As atividades de aprendizagem para esta seção incluem o seguinte:

  • Manipulando Material Genético
  • Clonagem
  • Engenharia genética
  • Autoverificação: tecnologias-chave

Introdução à produção e purificação de anticorpos

A capacidade dos sistemas imunológicos animais de produzir anticorpos capazes de se ligarem especificamente a antígenos pode ser aproveitada para fabricar sondas para a detecção de moléculas de interesse em uma variedade de aplicações de pesquisa e diagnóstico. Nenhuma outra tecnologia atual permite aos pesquisadores projetar e fabricar tais ferramentas de reconhecimento molecular altamente específicas.

Quase todos os pesquisadores médicos ou de biologia celular que fazem qualquer tipo de análise molecular fazem uso da tecnologia de anticorpos de uma forma ou de outra. Dependendo de suas necessidades específicas de pesquisa, os cientistas diferem na medida em que se preocupam com a produção e purificação de anticorpos.

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MCQ sobre introdução à biotecnologia Biotecnologia MCQ & # 8211 01

Biologia / Ciências da Vida MCQ: Biotecnologia MCQ01: (Perguntas de Múltipla Escolha / Perguntas do Modelo / Perguntas de Amostra em Biotecnologia: Introdução à Biotecnologia / Cientistas e Descobertas em Biotecnologia / com respostas detalhadas, explicações e referências para a preparação do CSIR JRF NET Life Science Examination e também para outros exames competitivos em Ciências da Vida / Ciências Biológicas, como Exame de Admissão ICMR JRF, Exame DBT BET JRF, Exame de Ciências da Vida GATE (XL), Exame de Biotecnologia GATE (BT), Exame ICAR JRF, Exame de Admissão University PG, Exame JAM, GS Exame de biologia, GRE, exame de admissão médica etc. Exames competitivos de biologia / ciências da vida. Aproveite as vantagens de nossas notas de aula, PPTs, perguntas do ano anterior, testes simulados e Tutoriais em vídeo para sua preparação.

Chave de respostas com explicações

1. Resp. (b). 3 x 10 9

O genoma humano contém aproximadamente 3 bilhões de pares de bases localizados em 23 cromossomos em seu conjunto haplóide. Esses 3 bilhões de pares de bases contêm cerca de 19.000 a 20.000 genes codificadores de proteínas.

2. Resp. (d). pBR 322

pBR322 é um vetor plasmídeo de E. coli amplamente utilizado para fins de clonagem. É o primeiro vetor de clonagem construído, criado em 1977 no laboratório de Herbert Boyer. O vetor recebeu o nome dos pesquisadores que o construíram pela primeira vez. ‘P’ representa ‘plasmídeo’, ‘B’ representa Bolivar e ‘R’ representa Rodriquez. O pBR322 tem 4361 pares de bases com dois genes de resistência a antibióticos, portanto, denominado vetor de resistência dupla. Ele contém o gene de resistência para ampicilina (AmpR) e tetraciclina (TetR). O plasmídeo também possui regiões de clonagem múltiplas únicas com locais de restrição para mais de 40 enzimas de restrição.

M13 é um vírus que infecta E. coli. Também é usado como vetor para processos de recombinação de DNA.

pUC18 e pUC19 também são vetores de clonagem.

3. Resp. (d). PCR

PCR ou Polymerase Chain Reaction é uma técnica de biologia molecular usada para amplificar a amostra de DNA. A técnica de PCR foi desenvolvida por Kary Mullis em 1983.

Ensaio de Retardo de Gel é mais conhecido como Ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética ou EMSA. EMSA é uma técnica de eletroforese para detectar interações proteína-DNA ou proteína-RNA.

Reação de terminação em cadeia: Um método de sequenciamento de DNA proposto por Frederick Sanger em 1977.

RFLP: RFLP é Restriction Fragment Length Polymorphism: Uma técnica de DNA para detectar as variações em sequências de DNA homólogas. Na análise de RFLP, as variações dos fragmentos de DNA obtidos após o tratamento com uma enzima endonuclease específica são analisadas quanto ao seu polimorfismo.

4. Resp. (c). Impressão digital de DNA

Impressão digital de DNA& # 8211 também chamado de perfil de DNA, é uma técnica de detecção forense usada para identificar indivíduos pelas características de seu perfil de DNA. A técnica de impressão digital de DNA foi desenvolvida por Alec Jeffreys em 1984.

Mutagênese dirigida ao local: um método molecular para induzir mudanças na sequência específica em um gene ou produto gênico para investigar a importância desse gene específico no organismo.

5. Resp. (c). DNA Recombinase

Recombinação Cre-Lox: é uma técnica de recombinação sítio-específica para induzir mutações em grande escala em regiões específicas do DNA por deleção, inserção ou translocações. O sistema Cre-Lox usa uma enzima recombinase chamada Cre-recombinase. A Cre-recombinase recombina um par de sequências alvo curtas chamadas sequências Lox, daí o nome. A enzima Cre e o local LoxP são originalmente derivados do bacteriófago P1.

6. Resp. (uma). Domínios de fatores de transcrição

Sistema Yeast Two Hybrid ou Y2H sistema é uma técnica usada para detectar interações proteína-proteína e interações proteína-DNA.

Nuclease S1: A nuclease S1 é uma enzima endonuclease derivada de Aspergillus oryzae que cliva especificamente DNA de fita simples (ssDNA) e RNA.

7. Resp. (d). Birnboim e Doly

Mandel e Higa: descobriram o uso de cloreto de cálcio para a transformação de bactérias (E.coli) pelo bacteriófago λ.

Temin e Baltimore: descoberta da enzima transcriptase reversa

Tatum e Lederberg: conjugação bacteriana descoberta

8. Resp. (uma). Poligalacturonase

Tomate Flavr Savr é a primeira cultura alimentar geneticamente modificada com licença para consumo humano. Por modificação genética, o processo de amadurecimento do tomate foi retardado para evitar o apodrecimento mole. A tecnologia usava o gene antisense contra a enzima poligalacturonase, inativando-a. Esta enzima normalmente degrada a pectina da parede celular e resulta no amolecimento do tecido.

Golden Rice (amarelo) & # 8211 fonte da imagem: cc wikipedia

9. Resp. (b). Betacaroteno

Betacaroteno é o precursor da vitamina A. O arroz dourado é um arroz geneticamente modificado que produz beta-caroteno em seus grãos. O arroz dourado destinava-se a produzir arroz rico em vitamina A para uso em áreas com deficiência de vitamina A na dieta.

10. Resp. (uma). Imidazol

Imidazol é usado para a purificação de proteínas marcadas com His (marcadas com histidina) usando cromatografia de afinidade. As proteínas marcadas com His foram primeiro executadas em uma coluna de íons de níquel. A histidina ligada à coluna de íons de níquel e as outras impurezas serão eluídas. As proteínas marcadas com His podem ser então eluídas passando uma quantidade excessiva de imidazol através da coluna.

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Globalização, biossegurança e o futuro das ciências da vida (2006)

Teste capítulo fornece uma visão geral e uma perspectiva sobre a amplitude e os tipos de tecnologias que podem ter um impacto nas empresas de ciências da vida do futuro, com o entendimento de que existem dificuldades inerentes em antecipar ou prever como qualquer uma dessas tecnologias sozinhas ou em combinação irá alterar a natureza da futura ameaça & ldquolandscape. & rdquo

Em vez de tentar cobrir o panorama da tecnologia de uma maneira abrangente, este capítulo (1) destaca tecnologias que podem ter consequências óbvias ou de alto impacto em curto prazo (2) ilustra os princípios gerais pelos quais o crescimento tecnológico altera a natureza das ameaças biológicas futuras e, (3) destaca como e por que algumas tecnologias são complementares ou sinérgicas no reforço da defesa contra ameaças futuras, ao mesmo tempo em que aumentam ou alteram a natureza das ameaças futuras.

Há uma diversidade imensa e uma evolução rápida de tecnologias com relevância (ou impacto) nas empresas de ciências biológicas. Seu (s) impacto (s) podem ser benéficos ou prejudiciais, dependendo de como essas ferramentas e tecnologias são aplicadas. Algumas podem ser vistas como “fora do campo esquerdo”, ou seja, essas tecnologias podem ter aplicações muito diferentes daquelas originalmente pretendidas, ou podem ser combinadas em configurações não tradicionais inesperadas. A combinação de nanotecnologia e biotecnologia é um exemplo de combinação sinérgica.

Muitas das tecnologias discutidas neste capítulo criam novas oportunidades para os cientistas (e outros) explorarem aspectos da diversidade biológica e química que não podem ser acessados ​​por meio de mecanismos naturais

ou processos. Dada a natureza imprevisível da mudança tecnológica, é difícil, senão impossível, descrever em termos definitivos como será o cenário da tecnologia global em 5 a 10 anos, tanto no que diz respeito ao surgimento de tecnologias com aplicações de dupla utilização quanto à geografia global de descobertas futuras. Novas e inesperadas descobertas e aplicações tecnológicas em RNAi e biologia sintética surgiram mesmo durante o curso das deliberações deste comitê. Se este relatório, com o mesmo encargo, fosse preparado um ou dois anos no futuro, muitos dos detalhes apresentados neste capítulo provavelmente seriam diferentes.

UM ESQUEMA DE CLASSIFICAÇÃO PARA TECNOLOGIAS BIOLÓGICAS

Apesar dos objetivos aparentemente díspares e dispersos dos avanços recentes nas tecnologias das ciências da vida, o comitê concluiu que existem classes ou categorias de avanços que compartilham características importantes. Essas características compartilhadas são baseadas em propósitos comuns, fundamentos conceituais comuns e plataformas de habilitação técnica comuns. Assim, as tecnologias descritas neste capítulo são categorizadas de acordo com um esquema de classificação elaborado pelo comitê e organizado em torno de quatro agrupamentos:

Aquisição de nova diversidade biológica ou molecular. Essas são tecnologias impulsionadas por esforços para adquirir ou sintetizar uma nova diversidade biológica ou molecular, ou uma gama maior de especificidade, de modo que o usuário possa então selecionar o que é útil a partir do grande conjunto de diversidade recém-adquirido. O objetivo é criar coleções de moléculas com maior amplitude de diversidade do que as encontradas até agora na natureza, bem como com tipos de diversidade que podem não existir na natureza. Os tipos de moléculas que podem ser geradas incluem, por exemplo, enzimas com atividades aumentadas ou alteradas, bem como moléculas compostas de aminoácidos "não naturais". As tecnologias nesta categoria incluem aquelas dedicadas à síntese de DNA, a geração de nova diversidade química (ou seja, através da química combinatória), aquelas que criam novas moléculas de DNA (de genes a genomas) usando evolução molecular in vitro dirigida (por exemplo, & ldquoDNA shuffling & rdquo 1) e aquelas que amplificam ou simplesmente coletam sequências anteriormente não caracterizadas (genomas) diretamente da natureza (ou seja, bioprospecção). Todas essas tecnologias requerem uma etapa de seleção subsequente, de modo que moléculas, complexos macromoleculares ou mesmo micróbios com as propriedades desejadas possam ser identificados e isolados a partir de um grande e muito diversificado conjunto de possibilidades. Para esse fim, novas triagens de alto rendimento (incluindo o uso de robótica e sistemas avançados de gerenciamento de informações) tornaram-se tecnologias capacitadoras críticas.

Desenho dirigido. Essas são tecnologias que envolvem esforços deliberados para gerar diversidade biológica ou molecular nova, mas predeterminada e específica. O uso dessas tecnologias começa com uma compreensão mais definida e preexistente do produto final desejado e suas características moleculares. Em seguida, sintetiza-se ou reprojeta o produto desejado ou seus componentes. Os exemplos incluem, mas não estão limitados ao projeto racional e auxiliado pela estrutura de ligantes de pequenas moléculas, a engenharia genética de vírus ou micróbios e o campo emergente da "biologia quossintética".

Compreensão e manipulação de sistemas biológicos. Essas são tecnologias impulsionadas por esforços para obter uma compreensão mais completa de sistemas biológicos complexos e a capacidade de manipular tais sistemas. Os exemplos incluem & ldquosystems biology & rdquo silenciamento de genes (por exemplo, interferência de RNA) a geração de novas tecnologias de reagentes de ligação (afinidade) focadas em programas de desenvolvimento (por exemplo, células-tronco embrionárias) genômica e medicina genômica o estudo de moduladores de sistemas homeostáticos, bioinformática e teoria de rede avançada .

Produção, entrega e & ldquopackaging. & Rdquo Essas são tecnologias impulsionadas por esforços nos setores farmacêutico, agrícola e de saúde para melhorar as capacidades de produção, reengenharia ou entrega de produtos biológicos ou derivados da biologia e miniaturização desses processos. Os exemplos incluem o uso de plantas transgênicas como plataformas de produção, tecnologia de aerossol, microencapsulação, microfluídica / nanotecnologia de microfabricação e tecnologia de terapia gênica. [Algumas dessas tecnologias estão relacionadas à manipulação de sistemas biológicos & mdashe.g., Nanotecnologia & mdashand também podem ser aplicadas à geração (categoria 1) ou projeto (categoria 2) de nova diversidade biológica ou à análise de sistemas biológicos complexos (categoria 3 ).]

O esquema de classificação serve a vários propósitos importantes. Isto:

destaca semelhanças entre as tecnologias e, ao fazer isso, chama a atenção para recursos de habilitação críticos

fornece uma visão sobre alguns dos motivadores técnicos por trás da tecnologia relacionada à biologia

facilita previsões sobre futuras tecnologias emergentes e,

fornece uma visão sobre a base para complementaridades ou sinergias entre tecnologias e, como tal, facilita a análise de interações que levam a fins benéficos ou potencialmente malévolos.

As limitações do esquema de classificação incluem o fato de que ele é baseado em um número relativamente pequeno de tecnologias relevantes (ou seja, o comitê & rsquos

lista de tecnologias pode ser tendenciosa e é inevitavelmente incompleta) e o reconhecimento de que há muitas maneiras de categorizar essas tecnologias. Como reflexo do último dilema, o comitê concluiu que algumas das tecnologias discutidas neste capítulo poderiam ter sido classificadas em mais de uma categoria. A atribuição da categoria nestes casos foi guiada pela natureza das aplicações particulares que o comitê tinha em mente ao considerar cada uma das tecnologias relevantes.

Os exemplos abaixo servem como um conjunto finito de tecnologias futuras que representam e ilustram cada uma das quatro categorias. Para cada exemplo, as seguintes questões são abordadas: o propósito da tecnologia, seu estado da arte atual e aplicações futuras. A cobertura dessas questões para cada uma das tecnologias não pretende ser exaustiva. As tecnologias abordadas neste capítulo incluem não apenas aquelas que abrem novas possibilidades para a criação de novos ou melhores agentes biológicos, mas também aquelas que expõem novas vulnerabilidades (ou seja, alvos para ataque biológico). Os detalhes são limitados aos necessários para uma explicação clara da plausibilidade de uso.

1. AQUISIÇÃO DE NOVAS DIVERSIDADE BIOLÓGICA OU MOLECULAR

Dada a clara capacidade de pelo menos alguns micróbios e vírus evoluírem rapidamente, adquirirem novos genes e alterarem seu comportamento, pode parecer razoável que ao longo de centenas de milhares de anos todos os agentes biológicos concebíveis tenham sido & ldquobuilt & rdquo e & ldquotestados & rdquo e que os agentes vistos hoje são os mais & ldquos bem-sucedidos & rdquo deles. Portanto, há alguma razão para pensar que seria possível criar um agente biológico mais bem-sucedido? Possivelmente não, mas é importante entender que & ldquosucesso & rdquo, neste contexto, significa o mais capaz de sobreviver dentro, sobre ou perto das populações humanas ao longo do tempo. & ldquoSucesso & rdquo não significa necessariamente virulência ou patogenicidade, a capacidade de causar doenças ou lesões.

Os tipos de diversidade biológica básica encontrados na natureza hoje, ou aqueles que evoluíram potencialmente no mundo natural e foram testados para adequação ao longo do tempo, podem ter sido (e ainda são) limitados por certas restrições naturais, incluindo blocos de construção disponíveis, mdashnucleotídeos e aminoácidos mecanismos naturais para gerar diversidade genética e, a força e natureza das pressões seletivas ao longo do tempo. Nem houve tempo suficiente ao longo da história da Terra para que a natureza explorasse mais do que uma pequena fração da diversidade possível. 2 As tecnologias descritas nesta seção são aquelas que buscam criar um conjunto muito mais amplo e profundo de diversas moléculas biológicas, muitas das quais podem nunca ter sido geradas ou dadas uma chance justa de sucesso na natureza (embora o sucesso possa ser definido de maneiras diferentes ) 3

As técnicas foram desenvolvidas para expandir a diversidade de sequências de nucleotídeos ou aminoácidos de ácidos nucleicos ou proteínas, respectivamente (que em ambos os casos, em última análise, contêm a informação que especifica o dobramento e, portanto, a conformação de moléculas biologicamente ativas), ou para a criação de uma diversidade de pequenas moléculas com diferentes formas, tamanhos e características de carga. Além disso, alguns pesquisadores estão criando ácidos nucléicos e aminoácidos não naturais para testar e explorar possíveis restrições estruturais em moléculas com função biológica. Todas essas abordagens resultam em novos tipos de diversidade genética ou molecular que, então, requerem avaliação do potencial funcional. Esta avaliação normalmente assume a forma de um processo de triagem (ou seja, exame deliberado de todas as moléculas para uma característica ou função desejada) ou um processo seletivo (ou seja, um que impõe uma vantagem seletiva sobre as moléculas que têm uma propriedade de interesse).Embora os processos tecnológicos de avaliação e seleção de moléculas de interesse & mdashhigh-throughput triagem e seleção & mdash tenham algumas características em comum com a próxima categoria de tecnologias (ou seja, design direcionado), eles estão incluídos nesta primeira categoria por causa de seu papel facilitador crítico na exploração de diversidade molecular e biológica.

Síntese de DNA
Descrição

A síntese de DNA é uma tecnologia que permite a geração de novo de sequências genéticas que programam especificamente as células para a expressão de uma determinada proteína. Não é novo, mas os aprimoramentos técnicos continuam a aumentar a velocidade, a facilidade e a precisão com que sequências cada vez maiores podem ser geradas quimicamente. No início da década de 1970, os cientistas demonstraram que podiam criar genes sintéticos. 4 No entanto, foi a automação da síntese de novo de DNA e o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) no início da década de 1980 que gerou o desenvolvimento de uma série de metodologias em cascata para a análise da expressão, estrutura e função gênica. Nossa capacidade de sintetizar oligonucleotídeos curtos (tipicamente de 10 a 80 pares de bases de comprimento) com rapidez e precisão tem sido uma tecnologia capacitadora essencial para uma miríade de avanços, não menos dos quais tem sido o sequenciamento do genoma humano.

Os últimos anos testemunharam avanços tecnológicos notáveis ​​neste campo, particularmente no que diz respeito à síntese de novo de construções de DNA cada vez mais longas. A síntese química e ligação de grandes segmentos de um molde de DNA, seguida pela transcrição enzimática do RNA levou à criação de novo do genoma do poliovírus em 2002 (cerca de 7.500 nucleotídeos de comprimento), a partir do qual o vírus infeccioso e virulento foi res-

indicado após sua transfecção em células permissivas. 5 No ano seguinte, os cientistas anunciaram a montagem bem-sucedida do genoma de um vírus bacteriano. 6 Esforços paralelos na indústria e na academia levaram à síntese e montagem de grandes segmentos do genoma do vírus da hepatite C, dos quais moléculas de RNA competentes para replicação foram resgatadas. Esses estudos levantaram preocupações na mídia de que organismos maiores e mais complexos, como o vírus da varíola (que tem aproximadamente 186.000 pares de bases), possam estar ao alcance. 7

A tecnologia de síntese de DNA é atualmente limitada pelo custo e tempo envolvidos para criar construções de DNA longas de alta fidelidade, bem como por sua alta taxa de erro. As estimativas atuais para gerar até mesmo oligonucleotídeos simples são de pelo menos 0,10 por base (incluindo a síntese dos oligonucleotídeos mais correção de erro). 8 Consulte a Figura 3-1.

FIGURA 3-1 Custo por base de sequenciamento e síntese.

FONTE: Apresentação de Rob Carlson ao comitê, fevereiro de 2004.

Estado da Arte Atual

Vários estudos recentes demonstraram passos importantes para tornar a síntese de genes facilmente acessível e acessível para pesquisadores com orçamentos pequenos, diminuindo seu custo e melhorando sua taxa de erro. 9 Por exemplo, em dezembro de 2004, quando este comitê deliberou sobre sua carga, os cientistas descreveram uma nova tecnologia baseada em microchip para a síntese multiplex semiautomática de oligonucleotídeos longos. 10 Os pesquisadores usaram a nova tecnologia para sintetizar todos os 21 genes que codificam proteínas do E. coli Subunidade ribossômica 30S. Quase simultaneamente, outro grupo de pesquisa descreveu uma nova abordagem para reduzir erros em mais de 15 vezes em comparação com as técnicas convencionais de síntese de genes, produzindo DNA com um erro por 10.000 pares de bases. 11

Aplicações Futuras

O desenvolvimento da capacidade de síntese do DNA gerou grande interesse na fabricação de construções cada vez maiores, incluindo circuitos genéticos, 12 a engenharia de vias bioquímicas inteiras 13 e, como mencionado acima, a construção de pequenos genomas. 14 Como um exemplo específico de uma potencial aplicação benéfica futura da síntese de DNA, um grupo de pesquisa descreveu um método para sintetizar terpenóide, um produto natural usado em sabores comerciais, fragrâncias e terapêuticas antimaláricas e anticâncer, usando construções de DNA recombinante. 15 Os terpenóides são normalmente isolados do tecido vegetal e só podem ser recuperados em pequenas quantidades. A tecnologia de síntese de DNA pode ser usada como um método alternativo para a produção de compostos de alto valor.

A tecnologia de síntese de DNA pode permitir a síntese rápida e eficiente de genomas virais e de outros patógenos, seja para vacinas ou pesquisa e desenvolvimento terapêutico, ou para fins malévolos ou com consequências não intencionais. Dados os últimos riscos, em 2004, George Church (Harvard Medical School, Cambridge, MA) elaborou uma proposta para diminuir os riscos de risco biológico (ou seja, criando vírus humanos quase extintos, como a poliomielite, ou novos patógenos, como o poxvírus IL-4) enquanto minimizar o impacto na pesquisa legítima. A proposta se concentra na regulamentação do licenciamento de instrumentos e reagentes (por exemplo, restringindo a venda e manutenção de máquinas de síntese de oligonucleotídeos a entidades licenciadas) para a triagem de agentes selecionados, estabelecendo um método para testar esses licenciamentos recém-implementados e, critérios de sistemas de triagem para isenção do todo processo e estratégias para manter o custo baixo. 16 A proposta é mencionada aqui não para endossá-la, mas sim para destacar a necessidade de uma análise cuidadosa e discussão cuidadosa das questões.

DNA Shuffling
Descrição

O melhoramento genético clássico tem se provado repetidamente ao longo da história humana como um meio poderoso de melhorar os estoques de plantas e animais para atender às mudanças nas necessidades da sociedade. A descoberta do final do século 20 de endonucleases de restrição, enzimas que cortam moléculas de DNA em locais que compreendem sequências de nucleotídeos curtas específicas, e o subsequente surgimento da tecnologia de DNA recombinante forneceram aos cientistas ferramentas de alta precisão para inserir (ou remover) genes únicos nos genomas de um variedade de vírus e organismos, levando, por exemplo, à introdução de características que aumentam a produção em plantas de cultivo. 17 Mais recentemente, um modo poderoso de evolução dirigida conhecido como & ldquoDNA shuffling & rdquo & mdashalso conhecido como multigene shuffling, gene shuffling e evolução molecular dirigida in vitro & mdash tem permitido aos cientistas melhorar significativamente a eficiência com a qual uma ampla diversidade de sequências genéticas pode ser derivada. Um salto quântico na capacidade de gerar novas sequências de DNA, o embaralhamento de DNA pode ser usado para produzir grandes bibliotecas de DNA que podem então ser submetidas a triagem ou seleção para uma gama de características desejadas, como função de proteína melhorada e / ou maior produção de proteína .

O cruzamento & ldquoClassical & rdquo de um único gene começa com um conjunto & ldquoparental & rdquo de sequências relacionadas (genes, etc.) e, em seguida, cria moléculas & ldquooffspring & rdquo, que são submetidas a triagem e seleção para a prole & ldquobest & rdquo. O processo se repete por várias gerações. Com o embaralhamento de DNA, a diversidade de sequência é gerada pela fragmentação e, em seguida, pela recombinação de versões relacionadas da mesma sequência ou gene de fontes múltiplas (por exemplo, espécies relacionadas), resultando em & ldquoshuffling & rdquo das moléculas de DNA. Basicamente, permite o acasalamento simultâneo de muitas espécies diferentes. O resultado é uma coleção de mosaicos de DNA. O rearranjo que ocorre durante o processo de embaralhamento produz uma maior diversidade de sequências de progênie funcional do que pode ser produzida por uma abordagem sequencial de um único gene.

Em uma das primeiras demonstrações da tecnologia, que envolveu o embaralhamento de quatro genes evoluídos separadamente (de quatro espécies microbianas diferentes), o embaralhado & ldquohybrids & rdquo codificou proteínas com 270 a 540 vezes maior atividade enzimática do que a melhor sequência parental. 18 Mesmo se essa mesma enzima recombinada pudesse ter evoluído por meio de triagem de um único gene, o processo teria sido dramaticamente mais lento. Mas as chances são de que nunca teria evoluído. A evidência de pelo menos um estudo mostra que o melhor pai não é necessariamente o mais próximo em sequência da melhor prole quimérica e, portanto, provavelmente não representaria o melhor ponto de partida para a evolução de um único gene (ou seja, algum outro melhor

sequência parental teria sido escolhida para a evolução dirigida por um único gene). 19

Estado da Arte Atual

A tecnologia se desenvolveu rapidamente, de forma que os cientistas não estão apenas embaralhando genes únicos, eles estão embaralhando genomas inteiros. Em 2002, os biólogos usaram o embaralhamento de todo o genoma para a rápida melhoria da produção de tilosina da bactéria Streptomyces fradiae após apenas duas rodadas de embaralhamento, foi gerada uma cepa bacteriana que poderia produzir tilosina (um antibiótico) a uma taxa comparável às cepas que passaram por 20 gerações de seleção sequencial. 20 Também em 2002, uma parte do genoma do HIV foi embaralhada para criar uma nova cepa de HIV que foi capaz de se replicar em uma linha celular de macaco que anteriormente era resistente à infecção viral. 21 Em 2003, a técnica havia avançado a tal ponto que muitas sequências de DNA de mamíferos podiam ser misturadas em uma única linha de células bacterianas. Em um estudo, os cientistas embaralharam um gene de uma citocina de sete espécies de mamíferos geneticamente semelhantes (incluindo humanos) para gerar uma citocina "evoluída" que demonstrou um aumento de 10 vezes na atividade em comparação com a citocina humana sozinha. 22 Deve-se enfatizar que o poder desta tecnologia (e de qualquer procedimento gerador de diversidade) só é plenamente realizado se as moléculas geradas com as propriedades desejadas mais realçadas puderem ser identificadas e isoladas. Apesar das melhorias contínuas no rendimento dos procedimentos de triagem atuais, o uso de condições que impõem fortes pressões seletivas para a emergência de moléculas com as propriedades desejadas é muito mais eficiente para encontrar a molécula mais potente do pool.

Aplicações Futuras

Em última análise, este método molecular rápido de evolução dirigida permitirá que os biólogos gerem novas proteínas, vírus, bactérias e outros organismos com as propriedades desejadas em uma fração do tempo necessário para o melhoramento clássico e de uma maneira mais econômica. Por exemplo, virologistas estão usando DNA shuffling para otimizar vírus para terapia genética e aplicações de vacinas. 23 Os biólogos sintéticos estão usando a tecnologia para acelerar seu processo de descoberta (veja & ldquoSynthetic Biology & rdquo mais adiante neste capítulo).

Bioprospecção
Descrição 24

Bioprospecção é a busca por diversidade biológica anteriormente não reconhecida, de ocorrência natural, que pode servir como fonte de material para uso na medicina, agricultura e indústria. Esses materiais incluem projetos genéticos (sequências de DNA e RNA), proteínas e compostos biológicos complexos e os próprios organismos intactos. Os humanos exploram produtos de origem natural há milhares de anos. Mesmo que as tecnologias de alto rendimento, como a química combinatória, descritas acima, tenham praticamente revolucionado a descoberta de medicamentos, a terapêutica moderna ainda é amplamente dependente de compostos derivados de produtos naturais. Excluindo os produtos biológicos (produtos feitos de organismos vivos), 60 por cento dos medicamentos aprovados pela Food and Drug Administration e candidatos à aplicação de novos medicamentos entre 1989 e 1995 eram de origem natural. 25 Entre 1983 e 1994, mais de 60 por cento de todos os medicamentos contra o câncer aprovados e medicamentos contra o câncer no estágio de aplicação do medicamento pré-novo e 78 por cento de todos os agentes antibacterianos recém-aprovados eram de origem natural. 26 Taxol, o primeiro medicamento anticâncer de um bilhão de dólares do mundo, é derivado do teixo. 27 A artemisinina, uma das novas drogas mais promissoras para o tratamento da malária, foi descoberta como um produto natural de uma erva daninha semelhante à samambaia na China chamada absinto doce. E aspirina - indiscutivelmente um dos medicamentos mais conhecidos e usados ​​universalmente - é derivado da salicina, um glicosídeo encontrado em muitas espécies nos gêneros de plantas Salix e Populus.

A bioprospecção não se limita às plantas, nem a descoberta de drogas sua única aplicação. Mais recentemente, com o uso de métodos de detecção molecular, os cientistas descobriram um número impressionante de formas de vida microbiana anteriormente não reconhecidas e não caracterizadas. 28 De fato, os genomas microbianos representam a maior fonte de diversidade genética no planeta & mdashdiversidade que poderia ser explorada para usos médicos, agrícolas e industriais. Os produtos naturais descobertos através da bioprospecção de endófitos microbianos & mdashmicroorganismos que residem nos tecidos de plantas vivas & mdashincluem antibióticos, compostos antivirais, agentes anticancerígenos, antioxidantes, agentes antidiabéticos, compostos imunossupressores e insetos. Com relação ao último, os bioinseticidas são um componente pequeno, mas crescente, do mercado de inseticidas. Compostos bioprospectados exibindo propriedades inseticidas potentes incluem compostos nodulispóricos para uso contra larvas de varejeira (isolado de um Nodulisporium spp. que habita a planta Bontia daphnoides) 29 e compostos de benzofurano para uso contra a lagarta do botão do abeto (isolado de um fungo endofítico não identificado de inverno-verde, Gaultheria procumbens) 30 Digno de nota, naftaleno, o ingrediente em

naftalina, é um produto importante de um fungo endofítico, Muscodor vitigenus, que habita um cipó, Paullina Paullinioides. 31

A prospecção direta de sequências de DNA e RNA que codificam novas proteínas com atividades úteis tornou-se um empreendimento científico e comercial potencialmente importante. Essa abordagem envolve pesquisas com base na expressão aleatória de milhares ou milhões de sequências, seguidas de triagem ou seleção de produtos com as atividades desejadas. 32 Às vezes, a pesquisa se concentra em famílias de sequências relacionadas que codificam produtos de interesse, que são recuperados diretamente de ambientes usando a tecnologia de amplificação de sequência. Este tipo de abordagem pode sinergizar com a tecnologia de DNA shuffling descrita acima. Incursões recentes e iniciais em & ldquocommunity genomics, & rdquo ou sequenciamento aleatório em grande escala do DNA de comunidades microbianas ambientais complexas, refletem o imenso potencial futuro desta abordagem para a descoberta e aproveitamento de atividades biológicas anteriormente inimagináveis. 33

Por exemplo, Diversa Corporation (San Diego, CA) utiliza bioprospecção de genomas microbianos para desenvolver pequenas moléculas e enzimas para os mercados farmacêutico, agrícola, químico e industrial. 34 Depois de coletar amostras ambientais de microrganismos não cultivados e extrair o material genético, os pesquisadores procuram novos genes e caminhos genéticos para produtos potencialmente úteis, como enzimas com maior eficiência e estabilidade (por exemplo, estabilidade de temperatura alta e baixa, tolerância a pH alto ou baixo, alta ou baixa tolerância ao sal). As amostras são coletadas em ambientes que variam de fontes térmicas a locais industriais contaminados e gelo marinho super-resfriado.

A bioprospecção também foi aplicada à descoberta de agentes microbianos em esforços para compreender melhor a diversidade de micróbios no ambiente que podem servir como patógenos humanos se houver oportunidade. Argumentou-se que, ao examinar deliberadamente os tipos de vetores e reservatórios que existem em um ambiente local para micróbios anteriormente não reconhecidos, novos agentes podem ser identificados muito antes de serem descobertos como patógenos humanos, animais ou vegetais, fornecendo assim um alerta precoce do potencial agentes causadores de doenças. 35 No mínimo, essas pesquisas poderiam expandir nossa apreciação da diversidade microbiana e da função microbiana inferida. 36 Por exemplo, em 2002, usando uma abordagem de PCR de amplo alcance (ou seja, usando locais de priming conservados para um grupo de alvos de sequência relacionados, em oposição a primers específicos para alvos únicos únicos), os cientistas descobriram quatro novos Bartonella Sequências de DNA em 98 espécimes de artrópodes (pulgas, piolhos e carrapatos) do Peru, três das sequências foram significativamente diferentes das anteriormente caracterizadas Bartonella espécies. 37 Bartonella s são bactérias transmitidas por vetores associadas a numerosas infecções humanas e animais. 38 Em vez de ter qualquer conhecimento clínico imediato

implicações, este estudo ilustra o poder desta abordagem genérica, bem como nossa compreensão incompleta de Bartonella diversidade.

Estado da Arte Atual

Os métodos atuais incluem a recuperação de micróbios usando métodos baseados em cultivo, pesquisas sorológicas de hospedeiros potenciais, extração / separação / purificação de moléculas com as propriedades desejadas, amplificação de famílias de sequências de ácido nucleico relacionadas usando PCR de amplo alcance (e técnicas semelhantes), clonagem shotgun. e sequenciação de DNA ou cDNA em massa de ambientes de interesse, e o uso de métodos de hibridização subtrativa 39 para enriquecer para novas sequências de ácido nucleico em hospedeiros ou ambientes.

Aplicações Futuras

Pode-se considerar abordagens baseadas em cultivo molecular e tradicional para examinar hospedeiros, como morcegos frugívoros e pequenos roedores, que já são conhecidos por servir como reservatórios para importantes patógenos microbianos humanos (vírus Hendra e Nipah, Borrelia spp. e outros gêneros, respectivamente). Conforme descrito acima, os benefícios potenciais associados à descoberta de novos produtos e da diversidade genética microbiana são inúmeros.

Química Combinatória: Gerando Diversidade Química
Descrição

Química combinatória refere-se a tecnologias e processos usados ​​para a criação rápida de um grande número de compostos sintéticos (& ldquolibraries & rdquo), normalmente para fins de triagem de atividade contra alvos biológicos de drogas (ver & ldquoHigh-throughput Screening & rdquo). Considerando que a síntese de DNA permite a aquisição de diversidade de sequência genética, essas técnicas permitem a geração de bibliotecas de compostos químicos com uma diversidade de formas, tamanhos e características de carga, que podem ser de interesse por suas várias habilidades de interagir e se ligar biologicamente proteínas ativas ou complexos macromoleculares, alterando assim as propriedades biológicas dessas proteínas e complexos. As técnicas de química combinatória podem ser usadas para criar uma ampla gama de quimiotipos ou motivos moleculares, variando de grandes compostos policíclicos de natureza peptídica a compostos menores, presumivelmente mais semelhantes a drogas. Inicialmente, acreditava-se que, quando usadas em combinação com tecnologias de triagem de alto rendimento, as técnicas combinatórias seriam dramaticamente

acelere o processo de descoberta de medicamentos e, ao mesmo tempo, reduza os custos iniciais associados ao esforço de descoberta de medicamentos. Embora isso ainda não tenha sido comprovado, a maioria das empresas farmacêuticas ainda está investindo pesadamente em química combinatória e está explorando o desenvolvimento e a implementação de novos métodos para criar bibliotecas adicionais de compostos. Uma tendência recente observada na indústria farmacêutica é a mudança do desenvolvimento de bibliotecas de triagem gerais grandes e sem foco para bibliotecas menores e menos diversas para triagem contra um alvo específico ou família de alvos relacionados.

As origens deste novo ramo da química remontam ao início dos anos 1960, quando foram desenvolvidos métodos para a síntese de peptídeos em fase sólida. 40 Isso envolveu anexar um aminoácido a um suporte sólido (ou seja, grânulos de resina plástica) e, em seguida, adicionar resíduos de aminoácidos, um por um de forma gradual através da criação de ligações químicas de peptídeo covalente, até que o produto de peptídeo desejado seja criado. O polipeptídeo final é liberado quebrando quimicamente sua ligação com o suporte sólido e lavando-o para liberá-lo. 41 As modificações subsequentes do processo de síntese em fase sólida aumentaram muito a capacidade de gerar um grande número de peptídeos com sequências de aminoácidos específicas. 42 Peptídeos individuais foram sintetizados nas extremidades de & ldquopins & rdquo que foram espacialmente orientados em uma matriz bidimensional projetada para combinar com os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Isso reduziu a escala do processo e facilitou muito a síntese paralela de um grande número de peptídeos. Uma modificação adicional da técnica aumentou a capacidade de criar uma diversidade de sequências de peptídeos ao incorporar uma abordagem combinatória. 43 Neste caso, a resina de fase sólida contendo o peptídeo sintético nascente foi encerrada em uma malha, ou "saco de". assim, permitiu a síntese paralela de muitos peptídeos diferentes, cada um em seu próprio saquinho de chá. No entanto, ao misturar a resina de diferentes saquinhos de chá após cada adição passo a passo individual de um resíduo de aminoácido, bibliotecas de peptídeos combinatórias envolvendo uma grande diversidade de sequências de aminoácidos poderiam ser facilmente geradas, em que cada grânulo de resina carrega um peptídeo individual com um aminoácido único. sequência de ácido. 44

Depois que os compostos são sintetizados e uma biblioteca é construída, uma estratégia de seleção ou triagem é necessária para identificar compostos exclusivos de interesse para as ciências biológicas. O método mais óbvio envolve o isolamento por afinidade do peptídeo de interesse em uma molécula alvo imobilizada, seguido pela liberação do peptídeo e análise utilizando combinações de cromatografia em fase gasosa, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear (RMN). Também é possível determinar a estrutura dos compostos ainda

ligado à resina, usando técnicas analíticas & ldquoon-bead & rdquo, como análise de infravermelho, NMR de fase de gel, espectrometria de massa de tempo de voo de ionização de dessorção a laser assistida por matriz, espectrometria de massa por eletrospray e detecção de nitrogênio por quimioluminescência por HPLC. 45

Embora a determinação direta da estrutura, conforme descrito no parágrafo anterior, funcione bem para pequenas bibliotecas, essas técnicas geralmente não são aplicáveis ​​a grandes bibliotecas baseadas em mistura. Para bibliotecas, foram desenvolvidas várias estratégias que governam a sequência de reação, anexando um produto químico legível & ldquotag & rdquo ao grânulo enquanto a molécula está sendo sintetizada. Uma das primeiras abordagens de marcação empregou o uso de oligonucleotídeos. 46 Nessa abordagem, para cada aminoácido adicionado à cadeia do peptídeo, um conjunto específico de oligonucleotídeos foi adicionado a uma cadeia separada que foi anexada ao mesmo grânulo. As técnicas de PCR e sequenciação de DNA foram então utilizadas para descodificar a estrutura do péptido. Inúmeras técnicas e agentes de marcação adicionais foram desenvolvidos desde então. 47

Estado da Arte Atual

A síntese paralela de fase de solução está se tornando a técnica de química combinatória de escolha na indústria farmacêutica, impulsionada principalmente pelos avanços em automação de laboratório, instrumentação e informática. Os compostos podem ser sintetizados como compostos discretos únicos por vaso de reação ou como misturas de compostos em um único vaso de reação, portanto, muitos dos mesmos princípios descritos acima para os princípios de fase sólida (ligado à resina) também são aplicáveis ​​aqui. A principal vantagem da química combinatória de fase de solução reside no aumento do número de reações / transformações químicas que podem ser acessadas, aumentando assim muito a gama de quimiotipos (andaimes químicos) que podem ser criados.

Os primeiros relatórios de técnicas de química combinatória de fase de solução envolveram o uso de uma reação multicomponente comum, denominada reação Ugi, na qual um isocianeto, um aldeído, uma amina e um ácido carboxílico são combinados em um único vaso de reação para criar um único produto principal. Usando essa abordagem sintética associada a técnicas avançadas de análise de dados, os cientistas foram capazes de identificar compostos com o efeito biológico desejado após sintetizar apenas um subconjunto de 400 compostos dos 160.000 produtos possíveis. Isso representa um aumento de 400 vezes na eficiência de descoberta em relação às abordagens convencionais.

A tendência atual na química de fase de solução paralela está se inclinando para o desenvolvimento de arranjos menores (12 a 96 compostos) de composições químicas simples a moderadamente complexas. À medida que a robótica e a instrumentação de laboratório necessárias para a síntese paralela se tornam mais

fordable e facilmente acessível, a tecnologia está sendo transferida para laboratórios de química médica básica e se tornando instrumental na otimização de compostos principais (ou seja, compostos que mostram potencial para serem desenvolvidos em drogas). Tais esforços são idealmente realizados com o conhecimento da estrutura da molécula alvo, geralmente obtida pela aplicação de cristalografia de raios-X ou técnicas de RMN. As relações estrutura-atividade são determinadas como compostos principais, identificados inicialmente por meio da triagem de grandes bibliotecas de compostos, são modificados em locais específicos e o impacto da modificação química nas propriedades biológicas desejadas do composto é determinado.

A pureza e a identidade dos compostos produzidos combinatorialmente têm sido uma fonte de grande discussão e avanço tecnológico recente, uma vez que, para que quaisquer dados significativos sejam produzidos a partir de um ensaio biológico, a pureza do composto de interesse deve ser a mais alta possível. 48 A atividade do composto também deve ser confirmada por ressíntese da molécula específica e repetição dos ensaios de atividade biológica.

Aplicações Futuras

As técnicas de química combinatória não são úteis apenas para a descoberta e desenvolvimento de drogas, mas estão sendo usadas na busca de melhores supercondutores, melhores fósforos para uso em monitores de vídeo (fósforos são substâncias que emitem luz), melhores materiais para uso em computadores magnéticos e outros tipos de armazenamento dispositivos e melhores biossensores para a detecção de moléculas importantes do ponto de vista médico e toxinas ambientais. Abordagens combinatórias têm sido usadas para desenvolver um sensor de & ldquonose & rdquo capaz de detectar e distinguir entre sete solventes comuns (tolueno, clorofórmio, tetrahidrofurano, acetona, acetato de etila, etanol e metanol). 49

Usando métodos combinatórios e de alto rendimento, a indústria farmacêutica sintetiza e rastreia vários milhões de novos ligantes potenciais anualmente. Embora a maioria das empresas tenha pouco uso para as dezenas de milhares desses compostos identificados a cada ano como tóxicos, alguns podem ter potencial como armas bioquímicas (Capítulo 1). 50 Embora a maioria das informações derivadas da tecnologia combinatória e de alto rendimento seja mantida em bancos de dados proprietários, um novo banco de dados público recentemente proposto como parte do National Institutes of Health (NIH) Roadmap levanta preocupações sobre o acesso público a informações de uso duplo (Capítulo 1, caixa 1-1). O esforço de descoberta do NIH Roadmap é particularmente preocupante a esse respeito, por causa dos planos para otimizar compostos líderes que demonstraram ser capazes de atingir proteínas celulares específicas. O objetivo não é desenvolver agentes terapêuticos, mas fornecer uma série de reagentes, facilitando

exploração adicional da função da proteína e biologia de sistemas. 51 Tais compostos podem ser venenos relativamente potentes.

Embora as tecnologias aplicadas em química combinatória não sejam excessivamente complexas, uma ampla variedade de automação e instrumentação de laboratório é necessária para realizar uma campanha de química combinatória eficaz.

Rastreio de alto rendimento 52
Descrição

A triagem de alto rendimento (HTS) se refere ao processo de examinar um grande número de diversos compostos biomoleculares ou químicos de uma maneira rápida e eficiente para propriedades de interesse. Essas tecnologias são essenciais para alcançar qualquer benefício da construção de grandes e diversas bibliotecas de compostos, uma vez que são usadas para selecionar um composto particular com as propriedades desejadas. Essas propriedades podem incluir atividades bioquímicas ou enzimáticas desejadas de um agente terapêutico potencial ou toxicidade em tal agente que, em circunstâncias usuais, se desejaria evitar. Os avanços nas tecnologias de triagem miniaturizadas, bioinformática, robótica e uma variedade de outras tecnologias contribuíram para a melhoria da eficiência do ensaio biológico que caracteriza o HTS. Em contraste com este paradigma, no qual uma grande biblioteca de compostos (ou seja, amostras) é testada para uma atividade específica ou conjunto de atividades, uma variação no tema HTS envolve o teste de uma única amostra biológica para uma ampla variedade de atividades. O melhor exemplo disso é o uso de microarranjos de DNA ou oligonucleotídeo - também conhecidos como chips de DNA. Estes são usados ​​rotineiramente em pesquisas básicas e aplicadas para facilitar a triagem e monitoramento em larga escala dos níveis de expressão gênica, função gênica e variação genética em amostras biológicas, e para identificar novos alvos de drogas.

O processo de triagem de um grande número de compostos contra potenciais alvos de doenças é caracterizado por uma coleção de tecnologias que se esforçam para aumentar a eficiência do ensaio biológico por meio da aplicação de formatos de triagem miniaturizados e manuseio avançado de líquidos, detecção de sinal, robótica, informática e uma variedade de outros tecnologias. Nos últimos anos, a indústria testemunhou uma evolução nas capacidades de triagem, resultando na capacidade de um usuário de triar mais de 100.000 compostos por dia para potencial atividade biológica. Avaliar mais de 1 milhão de compostos para propriedades biológicas (ou várias outras) em uma campanha de triagem agora é comum na indústria farmacêutica.

Estado da Arte Atual

O HTS eficaz depende de ensaios robustos que podem detectar e então traduzir atividades biológicas ou outras em um formato que pode ser prontamente interpretado. Uma grande variedade de ensaios está atualmente em uso, incluindo:

ensaios colorimétricos livres de células ou quimioluminescência

ensaios de transferência de energia de ressonância de fluorescência livre de células

ensaios de gene repórter baseados em células, geralmente com uma leitura enzimática

ensaios de imagem de fluorescência baseados em células

Ensaios de NMR, que envolvem a identificação de ligantes de moléculas pequenas para alvos de receptores macromoleculares

ensaios de cromatografia de afinidade

Microarrays de DNA (arranjos de alta densidade de clones de DNA de fita dupla (cDNA) ou oligonucleotídeos que servem como sondas idênticas ou complementares, respectivamente, para genes específicos, transcritos ou sequências de genoma) e

Outros tipos de microarranjos, incluindo arranjos de alta densidade de anticorpos, aptâmeros de ácido nucleico ou peptídeo, antígenos (proteína ou lipídio), complexos de antígeno de peptídeo MHC 53 e células intactas.

Direções futuras

Avanços futuros em HTS & mdashs tais como o desenvolvimento de ensaios de uma etapa e miniaturização aumentada & mdash continuarão a aumentar o rendimento e reduzir o custo dos ensaios HTS e podem, eventualmente, permitir o monitoramento simultâneo de múltiplos endpoints (por exemplo, biológico, toxicológico) em uma ampla variedade de alvos . Uma análise do cenário atual de tecnologia HTS revela o seguinte como oportunidades potenciais e direções futuras:

desenvolvimento adicional de ensaios de uma etapa (homogêneos)

desenvolvimento de hardware aprimorado de triagem primária

miniaturização como meio de aumentar o rendimento e diminuir o custo

melhorias nas capacidades e eficiência dos sistemas robóticos nas ciências da vida

aplicação de HTS para liderar a otimização de compostos e,

novas abordagens para a identificação de alvos biologicamente relevantes.

Em suma, os ensaios e tecnologias HTS irão permear novos setores nas ciências da vida, afetando a produtividade e a velocidade dos avanços e descobertas nesses diversos setores. A relação custo-eficácia dos ensaios e tecnologias HTS irá melhorar, de modo que as tarefas que antes eram consideradas impraticáveis ​​se tornarão bastante tratáveis. Juntamente com métodos para gerar sequência aprimorada e diversidade estrutural além da vista na natureza, esses ensaios e tecnologias permitirão a identificação e seleção de novas moléculas com funções biológicas importantes, com ramificações para todas as ciências da vida.

2. DESIGN DIRIGIDO

Existem outras tecnologias, além das descritas na categoria de tecnologias anterior, que procuram gerar novos tipos de diversidade genética ou molecular. No entanto, em contraste com as tecnologias da primeira categoria, essas abordagens de & ldquodirected design & rdquo são mais deliberadas e contam com o conhecimento preexistente com relação ao que precisa ser criado.

Projeto Racional de Drogas
Descrição

Os métodos descritos acima, em que uma grande biblioteca de diversos compostos químicos são selecionados usando métodos HTS para identificar um número menor de compostos líderes potenciais com atividades desejadas, estão gradualmente sendo aprimorados por abordagens menos empíricas que são baseadas em uma maior compreensão dos sistemas biológicos ( isto é, interações alvo: ligante), identificação de moléculas alvo específicas e determinação da estrutura de uma molécula alvo cuja atividade se mostrou crítica para a produção de uma doença específica ou para a manutenção da saúde. Esse conhecimento estrutural cresceu rapidamente na última década devido aos avanços na cristalografia de raios-x, tecnologias de NMR e técnicas computacionais associadas que agora permitem a rápida determinação da estrutura de até mesmo grandes proteínas ou moléculas de ácido nucleico em resolução de nível atômico. Uma rápida pesquisa do Protein Data Bank (PDB), 54 o recurso global para todas as estruturas macromoleculares biológicas publicamente disponíveis, revela que o número de estruturas depositadas anualmente testemunhou um aumento de quase 10 vezes entre 1994 (3.091) e 2004 ( 28.992) consulte a Figura 3-2. Com tal conhecimento estrutural de alvos em mãos, os químicos podem buscar racionalmente o projeto de novos compostos químicos que se ligam a locais selecionados na superfície dessas moléculas alvo ou imitam a estrutura da molécula alvo e, assim, competem pela ligação a uma molécula receptora .

FIGURA 3-2 Crescimento do número de estruturas depositadas por ano (cinza) e participações totais do PDB (preto) desde a fundação do banco.

FONTE: Reimpresso de Dutta, S. e H.M. Berman. 2005. Grandes complexos macromoleculares no banco de dados de proteínas: um relatório de status. Estrutura 13 (3): 382, ​​com permissão da Elsevier.

Um excelente exemplo de convergência tecnológica existe com o campo de em sílico, ou virtual, triagem. Esta metodologia capitaliza os avanços descritos acima no que diz respeito à determinação de estruturas para moléculas alvo, bem como avanços em hardware de computador e algoritmos de informática química especializados, os chamados programas de encaixe e pontuação. Muitos milhares de compostos virtuais podem ser avaliados de forma rápida e eficaz quanto à complementaridade potencial da molécula alvo, 55 como um pré-requisito para a atividade biológica, antes de qualquer química real ser realizada ou ensaios biológicos serem realizados. O produto desse esforço computacional é, portanto, uma molécula projetada racionalmente que, uma vez sintetizada, pode servir como um composto líder no processo de descoberta de drogas.

Estado da Arte Atual

Embora o design racional de medicamentos tenha recebido grande atenção da indústria farmacêutica e seja reconhecido como tendo um grande potencial para o futuro, a maioria dos esforços atuais da indústria de descoberta de medicamentos refletem uma combinação de design racional de compostos auxiliado por estrutura e a triagem HTS de bibliotecas de diversos compostos. Assim, o uso da estrutura, quando conhecido para um determinado alvo molecular, pode entrar em jogo uma vez que um composto principal tenha sido identificado por meio de um processo HTS e esforços sejam feitos para otimizar esse chumbo e melhorar a atividade biológica ou propriedades farmacológicas do composto. O campo hoje é tal que a falta de conhecimento da estrutura de uma molécula-alvo é vista como um impedimento crítico para o desenvolvimento de uma nova droga.

Em contraste com o projeto racional da terapêutica de moléculas pequenas, o projeto racional de compostos terapêuticos à base de ácido nucleico é muito mais fácil em que tais compostos são sintetizados para serem complementares à sequência de ácido nucleico alvo. Embora a terapêutica de ácido nucleico com base em oligonucleotídeos antisense ou ribozimas, RNAs enzimaticamente ativos que clivam sequências alvo de RNA específicas, tenham sido perseguidos por mais de uma década, sua promessa ainda não foi realizada devido às dificuldades em entregar compostos estáveis ​​aos locais desejados. Avanços significativos estão ocorrendo agora, no entanto, no fornecimento de propriedades farmacológicas desejadas para compostos à base de siRNA e oligonucleotídeos antisense de morfolino.

Aplicações Futuras

Como a estrutura de um maior número de moléculas-alvo potenciais são identificados no futuro e como ambos em sílico métodos de triagem e síntese química continuam a avançar, parece claro que uma maior confiança

é provável que se desenvolva nesses tipos de abordagens. Uma maior aplicação de abordagens de design racionais e baseadas em estrutura provavelmente acelerará significativamente o processo de descoberta. Embora existam implicações de uso duplo para tais tecnologias, como há para quase qualquer tecnologia avançada de ciências da vida, a infraestrutura necessária para buscar tal projeto baseado em estrutura de novos compostos biologicamente ativos provavelmente limitará seu uso à indústria farmacêutica legítima para um número de anos. Deve-se notar, no entanto, que, como os bancos de dados de sequência de nucleotídeos que estão abertos ao público, um número crescente de estruturas de proteínas está sendo colocado no domínio público. É provável que essa tendência continue e até mesmo se acelere, e à medida que os requisitos de hardware e software de computador para visualizar e interpretar tais estruturas se tornam cada vez mais simples, essas abordagens se tornarão cada vez mais acessíveis a cientistas fora da indústria farmacêutica.

Biologia sintética
Descrição

O campo incipiente da biologia sintética com 5 anos de idade & mdash, que está atraindo engenheiros e biólogos em igual medida & mdash, significa coisas diferentes para pesquisadores diferentes. Os engenheiros veem isso principalmente como uma forma de fabricar micróbios úteis para fazer o que nenhuma tecnologia atual pode fazer (ou seja, eles veem isso como uma disciplina de engenharia). Os biólogos veem isso como uma nova maneira poderosa de aprender sobre os princípios básicos da função celular.

Ao contrário dos biólogos de sistemas (veja a descrição mais adiante neste capítulo), que adotam uma abordagem mais ampla da biologia por meio da análise de uma grande quantidade de dados sobre a atividade simultânea de milhares de genes e proteínas, os biólogos sintéticos reduzem os mesmos sistemas a seus componentes mais simples. Eles criam modelos de circuitos genéticos, constroem os circuitos, vêem se funcionam e os ajustam caso não funcionem, aprendendo os princípios básicos da biologia no processo. Examinando padrões simples de expressão gênica e tratando pedaços de DNA como módulos, que, como Legos & trade, podem ser unidos, biólogos sintéticos constroem o que são efetivamente placas lógicas bioquímicas que controlam tanto a atividade intra quanto extracelular.

Como a natureza molecular de muitas reações celulares é apenas parcialmente compreendida, a maioria dos circuitos genéticos sintéticos requer um refinamento empírico considerável após o trabalho computacional inicial. Alguns cientistas usam DNA shuffling para agilizar o processo empírico. Depois de inserir circuitos de DNA mutado nas células e selecionar aquelas células (e os circuitos nelas contidos) que tiveram o melhor desempenho, os pesquisadores podem desenvolver um produto eficaz em apenas algumas gerações. 56

Estado da Arte Atual

Um dos objetivos da área é transformar bactérias em minúsculos computadores programáveis. Como os computadores eletrônicos, os circuitos bacterianos vivos usariam circuitos lógicos analógicos e digitais para realizar cálculos simples. Por exemplo, os pesquisadores estão trabalhando para desenvolver unidades modulares, como sensores e atuadores, dispositivos de entrada e saída, circuitos genéticos para células de controle e um chassi microbiano para montar essas peças. Se forem bem-sucedidos, um & ldquoregistry de partes biológicas & rdquo permitirá que os pesquisadores vão até o congelador, consigam uma parte e conectem-na. 57 O poder de computação das células programáveis ​​provavelmente nunca rivalizará com o de suas contrapartes eletrônicas. Em vez disso, a beleza da biologia sintética reside no que as células vivas podem fazer.

Em 2000, um & ldquocircuit & rdquo genético foi criado em E.coli que fez as células piscarem como um farol. 58 O circuito, que era chamado de & ldquothe repressilator & rdquo, era composto por três genes repressores, um dos quais ativava um gene para proteína fluorescente verde (GFP), que, quando ativado, emite um brilho verde. Três anos depois, outro grupo de pesquisa criou um circuito genético elaborando um & ldquotoggle switch & rdquo que poderia oscilar o circuito e alterar seu padrão dependendo das condições de crescimento. 59 Usando essa técnica, os investigadores desenvolveram posteriormente um procedimento para reengenharia de uma proteína bacteriana que se liga a TNT (um explosivo) e que, quando ligada, ativa um circuito gênico que produz GFP. 60 Isso demonstra um esforço inicial para projetar organismos que operam como sentinelas biológicas, localizando explosivos ou detectando a presença de armas biológicas.

Em 2004, pesquisadores em Israel desenvolveram um protótipo de & ldquoDNA computer & rdquo com a capacidade de analisar logicamente indicadores de doença de mRNA in vitro (ou seja, neste caso, sinais precoces de câncer de próstata e de pulmão) e controlar a administração de moléculas de ssDNA biologicamente ativas, incluindo drogas. 61 O procedimento é relativamente inócuo, exigindo a injeção de uma quantidade muito pequena de fluido contendo bilhões de nanopartículas, cada uma operando como um minúsculo computador interrogando efetivamente a célula e detectando a presença de marcadores de DNA de diagnóstico (por exemplo, sequências de mRNA mutadas ou mRNA subexpresso ou superexpresso). Se os marcadores estiverem presentes, a nanopartícula envia um ácido nucleico curto terapêutico que pode afetar o nível de expressão do gene.

Aplicações Futuras

A tecnologia de biologia sintética tem muitas aplicações potenciais, incluindo desenvolvimento de bactérias que podem detectar assinaturas de agentes químicos ou biológicos, bactérias de engenharia que podem limpar poluentes ambientais e organismos ou compostos de engenharia que podem diagnosticar doenças ou consertar genes defeituosos. Embora os esforços iniciais sejam focados em células microbianas, alguns biólogos sintéticos imaginam um dia em que serão capazes de

Gram células-tronco adultas para fins terapêuticos (por exemplo, para consertar um coração danificado).

O especialista em ética da engenharia Aarne Vesilind (Bucknell University) é um dos muitos cientistas que promovem a ideia de que biólogos sintéticos e eticistas realizam uma conferência semelhante a Asilomar sobre biologia sintética & mdashmuch como a realizada no início da pesquisa de engenharia genética em meados da década de 1970 & mdash para definir bioengenheiros & rsquo & ldquores responsabilidades para com a sociedade & rdquo caso esses organismos modificados sobrevivam fora do laboratório, causando danos à saúde humana ou ao meio ambiente. 62 Vários esforços já foram planejados para examinar as implicações desse tipo de trabalho, incluindo um estudo financiado por uma fundação envolvendo três instituições, duas das quais desempenham um papel importante na pesquisa em genômica sintética. 63 Além disso, o National Science Advisory Board for Biosecurity identificou a genômica sintética como uma área de interesse principal. Muitas das mesmas questões são levantadas pela engenharia genética de vírus.

Engenharia Genética de Vírus
Descrição

Conforme descrito acima, o desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante e a capacidade de manipular sequências de DNA em espécies bacterianas, como E. coli resultou ao longo do tempo na capacidade de inserir quase qualquer gene desejado em quase qualquer tipo de célula procariótica ou eucariótica. Colocar o DNA inserido sob controles transcricionais apropriados, e a proteína codificada por ele sob controle translacional apropriado, permite que o gene direcione a expressão de quase qualquer tipo de proteína: um marcador fluorescente (como no GloFish descrito no Capítulo 1), uma enzima que pode funcionar como um repórter, um marcador de resistência a antibióticos ou mesmo uma toxina. Usando técnicas muito semelhantes, os genes de interesse (sujeitos a restrições de tamanho) podem ser introduzidos nos genomas de muitos tipos diferentes de vírus de DNA, variando de adenovírus a herpesvírus. Esses recursos levantam questões óbvias e convincentes de uso duplo.

A introdução de sequências gênicas heterólogas nos genomas de vírus de RNA, ou outros tipos de modificações nos genomas de RNA desses vírus, apresentam um conjunto especial de dificuldades técnicas devido ao fato de o material genético ser RNA, que é menos estável que o DNA. e não tão suscetível às técnicas de splicing genético que tornaram a tecnologia do DNA recombinante tão versátil. No entanto, isso tem sido realizado para um número crescente de tipos diferentes de vírus de RNA. Além disso, dado o pequeno tamanho desses genomas de RNA, provou ser possível sintetizar completamente de novo todo o material genético necessário para recuperar partículas virais totalmente infecciosas com infectividade, virulência e potencial de replicação quase do tipo selvagem.

Os vírus de RNA vêm em vários tipos, dependendo do número de fitas de RNA em cada molécula de seu genoma (isto é, moléculas de RNA de fita simples ou dupla) e do número de segmentos genômicos (um ou mais). A engenharia genética de vírus de RNA de fita simples em que o RNA é de polaridade positiva (isto é, o mesmo sentido que o RNA mensageiro que codifica as proteínas virais) provou ser mais direta. É sabido há muitos anos que o RNA genômico isolado de vírus de RNA de fita positiva, como o poliovírus, é intrinsecamente infeccioso. Quando transfectado (ou seja, introduzido) em uma célula permissiva na ausência de quaisquer proteínas acompanhantes, tal RNA levará diretamente à síntese das proteínas virais, que irão então começar a montar a maquinaria replicativa necessária para fazer cópias adicionais do RNA como bem como mais proteína viral, levando, em última instância, à montagem e ao "sequestro" de vírus totalmente infeccioso, que geralmente é liberado da célula.

Para manipular o genoma do RNA viral, cientistas da era da biologia molecular desenvolveram métodos enzimáticos eficientes para criar cópias de DNA complementar (cDNA) do RNA genômico viral usando enzimas de transcriptase reversa codificadas por retrovírus. Este cDNA pode ser projetado para ter extremidades & ldquosticky & rdquo, permitindo que ele seja clonado molecularmente em E. coli, no qual pode ser manipulado por todos os métodos modernos disponíveis. Isso pode incluir a deleção de sequências de codificação de proteínas, a criação de deleção ou mutações pontuais, ou mesmo a introdução de sequências de codificação de proteínas completamente novas. O cDNA modificado pode então ser colocado a jusante de uma sequência de promotor apropriada para uma polimerase de RNA dependente de DNA e um novo genoma de RNA viral modificado por engenharia molecular transcrito de forma eficiente em uma reação de transcrição in vitro. O RNA transcrito pode então ser transfectado de volta para uma célula permissiva e, se as mutações introduzidas forem compatíveis com a viabilidade contínua do vírus, darão origem a novos vírus infecciosos.

O processo pelo qual os virologistas usam esse método, envolvendo a conversão da sequência genética do vírus de RNA em DNA e de volta em RNA, geralmente para avaliar o impacto das mutações no ciclo de vida viral ou nas propriedades patogênicas, é conhecido como & ldquoreverse engenharia genética. & rdquo Essa abordagem é amplamente usada por virologistas moleculares de fita positiva. Realizado pela primeira vez em 1980 com poliovírus, 64 clones de cDNA infecciosos foram agora construídos para membros de muitas famílias de vírus de RNA de fita positiva, incluindo vírus do mosaico do bromo, vírus da febre amarela 65, vírus Sindbis 66, vírus da tristeza cítrica 67, 68 e arterite equina vírus. 69 No caso do vírus da hepatite C, um vírus de fita positiva no Flaviviridae, o resgate do vírus geralmente requer a injeção do RNA sintético diretamente no fígado de um chimpanzé. Por outro lado, o poliovírus totalmente infeccioso, um membro da família Picornaviridae, foi recuperado em uma reação livre de células realizada in vitro em um sistema de extrato celular otimizado.

No passado, os coronavírus, que têm os maiores genomas de todos os vírus de RNA de fita positiva (cerca de 30 quilobases de comprimento), eram difíceis de realizar a engenharia reversa por causa do tamanho e da instabilidade de seus clones de cDNA de comprimento total em vetores bacterianos. 70 No entanto, os avanços tecnológicos recentes tornaram possível a engenharia reversa até mesmo desses maiores de todos os vírus de RNA conhecidos, 71 incluindo o agente causador da síndrome respiratória aguda grave (SARS), um coronavírus anteriormente não descrito. 72

Da mesma forma, a engenharia genética reversa de vírus de RNA de fita negativa 73 tem se mostrado muito mais difícil, dado o fato de que os genomas de RNA desses vírus não funcionam diretamente como RNAs mensageiros e, portanto, não dão origem a progênie de vírus infecciosos após sua introdução em células permissivas. Esses RNAs requerem a expressão de certas proteínas virais, a fim de fazer cópias da fita positiva do genoma do RNA de fita negativa e iniciar o ciclo replicativo. A tecnologia para fazer isso foi desenvolvida pela primeira vez para o vírus da influenza A no final dos anos 1980 até o início dos anos 1990. Como os esforços anteriores com vírus de RNA de fita positiva, esses esforços não apenas melhoraram dramaticamente nossa compreensão de como esses vírus se replicam, mas também criaram os meios para manipular geneticamente genomas virais a fim de gerar novos vírus para uso como vacinas vivas atenuadas ou vetores. 74

Inicialmente, a engenharia reversa do vírus influenza exigiu o uso de vírus auxiliares, que forneceram proteínas e segmentos de RNA que os RNPs reconstituídos in vitro (ou seja, complexos de ribonucleoproteína reconstituídos contendo RNA transcrito do cDNA clonado molecularmente) precisavam para serem infecciosos após a transfecção em células. Posteriormente, foram desenvolvidos métodos alternativos para a introdução de RNPs de influenza nas células, incluindo o resgate inteiramente conduzido por plasmídeo que não exigia o envolvimento de um vírus auxiliar. 75 O último sistema baseado em plasmídeo permitiu a fácil engenharia de genomas virais com múltiplas mutações específicas. Em 2001, pelo menos um laboratório havia gerado um vírus H5N1 patogênico usando engenharia reversa. 76

Além do vírus influenza A, e conforme resumido em um artigo publicado no Journal of Virology em 1999, 77 em sua primeira década, a tecnologia foi usada para fazer engenharia reversa ou & ldquorecover & rdquo muitos outros vírus de RNA de fita negativa, incluindo vírus da raiva, 78 vírus da estomatite vesicular, 79 vírus sincicial respiratório, 80 vírus do sarampo, 81 vírus Sendai, 82 parainfluenza humana tipo 3, 83 vírus da peste bovina, 84 vírus símio, 85 vírus sincicial respiratório bovino, 86 vírus da doença de Newcastle, 87 e bunyavírus. 88

Estado da Arte Atual

Mais recentemente, conforme mencionado no Capítulo 1, a engenharia reversa tem sido usada para produzir vírus influenza A infecciosos contendo o vírus

Os genes hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) da cepa que causou a devastadora pandemia de influenza de 1918-1919 & ldquoSpanish & rdquo. Os cientistas demonstraram que o HA do vírus de 1918 confere patogenicidade aumentada em camundongos a vírus humanos recentes que de outra forma não são patogênicos em seu hospedeiro murino. HA é uma importante proteína de superfície que estimula a produção de anticorpos neutralizantes no hospedeiro, e mudanças no segmento do genoma que o codifica podem tornar o vírus resistente a anticorpos neutralizantes preexistentes, aumentando assim o potencial para epidemias ou pandemias de doenças. Além disso, os vírus de engenharia reversa que expressam HA viral de 1918 provocaram sintomas característicos da doença produzida durante a pandemia original. 89

Com o sequenciamento genético completo do vírus da influenza A H1N1, referido no Capítulo 1, alguns questionaram se esses estudos deveriam ter sido publicados 90 na literatura aberta, devido à preocupação de que os terroristas poderiam, em teoria, usar as informações para reconstruir a gripe de 1918 vírus. 91 Deve-se notar que, além da revisão científica & ldquonormal & rdquo por pares, os editores de Ciência exigiu que os autores demonstrassem que haviam obtido aprovação para publicar sua pesquisa do diretor dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças e do diretor do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. 92 Além disso, o National Science Advisory Board for Biossegurity (NSABB) foi solicitado a considerar esses documentos antes da publicação e determinou que o benefício científico do uso futuro desta pesquisa superava em muito o risco potencial de uso indevido. 93

Aplicações Futuras

A engenharia reversa do agente causador da SARS ilustra as muitas aplicações potenciais benéficas da tecnologia. Além de abrir novas oportunidades para explorar a complexidade do genoma do SARS-coronavírus, a disponibilidade de um cDNA de comprimento completo fornece um modelo genético para manipular o genoma de maneiras que permitirão o desenvolvimento rápido e racional e o teste de vacinas candidatas e terapêutica. 94 Ao mutar as muitas pequenas proteínas aparentemente expressas por este coronavírus único, os cientistas aprenderão sua função na replicação viral e / ou patogênese e potencialmente identificarão alvos úteis para esforços de descoberta de drogas.

O sistema de engenharia genética reversa da influenza A serve como um excelente exemplo do potencial dessa tecnologia para ser usada com a intenção de causar danos. Conforme resumido em um artigo de 2003 sobre o uso potencial do vírus da gripe como agente de bioterrorismo, com relação aos avanços que permitiram a produção livre de vírus auxiliar de um vírus H5N1 patogênico, o virologista Robert M. Krug (Universidade do Texas, Austin) escreveu :

Há todas as razões para acreditar que as mesmas técnicas de DNA recombinante podem ser usadas para tornar este vírus H5N1 transmissível de humanos para humanos. Além disso, deve ser possível introduzir mutações em tal vírus recombinante de modo que seja resistente aos antivirais do vírus da gripe atualmente disponíveis (inibidores M2: amantadina e rimantadina e inibidores de NA: zanamivir e oseltamivir), e de modo que possua um sítio antigênico HA isso é diferente dos vírus humanos que circulam recentemente. Na verdade, vários vírus com diferentes sítios antigênicos HA podem ser gerados. A população humana não teria proteção imunológica contra esses vírus, os medicamentos antivirais existentes não proporcionariam nenhuma proteção e esses vírus poderiam se espalhar simplesmente pela liberação de um spray aerossol em várias áreas congestionadas. 95

3. COMPREENSÃO E MANIPULAÇÃO DE SISTEMAS BIOLÓGICOS

Uma compreensão mais holística de sistemas biológicos complexos (por exemplo, o funcionamento de uma célula intacta, organismo multicelular ou comunidade microbiana complexa) está emergindo por meio de um conjunto de tecnologias que permitem a coleta de conjuntos de dados vastos e abrangentes (altamente paralelos) para vários tipos de processos biológicos, a integração desses conjuntos de dados e a identificação de componentes ou vias críticas. Os componentes críticos podem então servir como alvos para intervenção terapêutica e preventiva ou manipulação; eles também podem servir como alvos para manipulação malévola e como base para novos tipos de ataque biológico. Ao mesmo tempo, as tecnologias que facilitam uma melhor compreensão do controle intracelular, de órgãos e de animais inteiros & ldquocircuito & rdquo aumentarão a capacidade dos cientistas de manipular esses sistemas complexos.

Exemplos de algumas tecnologias que estão levando a esse tipo de visão geral holística incluem o campo / disciplina emergente da & ldquosystems biology & rdquo 96 e da medicina genômica. Exemplos das ferramentas que podem ser usadas para manipular sistemas biológicos complexos incluem silenciamento de genes, novos reagentes de ligação (por exemplo, ácido nucleico e aptâmeros de peptídeo, anticorpos projetados) e moduladores de pequenas moléculas de sistemas fisiológicos. De muitas maneiras, essa categoria de tecnologias abre aspectos inteiramente novos das futuras paisagens de biodefesa e de agentes de biosseagências e muda o paradigma fundamental para futuras discussões sobre esse tópico.

Interferência de RNA

A interferência de RNA, também conhecida como RNAi e silenciamento de RNA, foi observada pela primeira vez em plantas quando se observou que os genes endógenos e & ldquoforeignos pareciam estar se desligando por um processo inicialmente denominado

& ldquoco-supressão. & rdquo 97 O que inicialmente se pensava ser peculiar às petúnias foi mais tarde encontrado em outras plantas e também em animais. O fenômeno agora é conhecido como interferência de RNA e é reconhecido como um mecanismo de defesa antiviral comum em plantas e um fenômeno comum em muitos outros organismos, incluindo mamíferos. Também é cada vez mais evidente que o RNAi está intimamente relacionado à ampla regulação da expressão gênica por moléculas de RNA expressas endogenamente muito pequenas, os chamados micro-RNAs (miRNA). Este campo está explodindo com novas descobertas quase que diariamente sobre o papel dos miRNAs na regulação da expressão gênica durante e após o desenvolvimento.A interação de miRNAs endógenos com mRNAs celulares que codificam proteínas específicas leva à supressão da expressão da proteína, seja por prejudicar a estabilidade do mRNA ou por suprimir sua tradução em proteína. O fato de que pequenos RNAs de fita dupla deste tipo, com cerca de 21 nucleotídeos de comprimento, poderiam desempenhar um papel aparentemente amplo e fundamental no desenvolvimento e no controle da homeostase celular não foi avaliado há apenas alguns anos e destaca as mudanças súbitas e imprevisíveis de paradigma e mudanças bruscas na maneira como os cientistas pensam que são possíveis no avanço das ciências da vida (Figura 3-3).

O mecanismo molecular básico do RNAi é o seguinte. RNAs de fita dupla longos (dsRNAs tipicamente & gt200 nucleotídeos de comprimento) silenciam a expressão de genes alvo ao entrar em uma via celular comumente referida como via de RNAi. Primeiro, na chamada etapa de iniciação, os dsRNAs são processados ​​em pequenos RNAs interferentes de 20 a 25 nucleotídeos (siRNAs) por uma enzima semelhante à Rnase III chamada Dicer. Os siRNAs então se agrupam em complexos contendo endoribonuclease conhecidos como complexos de silenciamento induzido por RNA (RISCs), desenrolando-se no processo. As fitas de siRNA subsequentemente guiam os RISCs para moléculas de RNA complementares, onde o complexo RISC cliva e destrói o RNA cognato (isto é, esta é a etapa efetora). Os miRNAs são gerados de forma semelhante a partir de RNAs expressos endogenamente contendo estruturas curtas em grampo, usando uma proteína semelhante a Dicer. Eles são capazes de silenciar a expressão gênica de forma semelhante, mas também podem direcionar o silenciamento pós-transcricional, bloqueando a tradução de um mRNA do hospedeiro direcionado. Este último efeito depende tipicamente da ligação a uma sequência alvo parcialmente complementar perto da extremidade 3 & rsquo do mRNA.

O RNAi é altamente específico e notavelmente potente (apenas algumas moléculas de dsRNA por célula são necessárias para uma interferência efetiva), e a atividade interferente pode ocorrer em células e tecidos muito distantes do local de introdução.

FIGURA 3-3 O processo de interferência de RNA.

FONTE: Steven Block, apresentação ao comitê, abril de 2004.

Estado da Arte Atual

Espera-se que a tecnologia se mostre particularmente valiosa nos casos em que o RNA direcionado codifica genes e produtos proteicos inacessíveis a drogas convencionais (isto é, proteínas, moléculas pequenas e terapêuticas de anticorpos monoclonais). No entanto, a entrega clínica representa um desafio significativo, assim como a probabilidade de silenciamento indesejável de genes não direcionados. 98 No entanto, vários experimentos recentes indicam que os investigadores estão bem encaminhados para superar esses desafios e criar um risco emergente de uso duplo na forma de patógenos baseados em RNAi produzidos por bioengenharia. Em 2003, uma equipe de pesquisa alemã anunciou o sucesso do vetor lentivírus

entrega de silenciamento de genes in vivo com RNAi. 99 Também em 2003, os pesquisadores anunciaram o uso bem-sucedido da injeção intravenosa de alta pressão e alto volume de siRNA sintético. 100 Outros estudos demonstraram o potencial de entregar RNAi a órgãos específicos, como os olhos, 101 pulmões, 102 e sistema nervoso central. 103 Embora os ensaios em humanos de RNAi tenham começado para o tratamento da degeneração macular relacionada à idade, 104 um modo sistêmico de entrega teria sem dúvida maior utilidade clínica. Progresso substancial está sendo feito em direção a este objetivo, no entanto, usando lipossomas e formulações de nanopartículas lipídicas de siRNAs quimicamente modificados e, portanto, estabilizados. Cientistas da Sirna, uma pequena empresa de biotecnologia que trabalha há mais de uma década em terapias baseadas em ácido nucléico, descreveram recentemente uma redução de 1.000 vezes na quantidade de vírus da hepatite B presente no sangue de camundongos que replicam este vírus no fígado, após uma série de três inoculações intravenosas separadas de uma nanopartícula lipídica formulada, quimicamente modificada, siRNA.


16.9: Introdução às tecnologias-chave - Biologia

Biologia é o estudo da vida. Como aprendemos, esse campo cobre um amplo escopo de assuntos. À medida que avança neste curso, você ganhará o conhecimento de que precisa para tomar decisões informadas. Vamos relembrar os artigos que Cristina encontrou no início deste módulo: como o conhecimento dos princípios biológicos pode ajudar na compreensão de cada artigo?

Relembrar

Cristina leu um artigo sobre alguns dos animais mais estranhos do mundo & # 8217s. Ao aprender sobre evolução e seleção natural, Cristina pôde começar a ver as diferentes razões evolutivas por trás das características extremas de alguns animais. Por exemplo, o aye-aye, um mamífero nativo de Madagascar, evoluiu para ter um dedo médio extra longo, que pode ser usado para desenterrar larvas de árvores. Aprenderemos mais sobre como esses tipos de características são selecionados no Módulo 12: Teoria da Evolução.

O próximo artigo que Cristina leu falou sobre OGM (organismos geneticamente modificados) e os riscos que eles apresentam. Para realmente entender os riscos potenciais dos alimentos geneticamente modificados, Cristina precisará primeiro entender a ciência por trás desses alimentos. Como são criados os OGM? Aprenderemos mais sobre isso no Módulo 13: Biologia Moderna.

Cristina então olhou para um artigo sobre a dieta paleo. Para sobreviver, os humanos precisam de nutrientes específicos. Embora não possamos nos aprofundar muito sobre nutrição neste curso, aprenderemos sobre diferentes macromoléculas biológicas no Módulo 3: Macromoléculas biológicas importantes. Essas macromoléculas incluem categorias que você pode reconhecer, como proteínas, lipídios (mais comumente chamados de gorduras) e carboidratos. Nesse módulo, aprenderemos sobre as funções que essas moléculas desempenham em nossos corpos - aprenderemos as funções essenciais que desempenham. Com esse conhecimento, Cristina pode decidir melhor o que deve ou não deve remover de sua dieta.

Como você pode ver no exemplo de Cristina & # 8217s, a biologia está ao nosso redor - afinal, você & # 8217é um ser humano vivo! Neste curso, aprenderemos sobre os principais princípios biológicos que podem ajudá-lo a viver sua vida da melhor maneira possível.


Uma breve introdução à fisiologia

Fisiologia é o estudo da função normal nas criaturas vivas. É uma subseção da biologia, cobrindo uma variedade de tópicos que incluem órgãos, anatomia, células, compostos biológicos e como todos eles interagem para tornar a vida possível.

De teorias antigas a técnicas de laboratório molecular, a pesquisa fisiológica moldou nossa compreensão dos componentes de nosso corpo, como eles se comunicam e como nos mantêm vivos.

Merrian-Webster define fisiologia como:

“[Um] ramo da biologia que lida com as funções e atividades da vida ou da matéria viva (como órgãos, tecidos ou células) e dos fenômenos físicos e químicos envolvidos.”

Share on Pinterest Physiology cobre uma variedade de disciplinas dentro da biologia humana e além.

O estudo da fisiologia é, em certo sentido, o estudo da vida. Ele faz perguntas sobre o funcionamento interno dos organismos e como eles interagem com o mundo ao seu redor.

A fisiologia testa como os órgãos e sistemas do corpo funcionam, como se comunicam e como combinam seus esforços para criar condições favoráveis ​​à sobrevivência.

A fisiologia humana, especificamente, é freqüentemente separada em subcategorias - esses tópicos cobrem uma vasta quantidade de informações.

Os pesquisadores da área podem se concentrar em qualquer coisa, desde organelas microscópicas na fisiologia celular até tópicos mais abrangentes, como a ecofisiologia, que examina organismos inteiros e como eles se adaptam aos ambientes.

O braço mais relevante da pesquisa fisiológica para Notícias Médicas Hoje é fisiologia humana aplicada, este campo investiga sistemas biológicos no nível da célula, órgão, sistema, anatomia, organismo e em todos os lugares entre eles.

Neste artigo, visitaremos algumas das subseções da fisiologia, desenvolvendo uma breve visão geral deste enorme assunto. Em primeiro lugar, examinaremos uma breve história da fisiologia.

O estudo da fisiologia tem suas raízes na Índia e no Egito antigos.

Como disciplina médica, remonta pelo menos à época de Hipócrates, o famoso “pai da medicina” - por volta de 420 aC.

Hipócrates cunhou a teoria dos quatro humores, afirmando que o corpo contém quatro fluidos corporais distintos: bile negra, catarro, sangue e bile amarela. Qualquer perturbação em suas proporções, como diz a teoria, causa problemas de saúde.

Claudius Galenus (c.130-200 DC), também conhecido como Galen, modificou a teoria de Hipócrates e foi o primeiro a usar a experimentação para obter informações sobre os sistemas do corpo. Ele é amplamente referido como o fundador da fisiologia experimental.

Foi Jean Fernel (1497-1558), um médico francês, quem primeiro introduziu o termo "fisiologia", do grego antigo, que significa "estudo da natureza, origens".

Fernel também foi o primeiro a descrever o canal espinhal (o espaço na coluna por onde passa a medula espinhal). Ele tem uma cratera na lua com o seu nome por seus esforços - é chamada Fernelius.

Outro salto em frente no conhecimento fisiológico veio com a publicação do livro de William Harvey intitulado Uma dissertação anatômica sobre o movimento do coração e do sangue em animais em 1628.

Harvey foi o primeiro a descrever a circulação sistêmica e a jornada do sangue pelo cérebro e pelo corpo, impulsionada pelo coração.

Talvez surpreendentemente, grande parte da prática médica baseava-se nos quatro humores até meados do século XIX (derramamento de sangue, por exemplo). Em 1838, uma mudança de pensamento ocorreu quando a teoria celular de Matthias Schleiden e Theodor Schwann entrou em cena, teorizando que o corpo era feito de minúsculas células individuais.

A partir daqui, o campo da fisiologia se abriu e o progresso foi feito rapidamente:

  • Joseph Lister, 1858 - inicialmente estudou coagulação e inflamação após uma lesão, ele passou a descobrir e utilizar anti-sépticos que salvam vidas.
  • Ivan Pavlov, 1891 - respostas fisiológicas condicionadas em cães.
  • August Krogh, 1910 - ganhou o Prêmio Nobel por descobrir como o fluxo sanguíneo é regulado nos capilares.
  • Andrew Huxley e Alan Hodgkin, 1952 - descobriram o mecanismo iônico pelo qual os impulsos nervosos são transmitidos.
  • Andrew Huxley e Hugh Huxley, 1954 - fizeram avanços no estudo dos músculos com a descoberta de filamentos deslizantes no músculo esquelético.

Os principais sistemas abrangidos no estudo da fisiologia humana são os seguintes:

  • Sistema circulatório - incluindo o coração, os vasos sanguíneos, as propriedades do sangue e como a circulação funciona na doença e na saúde.
  • Sistema digestivo / excretor - mapear o movimento dos sólidos da boca ao ânus, inclui o estudo do baço, do fígado e do pâncreas, a conversão dos alimentos em combustível e sua saída final do corpo.
  • Sistema endócrino - o estudo dos hormônios endócrinos que transportam sinais por todo o organismo, ajudando-o a responder em conjunto. As principais glândulas endócrinas - hipófise, tireóide, supra-renais, pâncreas, paratireóides e gônadas - são o foco principal, mas quase todos os órgãos liberam hormônios endócrinos.
  • Sistema imunológico - o sistema de defesa natural do corpo é composto por glóbulos brancos, o timo e os sistemas linfáticos. Uma complexa gama de receptores e moléculas se combinam para proteger o hospedeiro de ataques de patógenos. Moléculas como anticorpos e citocinas aparecem fortemente.
  • Sistema tegumentar - a pele, cabelo, unhas, glândulas sudoríparas e glândulas sebáceas (secretando uma substância oleosa ou cerosa).
  • Sistema musculo-esquelético - o esqueleto e músculos, tendões, ligamentos e cartilagem. A medula óssea - onde são produzidos os glóbulos vermelhos - e como os ossos armazenam cálcio e fosfato são incluídos.
  • Sistema nervoso - o sistema nervoso central (cérebro e medula espinhal) e o sistema nervoso periférico. O estudo do sistema nervoso inclui pesquisas sobre os sentidos, memória, emoção, movimento e pensamento.
  • Sistema renal / urinário - incluindo os rins, ureteres, bexiga e uretra, este sistema remove a água do sangue, produz urina e leva embora os resíduos.
  • Sistema reprodutivo - consiste nas gônadas e nos órgãos sexuais. O estudo desse sistema também inclui a investigação da forma como um feto é criado e nutrido por 9 meses.
  • Sistema respiratório - consiste em nariz, nasofaringe, traqueia e pulmões. Este sistema traz oxigênio e expele dióxido de carbono e água.

Há um grande número de disciplinas que usam a palavra fisiologia em seu título. Abaixo estão alguns exemplos:

  • Fisiologia celular - estudar a forma como as células funcionam e interagem, a fisiologia celular concentra-se principalmente no transporte por membrana e transmissão neuronal.
  • Fisiologia de sistemas - centra-se na modelagem computacional e matemática de sistemas biológicos complexos. Tenta descrever a maneira como células ou componentes individuais de um sistema convergem para responder como um todo. Eles frequentemente investigam redes metabólicas e sinalização celular.
  • Fisiologia evolutiva - estudar a maneira como os sistemas, ou partes de sistemas, se adaptaram e mudaram ao longo de várias gerações. Os tópicos de pesquisa cobrem muitos campos, incluindo o papel do comportamento na evolução, seleção sexual e mudanças fisiológicas em relação à variação geográfica.
  • Fisiologia de defesa - mudanças que ocorrem como reação a uma ameaça potencial, como a preparação para a resposta de luta ou fuga.
  • Fisiologia do exercício - como o nome sugere, este é o estudo da fisiologia do exercício físico. Isso inclui pesquisas em bioenergética, bioquímica, função cardiopulmonar, biomecânica, hematologia, fisiologia do músculo esquelético, função neuroendócrina e função do sistema nervoso.

Os tópicos mencionados acima são apenas uma pequena seleção das fisiologias disponíveis. O campo da fisiologia é tão essencial quanto vasto.

A anatomia está intimamente relacionada à fisiologia. A anatomia se refere ao estudo da estrutura das partes do corpo, mas a fisiologia se concentra em como essas partes funcionam e se relacionam entre si.


O que é o perfil de expressão gênica e quem o usa?

O perfil de expressão gênica mede quais genes estão sendo expressos em uma célula em um determinado momento. Este método pode medir milhares de genes ao mesmo tempo, alguns experimentos podem medir todo o genoma de uma só vez [3]. O perfil de expressão gênica mede os níveis de mRNA, mostrando o padrão de genes expressos por uma célula no nível de transcrição [4]. Isso geralmente significa medir as quantidades relativas de mRNA em duas ou mais condições experimentais e, em seguida, avaliar quais condições resultaram na expressão de genes específicos.

O perfil de expressão gênica é usado por uma variedade de pesquisadores biomédicos, de biólogos moleculares a toxicologistas ambientais. Essa tecnologia pode fornecer informações precisas sobre a expressão gênica, para inúmeros objetivos experimentais.

Diferentes técnicas são usadas para determinar a expressão do gene. Isso inclui microarranjos de DNA e tecnologias de sequenciamento. O primeiro mede a atividade de genes específicos de interesse e o último permite aos pesquisadores determinar todos os genes ativos em uma célula [5].

Depois que o genoma é sequenciado, sabemos qual é o potencial de uma célula - quais são as características e funções que ela pode ter - com base nos genes que contém. No entanto, o sequenciamento do genoma não nos diz quais genes uma célula está expressando, ou as funções ou processos que está realizando em determinado momento. Para determiná-los, precisamos trabalhar seu perfil de expressão gênica. Se um gene está sendo usado para fazer mRNA, ele é considerado 'ligado' se não estiver sendo usado para fazer mRNA, é considerado 'desligado'.

Um perfil de expressão gênica nos diz como uma célula está funcionando em um momento específico. Isso ocorre porque a expressão do gene celular é influenciada por estímulos externos e internos, incluindo se a célula está se dividindo, quais fatores estão presentes no ambiente da célula, os sinais que ela está recebendo de outras células e até mesmo a hora do dia [6].


Lição de introdução à engenharia genética e suas aplicações

As unidades servem como guias para um determinado conteúdo ou área de assunto. Aninhadas nas unidades estão as aulas (em roxo) e atividades práticas (em azul).

Observe que nem todas as aulas e atividades existirão em uma unidade e, em vez disso, podem existir como currículo "independente".

Boletim Informativo da TE

Os alunos aprendem sobre mutação genética

Resumo

Conexão de Engenharia

Engenheiros genéticos desenvolveram técnicas de recombinação genética para manipular sequências de genes em plantas, animais e outros organismos para expressar características específicas. Os pedidos de engenharia genética estão aumentando à medida que engenheiros e cientistas trabalham juntos para identificar as localizações e funções de genes específicos na sequência de DNA de vários organismos. Depois que cada gene é classificado, os engenheiros desenvolvem maneiras de alterá-los para criar organismos que fornecem benefícios, como vacas que produzem grandes volumes de carne, bactérias geradoras de combustível e plástico e plantações resistentes a pragas.

Objetivos de aprendizado

Após esta lição, os alunos devem ser capazes de:

  • Liste várias aplicações atuais da engenharia genética.
  • Descreva as técnicas gerais usadas por engenheiros genéticos para modificar o DNA.
  • Analise as vantagens e desvantagens de manipular o DNA de um organismo.

Padrões Educacionais

Cada Ensino de Engenharia a aula ou atividade está correlacionada a um ou mais padrões educacionais de ciência, tecnologia, engenharia ou matemática (STEM) do ensino fundamental e médio.

Todos os mais de 100.000 padrões K-12 STEM cobertos em Ensino de Engenharia são coletados, mantidos e embalados pelo Rede de Padrões de Conquista (ASN), um projeto de D2L (www.achievementstandards.org).

No ASN, os padrões são estruturados hierarquicamente: primeiro pela fonte por exemplo., por estado dentro da fonte por tipo por exemplo., ciências ou matemática dentro de tipo por subtipo, depois por série, etc.

NGSS: Next Generation Science Standards - Science

HS-LS1-1. Construa uma explicação baseada em evidências de como a estrutura do DNA determina a estrutura das proteínas que realizam as funções essenciais da vida por meio de sistemas de células especializadas. (Séries 9 - 12)

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Todas as células contêm informações genéticas na forma de moléculas de DNA. Genes são regiões do DNA que contêm as instruções que codificam a formação das proteínas, responsáveis ​​pela maior parte do trabalho das células.

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Associação Internacional de Educadores de Tecnologia e Engenharia - Tecnologia
  • As considerações éticas são importantes no desenvolvimento, seleção e uso de tecnologias. (Classes 9 - 12) Mais detalhes

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Padrões Estaduais
Texas - Ciência
  • descrevem como técnicas como impressão digital de DNA, modificações genéticas e análise cromossômica são usadas para estudar os genomas dos organismos. (Classes 9 - 11) Mais detalhes

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Planilhas e anexos

Mais currículos como este

Como uma classe, os alunos trabalham com um exemplo que mostra como o DNA fornece a & quotrecipe & quot para a produção de proteínas do corpo humano. Eles vêem como o padrão de bases de nucleotídeos (adenina, timina, guanina, citosina) forma a forma de escada de dupla hélice do DNA e serve como o código para as etapas necessárias para fazer o gene.

Os alunos aprendem sobre mutações no DNA e nos cromossomos, e mudanças não controladas no código genético. Eles são apresentados a mutações de pequena escala (substituições, deleções e inserções) e mutações de grande escala (duplicações de deleção, inversões, inserções, translocações e não disjunção.

Os alunos constroem plasmídeos recombinantes de papel para simular os métodos que os engenheiros genéticos usam para criar bactérias modificadas. Eles aprendem o papel que enzimas, DNA e genes desempenham na modificação dos organismos.

Os alunos reforçam o conhecimento de que o DNA é o material genético de todas as coisas vivas modelando-o com palitos e gomas de mascar que representam os quatro compostos bioquímicos (adenina, tiamina, guanina e citosina) que formam pares entre si em um padrão específico, formando uma dupla hélice . Equipes de alunos.

Conhecimento Pré-Req

Uma compreensão básica da síntese de proteínas e do papel do DNA na célula / corpo é útil para que os alunos possam acompanhar como as mudanças no DNA resultam em grandes mudanças nas características dos organismos.

Introdução / Motivação

(Faça cópias do Fluxograma de Engenharia Genética, um por aluno. Distribua os fluxogramas em branco para os alunos preencherem durante a apresentação e palestra. Em seguida, mostre à classe a Apresentação de Engenharia Genética de 16 slides, um arquivo PowerPoint®. Abra com duas imagens do mesmo organismo: uma que foi geneticamente modificada e outra que não foi. Exemplos: duas espigas de milho em que a não modificada está doente duas vacas em que a modificada é maior ou, desde que os alunos realmente respondam a organismos bioluminescentes, mostram dois camundongos nos quais um foi modificado para brilhar em verde. Diapositivo 2 mostra dois exemplos de camundongos modificados versus não modificados. Outra ideia é mostrar dois organismos que parecem iguais, embora um tenha sido modificado, como um exemplo de como a maioria das modificações não são visíveis.)

Qual é a diferença entre esses dois organismos? (As respostas variam, dependendo da imagem mostrada.) Embora sejam o mesmo organismo, por que são diferentes? (Resposta: Engenharia genética. Alguns alunos podem não chegar a esta resposta por conta própria. Espere que alguns sugiram mutações.) A diferença se deve à engenharia genética. O animal (ou planta) que foi modificado é denominado organismo geneticamente modificado, ou OGM.

Como os engenheiros mudam as características dos organismos? (Ouça as idéias dos alunos.) O DNA contém todas as informações genéticas para determinar os traços ou características de um organismo. Ao modificar o DNA, os engenheiros são capazes de determinar quais características um organismo possui.

(Continue durante a apresentação: O que é engenharia genética? História do Desenvolvimento de OGM, O que é o processo de OGM? Então, começando com slide 6, consulte os exemplos fornecidos de bactérias, plantas e animais OGM. Enfatize as razões para modificar cada organismo [slide 10].)

(Mostra a slide 14 imagem de um homem e uma aranha.) Alguém consegue adivinhar o que aconteceria se combinássemos o DNA dessas duas criaturas? (Espere que os alunos respondam com entusiasmo "homem-aranha".) Os engenheiros poderiam criar um "homem-aranha" no laboratório hoje? (Espere algumas respostas sim, enquanto a maioria dos alunos responde não.) Não exatamente. No entanto, em 2000, os engenheiros criaram a primeira cabra capaz de produzir proteínas de seda de aranha (uma fibra incrivelmente forte e elástica com benefícios futuristas na construção [cabos de suspensão de pontes, airbags que são mais suaves para os passageiros], remédios [pele artificial para curar queimaduras, artificiais ligamentos, linha para suturar feridas] e militar [armadura corporal] se quantidades suficientes pudessem ser geradas), então talvez não esteja muito longe.

(Mostrar slide 15.) A engenharia genética é tão nova e surpreendente que as pessoas ainda estão tentando descobrir os prós e os contras. Vimos alguns exemplos dos benefícios dos organismos geneticamente modificados, e quanto às desvantagens e danos causados ​​pela engenharia genética? (Depois de ouvir as ideias dos alunos, analise as questões listadas no slide. Como alternativa, analise o conteúdo deste slide e as informações básicas como uma discussão em classe durante o Encerramento da Aula, estendendo o tempo da aula conforme necessário.)

(Continue a apresentar aos alunos o conteúdo da seção Plano de fundo da lição e, em seguida, uma revisão em classe dos fluxogramas concluídos.)

Antecedentes da lição e conceitos para professores

Figura 1. A estrutura do DNA: os blocos de construção dos nucleotídeos são mostrados em detalhes quase atômicos.

Ácido desoxirribonucléico (DNA) é uma grande biomolécula que contém a informação genética completa de um organismo. Cada célula de organismos vivos e muitos vírus contém DNA. O bloco básico de construção de uma molécula de DNA é chamado de nucleotídeo, e uma única fita de DNA pode conter bilhões de nucleotídeos. (Consulte a Figura 1 para ver a estrutura do DNA com partes marcadas.) Embora cada molécula de DNA contenha muitos desses blocos de construção, apenas quatro nucleotídeos exclusivos são usados ​​para criar a sequência de DNA inteira, estes são escritos como A, G, C e T. De forma análoga a como as 26 letras do alfabeto podem ser organizadas para criar palavras com significados diferentes, esses quatro nucleotídeos podem ser organizados em sequências para "soletrar" as instruções genéticas para criar todos os diferentes proteínas os organismos precisam para viver.

Como o DNA contém instruções para um organismo criar várias proteínas diferentes, é útil definir outra subunidade de DNA chamada genes (mostrado na Figura 2). Cada gene é um pequeno segmento de DNA que contém um conjunto de instruções para um organismo criar uma única proteína - um único organismo pode ter milhares de genes diferentes. Juntos, todo o conjunto de genes de um organismo é chamado de genoma. Para usar outra analogia, pense no genoma como um livro de receitas inteiro para um organismo, e cada gene é uma receita individual nesse livro de receitas. Quando uma única receita é seguida, o resultado é uma proteína específica. Figura 2. Um gene é uma seção de uma molécula de DNA que contém as informações para construir uma única proteína.

Por que as proteínas são importantes?

As proteínas realizam todo o trabalho nos organismos. Algumas funções das proteínas incluem:

  • Servindo como catalisadores para reações
  • Executando sinalização celular
  • Transporte de moléculas através das membranas
  • Criando estruturas

Quando uma proteína é criada por seu gene, diz-se que o gene é "expresso" ou usado. A maioria das expressões gênicas não produz resultados visíveis a olho nu. No entanto, alguns genes, como aqueles que codificam proteínas responsáveis ​​pelo pigmento, têm expressão visual. A expressão de um gene de maneira observável é chamada de traço fenotípico um exemplo é a cor do cabelo de um organismo. Na verdade, tudo o que você pode ver em um organismo é resultado de proteínas ou ações de proteínas.

Como o DNA é usado na engenharia genética?

Figura 3. Um exemplo de como o processo de engenharia genética pode ser usado na produção de medicamentos.

Por definição, a engenharia genética é a alteração direta do genoma de um organismo. Isso é conseguido por meio da manipulação do DNA. Isso é possível porque o DNA é como uma linguagem universal, todo o DNA de todos os organismos é feito dos mesmos blocos de construção de nucleotídeos. Assim, é possível que genes de um organismo sejam lidos por outro organismo. Na analogia do livro de receitas, isso equivale a pegar uma receita do livro de receitas de um organismo e colocá-la em outro livro de receitas. Agora imagine que todos os livros de receitas são escritos no mesmo idioma, portanto, qualquer receita pode ser inserida e usada em qualquer outro livro de receitas.

Na prática, como o DNA contém os genes para construir certas proteínas, ao mudar a sequência do DNA, os engenheiros são capazes de fornecer um novo gene para uma célula / organismo criar uma proteína diferente. As novas instruções podem complementar as instruções antigas de forma que uma característica extra seja exibida, ou podem substituir completamente as instruções antigas de forma que uma característica seja alterada.

Técnica de Engenharia Genética

O processo de engenharia genética começa da mesma forma para qualquer organismo sendo modificado (veja a Figura 3 para um exemplo deste procedimento).

  1. Identifique um organismo que contém um gene desejável.
  2. Extraia todo o DNA do organismo.
  3. Remova este gene do resto do DNA. Uma maneira de fazer isso é usando um enzima de restrição. Essas enzimas procuram por sequências de nucleotídeos específicas onde irão "cortar" o DNA quebrando as ligações neste local.
  4. Insira o novo gene no DNA de um organismo existente. Isso pode ser alcançado por meio de vários processos diferentes.

Ao modificar bactérias, o método mais comum para esta etapa final é adicionar o gene isolado a um plasmídeo, um pedaço circular de DNA usado por bactérias. Isso é feito "cortando" o plasmídeo com a mesma enzima de restrição que foi usada para remover o gene do DNA original. O novo gene agora pode ser inserido nesta abertura no plasmídeo e o DNA pode ser ligado novamente usando outra enzima chamada ligase. Este processo, mostrado na Figura 4, cria um recombinante plasmídeo. Neste caso, o plasmídeo recombinante também é referido como um cromossomo bacteriano artificial (BAC). Consulte a atividade associada Transformação de bactérias para que os alunos criem um modelo para simular e aprender sobre o processo usado por engenheiros genéticos para modificar bactérias.
Figura 4. Construindo um plasmídeo recombinante para modificar bactérias.

Uma vez que o DNA recombinante tenha sido construído, ele pode ser passado ao organismo para ser modificado. Ao modificar bactérias, esse processo é bastante simples. O plasmídeo pode ser facilmente inserido na bactéria, onde a bactéria o trata como seu próprio DNA. Para modificação de plantas, certas bactérias, como Agrobacterium tumefaciens pode ser usado porque essas bactérias permitem que seus plasmídeos sejam passados ​​para o DNA da planta.

Aplicações e Economia

O número de aplicações para a engenharia genética está aumentando à medida que mais e mais se aprende sobre os genomas de diferentes organismos. Algumas áreas de aplicação interessantes ou notáveis ​​são descritas abaixo.

Quantas safras de hoje são geneticamente modificadas? A partir de 2010, nos EUA, 86% do milho produzido era geneticamente modificado. Bt- o milho é um OGM comum que combina um gene do Bt bactéria com DNA de milho para produzir uma cultura resistente a insetos. O gene da bactéria usado contém uma receita para uma proteína que é tóxica quando consumida por insetos, mas segura quando consumida por humanos.

Vários outros genes podem ser combinados com colheitas para produzir propriedades desejáveis, como:

  • Resistência a herbicidas, secas, congelamento ou doenças
  • Maior rendimento
  • Crescimento mais rápido
  • Nutrição melhorada
  • Vida útil mais longa

A criação de safras geneticamente modificadas oferece muitos incentivos para agricultores e empresas. Quando os agricultores conseguem plantar uma safra com maior rendimento por acre, eles podem aumentar significativamente a produção e, portanto, as vendas com custo mínimo. Doenças, pragas e outras resistências reduzem a perda de safra, o que também ajuda a aumentar os lucros. Além dos agricultores, outros benfeitores das culturas modificadas incluem empresas de sementes, agroquímicos e equipamentos agrícolas, bem como distribuidores e universidades que estão envolvidas na pesquisa de OGM. Em 2011, o valor das sementes geneticamente modificadas foi de US $ 13,2 bilhões apenas nos EUA. O valor dos produtos finais produzidos a partir dessas sementes ultrapassou US $ 160 bilhões.

Devido às suas estruturas simples, os organismos mais comumente modificados são as bactérias. As primeiras bactérias modificadas foram criadas em 1973. As bactérias podem ser modificadas para produzir proteínas desejáveis ​​que podem ser colhidas e utilizadas. Um exemplo é a insulina ou seda de aranha, que é difícil de coletar naturalmente. Outras modificações nas bactérias incluem fazer mudanças no processo de respiração celular para alterar os subprodutos normalmente CO2 é produzido, no entanto, os engenheiros fizeram modificações para que subprodutos de hidrocarbonetos, como diesel e polietileno (um combustível e um plástico) sejam produzidos.

(A aula de 30 minutos deixa uma boa quantidade de tempo para discussão, mas como a participação em classe varia, você pode estender a aula por mais 30 minutos para permitir uma discussão completa das implicações éticas da engenharia genética. um bom tópico de pesquisa e debate do aluno.)

A principal razão pela qual os organismos geneticamente modificados não são mais amplamente usados ​​é devido a questões éticas. Quase 50 países em todo o mundo, incluindo Austrália, Japão e todos os países da União Europeia, decretaram restrições significativas ou proibições totais à produção e venda de produtos alimentícios de organismos geneticamente modificados, e 64 países têm requisitos de rotulagem de OGM. Algumas questões a serem consideradas ao decidir se deve criar e / ou usar OGM incluem:

Segurança: Isso geralmente ocorre no caso de alimentos OGM. Os alimentos são seguros para consumo humano? Os alimentos OGM são saudáveis ​​para os animais? Muitos oponentes dos alimentos OGM dizem que não são feitos testes independentes o suficiente antes de o alimento ser aprovado para venda aos consumidores. Em geral, a pesquisa mostrou que os alimentos OGM são seguros para os humanos. Outra consideração de segurança é a saúde dos agricultores e suas famílias, animais e comunidades que são colocados em risco com a exposição a produtos químicos usados ​​em conjunto com sementes OGM.

Impacto ambiental: Considere que os engenheiros genéticos têm a capacidade de criar árvores que crescem mais rápido do que suas contrapartes não modificadas. Isso parece um grande negócio para a indústria madeireira, mas podem ocorrer algumas consequências não intencionais? Estando ao ar livre e cultivadas em grandes quantidades, as árvores modificadas podem fazer polinização cruzada com árvores não modificadas para formar híbridos fora das áreas de cultivo designadas. Em troca, isso poderia criar árvores que poderiam perturbar o ecossistema. Por exemplo, eles podem superpovoar a área ou crescer tanto que sufocam outras plantas. Este mesmo cenário tem conseqüências não intencionais e indesejáveis ​​quando o pólen das plantações de OGMs vai para campos não-OGM.

Humanos: Os humanos devem ser geneticamente modificados? Isso pode ter aplicações médicas que reduzem ou previnem doenças genéticas, como a síndrome de Down. No entanto, a grande questão é onde a engenharia humana deve parar? Os pais devem ter permissão para decidir a cor dos olhos de seus filhos, altura ou até mesmo sexo antes do nascimento?

Atividades Associadas

  • Transformação de bactérias - os alunos usam um modelo de papel simples para simular e aprender sobre o processo usado por engenheiros genéticos para modificar bactérias.

Encerramento da aula

Que parte de um organismo contém todas as informações necessárias para seu funcionamento? (Resposta: DNA) Quando os genes são expressos, qual é o produto final feito? (Resposta: Proteínas) Alguém sabe por que as bactérias são modificadas mais do que outros organismos? (Resposta: Com suas estruturas muito simples e capacidade de usar plasmídeos, as bactérias são muito mais fáceis e menos dispendiosas de modificar.)

Quais são algumas preocupações éticas e morais que os engenheiros genéticos devem considerar? Alguém acha que é uma boa ideia modificar geneticamente as pessoas? Alguns pesquisadores dizem que essa pode ser uma abordagem para curar doenças como a síndrome de Down e outros defeitos genéticos. Mudanças superficiais também podem ser feitas, como a determinação da altura, cor dos olhos ou sexo de uma pessoa, fazendo mudanças em embriões no útero das mães. Mas só porque algo pode ser feito, isso a torna uma boa ideia? (Resposta: Não. Este é um bom tópico para uma discussão extensa.)

Vocabulário / Definições

DNA: acrônimo para ácido desoxirribonucléico, que é uma molécula que contém a informação genética completa de um organismo.

gene: A unidade molecular de um organismo que contém informações para uma característica específica (sequência de DNA específica).

genoma: um conjunto completo de genes de um organismo.

OGM: Acrônimo para organismo geneticamente modificado.

nucleotídeo: O bloco de construção do DNA.

plasmídeo: A estrutura circular do DNA usada pelas bactérias.

proteína: Grandes biomoléculas usadas por um organismo para vários fins neste contexto, para expressar uma característica desejada.

DNA recombinante: DNA para o qual uma seção foi removida e substituída (recombinada) por uma nova sequência.

Enzima de restrição: Enzima que "corta" o DNA quando sequências específicas de pares de bases estão presentes.

traço: uma característica distintiva.

Avaliação

Questões de discussão: Inicie uma breve discussão para avaliar se os alunos ouviram ou sabem algo sobre genética. Faça perguntas como:

  • Por que seus olhos são da mesma cor?
  • Alguém gostaria de ser mais alto (ou mais baixo)?
  • Existe alguma maneira de fazer essas alterações?

Fluxograma: Peça aos alunos que completem o fluxograma de engenharia genética durante o curso da lição. Depois de fazer a apresentação e a palestra, analise o fluxograma com a turma, para que os alunos possam concluir tudo o que perderam e verificar a precisão dos fluxogramas. As respostas são fornecidas na Chave de respostas do fluxograma de engenharia genética.

Avaliação do resumo da lição

Design de Criatura Recombinante: Peça aos alunos em pares (ou individualmente) que criem seus próprios organismos recombinantes. Oriente os alunos a escolher qualquer organismo e decidir qual gene eles gostariam de adicionar. Se desejar, forneça uma lista de genes a partir dos quais eles possam escolher (como genes que tornam um organismo mais inteligente, maior, mais rápido, desenvolvem membros extras, etc.). Para encorajar o pensamento crítico, peça aos alunos que escrevam um uso potencial para as criaturas resultantes. Finalmente, peça aos alunos que desenhem como seriam suas criaturas recombinantes.

Suporte adicional de multimídia

Veja alguns exemplos de engenharia genética (com fotos) em: http://www.mnn.com/green-tech/research-innovations/photos/12-bizarre-examples-of-genetic-engineering/

Mostre aos alunos algumas aplicações da seda de aranha em Popular Mechanics ' Apresentação de slides "6 Spider-Silk Superpowers" em http://www.popularmechanics.com/science/health/med-tech/6-spider-silk-superpowers#slide-1

Referências

12 Exemplos bizarros de engenharia genética. Postado em 27 de outubro de 2010. MNN Holdings, Mother Nature Network. Acessado em 8 de dezembro de 2013. http://www.mnn.com/green-tech/research-innovations/photos/12-bizarre-examples-of-genetic-engineering

Biello, David. Transformando bactérias em fábricas de plástico. Postado em 16 de setembro de 2008. Scientific American. Acessado em 11 de dezembro de 2013. http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=turning-bacteria-into-plastic-factories-replacing-fossil-fuels

DNA. Atualizado em 7 de junho de 2014. Wikipedia, The Free Encyclopedia. Acessado em 16 de junho de 2014. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA

Emspak, Jesse. Bactérias intestinais produzem combustível diesel. Postado em 23 de abril de 2013.Discovery Communications. Acessado em 11 de dezembro de 2013. http://news.discovery.com/tech/biotechnology/gut-bacteria-make-diesel-fuel-130423.htm

Engenharia genética. Atualizado em 7 de dezembro de 2013. Wikipedia, The Free Encyclopedia. Acessado em 9 de dezembro de 2013. http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_engineering

Culturas geneticamente modificadas. Atualizado em 12 de junho de 2014. Wikipedia, The Free Encyclopedia. Acessado em 16 de junho de 2014. http://en.wikipedia.org/wiki/Genetically_modified_crops

Straley, Regan. Preocupações com alimentos OGM. Postado em 29 de agosto de 2014. Lancaster Online, Lancaster, PA. Acessado em 31 de agosto de 2014. http://lancasteronline.com/opinion/gmo-food-concerns/article_3c5092ba-2ed0-11e4-ab00-001a4bcf6878.html

Vierra, Craig, et al. O Futuro da Fabricação de Biomateriais: Produção de Seda de Aranha a partir de Bactérias. Postado em 17 de julho de 2012. Journal of Visualized Experiments (JoVE). Acessado em 11 de dezembro de 2013. http://www.jove.com/about/press-releases/39/the-future-biomaterial-manufacturing-spider-silk-production-from

O que é engenharia genética e como funciona? Atualizado em 2005. University of Nebraska. Acessado em 10 de dezembro de 2013. http://agbiosafety.unl.edu/basic_genetics.shtml

Outras Informações Relacionadas

(opcional: mostre aos alunos o vídeo O que é engenharia?)

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Assista o vídeo: Seminário de biologia DNA RECOMBINANTE (Agosto 2022).