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Quantidade de transcriptase reversa em µg ou mM para qRT-PCR

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Estou tentando calcular uma quantidade de titulação para uma molécula que gostaria de usar em minhas amostras de PCR. Moléculas diferentes têm densidades diferentes, então eu gostaria de calcular a densidade apropriada da molécula titulada. Quantos microgramas ou microMolares de transcriptase reversa são usados ​​nos kits qRT_PCR?


A transcriptase reversa (e a maioria das outras enzimas comerciais hoje em dia) é feita de forma recombinante, depois purificada em vários graus, usando vários métodos, entre diferentes fornecedores (e às vezes entre diferentes lotes do mesmo fornecedor). Algumas enzimas, na verdade, têm várias unidades funcionais combinadas em um complexo, outras podem exigir uma etapa de ativação pós-tradução, como a fosforilação por uma quinase separada, a fim de serem totalmente funcionais. Todas essas variáveis ​​podem produzir preparações de diferentes concentração molar, mas muito parecido atividade. Portanto, empresas como a New England Biolabs têm definições de unidades para seus vários produtos com base na atividade.

Tendo lidado com NEB no passado, eu sei que eles geralmente têm uma concentração para seus produtos também, então se você estiver fazendo experimentos como um ensaio de inibição enzimática, você pode dosar para concentração, bem como para atividade. Vai variar de enzima para enzima se o seu inibidor se ligará a qualquer proteína inativa que possa estar presente; nesse caso, a atividade seria o melhor atributo a ser usado em seus cálculos.


Avaliação de genes de referência adequados para normalização de análises quantitativas de PCR de transcrição reversa em Clavibacter michiganensis

Laixin Luo, Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola da China, Pequim, China.

Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola da China, Pequim, China

Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola da China, Pequim, China

Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola da China, Pequim, China

Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola da China, Pequim, China

Departamento de Patologia Vegetal, 4315 Miller Plant Sciences, Universidade da Geórgia, Athens, GA, EUA

Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola da China, Pequim, China

Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola da China, Pequim, China

Laixin Luo, Departamento de Patologia Vegetal, Faculdade de Proteção Vegetal, Universidade Agrícola da China, Pequim, China.

Declaração de disponibilidade de dados: Todos os dados estão incluídos no manuscrito principal e nos apêndices. Dados brutos e materiais estão disponíveis mediante solicitação.


Introdução

Os gliomas são os tumores cerebrais primários heterogêneos mais comuns que surgem das células gliais. Em 2007, a Organização Mundial da Saúde (OMS) classificou os gliomas em quatro graus diferentes com base no tipo de célula e gravidade (Louis et al. 2007). Entre esses, o glioblastoma (GB) é o tumor cerebral mais frequente e agressivo em adultos (Arvold e Reardon 2014). As características marcantes do GB são a proliferação celular descontrolada, invasão, capacidade de formar novos vasos sanguíneos e evasão da apoptose (Furnari et al. 2007). Mesmo com o avanço no campo da cirurgia, quimioterapia e radioterapia, o prognóstico dos pacientes com GB permanece ruim devido à presença de células-tronco cancerosas que tornam esses tumores resistentes à quimioterapia e à radioterapia (Singh et al. 2003 Yuan et al. 2004) . Numerosas alterações moleculares e genéticas que mantêm fenótipos moleculares de tumores são freqüentemente vistas em gliomas (Sathornsumetee et al. 2007 Zhang et al. 2012).

Os telômeros humanos são complexos únicos de proteína-DNA presentes nas extremidades de todos os cromossomos eucarióticos com repetições em tandem de sequências TTAGGG. Eles protegem os cromossomos de fusões de ponta a ponta e mantêm a estabilidade genômica (Cong et al. 2002). Os telômeros também desempenham um papel importante no envelhecimento e no câncer (Blasco 2005). A telomerase é uma ribonucleoproteína transcriptase reversa especializada que mantém as repetições teloméricas de TTAGGG adicionando repetições de sequência de DNA à extremidade 3 & # x02032 dos cromossomos (Cong et al. 2002 Osterhage e Friedman 2009). A holoenzima telomerase consiste em dois componentes principais: um componente de proteína catalítica transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT) e um componente de RNA (hTR) que atua como um modelo para adicionar repetições de hexanucleotídeo (Artandi e DePinho 2010 Wai 2004). A expressão e atividade da telomerase foram observadas em 80 & # x0201390% de todas as células cancerosas e envolvem aumento da proliferação celular, imortalidade celular e tumorigênese (Kong et al. 2015). Em contraste com a maioria das células humanas normais, a expressão de hTERT e a atividade da telomerase são baixas ou reprimidas (Counter et al. 1992 Harley et al. 1990). Portanto, a diferença na expressão de hTERT e na atividade da telomerase em células cancerosas em relação às células normais torna a telomerase um alvo atraente para o desenvolvimento de novas terapêuticas para o câncer. A expressão e a atividade da telomerase se correlacionaram com a progressão do glioma maligno (Falchetti et al. 1999 Komata et al. 2002). Portanto, a telomerase é um alvo essencial para melhorar o prognóstico e o tratamento dos gliomas.

Nos últimos anos, várias abordagens terapêuticas foram avaliadas para inibir a atividade da telomerase e bloquear o crescimento das células cancerosas. Estudos anteriores demonstraram que a inibição de hTERT por interferência de RNA e agentes farmacológicos reduz a atividade da telomerase e permite que as células sofram apoptose (Lavanya et al. 2016 Lu et al. 2012 Mergny et al. 2002). Além disso, foram desenvolvidos numerosos inibidores da telomerase que bloqueiam a atividade da enzima ou o recrutamento da telomerase para os telômeros. Eles são análogos de nucleosídeos, inibidores catalíticos, oligonucleotídeos antisense hTR, ribozimas e Ligantes G-quadruplex (Seimiya et al. 2002). Inibidores como o imetelstat (GRN163L) demonstraram um perfil farmacocinético promissor com menos efeitos colaterais e estão atualmente em ensaios clínicos de fase I e II (Asai et al. 2003 Marian et al. 2010).

O ácido 2 - [(E) -3-naftalen-2-il-but-2-enoilamino] -benzóico BIBR1532, um dos inibidores mais potentes e específicos de hTERT, foi descoberto recentemente (Damm et al. 2001 Kong et al . 2015). BIBR1532 é um inibidor de moléculas pequenas não peptídicas e não nucleosídicas que inibe a atividade da telomerase ao se ligar especificamente ao sítio ativo de hTERT (Damm et al. 2001). Foi observado que BIBR1532 tem uma forte capacidade de reduzir o crescimento em várias células cancerosas, incluindo mama, leucemia, pulmão, ovário, condrossarcoma e tumores de células germinativas (Bashash et al. 2013 Damm et al. 2001 Meng et al. 2012 Mueller et al. . 2007 Parsch et al. 2008 Ruden e Puri 2013). No presente estudo, pretendemos investigar o efeito do knockdown de hTERT e inibição da atividade telomerase por BIBR1532 em células de glioblastoma.


Bonecos

Em um abatedouro comercial de carne, foram amostradas as carcaças de 30 novilhos abatidos. Os esfregaços de carcaça foram coletados usando uma técnica de esfregaço de esponja de quatro locais antes do resfriamento, conforme descrito na Diretiva da UE (2001/471 / EEC). As zaragatoas foram examinadas utilizando o método da placa espalhada, por plaqueamento superficial de uma série de diluições no Agar Standard Plate Count A.P.H.A. (SPC) (Oxoid Ltd. U.K.) a 30 ° C por 72 h para estabelecer o TVC, e em uma gama de ágares seletivos a fim de examinar os swabs em particular


Materiais e métodos

Geração e identificação de camundongos transgênicos

Um fragmento de 319 pb de DNA genômico contendo precursores miR-335-5p com dois XhoOs locais da enzima de restrição I foram amplificados por PCR e subclonados a jusante do promotor Osterix específico para osteoblastos de 2,0 kb em um vetor contendo o gene repórter de luciferase. Um fragmento de 4,3 kb contendo o promotor Osx (2,0 kb um generoso presente do Dr. Hicham Drissi, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, EUA), 25 miR-335-5p precursor, gene repórter de luciferase e sinal SV40 polyA foi nomeado como Osx-335 / luc e liberado do plasmídeo (pGL3-Osx-miR-335-5p-luc Fig. 1 de suporte) por digestão com duas enzimas de restrição Kpneu e SalI. Em seguida, Osx-335 / luc foi separado por gel de agarose a 1% e purificado em gel usando um kit GENECLEAN II (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A microinjeção do transgene foi realizada logo após a fertilização de ovos de camundongo B6D2F1 / J no Tufts Transgenic Facility de acordo com técnicas padrão. 26 camundongos fundadores e descendentes foram identificados por análise de Southern blot e PCR usando DNA genômico da cauda de camundongo. Para Southern blots, 10 μg de DNA de cada camundongo foi digerido com TraseiroIII e XbaSeparei em gel de agarose a 1% e hibridizei com uma sonda radiomarcada com 32P como descrito. 26 A sonda era o produto de PCR resultante da amplificação do plasmídeo (pGL3-Osx-miR-335-5p-luc) com iniciadores que amplificam a luciferase (Tabela de Apoio 1). Após a amplificação por PCR, o produto foi separado em gel de agarose a 1%, purificado em gel e radiomarcado com 32 P. A análise de PCR também foi realizada para confirmar a presença do transgene usando primers de luciferase. Os camundongos transgênicos foram então designados como camundongos Osx-335 Tg. Os camundongos foram mantidos cruzando camundongos Osx-335 Tg com camundongos Osx-335 Tg e identificados por PCR. Ao caracterizar o fenótipo desta linha de camundongos transgênicos, seus companheiros de ninhada de tipo selvagem de mesma idade foram usados ​​como controles. Todos os ratos foram usados ​​de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório preparado pelo Instituto de Recursos de Animais de Laboratório, Conselho Nacional de Pesquisa (Departamento de Saúde e Publicação de Serviços Humanos NIH 86-23, 1985) e pelas diretrizes estabelecido pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Tufts University (Boston, MA, EUA). Os camundongos foram mantidos em condições padronizadas com um ciclo de 12 horas de luz / 12 horas de escuridão e receberam comida (dieta padrão de laboratório) e água AD Libitum.

Preparação de tecido

Os camundongos Osx-335 Tg e seus companheiros de ninhada de tipo selvagem (WT) foram sacrificados com as idades de 3 dias, 2 semanas, 4 semanas e 8 semanas. Sua calvária e fêmures foram coletados. Os espécimes de calvária foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a –80 ° C para análise posterior, enquanto os fêmures foram fixados em paraformaldeído a 4% e imersos em etanol 75%. Após a análise de μCT, os fêmures foram descalcificados em EDTA a 10%, incluídos em parafina e cortados em seções de tecido de 6 µm de espessura. Tecidos moles, como pulmão, fígado, rim e tecido adiposo marrom, foram isolados de camundongos, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ° C para análise posterior.

Análise µCT

O osso trabecular distal da placa de crescimento foi isolado de fêmures de camundongos WT e Osx-335 Tg de 4 semanas de idade e examinados por µCT (Viva CT-40 Scanco Medical, Bassersdorf, Suíça) com resolução de voxel de 10,5 µm. Cento e cinquenta cortes µCT, correspondendo a uma região de 1,575 mm distal da placa de crescimento, foram adquiridos para análise. Parâmetros morfológicos tridimensionais, incluindo volume ósseo / volume do tecido (BV / TV), número trabecular (Tb.N), espessura trabecular (Tb.Th) e separação trabecular (Tb.Sp) foram registrados e calculados.

Isolamento de RNA e análise de RT-PCR

Amostras de osso e tecidos moles armazenados a -80 ° C após o isolamento foram moídos em um pó fino sob nitrogênio líquido usando um almofariz e pilão. Em seguida, o reagente TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) foi adicionado. O RNA total incluindo miRNA foi preparado a partir de tecidos com modificações nas instruções do fabricante, ou seja, após a separação de fases, dois volumes de isopropanol 100% foram adicionados à fase aquosa, que foi subsequentemente incubada a -20 ° C durante a noite para a precipitação completa do RNA. As fases de interfase e fenol-clorofórmio orgânico foram salvas para posterior extração de proteína. Após o isolamento do RNA, o ensaio de transcrição reversa e os ensaios quantitativos de PCR em tempo real (qRT-PCR) foram realizados respectivamente com M-MLV Transcriptase Reversa (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) e USB VeriQuest FastSYBR GreenqPCR Master Mix com Fluoresceína (2 × ) (Affymetrix) usando um termociclador Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Para a expressão de miRNA, poli (A) tailing, síntese de cDNA e ensaios de qRT-PCR foram realizados com NCode VIVO miRNA cDNA Synthesis Kit e EXPRESS SYBR GreenER miRNA qRT-PCR Kits (Life Technologies), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão de mRNA dos genes foram calculados com o método de limiar de ciclo comparativo usando GAPDH como controle, enquanto a expressão de miR-335-5p foi calculada usando U6 como controle. Os primers usados ​​para amplificação por PCR estão listados na Tabela de Apoio 1.

Análise de Western blot

Os extratos de proteínas teciduais foram obtidos a partir da interfase e da fase orgânica fenol-clorofórmio de acordo com as instruções do reagente Trizol. SDS-PAGE e Western blots foram realizados usando géis Novex 4-20% Tris-Glycine (Life Technologies) e membranas de fluoreto de polivinilideno de 0,45 µm (Millipore, Billerica, MA, EUA). Os anticorpos para Runx2 (1: 1000), Osterix (1: 1000), Satb2 (1: 1000) e β-catenina (1: 1000) foram adquiridos em Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos para β-actina (1: 10000) e Dkk1 (1: 400) foram da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA) e da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), respectivamente. Os anticorpos secundários foram IgG de cabra anti-coelho ligada a peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology). Os blots foram visualizados usando SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).

Histomorfometria óssea e coloração imuno-histoquímica

As seções de tecido ósseo femoral foram submetidas à coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e com fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) usando um kit de fosfatase ácida, leucócito (TRAP) (Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante. As imagens digitais foram obtidas em microscópio OLYMPUS BX53 (Olympus, Waltham, MA, EUA) e analisadas por software. A histomorfometria óssea foi realizada na área trabecular das epífises femorais conforme descrito. 27 A porcentagem da superfície óssea coberta por osteoblastos cuboidais (Ob.S / BS,%) e a relação entre o número de osteoblastos e a superfície óssea (Ob.N / BS, N / mm) foram obtidas a partir de cortes corados com H&E com aumento de 400 × . A porcentagem da superfície dos osteoclastos trabeculares para a superfície óssea (Oc.S / BS,%) e a proporção do número de osteoclastos para a superfície óssea (Oc.N / BS, N / mm) foram obtidas a partir das medidas das seções coradas com TRAP em × Ampliação de 200.

A coloração imunohistoquímica foi realizada usando anticorpos para luciferase (Luc, 1: 200 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), osteocalcina (OCN, 1: 200 Santa Cruz Biotechnology, Inc, Dallas, TX, EUA) e sialoproteína óssea (BSP , 1: 200 EMD Millipore, Billerica, MA, EUA) e kits AEC (Life Technologies, Frederick, MD, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Imagens digitais foram obtidas com aumento de 100 × na área trabecular das epífises femorais. O citoplasma das células positivas foi corado de vermelho. A densidade óptica integrada média de células positivas foi analisada pelo software Image-Pro Plus.

Proliferação in vivo e ensaio de diferenciação de BMSCs

As BMSCs foram colhidas de camundongos Osx-335 Tg de 6 semanas a 8 semanas de idade e seus companheiros de ninhada WT. Os fêmures e tíbias foram isolados imediatamente após a eutanásia e os tecidos moles removidos. Ambas as extremidades dos ossos longos foram excisadas. DMEM foi usado para limpar a medula do eixo com uma agulha 27G. Uma suspensão unicelular foi obtida e cultivada em meio de manutenção não diferenciador (DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS Life Technologies, Grand Island, NY, EUA), 100 UI / mL de penicilina e 100 µg / mL de estreptomicina). 28

As BMSCs foram semeadas a 1 × 10 4 / poço em placas de cultura de 96 poços e incubadas a 37 ° C. O número de células viáveis ​​foi determinado pelo Cell Counting Kit-8 (ensaio CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante em 1, 2, 5, 8 e 12 dias.

Para induzir a diferenciação osteogênica, BMSCs confluentes foram cultivadas em meio de indução osteogênica (α-MEM suplementado com 10% de FBS, 100 IU / mL de penicilina, 100 µg / mL de estreptomicina, 1 × 10 –8 M dexametasona, 1 × 10 –2 M β -glicerofosfato e 50 µg / mL de ácido L-ascórbico) por 7 e 14 dias. Para induzir a condrogênese, as células confluentes foram incubadas em meio de indução condrogênica (DMEM de alta glicose suplementado com 10% de FBS, 100 IU / mL de penicilina, 100 µg / mL de estreptomicina, 1 × 10-8 M dexametasona, 50 µg / mL L-ascórbico ácido e fator de crescimento transformador-β3 de 10 ng / mL (TGF-β3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA) por 14 dias. Para induzir a adipogênese, as BMSCs foram cultivadas em meio de indução adipogênico (α-MEM suplementado com FBS a 10%, 100 IU / mL de penicilina e 100 µg / mL de estreptomicina, 1 × 10 –8 M de dexametasona e 6 ng / mL de insulina (SAFC Biosciences) por 14 dias. O RNA total foi então preparado a partir de culturas de BMSCs com reagente TRIzol. Transcrição reversa foram realizados o ensaio e o ensaio qRT-PCR.Os lisados ​​de proteínas inteiras foram preparados com tampão de lise RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante e utilizados para analisar a expressão de proteínas por análise de Western blot.

A coloração com vermelho de alizarina in vitro foi realizada essencialmente como descrito 29, 30 após as BMSCs terem sido mantidas em meio induzido por 4 semanas. Para a quantificação da mineralização, o Alizarin Red-S foi extraído com cloreto de cetilpiridínio a 10% e avaliado a 562 nm. A acumulação de matriz alcianofílica com aparência de condroide foi usada como evidência do potencial condrogênico de BMSC e avaliada por coloração com azul de Alcian. O acúmulo intracelular de lipídios neutros foi usado como um indicador de adipogênese in vitro e detectado por coloração com óleo vermelho conforme descrito. 29

Preparação de andaime, cirurgia animal e análise de osso recém-formado

O andaime de fibroína de seda (em forma de disco, 4 mm de diâmetro, 2 mm de espessura) foi preparado como descrito. 31 BMSCs foram isoladas de camundongos WT e Osx-335 Tg de 6 semanas de idade, respectivamente, e cultivadas em meio de manutenção não diferenciador. Após atingir a confluência, as células foram colhidas com tripsina / EDTA (0,25% p / vol tripsina, 0,02% EDTA) e concentradas em suspensões de células 2 × 10 7 / mL. As suspensões de células foram então semeadas no suporte e incubadas durante a noite para permitir a fixação de BMSC ao suporte antes da cirurgia animal.

Ratinhos C57BL / 6J machos com oito semanas de idade (peso corporal 25 ± 2 g) foram atribuídos aleatoriamente a dois grupos. Sob anestesia geral, defeitos calvarianos de tamanho crítico de 4 mm de diâmetro foram criados em cada lado do osso da calvária usando uma broca dentária. Os defeitos ósseos do grupo controle foram reparados usando scaffold com WT BMSCs, e o grupo transgênico foi implantado com BMSCs transgênicas. Os camundongos foram sacrificados 12 semanas após a cirurgia.

Após a eutanásia, os ossos da calvária foram colhidos e fixados em paraformaldeído 4%. Em seguida, as amostras foram mergulhadas em etanol 75% e avaliadas por µCT. A análise histomorfométrica tridimensional foi realizada automaticamente e o volume ósseo / volume do tecido (VB / VC) foi registrado.

Após a análise de µCT, as amostras foram descalcificadas em EDTA a 10%, incluídas em parafina e cortadas em seções de tecido de 6 µm de espessura. A coloração H&E foi realizada em seções de tecido. As imagens digitais foram obtidas com um microscópio OLYMPUS BX53. O osso neoformado foi quantificado em três seções de cinco animais diferentes com aumento de 200 × usando o software Image-Pro Plus. A proporção de osso neoformado para a área total do defeito (BV / TV) foi calculada. Além disso, a coloração imuno-histoquímica foi realizada com anticorpos para osteocalcina. Imagens digitais foram tiradas e a densidade óptica integrada média de células OCN-positivas foi analisada pelo software Image-Pro Plus conforme descrito anteriormente. 35

Análise estatística

Os resultados são apresentados como média ± DP. Os níveis de expressão da luciferase em diferentes tecidos de camundongos transgênicos foram analisados ​​por ANOVA unilateral com teste post hoc de Tukey. As diferenças entre os camundongos transgênicos e WT foram analisadas por t teste. Os dados foram considerados significativos em p & lt 0,05.


Discussão

IFNα (Lucifora et al, 2014) e IFNγ (Xia et al, 2016) pode desencadear uma remoção não citolítica de cccDNA de HBV do núcleo de hepatócitos infectados de uma forma dependente de A3A desaminase. A nuclease que servia para degradar o DNA desaminado, entretanto, era desconhecida. No presente estudo, identificamos ISG20 como a nuclease chave envolvida na purga de cccDNA desencadeada por interferon. Nós mostramos que ISG20 é expresso em tratamentos com IFNα e IFNγ em hepatócitos diferenciados e em amostras de tecido hepático de pacientes com hepatite B autolimitada aguda. No entanto, não foi detectado em infecção crônica, a menos que HDV ou HCV, vírus de RNA que desencadeiam IFN respostas, co-infecta o fígado. Após a indução do interferon, o ISG20 localizou-se nos nucléolos em vez de nos corpos nucleares de PML, onde pode ter como alvo o cccDNA do HBV. O knockdown de ISG20 bloqueou a perda de cccDNA induzida por interferon, e ISG20 em conjunto com a expressão de A3A foi suficiente para reduzir o cccDNA transcricionalmente ativo quando ambas as enzimas eram cataliticamente ativas. ISG20 foi enriquecido em DNA de fita simples contendo desoxiuridina que mimetizou o DNA de HBV desaminado de A3A. Assim, fornecemos fortes evidências de que ISG20 é a nuclease principal a jusante, que finalmente cliva o cccDNA "danificado".

ISG20 é conhecido por ser induzido por respostas celulares à sinalização de interferon (Gongora et al, Espert 1997 et al, 2006 Liu et al, 2017) e é encontrado nos núcleos e citoplasma dos hepatócitos em resposta ao tratamento com IFNα (Lu et al, 2013). ISG20 é uma exonuclease de 3 ′ a 5 ′ que, como a desaminase A3A, atua principalmente em substratos de RNA e DNA de fita simples (Nguyen et al, 2001). Nosso estudo mostra que, de forma semelhante ao A3A, ele pode se ligar ao DNA de fita simples e degrada o ssRNA de forma eficiente e, até certo ponto, também ao DNA de fita simples e dupla em vitro. Quando todo o proteoma celular estava presente, o ISG20 foi enriquecido em DNA de fita simples contendo desoxiuridina, que mimetizou o cccDNA desaminado de A3A em um estado transcricionalmente ativo. Durante a transcrição ativa, o cccDNA precisa formar uma bolha de transcrição, que torna o cccDNA parcialmente de fita simples (Liu et al, 2010 Nassal, 2015). Isto está de acordo com a observação de que o tratamento com IFNα e a expressão combinada de A3A e ISG20 são eficazes apenas na redução dos níveis de cccDNA quando a proteína HBx é expressa que permite a transcrição de cccDNA (Lucifora et al, 2011). O fato de ISG20 ser uma exonuclease (Nguyen et al, 2001) implica que seu substrato de DNA de HBV foi danificado anteriormente, isto é, os uracilos introduzidos por APOBEC3 desaminases foram removidos e quebras de fita de DNA foram formadas. Consequentemente, a expressão de ISG20 por si só não foi suficiente para afetar os níveis de cccDNA em nossos experimentos. No entanto, uma expressão combinada de ISG20 e A3A reduziu o cccDNA. Este efeito só foi alcançado expressando A3A nativa e ISG20, mas não usando variantes cataliticamente inativas (Nguyen et al, Stenglein de 2001 et al, 2010), demonstrando que as atividades de desaminase e nuclease são necessárias para a purga de cccDNA. Uma vez que A3A apenas desamina as citosinas em uracilos, parece razoável que os fatores celulares expressos constitutivamente removem os uracilos do DNA levando à formação de locais apurínicos / apirimidínicos (AP) e introduzem quebras na fita. O cccDNA danificado resultante torna-se então um substrato para ISG20. Em consonância com isso, os locais AP mostraram ser formados durante a purga de cccDNA induzida por tratamento com IFNα ou ativação de LTβR (Lucifora et al, 2014). Foi relatado que os locais AP são gerados pela glicosilase UNG no DNA do plasmídeo que é degradado de uma forma dependente do interferon (Stenglein et al, 2010) e estar envolvido na perda de cccDNA após desaminação por AICDA (Chowdhury et al, 2013 Qiao et al, 2016). Assim, parece razoável que a desaminação pelas proteínas APOBEC3 seja seguida por outras etapas enzimáticas gerando cccDNA danificado, que é finalmente degradado por ISG20.

Estudos recentes descreveram mecanismos adicionais de inibição viral por ISG20. Weiss et al, (2018) descreve que ISG20 exerce atividade antiviral indireta atuando como um regulador mestre de proteínas de resposta de interferon tipo I que impedem a tradução de RNAs de alfavírus infectantes no citoplasma. Wu et al, (2019) demonstram que ISG20 inibe a tradução do RNA do vírus da estomatite vesicular sem degradar o RNA. Eles descobriram que o ISG20 exerce controle sobre um grande painel de RNAs não próprios, poupando transcritos endógenos e, aparentemente, é capaz de discriminar a origem própria e não própria do RNA celular por meio da modulação da tradução.

Além desses efeitos indiretos, a degradação de RNAs virais foi descrita como o efeito antiviral mais proeminente do ISG20. A expressão de ISG20 inibe a replicação de HBV pela diminuição de RNAs de HBV, pelo que a atividade de exonuclease de ISG20 é necessária (Leong et al, 2016 Ma et al, 2016 Liu et al, 2017). Recentemente, foi demonstrado que a degradação do RNA do HBV depende da modificação N6-metiladenosina do nucleotídeo A1907 presente duas vezes no RNA do HBV genômico terminalmente redundante (Imam et al, 2020). Por meio deste, a ligação de ISG20 ao RNA de HBV é mediada por uma proteína leitora de N6-metiladenosina. Consistente com esses achados, os RNAs do VHB, bem como o DNA do VHB intracelular total, foram reduzidos em nossos experimentos, quando o ISG20 foi expresso em células infectadas pelo VHB. O DNA intracelular do HBV consiste principalmente em rcDNA citoplasmático, que está localizado exclusivamente dentro dos capsídeos e, portanto, muito provavelmente protegido do ataque de nuclease. Assim, a redução do DNA citoplasmático do HBV também pode ser explicada pela degradação direta do RNA pré-genômico pelo ISG20 (Leong et al, 2016 Liu et al, Imam 2017 et al, 2020) ou inibição estérica da encapsidação de RNA pré-genômico por ISG20 (Liu et al, 2017). Isso, no entanto, não é suficiente para explicar a redução do cccDNA do VHB nuclear.

Em nossos experimentos, o silenciamento de ISG20 mediado por siRNA ou shRNA poderia resgatar os níveis de cccDNA, mas não influenciou a redução mediada por interferon de HBV DNA ou HBeAg. Isso indica fortemente que a atividade do ISG20 tem como alvo o cccDNA diretamente e não indiretamente, reduzindo o RNA pré-genômico ou a reimportação de cápsides de HBV contendo rcDNA para o núcleo. Além disso, as células dHepaRG carecem de amplificação de cccDNA por reimportação ou reinfecção do capsídeo nuclear (Hantz et al, 2009). O efeito do interferon em HBeAg e HBV rcDNA é explicado por seus efeitos antivirais adicionais conhecidos, como silenciamento epigenético mediado por IFNα de cccDNA resultando em inibição da transcrição (Belloni et al, Tropberger 2012 et al, 2015), a desestabilização induzida por citocinas do RNA do VHB (Heise et al, 1999), ou a inibição da formação ou decadência acelerada de capsídeos contendo ácido nucleico de HBV por interferons do tipo I ou II (Wieland et al, 2005 Xu et al, 2010). Tomados em conjunto, isso indica que ISG20 induzido por interferon pode esgotar diretamente o pool de cccDNA nuclear, fortalecendo ainda mais a noção de que a perda de cccDNA mediada por ISG20 sob tratamento com interferon não é um artefato de níveis reduzidos de rcDNA citoplasmático, mas uma consequência de ISG20 induzido por interferon que tem como alvo nuclear HBV cccDNA.

Em nossos experimentos, o knockdown mediado por shRNA de ISG20 aboliu a perda de cccDNA induzida por IFNγ completamente, mas a redução mediada por IFNα foi apenas parcialmente resgatada. O efeito de knockdown de ISG20 mais fraco sob tratamento com IFNα pode refletir um knockdown incompleto. Outra explicação possível é uma compensação por outras nucleases, que podem auxiliar no funcionamento do ISG20. Stenglein et al (2010) levantaram a hipótese de que a nuclease APEX1 degrada DNA estranho após desaminação por A3A (Stenglein et al, 2010), mas um knockdown de APEX1 não afetou a redução de cccDNA mediada por IFNγ em nossos experimentos (Xia et al, 2016). As análises de expressão gênica por microarrays exibiram a indução de nucleases induzidas por IFNα adicionais. No entanto, a adição de interferons às células que expressam A3A e ISG20 não pode aumentar o efeito no declínio de cccDNA já causado por A3A e ISG20.

Por análise de expressão gênica em todo o genoma e análise de ontologia gênica, identificamos várias nucleases induzidas por interferon que poderiam afetar a estabilidade do cccDNA. No entanto, seu envolvimento é improvável, uma vez que eles se localizam no compartimento celular errado ou não foram ou foram apenas minimamente induzidos por interferon em experimentos posteriores. RAD9A é uma DNase com preferência para fitas simples em relação às duplas (Bessho & Sancar, 2000) localizando-se no núcleo (Yoshida et al, 2003), mas foi apenas fracamente induzido em células dHepaRG por interferons. PNPT1 codifica para o polinucleotídeo fosforilase humano RNase (hPNPase) que se localiza no espaço intermembranar mitocondrial (Chen et al, 2007), e a exoribonuclease XRN1 é uma RNase citoplasmática (Nagarajan et al, 2013). PELO (homólogo de pelota de proteína) tem um sinal de localização nuclear (Shamsadin et al, 2000), também se localiza no citoesqueleto e pode degradar mRNAs aberrantes (Burnicka-Turek et al, 2010), mas não pudemos confirmar sua regulação positiva por interferons em células dHepaRG.

Em estudos semelhantes aos nossos, a superexpressão da desaminase AICDA foi relatada como suficiente para reduzir os níveis de cccDNA (Chowdhury et al, 2013 Qiao et al, 2016). Não pudemos confirmar uma indução de AICDA e não detectar nenhuma diminuição dos níveis de cccDNA quando apenas A3A foi superexpresso, indicando que A3A sozinho não é suficiente para permitir a degradação de cccDNA. Quando ISG20 foi co-expresso, cccDNA foi diminuído em nossos experimentos de cultura de células em células dHepG2H1.3-A3A que foram diferenciadas para estabilizar pools de cccDNA (Protzer et al, 2007), bem como nas células dHepaRG-TR-A3A, nas quais o cccDNA é derivado apenas do vírus de entrada (Hantz et al, 2009). Descobrimos que a expressão combinada de A3A e ISG20 é suficiente para reduzir os níveis de cccDNA para menos de 50% do controle sem tratamento adicional. Este achado pode abrir a oportunidade para intervenção terapêutica ao desencadear especificamente a expressão de A3A e ISG20 ou entrega direta de A3A e ISG20 aos hepatócitos e tem a chance de evitar os efeitos colaterais da terapia sistêmica com IFNα (Janssen et al, 2005 ).

Estudos com chimpanzés mostraram que ISG20 foi expresso no fígado de animais com infecção aguda durante a depuração viral (Wieland et al, 2004), sugerindo que ISG20 estaria disponível para a eliminação do HBV. Confirmamos a regulamentação do ISG20 por meio na Vivo exame histológico para expressão de ISG20 em amostras de tecido hepático de pacientes com hepatite B aguda autolimitada. Notavelmente, durante a hepatite B crônica, o nível de expressão de ISG20 foi tão baixo quanto em amostras de controle. Durante a hepatite B aguda, uma forte resposta de células T polifuncionais é observada (Bertoletti & Ferrari, 2012 Said & Abdelwahab, 2015) que tem efeitos citolíticos, mas também não citolíticos no HBV (Murray et al, 2005). A simulação matemática da eliminação do VHB em chimpanzés apoiou a noção de que, durante a fase inicial da eliminação do VHB, os mecanismos efetores das células T não citopáticas inibem a replicação viral e encurtam muito a meia-vida do cccDNA de longa duração, limitando assim a extensão em que As funções efetoras das células T citopáticas e a destruição do tecido são necessárias para encerrar a infecção aguda por HBV (Murray et al, 2005). De acordo com esta observação, no local hybridization showed increased mRNA amounts of A3A and A3B in human liver tissue in acute but not in chronic hepatitis B (Xia et al, 2016 ) and T-cell cytokines IFNγ and tumor necrosis factor alpha (TNFα) (Xia et al, 2016 ) or T cell-mediated LTβR activation (Koh et al, 2018 ) lead to non-cytolytic cccDNA reduction, most likely via induction of A3 deaminases and ISG20.

During chronic HBV infection, in contrast, the T-cell response is weak. HBV-specific T cells are scarce and partially exhausted, and thus, there is little cytokine secretion (Gehring & Protzer, 2019 Rehermann & Thimme, 2019 ). Coinfection with HDV or HCV during chronic hepatitis B restored ISG20 expression in liver tissue samples. HDV (Giersch et al, 2015 ) and HCV (Su et al, 2002 Heim & Thimme, 2014 ) trigger innate immune responses and induce interferons. Accordingly, chronic hepatitis B patients responding to IFNα therapy showed increased ISG20 expression as compared to non-responders (Xiao et al, 2012 Lu et al, 2013). Taken together, clinical data strongly support the notion that ISG20 is critically involved in HBV elimination na Vivo and acts as the DNase targeting the HBV persistence form cccDNA during viral clearance.

In summary, this study shows that ISG20 is the nuclease responsible for an interferon-induced decline of HBV cccDNA. Co-expression of catalytically active ISG20 and A3A is sufficient to reduce HBV cccDNA, opening new avenues for therapeutic targeting of the HBV persistence form, which remains a difficult target for antiviral therapies that aim at curing chronic hepatitis B.


D iscussion

This work was an investigation of gene expression at the single cell level during the early steps of differentiation of mESCs. The main focus was on differentiation towards the neuronal lineage. A expressão de Pou5f1 e Sox1 was chosen as marker of pluripotent cells and early neuronal precursors, respectively. The main findings are (a) the initial activation of Sox1 occurs in cells that contain varying amounts of Pou5f1 mRNA and protein (b) early differentiation appears to be characterized by the existence of a transient population of cells which simultaneously transcribe pluripotency and early lineage markers at the single cell level (c) the increase in Sox1 expression occurs through an increase both in the proportion of active alleles in the cell population and in the average transcriptional output at each of these alleles.

Pou5f1 is well known to be one of the pluripotency-associated genes with the broadest temporal and spatial patterns of expression, encompassing pluripotent cells in the inner cell mass, in the epiblast and in the primitive ectoderm of the embryo 41 . Several reports indicated that the expression of Pou5f1 was maintained during the earliest stages of differentiation, especially towards the neuronal lineage. In mouse, neural stem cells prepared from the whole cerebrum of E14 embryos were found to express Pou5f1, although at low levels 42 . Expressão de Pou5f1 was also detected by qRT-PCR in early populations of Sox1-expressing neural plate cells derived from epiblast stem cells 43 . Recently, the coexpression of pluripotent and early neuronal markers (POU5F1 e PAX6) in lineage-primed human ESCs was confirmed by single-cell qRT-PCR 11 . Genome-wide expression profiling of mESCs differentiating towards the neuronal lineage under conditions similar to the ones used here (low density plating in serum-free medium) revealed that cells convert from pluripotency to a primitive ectoderm-like state before becoming neuroepithelial progenitors 44 . The intermediate step is characterized by the expression of Fgf5 in a cell population that still expresses Pou5f1, reminiscent of what is observed in the E5.5–E6.5 epiblast of the mouse embryo 22, 45 . Interestingly, mESCs cultured at low densities in serum-free medium supplemented with LIF are able to generate spheres of cells which display these features 46 . As they will revert to pluripotency when transferred to mESC culture conditions, it has been suggested that these LIF-dependent primitive neural stem cells represent a reversible stage of neural commitment 47 .

In view of their similarity in terms of gene expression and of their early and transient appearance, it is probably safe to assume that the cells that were found in this study to coexpress Pou5f1 e Sox1 are phenotypically similar to the primitive neural stem cells described in the reports cited above. The quantitative analysis of gene expression that was performed here revealed a novel property of these cells, that is, a general lack of correlation between the expression levels of the pluripotency and the early differentiation markers in single cells. Thus, despite a approximately eightfold range in Pou5f1 protein levels and a approximately 25-fold range in mRNA counts, the expression levels of Sox1 varied equally and independently of those of Pou5f1 24 hours after the induction of differentiation. Obviously, cellular differentiation is not a synchronized process at the level of single cells 48 cells that expressed high levels of either Pou5f1 ou Sox1 after only 1 day of differentiation could be found these presumably represented earlier or later stages of differentiation. The cells of interest here, however, are those that expressed intermediate levels of expression, in which the expression levels were found not to be correlated. The importance of rigorous quantification of gene expression in arriving at this conclusion has to be emphasized. In this regard, it should be noted that smRNA FISH offered a better approach than immunostaining because the signals are discrete and can be expressed as counts instead of as relative intensity levels 49 . In addition, by measuring RNA levels, smRNA FISH provided a more immediate read-out of the transcriptional changes that occurs early in differentiation. It is therefore significant that the Pou5f1 e Sox1 abundance were even less correlated at the mRNA level than at the protein level in coexpressing cells.

Previous reports have revealed an active role for Pou5f1 in neuronal differentiation 42, 50 . Recently, under culture conditions similar to the ones used here, that is, defined N2B27 medium, Pou5f1 was shown to be expressed for up to 3 days after exit of mESCs from ground state pluripotency and to cooperate with Otx2 in the activation of genes involved in neural development and Wnt signaling 51 . On the other hand, it was suggested that Pou5f1 specifically suppresses the neural ectodermal fate in cells engaged in mesendodermal differentiation 52 . Notwithstanding these divergent proposals, the present observation of uncorrelated expression between Pou5f1 e Sox1 would seem to suggest that Pou5f1 levels alone do not play an instructive role during the early differentiation process. In this context, it can be argued that artificial increases or decreases of Pou5f1 levels may instead exert their effects on cellular differentiation through selection of certain cell fates, as suggested by the fact that the altered Pouf51 expression levels have to be sustained for at least 5 days (or in stable cell lines) to influence cellular differentiation 33, 50 .

An important finding of the present study is undoubtedly that there can exist differentiating mESCs that actively transcribe both Pou5f1 e Sox1, as visualized by the cooccurrence of nascent transcription signals in individual cell nuclei. A similar observation was made for Pou5f1 e T-brachyury in the case of cells differentiating in untreated embryoid bodies towards the mesendodermal lineage, of which T-brachyury is an early marker. Taken together, these observations indicate that coexpression is the result of an active cellular process whereby the Pou5f1 gene continues to be transcribed during the early steps of differentiation as lineage-specific genes are being activated. This promiscuity may be a result of the epigenetic environment of the ESC genome. Indeed, it has been shown that in these cells the chromatin at promoters of numerous lineage markers, including Sox1, is characterized by histone modifications that are associated both with chromatin accessibility (methylated H3K4) and transcriptional repression (trimethylated H3K27) 53, 54 . It is tempting to speculate that these bivalent structures are inherently unstable and that they are dismantled at the beginning of differentiation more rapidly than repressive marks are added at the Pou5f1 locus.

Transcription has been shown to be a discontinuous process, with pulses of activity interspersed with periods of inactivity 14 . A recent report described the pulsatile nature of Nanog transcription in living undifferentiated mESC 18 . By comparing transcriptional dynamics in cells grown in conditions that are known to influence the extent of cell-to-cell variability in Nanog expression (serum vs. MEK/GSK3 inhibition), the authors found that Nanog transcription was not regulated through changes in the number of transcripts per transcriptional event, but rather by the frequency of pulsing in individual cells. The data presented here are consistent with the transcription of both Pou5f1 e Sox1 displaying a pulsing behavior at each time point, many of the cells that contained mature mRNAs in the cytoplasm did not show any signal indicative of ongoing transcription in the nucleus. The changes that were observed in the proportion of cells that did show a nuclear signal suggest that the frequency of Pouf51 pulsing decreases during early differentiation and that, conversely, the pulsing frequency of Sox1 aumenta. Direct measurement of transcriptional output at the active alleles revealed no change for Pou5f1, but a approximately 30% increase for Sox1, suggesting that transcriptional pulse size also increases during differentiation for this gene. A recent work, which calculated the transcriptional parameters of transgenes integrated randomly across the entire genome, suggested that an increase in activity occurs first through increased pulsing frequency and, upon expression levels reaching a certain threshold, through increased size of the transcriptional bursts 55 . The data for Sox1 are in general agreement with this model, which may represent a general mode of transcriptional dynamics during ESC differentiation. As was performed for Nanog in pluripotent cells 18 , live cell imaging of gene transcription will be needed to analyze whether and how changes in the frequency, the duration, and the intensity of transcriptional pulses correlate with cell fate decisions in differentiating mESCs.

The picture that emerges from this study is one in which transcriptional activities appear uncoordinated within single cells at an early, transient stage of mESC differentiation. As pluripotent and early differentiation markers belong to transcriptional “programs” that are generally viewed as antagonistic, the finding that both can be transcribed in the same cell suggests a mechanistic uncoupling of gene regulation across the mESC genome upon exit from pluripotency. The molecular nature of this putative uncoupling remains unknown. Its clear consequence, however, is an increased stochasticity in gene expression at early steps of cellular differentiation. Although none extended the analysis to nascent transcription, as was done here, a number of recent studies have highlighted the stochastic nature of gene expression during early differentiation. Por exemplo, Tbx21 e Gata3, which mark the mutually exclusive Th1 and Th2 fates, were found by smRNA FISH to be coexpressed in the same individual cells during the early stages of CD4 T cell differentiation 56 . Interestingly, the expression levels of these two transcription factors did not correlate with those of their target cytokines Ifng e Il4, respectively, further pointing to a general uncoupling of transcriptional regulation in the early steps of differentiation. Coexpression of transcription factors that subsequently become cell-type restricted was also reported in the preimplantation mouse embryo 57 . In another work on mouse embryo, single cell qRT-PCR analysis showed that the expression of lineage-specific markers in the inner cell mass was uncorrelated early in the lineage segregation process, and that evidence for hierarchy appeared only later through what the authors referred to as signal reinforcement, mainly of the Fgf4 type 58 . Finally, single cell analysis revealed an early stochastic phase during cellular reprogramming of mouse embryonic fibroblast into induced pluripotent stem cells, with no specific sequence or order of gene expression before the re-activation of Nanog 59 . In line with these results, current models postulate that early ESC differentiation is linked to increased stochasticity in gene expression and that multilineage priming at the single cell level is a pre-requisite step in the process 60-62 . The results presented here show for the first time that this priming can occur in cells that are actively transcribing a pluripotent marker. Furthermore, they suggest that the process is associated with changes in transcriptional dynamics, a likely source of gene expression noise in the cell population 63 . Additional work is needed to investigate how cellular lineage decisions are made in stochastic conditions.


Materiais e métodos

Plant material

o del mutant, line JI:8, is closely related to the wild-type line, JI:7. o incolorata I mutant, line Jl:569, was obtained from Professor Linnert, Frei University of Berlin in 1984 and outcrossed to JI:7. Segregation in the F2 allowed the selection of ivory inc I : del homozigotos. o mutabilis mutant was identified from several individuals segregating in an F2 population from a cross between a stock line carrying decipiens and JI:7 (Stubbe, 1966 ). As origens de del rec (JI:602 JI22) and del 23 (JI:23) have been described by Goodrich et al. ( 1992 ) and Martin et al. () and lines JI:32, JI:33, JI:56, JI:520, and JI:522 have been described by Fincham & Harrison, ( 1967 ), Coen et al., ( 1986 ) and Almeida et al., ( 1989 ).

Construction of a cDNA library from RNA from lobes of del flowers

RNA was extracted from red petal lobes from a del line (Jl:8). cDNA was synthesised from polyA + RNA. EcoRl linkers were ligated to the cDNA ends and cloned into the EcoRl site of λgt10. The resultant library contained c. 6 × 10 6 PFU

Screening of the cDNA library

Approximately 5 × 10 5 PFU were screened using a 32 P-labelled fragment from a cDNA clone of An1 (Spelt et al., 2000 ) amplified from petals of line V26. Three positive plaques were identified. A 2.4 kb KpnI fragment from the largest cDNA insert was subcloned into the KpnI site of pBluescript (Stratagene) and named pJAM1494.

RNA preparation for RNA gel blots

RNA was extracted from petals and RNA gel blots were run as described by Martin et al. ( 1985 ). Probes for biosynthetic genes were prepared as described in Martin et al. ( 1991 ) and Schwinn et al. ( 2006 ).

Isolation of genomic clones

A library of genomic DNA from JI:522 was prepared in λEMBL4 (Martin et al., 1991 ) and screened with pJAM1494. DNA inserts from positive plaques were subcloned as EcoRI fragments into pBluescript. DNA was also isolated from inc I 1 : del e inc I 2 : del lines digested with EcoRI, size-fractionated and cloned into λNM1149. Inserts were screened with pJAM1494 and the positive EcoRI inserts were subcloned into pGEM-T (Promega) and sequenced.

Amplificação de inc I, delila e Delila-like alleles from genomic DNA was performed with iProof polymerase (Bio-Rad) and gene-specific primers (Supporting Information Table S1). Sequences have been submitted to GenBank with the following accession numbers: del 23 , genomic DNA, MW027119: inc I 1 , genomic DNA, MW027120 Incolorata I, cDNA, MW027121 WDR1, cDNA, MW027122.

Phylogenetic tree

Deduced amino acid sequences were aligned using M USCLE (Edgar, 2004 ) to generate a maximum likelihood phylogenetic tree using P hy ML (Guindon et al., 2010 ) with 1000 bootstrap replicates using G eneious (10.0.9) software. Amino acid sequence alignments are shown in Dataset S1.

Biolistic transformation of inc I pétalas

Complementation assays of inc I 1 : del petals were performed by biolistic transformation of petals (Albert et al., 2015). GFP-ER was used as an internal control for identifying transformed cells (Haselhoff et al., 1997 ).

Isolation of AmWDR1

WDR1 was isolated by 3′ Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) PCR (Frohman et al., 1988 ) from line JI:75 using degenerate oligonucleotides K112 and K113 for first and second amplification rounds, respectively. The 5′ end of the WDR1 gene was isolated using a Universal Genome Walker kit (Clontech) and gene-specific primers K127 and K128 for the first and second amplification rounds, respectively. O corpo inteiro WDR1 cDNA was amplified from RNA from petals using primers K133 and K134 and cloned into pJAM1502. For all primers see Table S1.

RNA isolation and qRT-PCR

Whole petals of wild-type (JI:522), rosea dorsea e incolorata I flowers, or dissected wild-type (JI:522) and delila (JI:8) petals (tubes and lobes) were sampled. Total RNA was extracted using Plant RNeasy Isolation kits (Qiagen). For qRT-PCR analysis, cDNA was prepared from 1 µg total RNA using IScript™ gDNA clear cDNA synthesis kits (Bio-Rad), and diluted 20-fold for analysis. qRT-PCR using SsoAdvanced™ Universal SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad), gene-specific primers (Table S1) were normalised to the geometric mean of Ciclofilina e EF1α (Albert et al., 2014). Means ± SEM of three biological replicates were calculated. Two-tailed Student’s t-tests between wild-type and the corresponding mutant samples were performed to determine significant differences. Data were transformed (log10) to account for unequal variance.

Full-length transcripts of Delila e Delila-like were amplified with gene-specific primers (Table S1) and 2GRobust polymerase (Kapa Biosciences), from cDNA synthesised using Superscript II™ reverse transcriptase (Life technologies) and oligo (dT)12–18.

Transient dual luciferase assays in Nicotiana Benthamiana

The ability of different transcription factors to activate the promoter of the Pallida gene encoding dihydroflavonol-4-reductase (DFR) was assessed by combining transient expression via agroinfiltration of N. benthamiana leaves with a quantitative dual luciferase reporter system.

Effector plasmids encoding transcription factors were obtained by cloning coding sequences first into the pDONR207 entry clone (Thermo Fisher Scientific/Invitrogen) and subsequently transferred to the destination vectors pJAM1502 (Ros, Inc1, WDR1) or pMDC32 (Del) using Gateway cloning technology (Thermo Fisher Scientific/Invitrogen). Both vectors are Gateway-compatible binary plasmids that allow strong, constitutive expression of the genes of interest driven by double CaMV 35S promoters (Curtis & Grossniklaus, 2003 Luo et al., 2007 ).

The reporter constructs p2532, p2534 and p2536 were obtained by PCR amplification of the DFR promoter from different A. majus accessions followed by cloning into the pGreen II 0800-LUC vector as Kpneu–NcoI fragments to control the expression of the firefly-derived luciferase reporter gene. This vector also contains a Renilla luciferase gene under the control of a CaMV 35S promoter as an internal control to normalise the values of the experimental reporter gene for variations caused by transfection efficiency (Hellens et al., 2005 ). The reporter constructs containing deletions in the DFR promoter (p2551, p2557, p2565 and p2571) were obtained using the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs) using plasmid p2532 as a template and primers listed in Table S1.

Effector and reporter plasmids were transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101. Reporter plasmids were co-transformed with the helper plasmid pSoup (Hellens et al., 2005 ). Liquid cultures were grown overnight with selection (kanamycin 50 mg l −1 , rifampicin 25 mg l −1 ) and harvested by centrifugation. Cells were washed and resuspended in 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 200 μM acetosyringone to A600 = 0.2. Agrobacterium suspensions were infiltrated into the abaxial surface of expanded leaves of 3-wk-old N. benthamiana plantas. For each combination, five injected areas were treated as biological replicates. Agroinfiltrated leaves were harvested after 3 d and luciferase activity was measured immediately using the Dual-Glo Luciferase Assay System kit (Promega). Leaf discs of 4 mm in diameter were collected in 1.5 ml white transparent tubes containing 100 μl of PBS. A volume of 75 μl of luciferase assay reagent was added and firefly luminescence was measured on a Glomax 20/20 single tube luminometer (Promega) after 10 min. Renilla luminescence was measured on the same instrument 10 min after the addition to the same sample of 75 μl of Stop & Glo reagent. Results were expressed as the ratio of firefly to Renilla luciferase activity (Luc/Ren).


Y.J.L.: Conception and design, collection and/or assembly of data, data analysis and interpretation, manuscript writing N.M. and A.C.T.: Collection and/or assembly of data, data analysis and interpretation T.M.L.: Conception and design, financial support, data analysis and interpretation, and manuscript writing T.M.: Conception and design, financial support, administrative support, data analysis and interpretation, manuscript writing, final approval of manuscript.

The authors indicate no potential conflicts of interest.

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