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Todos os anticorpos contra um antígeno comum são idênticos?

Todos os anticorpos contra um antígeno comum são idênticos?



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Eu entendo que quando algum antígeno (por exemplo, vírus, bactéria, etc.) é reconhecido no corpo, anticorpos específicos para este antígeno são produzidos que, por sua vez, se ligam ao antígeno e os neutralizam efetivamente como uma ameaça potencial ao organismo.

Todos os anticorpos produzidos contra um antígeno específico são necessariamente idênticos? Tanto dentro de um único organismo (por exemplo, uma única pessoa), ou entre diferentes organismos (por exemplo, entre pessoas diferentes, espécies diferentes, etc.)? Se duas pessoas adoecem com a mesma doença, desenvolvem anticorpos e se recuperam, esses anticorpos são iguais? Se um ser humano e algum outro animal ficarem doentes com a mesma doença, os anticorpos desenvolverão correspondências?

A chave para o funcionamento dos anticorpos é o seu reconhecimento / ligação específica do antígeno. Presumo que a estrutura e a composição do anticorpo sejam ajustadas para se ligar a porções específicas expostas no antígeno. Posso imaginar que existem muitos locais de ligação potenciais diferentes no antígeno a ser alvo e muitas combinações possíveis de maneiras de reconhecer esses locais pelos anticorpos. Eu pensaria que seria uma coincidência notável (altamente improvável) se organismos separados, independentemente, desenvolvessem a mesma “estratégia molecular” para reconhecer um antígeno particular. Esse resultado parece estar implícito nesta pergunta: Como os anticorpos específicos para uma doença são detectados no sangue se todos produzem um anticorpo diferente para o mesmo antígeno?


Tudo bem, existem duas questões principais:

(uma) Todos os anticorpos produzidos contra um antígeno específico são necessariamente idênticos?

Na maioria dos casos, não. Os antígenos podem ser monovalentes ou polivalentes, o que significa que eles podem ter um epítopo ou vários epítopos diferentes (um epítopo é o local do antígeno que se liga a um receptor de células T ou B). A maioria dos antígenos é polivalente, o que implica que um único antígeno pode interagir com várias linhagens de células T e B diferentes. Cada linhagem de células B é capaz de produzir e exportar apenas um tipo de anticorpo. Como o antígeno irá interagir com diferentes linhagens, ele promoverá a produção de diferentes tipos de anticorpos. Esses múltiplos anticorpos produzidos contra um antígeno são chamados anticorpos policlonais, uma vez que surgem de várias linhagens clonais. Quando o antígeno possui apenas um tipo de epítopo, ele irá induzir a produção de apenas um tipo de anticorpo, que são chamados de anticorpos monoclonais, porque eles surgem de apenas uma linhagem clonal.

(b) Os anticorpos produzidos contra um determinado antígeno diferem entre membros da mesma espécie ou entre espécies?

Sim, em ambos os casos. Existe uma importante variabilidade genética em torno das imunoglobulinas e dos receptores de células T.

Referência: Karp, G. (2009). Biologia molecular e celular: métodos e conceitos. Wiley. Nova york.


42,3 Anticorpos

Ao final desta seção, você será capaz de fazer o seguinte:

  • Explicar reatividade cruzada
  • Descreva a estrutura e função dos anticorpos
  • Discuta a produção de anticorpos

Um anticorpo, também conhecido como imunoglobulina (Ig), é uma proteína produzida por células plasmáticas após estimulação por um antígeno. Os anticorpos são a base funcional da imunidade humoral. Os anticorpos ocorrem no sangue, nas secreções gástricas e de muco e no leite materno. Os anticorpos nesses fluidos corporais podem ligar patógenos e marcá-los para destruição por fagócitos antes que eles possam infectar as células.

Estrutura de Anticorpo

Uma molécula de anticorpo é composta por quatro polipeptídeos: duas cadeias pesadas idênticas (unidades de peptídeo grandes) que estão parcialmente ligadas uma à outra em uma formação em "Y", que são flanqueadas por duas cadeias leves idênticas (unidades de peptídeo pequenas), conforme ilustrado na Figura 42,22. As ligações entre os aminoácidos cisteína na molécula de anticorpo ligam os polipeptídeos uns aos outros. As áreas onde o antígeno é reconhecido no anticorpo são domínios variáveis ​​e a base do anticorpo é composta de domínios constantes.

Nas células B da linha germinal, a região variável do gene da cadeia leve tem 40 segmentos variáveis ​​(V) e cinco segmentos de junção (J). Uma enzima chamada DNA recombinase retira aleatoriamente a maioria desses segmentos do gene e une um segmento V a um segmento J. Durante o processamento do RNA, todos os segmentos V e J, exceto um, são separados. A recombinação e o splicing podem resultar em mais de 10 6 combinações de VJ possíveis. Como resultado, cada célula B diferenciada no corpo humano normalmente tem uma cadeia variável única. O domínio constante, que não liga o anticorpo, é o mesmo para todos os anticorpos.

Semelhante aos TCRs e BCRs, a diversidade de anticorpos é produzida pela mutação e recombinação de aproximadamente 300 segmentos de genes diferentes que codificam os domínios variáveis ​​da cadeia leve e pesada em células precursoras que são destinadas a se tornarem células B. Os domínios variáveis ​​das cadeias pesadas e leves interagem para formar o local de ligação através do qual um anticorpo pode se ligar a um epítopo específico em um antígeno. Os números de domínios constantes repetidos nas classes de Ig são iguais para todos os anticorpos correspondentes a uma classe específica. Os anticorpos são estruturalmente semelhantes ao componente extracelular dos BCRs, e a maturação das células B em células plasmáticas pode ser visualizada em termos simples, à medida que a célula adquire a capacidade de secretar a porção extracelular de seu BCR em grandes quantidades.

Classes de Anticorpos

Os anticorpos podem ser divididos em cinco classes - IgM, IgG, IgA, IgD, IgE - com base em suas propriedades físico-químicas, estruturais e imunológicas. IgGs, que constituem cerca de 80 por cento de todos os anticorpos, têm cadeias pesadas que consistem em um domínio variável e três domínios constantes idênticos. IgA e IgD também têm três domínios constantes por cadeia pesada, enquanto IgM e IgE cada um tem quatro domínios constantes por cadeia pesada. O domínio variável determina a especificidade de ligação e o domínio constante da cadeia pesada determina o mecanismo imunológico de ação da classe de anticorpo correspondente. É possível que dois anticorpos tenham as mesmas especificidades de ligação, mas estejam em classes diferentes e, portanto, estejam envolvidos em funções diferentes.

Depois que uma defesa adaptativa é produzida contra um patógeno, normalmente os plasmócitos secretam primeiro IgM no sangue. BCRs em células B virgens são da classe IgM e ocasionalmente da classe IgD. As moléculas de IgM constituem aproximadamente dez por cento de todos os anticorpos. Antes da secreção do anticorpo, as células plasmáticas montam moléculas de IgM em pentâmeros (cinco anticorpos individuais) ligados por uma cadeia de junção (J), como mostrado na Figura 42.23. O arranjo do pentâmero significa que essas macromoléculas podem se ligar a dez antígenos idênticos. No entanto, as moléculas de IgM liberadas no início da resposta imune adaptativa não se ligam aos antígenos de forma tão estável quanto as IgGs, que são um dos possíveis tipos de anticorpos secretados em grandes quantidades após a reexposição ao mesmo patógeno. A Figura 42.23 resume as propriedades das imunoglobulinas e ilustra suas estruturas básicas.

IgAs povoam a saliva, lágrimas, leite materno e secreções de muco dos tratos gastrointestinal, respiratório e geniturinário. Coletivamente, esses fluidos corporais revestem e protegem a extensa mucosa (4000 pés quadrados em humanos). O número total de moléculas de IgA nessas secreções corporais é maior do que o número de moléculas de IgG no soro sanguíneo. Uma pequena quantidade de IgA também é secretada no soro na forma monomérica. Por outro lado, algum IgM é secretado nos fluidos corporais da mucosa. Semelhante ao IgM, as moléculas de IgA são secretadas como estruturas poliméricas ligadas a uma cadeia J. No entanto, IgAs são secretados principalmente como moléculas diméricas, não pentâmeros.

A IgE está presente no soro em pequenas quantidades e é mais bem caracterizada em seu papel como mediador de alergia. IgD também está presente em pequenas quantidades. Semelhante ao IgM, os BCRs da classe IgD são encontrados na superfície das células B virgens. Esta classe suporta o reconhecimento de antígenos e a maturação de células B em células plasmáticas.

Funções de Anticorpo

As células plasmáticas diferenciadas são atores cruciais na resposta humoral, e os anticorpos que secretam são particularmente significativos contra patógenos extracelulares e toxinas. Os anticorpos circulam livremente e atuam independentemente das células plasmáticas. Os anticorpos podem ser transferidos de um indivíduo para outro para proteger temporariamente contra doenças infecciosas. Por exemplo, uma pessoa que recentemente produziu uma resposta imune bem-sucedida contra um agente de doença em particular pode doar sangue a um receptor não imune e conferir imunidade temporária por meio de anticorpos no soro sanguíneo do doador. Este fenômeno é denominado imunidade passiva e também ocorre naturalmente durante a amamentação, o que torna os bebês amamentados altamente resistentes a infecções durante os primeiros meses de vida.

Os anticorpos revestem os patógenos extracelulares e os neutralizam, conforme ilustrado na Figura 42.24, bloqueando os principais locais do patógeno que aumentam sua infecciosidade (como os receptores que “atracam” os patógenos nas células hospedeiras). A neutralização de anticorpos pode evitar que os patógenos entrem e infectem as células hospedeiras, ao contrário da abordagem mediada por CTL de matar células que já estão infectadas para prevenir a progressão de uma infecção estabelecida. Os patógenos revestidos de anticorpos neutralizados podem então ser filtrados pelo baço e eliminados na urina ou nas fezes.

Os anticorpos também marcam os patógenos para destruição por células fagocíticas, como macrófagos ou neutrófilos, porque as células fagocíticas são altamente atraídas por macromoléculas complexadas com anticorpos. A intensificação fagocítica por anticorpos é chamada de opsonização. Em um processo denominado fixação do complemento, IgM e IgG no soro se ligam aos antígenos e fornecem locais de encaixe nos quais as proteínas sequenciais do complemento podem se ligar. A combinação de anticorpos e complemento aumenta ainda mais a opsonização e promove a eliminação rápida de patógenos.

Afinidade, avidez e reatividade cruzada

Nem todos os anticorpos se ligam com a mesma força, especificidade e estabilidade. Na verdade, os anticorpos exibem diferentes afinidades (atração) dependendo da complementaridade molecular entre o antígeno e as moléculas de anticorpo, conforme ilustrado na Figura 42.25. Um anticorpo com uma afinidade mais alta para um antígeno particular se ligaria mais forte e estável e, portanto, seria esperado que apresentasse uma defesa mais desafiadora contra o patógeno correspondente ao antígeno específico.

O termo avidez descreve a ligação por classes de anticorpos que são secretados como estruturas multivalentes unidas (como IgM e IgA). Embora a avidez meça a força de ligação, assim como a afinidade, a avidez não é simplesmente a soma das afinidades dos anticorpos em uma estrutura multimérica. A avidez depende do número de sítios de ligação idênticos no antígeno que está sendo detectado, bem como de outros fatores físicos e químicos. Normalmente, os anticorpos multiméricos, como IgM pentamérico, são classificados como tendo menor afinidade do que os anticorpos monoméricos, mas alta avidez. Essencialmente, o fato de que os anticorpos multiméricos podem ligar muitos antígenos simultaneamente equilibra sua força de ligação ligeiramente inferior para cada interação anticorpo / antígeno.

Os anticorpos secretados após a ligação a um epítopo em um antígeno podem exibir reatividade cruzada para o mesmo epítopo ou epítopos semelhantes em diferentes antígenos. Como um epítopo corresponde a uma região tão pequena (a área de superfície de cerca de quatro a seis aminoácidos), é possível que diferentes macromoléculas exibam as mesmas identidades moleculares e orientações em regiões curtas. A reatividade cruzada descreve quando um anticorpo se liga não ao antígeno que desencadeou sua síntese e secreção, mas a um antígeno diferente.

A reatividade cruzada pode ser benéfica se um indivíduo desenvolver imunidade a vários patógenos relacionados, apesar de ter sido apenas exposto ou vacinado contra um deles. Por exemplo, a reatividade cruzada do anticorpo pode ocorrer contra as estruturas de superfície semelhantes de várias bactérias Gram-negativas. Por outro lado, os anticorpos criados contra componentes moleculares patogênicos que se assemelham a moléculas próprias podem marcar incorretamente as células hospedeiras para destruição e causar danos auto-imunes. Pacientes que desenvolvem lúpus eritematoso sistêmico (LES) comumente exibem anticorpos que reagem com seu próprio DNA. Esses anticorpos podem ter surgido inicialmente contra o ácido nucléico de microrganismos, mas posteriormente reagiram de forma cruzada com antígenos próprios. Este fenômeno também é denominado mimetismo molecular.

Anticorpos do Sistema Imunológico Mucoso

Os anticorpos sintetizados pelo sistema imunológico da mucosa incluem IgA e IgM. As células B ativadas se diferenciam em plasmócitos da mucosa que sintetizam e secretam IgA dimérica e, em menor extensão, IgM pentamérica. A IgA secretada é abundante nas lágrimas, saliva, leite materno e nas secreções do trato gastrointestinal e respiratório. A secreção de anticorpos resulta em uma resposta humoral local nas superfícies epiteliais e evita a infecção da mucosa pela ligação e neutralização de patógenos.


Cinética de interação anticorpo-antígeno

A associação específica de antígenos e anticorpos é dependente de ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, forças eletrostáticas e forças de Van der Waals. Estes são de natureza fraca e não covalente, embora algumas das associações entre o antígeno e o anticorpo possam ser bastante fortes. Como os anticorpos, os antígenos podem ser multivalentes, seja por meio de várias cópias do mesmo epítopo, seja por meio da presença de vários epítopos que são reconhecidos por vários anticorpos. Interações envolvendo multivalência podem produzir complexos mais estabilizados; entretanto, multivalência também pode resultar em dificuldades estéricas, reduzindo assim a possibilidade de ligação. Toda a ligação do anticorpo antígeno é reversível e segue os princípios termodinâmicos básicos de qualquer interação bimolecular reversível: onde KA é a constante de afinidade, [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo anticorpo-antígeno, e [Ab] e [Ag] são as concentrações molares de locais de ligação não ocupados no anticorpo (Ab) ou antígeno (Ag), respectivamente.

O tempo necessário para atingir o equilíbrio depende da taxa de difusão e da afinidade do anticorpo pelo antígeno e pode variar amplamente. A constante de afinidade para a ligação anticorpo-antígeno pode abranger uma ampla faixa, estendendo-se de abaixo de 105 / mol a acima de 1012 / mol. As constantes de afinidade podem ser afetadas pela temperatura, pH e solvente. As constantes de afinidade podem ser determinadas para anticorpos monoclonais, mas não para anticorpos policlonais, uma vez que múltiplas formações de ligação ocorrem entre os anticorpos policlonais e seus antígenos. As medições quantitativas da afinidade do anticorpo para o antígeno podem ser feitas por diálise de equilíbrio. Diálises de equilíbrio repetidas com uma concentração de anticorpo constante, mas concentração de ligante variável, são usadas para gerar gráficos de Scatchard, que fornecem informações sobre valência de afinidade e possível reatividade cruzada.

Ao projetar procedimentos experimentais, é importante diferenciar entre anticorpos monoclonais e policlonais, pois essas diferenças são a base das vantagens e limitações de seu uso.


Uso de anticorpos em testes e identificação

Os imunoensaios enzimáticos (EIAs) usam anticorpos para detectar a presença de antígenos. No entanto, os ensaios são realizados em placas de microtitulação ou na Vivo. Existem muitos tipos diferentes de EIAs, mas todos envolvem uma molécula de anticorpo cuja região constante se liga a uma enzima, deixando a região variável livre para se ligar a seu antígeno específico. A adição de um substrato para a enzima permite que o antígeno seja visualizado ou quantificado (Figura ( PageIndex <4> )).

Em EIAs, o substrato para a enzima é mais frequentemente um cromógeno, uma molécula incolor que é convertida em um produto final colorido. As enzimas mais amplamente utilizadas são a fosfatase alcalina e a peroxidase de rábano, para as quais os substratos apropriados estão prontamente disponíveis. Em alguns EIAs, o substrato é um fluorogênio, uma molécula não fluorescente que a enzima converte em uma forma fluorescente. Os EIAs que utilizam um fluorogênio são chamados de imunoensaios enzimáticos fluorescentes (FEIAs). A fluorescência pode ser detectada por um microscópio de fluorescência ou um espectrofotômetro.

Figura ( PageIndex <4> ): Os imunoensaios enzimáticos, como o ELISA direto mostrado aqui, usam um conjugado enzima-anticorpo para entregar um substrato detectável no local de um antígeno. O substrato pode ser uma molécula incolor que é convertida em um produto final colorido ou uma molécula fluorescente inativa que fica fluorescente após a ativação da enzima. (crédito: modificação do trabalho por & ldquoCavitri & rdquo / Wikimedia Commons)

A vacina MMR é uma vacina combinada que fornece proteção contra sarampo, caxumba e rubéola (sarampo alemão). A maioria das pessoas recebe a vacina MMR na infância e, portanto, tem anticorpos contra essas doenças. No entanto, por várias razões, mesmo os indivíduos vacinados podem se tornar suscetíveis a essas doenças novamente mais tarde na vida. Por exemplo, algumas crianças podem receber apenas uma rodada da vacina MMR em vez das duas recomendadas. Além disso, o título de anticorpos protetores no corpo de um indivíduo pode começar a diminuir com a idade ou como resultado de algumas condições médicas.

Para determinar se o título de anticorpo na corrente sanguínea de um indivíduo é suficiente para fornecer proteção, um teste de título MMR pode ser realizado. O teste é um imunoensaio simples que pode ser feito rapidamente com uma amostra de sangue. O resultado do teste indicará se o indivíduo ainda tem imunidade ou se precisa de outra dose da vacina MMR.

Submeter a um título MMR é frequentemente um requisito pré-emprego para profissionais de saúde, especialmente aqueles que estarão freqüentemente em contato com crianças pequenas ou pacientes imunocomprometidos. Se um profissional de saúde fosse infectado com sarampo, caxumba ou rubéola, o indivíduo poderia facilmente transmitir essas doenças para pacientes suscetíveis, levando a um surto. Dependendo dos resultados do título MMR, os profissionais de saúde podem precisar ser revacinados antes de iniciar o trabalho.

Imunocoloração

Um uso poderoso do EIA é a imunocoloração, na qual os conjugados de anticorpo-enzima aprimoram a microscopia. A imunohistoquímica (IHC) é usada para examinar tecidos inteiros. Como pode ser visto na Figura ( PageIndex <5> ), uma seção de tecido pode ser tingida para visualizar os vários tipos de células. Neste exemplo, um mAb contra CD8 foi usado para corar células CD8 em uma seção de tecido tonsilar. Agora é possível contar o número de células CD8, determinar seus números relativos em relação aos outros tipos de células presentes e determinar a localização dessas células dentro deste tecido. Esses dados seriam úteis para estudar doenças como a AIDS, em que a função normal das células CD8 é crucial para retardar a progressão da doença.

A imunocitoquímica (ICC) é outra forma valiosa de imunocoloração. Embora semelhante ao IHC, no ICC, o material da matriz extracelular é removido e a membrana celular é atacada com álcool para torná-la permeável aos anticorpos. Isso permite que os anticorpos passem pela membrana celular e se liguem a alvos específicos dentro da célula. Organelas, componentes do citoesqueleto e outras estruturas intracelulares podem ser visualizados dessa forma. Embora algumas técnicas de ICC usem EIA, a enzima pode ser substituída por uma molécula fluorescente, tornando-a um imunoensaio fluorescente.

Figura ( PageIndex <5> ): Anticorpos ligados a enzimas contra CD8 foram usados ​​para corar as células CD8 nesta preparação de medula óssea usando um cromógeno. (crédito: modificação do trabalho de Yamashita M, Fujii Y, Ozaki K, Urano Y, Iwasa M, Nakamura S, Fujii S, Abe M, Sato Y, Yoshino T)

  1. Qual é a diferença entre imunohistoquímica e imunocitoquímica?
  2. O que deve ser verdade sobre o produto da reação enzimática usada na imunohistoquímica?

Ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs)

Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) são EIAs amplamente utilizados. No ELISA direto, os antígenos são imobilizados na cavidade de uma placa de microtitulação. Um anticorpo que é específico para um determinado antígeno e é conjugado a uma enzima é adicionado a cada poço. Se o antígeno estiver presente, o anticorpo se ligará. Após a lavagem para remover quaisquer anticorpos não ligados, um substrato incolor (cromógeno) é adicionado. A presença da enzima converte o substrato em um produto final colorido (Figura ( PageIndex <4> )). Embora essa técnica seja mais rápida porque requer o uso de apenas um anticorpo, ela tem a desvantagem de que o sinal de um ELISA direto é mais baixo (menor sensibilidade).

Em um ELISA sanduíche, o objetivo é usar anticorpos para quantificar precisamente o antígeno específico presente em uma solução, como o antígeno de um patógeno, uma proteína sérica ou um hormônio do sangue ou da urina, para listar apenas alguns exemplos. A primeira etapa de um ELISA sanduíche é adicionar o anticorpo primário a todos os poços de uma placa de microtitulação (Figura ( PageIndex <6> )). O anticorpo adere ao plástico por interações hidrofóbicas. Após um tempo de incubação apropriado, qualquer anticorpo não ligado é lavado. Lavagens comparáveis ​​são usadas entre cada uma das etapas subsequentes para garantir que apenas moléculas especificamente ligadas permaneçam fixadas à placa. Uma proteína de bloqueio é então adicionada (por exemplo, albumina ou a caseína da proteína do leite) para ligar os sítios de ligação de proteína não específicos restantes no poço. Alguns poços receberão quantidades conhecidas de antígeno para permitir a construção de uma curva padrão, e soluções de antígenos desconhecidos serão adicionados aos outros poços. O anticorpo primário captura o antígeno e, após uma lavagem, é adicionado o anticorpo secundário, que é um anticorpo policlonal conjugado a uma enzima. Após a lavagem final, um substrato incolor (cromógeno) é adicionado e a enzima o converte em um produto final colorido. A intensidade da cor da amostra causada pelo produto final é medida com um espectrofotômetro. A quantidade de cor produzida (medida como absorbância) é diretamente proporcional à quantidade de enzima, que por sua vez é diretamente proporcional ao antígeno capturado. ELISAs são extremamente sensíveis, permitindo que o antígeno seja quantificado na faixa de nanogramas (10 & ndash9 g) por mL.

Em um ELISA indireto, quantificamos o anticorpo específico do antígeno em vez do antígeno. Podemos usar ELISA indireto para detectar anticorpos contra muitos tipos de patógenos, incluindo Borrelia burgdorferi (Doença de Lyme) e HIV. Existem três diferenças importantes entre ELISAs indiretos e diretos, conforme mostrado na Figura ( PageIndex <7> ). Em vez de usar o anticorpo para capturar o antígeno, o ELISA indireto começa com a anexação do antígeno conhecido (por exemplo, peptídeos do HIV) ao fundo dos poços da placa de microtitulação. Depois de bloquear os locais não ligados na placa, o soro do paciente é adicionado se houver anticorpos (anticorpo primário), eles irão se ligar ao antígeno. Depois de lavar quaisquer proteínas não ligadas, o anticorpo secundário com sua enzima conjugada é direcionado contra o anticorpo primário (por exemplo, imunoglobulina anti-humana). O anticorpo secundário nos permite quantificar quanto anticorpo específico para o antígeno está presente no soro do paciente pela intensidade da cor produzida pela reação enzimática-cromogênica conjugada.

Assim como acontece com vários outros testes de anticorpos discutidos neste capítulo, sempre há preocupação quanto à reatividade cruzada com anticorpos direcionados contra algum outro antígeno, o que pode levar a resultados falso-positivos. Portanto, não podemos diagnosticar definitivamente uma infecção por HIV (ou qualquer outro tipo de infecção) com base em um único ensaio ELISA indireto. Devemos confirmar qualquer teste suspeito positivo, que na maioria das vezes é feito usando um imunoblot que realmente identifica a presença de peptídeos específicos do patógeno ou um teste para identificar os ácidos nucléicos associados ao patógeno, como a transcriptase reversa PCR (RT-PCR ) ou um teste de antígeno de ácido nucleico.

Figura ( PageIndex <6> ): (a) Em um ELISA sanduíche, um anticorpo primário é usado para capturar primeiro um antígeno com o anticorpo primário. Um anticorpo secundário conjugado a uma enzima que também reconhece epítopos no antígeno é adicionado. Após a adição do cromógeno, um espectrofotômetro mede a absorbância do produto final, que é diretamente proporcional à quantidade de antígeno capturado. (b) Uma placa de ELISA mostra diluições de anticorpos (esquerda) e antígenos (parte inferior). Concentrações mais altas resultam em uma cor final mais escura. (crédito b: modificação do trabalho pela Região do Pacífico do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA) Figura ( PageIndex <7> ): O ELISA indireto é usado para quantificar os anticorpos específicos do antígeno no soro do paciente para o diagnóstico de doenças. O antígeno do agente suspeito da doença é anexado às placas de microtitulação. O anticorpo primário vem do soro do paciente, que é subsequentemente ligado pelo anticorpo secundário conjugado à enzima. Medir a produção do produto final nos permite detectar ou quantificar a quantidade de anticorpo específico do antígeno presente no soro do paciente.


Produção de anticorpos monoclonais

Alguns tipos de ensaios requerem melhor especificidade e afinidade de anticorpos do que as que podem ser obtidas usando um anti-soro policlonal. Para atingir essa alta especificidade, todos os anticorpos devem se ligar com alta afinidade a um único epítopo. Esta alta especificidade pode ser fornecida por anticorpos monoclonais (mAbs). A Tabela 1 compara algumas das características importantes dos anticorpos monoclonais e policlonais.

Tabela 1. Características de anticorpos policlonais e monoclonais
Anticorpos Monoclonais Anticorpos Policlonais
Produção cara Produção barata
Longo tempo de produção Produção rápida
Grandes quantidades de anticorpos específicos Grandes quantidades de anticorpos inespecíficos
Reconhecer um único epítopo em um antígeno Reconhecer múltiplos epítopos em um antígeno
A produção é contínua e uniforme uma vez que o hibridoma é feito Lotes diferentes variam em composição

Ao contrário dos anticorpos policlonais, que são produzidos em animais vivos, os anticorpos monoclonais são produzidos em vitro usando técnicas de cultura de tecidos. Os mAbs são produzidos pela imunização de um animal, geralmente um camundongo, várias vezes com um antígeno específico. As células B do baço do animal imunizado são então removidas. Uma vez que as células B normais são incapazes de proliferar para sempre, elas são fundidas com células B cancerosas imortais chamadas células de mieloma, para produzir hibridoma células. Todas as células são então colocadas em um meio seletivo que permite que apenas os hibridomas cresçam. As células de mieloma não fundidas não podem crescer e quaisquer células B não fundidas morrem. Os hibridomas, que são capazes de crescer continuamente em cultura enquanto produzem anticorpos, são então rastreados para o mAb desejado. Aqueles que produzem o mAb desejado são cultivados em cultura de tecidos, o meio de cultura é colhido periodicamente e os mAbs são purificados do meio. Este é um processo muito caro e demorado. Pode levar semanas de cultura e muitos litros de mídia para fornecer mAbs suficientes para um experimento ou para tratar um único paciente. mAbs são caros (Figura 3).

Figura 3. Os anticorpos monoclonais (mAbs) são produzidos pela introdução de um antígeno em um camundongo e, em seguida, pela fusão de células B policlonais do baço do camundongo às células de mieloma. As células de hibridoma resultantes são cultivadas e continuam a produzir anticorpos contra o antígeno. Os hibridomas que produzem o mAb desejado são então cultivados em grande número em um meio seletivo que é colhido periodicamente para obter os mAbs desejados.


Introdução

As interações anticorpo-antígeno (Ab-Ag) são baseadas na ligação não covalente entre o anticorpo (Ab) e o antígeno (Ag). A identificação correta dos resíduos que medeiam o reconhecimento e a ligação de Ag melhoraria nossa compreensão das interações antigênicas e pode permitir a modificação e manipulação de Abs. Por exemplo, a introdução de mutações nos genes V foi sugerida como uma forma de melhorar a afinidade Ab [1] - [3]. No entanto, as mutações nas regiões estruturais (FRs), em vez dos próprios resíduos de ligação de Ag, têm maior probabilidade de evocar uma resposta imune indesejada [4]. Saber quais resíduos se ligam ao Ag pode ajudar a direcionar tais mutações e ser benéfico para a engenharia de Ab [5] - [7]. Foi demonstrado que os resíduos de ligação de Ag estão localizados principalmente nas chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) [7] - [9]. Assim, a tentativa de identificar CDRs, e particularmente a tentativa de definir seus limites, tornou-se o foco de extensas pesquisas nas últimas décadas [7], [8], [10]. Kabat e colegas de trabalho [9], [11] tentaram identificar sistematicamente CDRs em Abs recentemente sequenciados. Sua abordagem foi baseada na suposição de que os CDRs incluem as posições mais variáveis ​​em Abs e, portanto, podem ser identificados alinhando o número bastante limitado de Abs disponíveis então. Com base neste alinhamento, eles introduziram um esquema de numeração para os resíduos nas regiões hipervariáveis ​​e determinaram quais posições marcam o início e o fim de cada CDR. O esquema de numeração de Kabat foi desenvolvido quando nenhuma informação estrutural estava disponível. Chothia et al. [12], [13] analisaram um pequeno número de estruturas Ab e determinaram a relação entre as sequências de Abs e as estruturas de seus CDRs. Os limites dos FRs e dos CDRs foram determinados e os últimos demonstraram adotar um conjunto restrito de conformações com base na presença de certos resíduos em posições-chave nos CDRs e nos FRs flanqueadores. Esta análise sugeriu que os locais de inserções e deleções nas CDRs L1 e H1 são diferentes daqueles sugeridos por Kabat. Assim, o esquema de numeração de Chothia é quase idêntico ao esquema de Kabat, mas com base em considerações estruturais, coloca as inserções nos CDRs L1 e H1 em posições diferentes. À medida que mais dados experimentais se tornavam disponíveis, a análise foi realizada novamente, redefinindo os limites dos CDRs. Essas definições de CDRs são baseadas principalmente na análise manual e podem exigir ajustes conforme a estrutura de mais Abs se torna disponível. Abhinandan et al. [14] alinharam as sequências Ab no contexto da estrutura e descobriram que aproximadamente 10% das sequências no banco de dados Kabat anotado manualmente têm numeração incorreta. Uma tentativa mais recente de definir CDRs é a do banco de dados IMGT [15], que seleciona informações da sequência de nucleotídeos para imunoglobulinas (IG), receptores de células T (TcR) e moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). Ele propõe um sistema de numeração uniforme para sequências IG e TcR, baseado no alinhamento de mais de 5000 sequências de região variável IG e TcR, levando em consideração e combinando a definição de Kabat de FRs e CDRs [16], dados estruturais [17] e caracterização de Chothia de os loops hipervariáveis ​​[12]. Seu esquema de numeração não diferencia entre as várias imunoglobulinas (ou seja, IG ou TcR), o tipo de cadeia (ou seja, pesada ou leve) ou as espécies.

Uma desvantagem desses esquemas de numeração é que a variabilidade do comprimento dos CDRs é acomodada com anotação de inserção (Kabat e Chothia) ou fornecendo números em excesso (IMGT). Abs com inserções excepcionalmente longas pode ser difícil de anotar dessa maneira e, portanto, seus CDRs podem não ser identificados corretamente. Honegger and Pluckthun [18] suggested a structurally improved version of the IMGT scheme. Instead of introducing unidirectional insertions and deletions as in the IMGT and Chothia schemes, they were placed symmetrically around a key position. MacCallum et al. [8] have proposed focusing on the specific notion of Ag binding residues rather than the more vague concept of CDRs. They suggested that these residues could be identified based on structural analysis of the binding patterns of canonical loops. Other studies have dubbed those Ag binding residues Specificity Determining Regions (SDRs) [5], [7]. Here, we analyze Ag-Ab complexes and show that virtually all Ag binding residues fall within regions of structural consensus. We refer to these regions as Ag Binding Regions (ABRs). We show that these regions can be identified from the Ab sequence as well. We used “Paratome”, an implementation of a structural approach for the identification of structural consensus in Abs [19]. While residues identified by Paratome cover virtually all the Ag binding sites, the CDRs (as identified by the commonly used CDR identification tools) miss significant portions of them. We refer to the Ag binding residues which are identified by Paratome but are not identified by any of the common CDR identification methods, as Paratome-unique residues. Similarly, Ag binding residues that are identified by any of the common CDR identification methods but are not identified by Paratome are referred to as CDRs-unique residues. We show that Paratome-unique residues make crucial energetic contribution to Ab-Ag interactions, while CDRs-unique residues have a rather minor contribution. These results allow for better identification of Ag binding sites and thus for better identification of B-cell epitopes. They may also help improve vaccine and Ab design.


Epitopes of an antigen

The actual portions or fragments of an antigen that react with receptors on B-lymphocytes and T-lymphocytes, as well as with free antibody molecules, are called epitopes or antigenic determinants. The size of an epitope is generally thought to be equivalent to 5-15 amino acids or 3-4 sugar residues.

Some antigens, such as polysaccharides, usually have many epitopes, but all of the same specificity. This is because polysaccharides may be composed of hundreds of sugars with branching sugar side chains, but usually contain only one or two different sugars. As a result, most "shapes" along the polysaccharide are the same (see Figure (PageIndex<1>)).

Other antigens such as proteins usually have many epitopes of different specificities. This is because proteins are usually hundreds of amino acids long and are composed of 20 different amino acids. Certain amino acids are able to interact with other amino acids in the protein chain and this causes the protein to fold over upon itself and assume a complex three-dimensional shape. As a result, there are many different "shapes" on the protein (see Figure (PageIndex<2>)). That is why proteins are more immunogenic than polysaccharides they are chemically more complex.

A microbe, such as a single bacterium, has many different proteins (and polysaccharides) on its surface that collectively form its various structures, and each different protein may have many different epitopes. Therefore, immune responses are directed against many different epitopes of many different antigens of the same microbe. (For example, a bacterial cell wall alone may contain over 100 different epitopes.) Even simple viruses possess many different epitopes. (see Figure (PageIndex<3>)).


Antigenic Characterization

&ldquoAntigens&rdquo are molecular structures on the surface of viruses that are recognized by the immune system and are capable of triggering an immune response (antibody production). On influenza viruses, the major antigens are found on the virus&rsquo surface proteins (see Figure 1).

When someone is exposed to an influenza virus (either through infection or vaccination) their immune system makes specific antibodies against the antigens (surface proteins) on that particular influenza virus. The term &ldquoantigenic properties&rdquo is used to describe the antibody or immune response triggered by the antigens on a particular virus. &ldquoAntigenic characterization&rdquo refers to the analysis of a virus&rsquo antigenic properties to help assess how related it is to another virus.

CDC antigenically characterizes about 2,000 influenza viruses every year to compare how similar currently circulating influenza viruses are to those that were included in the influenza vaccine and to monitor for changes in circulating influenza viruses. Antigenic characterization can give an indication of the flu vaccine&rsquos ability to produce an immune response against the influenza viruses circulating in people. This information also helps experts decide what viruses should be included in the upcoming season&rsquos influenza vaccine.

Other information that determines how similar a circulating virus is to a vaccine virus or another virus are the results of serology tests and genetic sequencing.

The above image shows the different features of an influenza virus, including the surface proteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Following influenza infection or receipt of the influenza vaccine, the body&rsquos immune system develops antibodies that recognize and bind to &ldquoantigenic sites,&rdquo which are regions found on an influenza virus&rsquo surface proteins. By binding to these antigenic sites, antibodies neutralize flu viruses, which prevents them from causing further infection.

The Hemagglutinin Inhibition Assay (HI Test)

Scientists use a test called the hemagglutinin inhibition (HI) assay to antigenically characterize influenza viruses. The HI test works by measuring how well antibodies bind to (and thus inactivate) influenza viruses.

Scientists use the HI test to assess the antigenic similarity between influenza viruses. This test is particularly useful for helping to select the vaccine viruses used in the seasonal flu vaccine. HI test results can tell us whether antibodies developed against vaccination with one virus are antigenically similar enough to another circulating influenza virus to produce an immune response against that circulating virus. Scientists also use the HI test to compare antigenic changes in currently circulating influenza viruses with influenza viruses that have circulated in the past.

The HI test involves three main components: antibodies, influenza virus, and red blood cells that are mixed together in the wells (i.e., cups) of a microtiter plate. (See Image 1.)

A microtiter plate is used to perform the HI test. The plate contains wells (i.e., cup-like depressions that can hold a small amount of liquid) where the solution of antibodies, influenza virus and red blood cells are inserted and allowed to interact. These wells are arranged according to rows and columns (which are identified on the microtiter plate by letters and numbers, respectively). The rows of the plate can be used to test different influenza viruses against the same set of antibodies. The columns can be used to differentiate between greater dilutions of antibodies, like a scale from low to high going from left to right (see Figures 3 and 4 for an example).

The antibodies used in the HI test are obtained by infecting an animal (usually a ferret) that is immunologically naïve (i.e., it has not been exposed to any influenza virus or vaccine previously in its lifetime). The animal&rsquos immune system creates antibodies in response to the antigens on the surface of the specific flu virus that was used to infect that animal. To study these antibodies, a sample of blood (serum) is drawn from the animal. The HI test measures how well these antibodies recognize and bind to other influenza viruses (for example, influenza viruses that have been isolated from flu patients). If the ferret antibodies (that resulted from exposure to the vaccine virus) recognize and bind to the influenza virus from a sick patient, this indicates that the vaccine virus is antigenically similar to the influenza virus obtained from the sick patient. This finding has implications for how well the vaccine might work in people. See Flu Vaccine Effectiveness: Questions and Answers for Health Professionals for more information.

As previously mentioned, the influenza viruses used in the HI test are taken from samples from sick people. CDC and other WHO collaborating centers collect specimens from people all over the world to track which influenza viruses are infecting humans and to monitor how these viruses are changing.

For the HI test, red blood cells (RBCs) are taken from animals (usually turkeys or guinea pigs). They are used in the HI test because influenza viruses bind to them. Normally, RBCs in a solution will sink to the bottom of the assay well and form a red dot at the bottom (Figure 2A). However, when an influenza virus is added to the RBC solution, the virus&rsquo hemagglutinin (HA) surface proteins will bind to multiple RBCs. When influenza viruses bind to the RBCs, the red cells form a lattice structure (Figure 2B). This keeps the RBCs suspended in solution instead of sinking to the bottom and forming the red dot. The process of the influenza virus binding to RBCs to form the lattice structure is called &ldquohemagglutination.&rdquo

The HI test involves the interaction of red blood cells (RBCs), antibody and influenza virus. Row A shows that in the absence of virus, RBCs in a solution will sink to the bottom of a microtiter plate well and look like a red dot. Row B shows that influenza viruses will bind to red blood cells when placed in the same solution. This is called hemagglutination and is represented by the formation of the lattice structure, depicted in the far right column under &ldquoMicrotiter Results.&rdquo Row C shows how antibodies that are antigenically similar to a virus being tested will recognize and bind to that influenza virus. This prevents the virus and RBCs from binding, and therefore, hemagglutination does not occur (i.e., hemagglutination inhibition occurs instead).

When antibodies are pre-mixed with influenza virus followed by RBCs, the antibodies will bind to influenza virus antigens that they recognize, covering the virus so that its HA surface proteins can no longer bind to RBCs (Figure 2C). The reaction between the antibody and the virus inhibits (i.e., prevents) hemagglutination from occurring, which results in hemagglutination inhibition (as shown in Figure 2C). This is why the assay is called a &ldquohemagglutinin inhibition (HI) test.&rdquo Hemagglutination (as depicted in Figure 2B) occurs when antibodies do not recognize and bind to the influenza viruses in the solution, and as a result, the influenza viruses bind to the red blood cells in the solution, forming the lattice structure. When the antibodies do recognize and bind to the influenza viruses in the solution, this shows that the vaccine virus (like the one the ferrets were infected with) has produced an immune response against the influenza virus obtained from the sick patient. When this happens, the influenza virus being tested is said to be &ldquoantigenically like&rdquo the influenza virus that created the antibodies (from ferrets).

When a circulating influenza virus is antigenically different from a vaccine or reference virus, the antibodies (developed in response to the vaccine or reference virus) will not recognize and bind to the circulating influenza virus&rsquo surface antigens. In the HI test this will cause hemagglutination to occur (see Figure 2B). This indicates that the vaccine virus or reference virus has not caused an immune response (i.e., the creation of antibodies) that recognizes and targets the circulating influenza virus. Circulating influenza viruses tested via the HI test are typically obtained from respiratory samples collected from ill patients.

Assessing Antigenic Similarity Using the HI Test

The HI test assesses the degree of antigenic similarity between two viruses using a scale based on greater dilutions of antibodies. As previously mentioned, the HI test is performed using a microtiter plate. The microtiter plate contains rows and columns of wells (i.e., cups) where RBCs, influenza virus and antibodies (developed against a comparison virus, such as a vaccine virus) are mixed. Dilutions are marked across the top of the microtiter plate. These dilutions function as a scale for assessing antigenic similarity and immune response. By testing the ability of greater dilutions of antibody to prevent hemagglutination, scientists measure how well those antibodies recognize and bind to (and therefore inactivate) an influenza virus. The higher the dilution, the fewer antibodies are needed to block hemagglutination and the more antigenically similar the two viruses being compared are to each other. The highest dilution of antibody that results in hemagglutinin inhibition is considered a virus&rsquos HI titer (Figure 3). Higher HI titers are associated with greater antigenic similarity. Greater antigenic similarity suggests that vaccination would produce an immune response against the test virus.

This virus sample has an HI titer of 1280, which means that the greatest dilution of antibody that still blocked hemagglutination from occurring was at 1280 dilution. At this dilution, the antibodies were still capable of recognizing and binding to the antigens on the virus.

When CDC antigenically characterizes influenza viruses to inform decisions on the formulation of the seasonal flu vaccine, the HI test is used to compare currently circulating viruses (B&C) with vaccine viruses (A). This allows scientists to quickly determine if a virus used in the seasonal flu vaccine is antigenically similar to circulating influenza viruses and therefore capable of producing an immune response against them.

Public health experts consider influenza viruses to be antigenically similar or &ldquolike&rdquo each other if their HI titers differ by two dilutions or less. (This is equivalent to a two-well (i.e., a four-fold dilution) or less difference). Using figure 4 as an example, when circulating virus 1 is compared to a vaccine virus, circulating virus 1 differs by one dilution (a 2-fold difference) and therefore is &ldquolike&rdquo the previous season&rsquos vaccine virus. However, circulating virus 2 differs by five dilutions (a 32-fold difference) and therefore is not like the previous season&rsquos vaccine virus. Circulating viruses that are antigenically dissimilar (i.e., not &ldquolike&rdquo) the reference panel are considered &ldquolow reactors.&rdquo

Limitations

Antigenic characterization gives important information about whether a vaccine made using a specific vaccine virus will protect against circulating influenza viruses, but there are several limitations to antigenic characterization test methodology, which are described below.

Egg Adaptations

Right now, most flu vaccines are made using viruses grown in eggs. As human influenza viruses adapt to grow in eggs, genetic changes can occur in the viruses. These are called &ldquoegg-adapted&rdquo changes. Some egg-adapted changes may change the virus&rsquo antigenic (or immunogenic) properties while others may not. Egg-adapted changes have become a particular problem for selection of candidate vaccine viruses (CVVs) for the influenza A(H3N2) virus component of the flu vaccine. Influenza A(H3N2) viruses tend to grow less well in chicken eggs than influenza A(H1N1) viruses and they also are more prone to egg-adapted changes. Such changes can reduce the immune protection provided by the flu vaccine against circulating A(H3N2) viruses.


Rhesus and Other Fetomaternal Incompatibilities

74.4.2 Molecular Basis of Rh Antigens

Studies of the molecular basis of the Rh antigens at the protein level were complicated by loss of Rh antigenic reactivity after membrane solubilization or immunoblotting.

Moore et al. (11) and Gahmberg (12) independently identified proteins of 28–32kDa that could be immunoprecipitated using anti-Rh antibodies. A team led by Cartron at Institut National de Transfusion Sanguine (INTS) in Paris, France virally transformed B cells from donors with circulating Rh antibodies to develop cell lines secreting monoclonal antibodies specific for RhD, c, and E antigens. These monoclonal antibodies allowed the number of Rh antigen sites per cell to be determined. There are approximately 105 Rh antigens to each erythrocyte, with C/c, D, and E each contributing about one-third of the total (13–15) The Rh polypeptides could then be immunopurified by the addition of large quantities of the monoclonal or polyclonal anti-D to erythrocyte membranes that had been surface labeled with 125I (16,17) Rh polypeptides were also isolated from surface-labeled RhD-positive erythrocytes by hydroxyapatite chromatography and electrophoresis of SDS-solubilized membrane skeleton vesicles (18) , leading to a nearly 200-fold purification. From these studies, the total number of Rh polypeptides per erythrocyte was calculated to be approximately 60,000. The 28- to 32-kDa Rh polypeptides were suspected to consist of several species, and one-dimensional SDS polyacrylamide gel electrophoresis showed that there was a small difference in the mobilities of the different polypeptides. The RhD polypeptide migrated with an apparent molecular weight of 31.9kDa, whereas c and E were 33.1kDa. When the isolated Rh polypeptides were digested and analyzed by electrophoresis, variations in the degradation patterns indicated that RhD is distinct from the C/c and E/e polypeptides. Antibodies raised to denatured, purified RhD polypeptide were found to cross-react with the Rhc and Rhe polypeptides (19) Digestion of intact erythrocytes with phospholipase A2 and papain caused degradation of the RhD polypeptide but not the RhC/c or -E/e polypeptides (20) These studies, therefore, showed that the Rhc, -D, and -E polypeptides are very similar although each is a distinct protein (21) The c and E polypeptides were found to be nearly identical, whereas the D polypeptide was found to be related but less similar ( Figure 74-1 ).

FIGURE 74-1 . The genetic basis of the rhesus blood group system. RhD protein is encoded by a single gene that is deleted on RHD-negative chromosomes. The RhCcEe proteins are encoded by a single gene that is highly homologous to the RHD gene. Translation of a full-length mRNA transcript produces the RhEe polypeptide, which is of similar size and structure to the RhD polypeptide. The RhEe polymorphism is due to a single-point mutation, which changes amino acid 226. RhC polypeptides are produced from smaller splicing isoform transcripts of the same gene and are therefore smaller peptides than their RhD or RhEe counterparts. The RhCc polymorphism is due to four-point mutations, which make four amino acid substitutions. Associated with these substitutions are two further silent point mutations.

Almost all our current knowledge of this group of proteins has come from cloning studies of the Rh cDNA. Although antibodies to RhD and other Rh antigens were widely available, they were only specific for the Rh antigens. They were not suitable for the identification of Rh polypeptides produced from cDNA expression libraries. Oligonucleotide probes for isolating Rh cDNAs were designed from partial amino acid sequence data of the isolated polypeptides. A clone specific for one species of Rh polypeptide was isolated independently in 1990 by the Paris group (22) and a group in Bristol (23) , both having used the polymerase chain reaction (PCR) with oligonucleotide primers designed from segments of the N-terminal amino acid sequence to amplify cDNA templates prepared from either thalassemic spleen erythroblasts or peripheral reticulocytes. These PCR products were then hybridized to cDNA libraries to identify specific clones of approximately 1.4kb. Both groups used the same commercially acquired cDNA library, prepared from the marrow of the same donor. The sequence of the open reading frames reported by each group was identical. The isolated cDNA localized to chromosome 1p34.3–p36.1 by in situ hybridization, which was consistent with previous linkage evidence that localized the RH gene locus to chromosome 1 (24) This first cDNA clone proved to encode both the C/c and E/e proteins. In 1992, the Paris group reported the isolation of the RhD polypeptide cDNA from a cDNA library (25) The coding sequence of this clone exhibited 3.5% divergence at the amino acid level. To confirm that this clone encoded the RhD polypeptide, they demonstrated that its gene was present only in RhD-positive individuals. Restriction fragment length polymorphism analysis of DNA from individuals with RhD-positive and RhD-negative erythrocytes shows that RhD-positive individuals have two Rh polypeptide genes and that RhD-negative individuals have only one (25) It therefore appears that the RH gene locus consists of two highly homologous, closely linked genes, one of which encodes both C/c and E/e proteins. The other gene encodes the RhD protein and is absent in RhD-negative individuals. Rh antigens are expressed on the erythrocyte surface only in the presence of RhAG. Both Rh and RhAG proteins have 12 transmembrane α-helices through the erythroid cell membrane, joined by six exoloops and five endoloops with N- and C-termini within the cytoplasm (26,27) The Rh accessory proteins form a group of glycoproteins that are associated with the Rh protein family, and together the association is called the “Rh complex.”

The Rh polypeptides are 30-kDa unglycosylated proteins that can undergo reversible palmitoylation. It is likely that they play a fundamental role in the physiology of RBC membranes that is unrelated to their antigenicity. Similar observations have been made in the cases of other blood group antigens that are often functionally important structures. The multiple membrane-spanning domains of the Rh polypeptides suggest a transporter protein, as a channel, an exchanger or a pump, but the function of the polypeptide or the ligand has not yet been conclusively demonstrated. It has recently been postulated that they may have a function similar to methylamine permease (Mep) transporters (28) , that they may be related to the superfamily of ammonium transporters (29) , and that the Rh glycoproteins function as dual directional ammonium transporters (30) However, the homology is about 20%, the Mep/Amt family of transporter proteins is present in bacteria, yeast, and plants but not in vertebrates, and there are conserved sequences within the Rh family not found in the Mep/Amt family. So, it remains unclear what may be transported across the membrane, if indeed anything at all. The study of uptake and excretion of metabolic molecules such as ammonium across normal and Rh-null erythrocyte membranes may help elucidate their biological function in mammals.

Erythrocytes from donors of all the common Rh phenotypes are normal, suggesting that the C/c or E/e polymorphisms have no effect on the function of the protein and that erythrocytes can function entirely normally without expression of the D polypeptide. Comparison of distantly related proteins isolated from erythrocytes of several nonhuman species show conservation of the fatty acylation characteristic, suggesting a common functional significance. The membrane defects seen on erythrocytes from individuals with the Rh-null phenotype provide clues to the functional roles of the Rh polypeptides. Rh-null patients have a mild to moderate chronic hemolytic anemia. Rh-null erythrocytes are pleomorphic but always have some degree of stomatocytosis and spherocytosis, and have increased sensitivity to osmotic lysis. Rh-null membranes have characteristically hyperactive membrane ATPases, reduced cation and water contents, and a deficiency in membrane cholesterol (31) Physiologic roles in membrane stability and volume regulation have been suggested for the Rh polypeptides, but specific details have yet to be elucidated.

Certainly, the principal clinical interest in the Rh polypeptides is in their roles as antigens. The RhD protein expresses the D antigen. The RhCE protein expresses both the C (or c) and E (or e) antigens on the same protein, the C/c antigens being present on the second exoloop and the E/e antigens on the fourth exoloop (32,33) Many of the current data on the primary structures of these polypeptides have come from cDNA studies (see previous discussion). They are 417 amino acids long, there being only about 8% difference in the sequence between RhD and RhCE, or by only 30–35 amino acids ( Figure 74-2 ). Despite such homology, the two proteins do not share antigens unless there is hybrid rearrangement between the two genes (34) These antigens appear early during erythropoietic development and early in fetal life.

FIGURE 74-2 . The genetic basis of the RhCcEe polymorphisms. (A) The RhCE proteins are encoded by a single gene, which is highly homologous to RHD. (B) Common RhCE polymorphisms arise from point mutations within RHCE. Single amino acid substitutions (P, proline S, serine A, alanine) give rise to the antigenic differences on the exoloops observed between the various isoforms. Numbers start from first methionine residue.


Polyclonal and monoclonal antibodies

Antibodies (whatever their class or subclass) are produced and purified in two basic forms for use as reagents in immunoassays: polyclonal and monoclonal. Typically, the immunological response to an antigen is heterogeneous, resulting in many different cell lines of B-lymphocytes (precursors of plasma cells) producing antibodies to the same antigen. All of these cells originate from common stem cells, yet each develops the individual capacity to make an antibody that recognizes a particular determinant (epitope) on the same antigen. As a consequence of this heterogeneous response, serum from an immunized animal will contain numerous antigen-specific antibody clones, potentially of several different immuglobulin classes and subclasses comprising generally 2 to 5% of the total immunoglobulin. Because it contains this heterogeneous collection of antigen-binding immunoglobulins, an antibody purified from such a sample is called a polyclonal antibody. Polyclonal antibodies, which are generally purified directly from serum, are especially useful as labeled secondary antibodies in immunoassays.

Because an individual B-lymphocyte produces and secretes only one specific antibody molecule, clones of B-lymphocytes produce monoclonal antibodies. All antibodies secreted by a B-cell clone are identical, providing a source of homogeneous antibody having a single defined specificity. However, while B-lymphocytes can be isolated from suspensions of spleen or lymph node cells excised from immunized animals, they have a limited life span and cannot be cultured directly to produce antibody in useful amounts. Fortunately, this restriction has been overcome with the development of hybridoma technology, wherein isolated B-lymphocytes in suspension are fused with myeloma cells from the same species (usually mouse) to create monoclonal hybrid cell lines that are virtually immortal while still retaining their antibody-producing abilities. Such hybridomas may be stored frozen and cultured as needed to produce the specific monoclonal antibody. Monoclonal antibodies are especially useful as primary antibodies in applications that require single epitope specificity and an unchanging supply over many years of use. Hybridoma clones may be grown in cell culture for collection of antibodies from ascites fluid.


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