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Os axônios neurais se estendem em torno de conexões como essa?

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Eu queria saber se os axônios às vezes se conectam assim:

Observe que não estou me referindo a situações em que o caminho dessa rede é curvo e o 3º / 4º neurônio está tão próximo do 1º neurônio quanto o 2º, estou falando de situações em que o 3º / 4º neurônio está fisicamente 2-3x mais longe do primeiro do que do segundo neurônio, ou mais. Isso é relevante para simulação neural.


O que é axônio colateral? (com fotos)

A maioria dos neurônios tem múltiplas projeções, ou processos, que brotam do corpo celular, ou soma, chamados de "neuritos". Os neurônios têm muitos processos, a maioria dos quais são dendritos, mas a maioria dos neurônios também tem um processo único e exclusivo chamado axônio. Os dendritos são os processos que recebem sinais de projeções aferentes de outras células, enquanto os axônios são os neuritos que se projetam, enviando sinais para outras células, mesmo em áreas distantes do cérebro ou da medula espinhal. Os axônios se bifurcam e podem enviar um ramo de volta ao físico de sua própria célula. Essas projeções são conhecidas como "axônios colaterais".

Embora um neurônio tenha apenas um axônio, é comum que esse processo único se bifurque em vários pontos ao longo de seu comprimento. Um axônio tem uma projeção principal, a localização do terminal, que determina para onde essa célula "se projeta", e tem ramificações. Um dos ramos que se bifurca do axônio primário é o axônio colateral, e ele se projeta de volta para a própria célula.

No terminal de um axônio existem "botões" que formam sinapses com outras células, geralmente nos processos dendríticos das células receptoras. Existem também sinapses que se formam ao longo do comprimento do axônio. Nos casos de processos mielinizados, as sinapses se formam apenas nas rupturas da mielina chamadas "Nodos de Ranvier".

Um axônio colateral é frequentemente associado a mecanismos de feedback que ajudam uma célula a regular seu próprio padrão de disparo. Como esse colateral se projeta de volta para a célula à qual o axônio está ligado, ele pode facilmente formar sinapses com a própria célula ou com outras células próximas. No caso das células piramidais, as excitatórias - células de integração de informações comuns no cérebro dos mamíferos - costumam ser quase interneurônios inibitórios. Como um axônio colateral pode formar sinapses com esses neurônios inibitórios próximos, ele serve como um sistema de regulação. As células excitatórias estimulam as células inibitórias próximas que as impedem de disparar com a mesma frequência.

Os axônios colaterais bifurcam-se dos segmentos primários do axônio nas regiões não mielinizadas. Isso faz sentido porque a mielina funciona como um envoltório neural quando um oligodendrócito envia um processo repetidamente ao redor de um processo axonal de outra célula. Um único processo oligodendrocítico, no entanto, teria dificuldade em envolver três segmentos que se juntam em um único ponto, que é o que acontece quando os segmentos do axônio formam ramificações.

Alguns cientistas acreditam que esse tipo de colateral é mais um mecanismo de preservação celular do que um mecanismo feito para codificar padrões de disparo e regular as informações de sinalização por meio de vias neurais. Isso ocorre porque algumas células excitatórias correm o risco de uma resposta de toxicidade com muita atividade. Se uma célula excitatória disparasse e o axônio colateral estimulasse a mesma célula novamente, ocorreria uma cascata de disparos que se autopropagaria, causando um fenômeno conhecido como "excito-toxicidade".


Materiais e métodos

Purificação de células NG2 + da medula espinhal adulta.

Usamos um novo protocolo de isolamento (Bai et al., 2013) para obter células NG2 + altamente purificadas de camundongos C57BL / 6J adultos (& # x0003e8 semanas). Após a dissecção da medula espinhal, os vasos sanguíneos superficiais foram removidos e o tecido foi dissociado com tripsina e EDTA por 30 min em temperatura ambiente. O tecido digerido foi centrifugado a 800 & # x000d7 g por 5 min, lavado três vezes e, em seguida, colocado em um gradiente de Percoll (GE Healthcare, catálogo # 17-0891-02). O gradiente foi centrifugado durante 30 min a 2.000 rpm. As frações celulares foram recolhidas, lavadas e ressuspensas em 1 ml de meio DMEM / F12 contendo 10% de soro fetal bovino. As células foram plaqueadas em um frasco de 75 cm 2 revestido com PLL e cultivadas a 37 & # x000b0C em 5% de CO2 por 4 semanas, depois passou para purificar. Após a passagem, 99% das células eram NG2 +, & # x0003c5% expressa GFAP e não havia expressão detectável de marcadores de oligodendrócitos maduros, como CNP ou MBP. A maioria das células (84%) expressa o receptor PDGF & # x003b1, um marcador frequentemente associado às células precursoras de oligodendrócitos. A maioria das células (99%) expressa marcadores de linhagem de oligodendrócitos A2B5, Olig2 e O4 (em passagens posteriores).

Cultura de neurônios DRG.

Os neurônios DRG foram coletados conforme descrito anteriormente (Tom et al., 2004b). Resumidamente, os DRGs foram removidos de ratos Sprague Dawley fêmeas adultos (Zivic-Miller Laboratories Harlan). Depois que as raízes centrais e periféricas foram aparadas, os DRGs foram incubados em uma solução de colagenase II (200 U / ml Worthington Biochemicals) e dispase II (2,5 U / ml Roche) em HBSS. DRGs digeridos foram lavados em HBSS-CMF e suavemente triturados três vezes, seguido por centrifugação em baixa velocidade. Os neurônios dissociados foram ressuspensos em meio Neurobasal A suplementado com B-27, GlutaMAX e penicilina & # x02013 estreptomicina (Invitrogen) para contagem.

Ensaio de crescimento de neurite mais longo.

As lamínulas foram revestidas com polil-lisina (PLL 0,1 mg / ml Sigma-Aldrich) durante a noite em temperatura ambiente, em seguida, lavadas com DDH20. As lamínulas foram banhadas em laminina (5 & # x003bcg / ml Invitrogen) em HBSS-CMF e incubadas (37 & # x000b0C) por 2 h antes do plaqueamento das células. Para os experimentos de monocamada de células NG2 +, células gliais NG2 + da medula espinhal de camundongo adulto foram densamente plaqueadas (60.000 células / ponto) por 24 h. As células foram tratadas com condroitinase ABC (ch'ase 0,1 U / ml em solução salina Seikagaku) ​​por 4 h antes de adicionar neurônios DRG dissociados (1500 & # x020132000 neurônios / lamela) à cultura. DRGs, junto com ch'ase em meio fresco, foram adicionados e deixados crescer por 24 h. Para as lamínulas de crescimento de laminina, lamínulas revestidas com PLL foram banhadas em 1 & # x003bcg / ml ou 5 & # x003bcg / ml laminina em CMF e incubadas a 37 & # x000b0C. Após 2 h de incubação, neurônios DRG dissociados foram adicionados à cultura. O crescimento foi permitido por 24 horas, então as culturas foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas para NG2 (Millipore Bioscience Research Reagents) e & # x003b2-III-tubulin (Sigma). Para estudos de crescimento, o neurito mais longo de cada neurônio crescendo em uma monocamada completa de células NG2 + foi medido usando o software MetaMorph.

Ensaio de aprisionamento.

As lamínulas foram revestidas com PLL e, em seguida, com nitrocelulose. As lamínulas foram então banhadas em laminina para formar substratos de várias concentrações [0 & # x003bcg / ml, 1 & # x003bcg / ml ou 5 & # x003bcg / ml em HBSS livre de Ca 2+ / Mg 2+ (HBSS-CMF ) BTI] por mais de 2 h a 37 & # x000b0C. Células NG2 + da medula espinhal de camundongo adulto foram semeadas nas lamelas a uma densidade de 15.000 células / lamela. As lamelas foram colocadas na incubadora (37 & # x000b0C). Vinte e quatro horas após o plaqueamento das células NG2 +, neurônios DRG dissociados foram adicionados à cultura (2.000 células / lamela). Após 24 h adicionais, as culturas foram fixadas por 30 min com paraformaldeído a 4%, lavadas e bloqueadas em soro de cabra natural a 5%. As células fixadas foram coradas para NG2, & # x003b2-III-tubulina e DAPI. Cada neurônio com um corpo celular começando em uma célula NG2 + com crescimento de neurito foi fotografado e quantificado pela contagem do número de neurônios capazes de estender processos para fora da superfície da célula NG2 +. Para examinar o papel do NG2 e de outros CSPGs no aprisionamento, a condroitinase foi adicionada na mídia (0,1 U / ml) no momento do plaqueamento das células NG2 +, e novamente na mídia no momento da adição de neurônios DRG. Para estudos de 5 dias, a mídia e a ch'ase foram substituídas diariamente.

Ensaios de stripe.

Os experimentos de ensaio de tira foram realizados de acordo com um protocolo modificado de Kn & # x000f6ll et al., 2007. As lamínulas foram revestidas em PLL durante a noite em temperatura ambiente, em seguida, lavadas com DDH20. As lamínulas foram secas completamente e cada lamínula foi colocada no centro de uma grande placa de Petri. A matriz de faixa (Karlsruhe Institute of Technology, Alemanha) foi colocada no centro da lamela, garantindo que todas as pistas estivessem na lamínula. A solução A consistia em uma laminina (1 & # x003bcg / ml, 5 & # x003bcg / ml ou 10 & # x003bcg / ml Invitrogen) -aggrecano (50 & # x003bcg / ml ou 100 & # x003bcg / ml Sigma-Aldrich) ou uma mistura de laminina (2 & # x003bcg / ml) -NG2 (7 & # x003bcg / ml presente de Joel Levine, Stony Brook University, Stony Brook, NY) (feita com BSA conjugado com 488 em CMF). Cento e cinquenta microlitros da solução A foram colocados no canal de entrada e aspirados suavemente através das pistas usando uma pipeta de vidro inflamado, com cuidado para não aspirar por toda a solução para que as pistas permanecessem cobertas de substrato. As lamínulas foram então colocadas na incubadora por 30 min. A solução foi removida da matriz e substituída por BSA a 2%. Após uma incubação adicional de 10 min a 37 & # x000b0C, o BSA foi removido das lamelas, junto com a matriz. As lamínulas foram colocadas em uma placa de 24 poços, onde foram banhadas em 400 & # x003bcl de solução B [laminina baixa (1 & # x003bcg / ml) ou fibronectina (5 & # x003bcg / ml), com BSA em CMF] e incubado a 37 & # x000b0C por 30 min. A solução B foi então removida dos poços e substituída por BSA a 2% por mais 10 min de incubação a 37 & # x000b0C. Para remover as cadeias GAG dos proteoglicanos, a condroitinase (0,1 U / ml em solução salina) foi adicionada às lamelas 4+ h antes do plaqueamento dos neurônios DRG. Neurônios DRG dissociados foram então adicionados às lamelas a uma densidade de 2.000 células / lamela. O crescimento foi permitido por 48 horas e, em seguida, as culturas foram fixadas com PFA a 4%. Algumas lamínulas foram imunocoradas para laminina (Sigma), CS56 (Sigma) e fibronectina (BD Biosciences) para garantir que esses componentes estivessem presentes. Todas as lamelas foram coradas com & # x003b2-III-tubulin para visualizar os neurônios. Todos os neurônios com crescimento de duas vezes o comprimento de seus corpos celulares foram fotografados. Neurônios com corpos celulares começando na faixa verde foram analisados ​​para ver se eles estendiam ou não os processos para a faixa preta e vice-versa.

Imunocitoquímica.

Todas as culturas foram bloqueadas em 5% de soro natural de cabra. Todos os anticorpos foram incubados durante a noite a 4 & # x000b0C. Os anticorpos primários usados ​​incluíram os seguintes: anti-NG2 (Millipore), anti-GFAP (Accurate), antivimentina (Sigma), anti-SV2 (Developmental Studies Hybridoma Bank), anti-PSD-95 (Abcam), anti- SNAP-25 (Sigma), anti-fibronectina (BD Biosciences), anti-laminina (Sigma), DAPI (Sigma), anti-Olig2 (Millipore), anti-A2B5 e anti-O4 (presentes generosos do laboratório de Robert Miller, Case Western Reserve University, Cleveland, OH). Isto foi seguido pelos anticorpos secundários apropriados, Alexa Fluor 350, 488, 594, 633 ou 647.

Quantificação do número sinaptoide em vitro entre os axônios DRG e as células NG2.

A intensidade do pixel foi medida usando o software ImageJ para estudos de colocalização. Métodos semelhantes aos descritos por Ippolito e Eroglu, 2010 foram usados ​​para quantificar as sinapses. Todas as imagens foram tiradas com as mesmas configurações no microscópio confocal Zeiss LSM510. Uma área de interesse foi delineada em torno do corpo celular, com o dobro do diâmetro do corpo celular. Usando o analisador de pontos e definindo o limite para 50, o número de pontos foi calculado.

Ensaio de ciclagem de vesículas sinápticas.

Os pratos foram revestidos com polil-lisina durante a noite à temperatura ambiente, enxaguados e revestidos com laminina 1 & # x003bcg / ml em CMF por 2 h a 37 & # x000b0C. A laminina foi removida e as células NG2 + foram plaqueadas densamente para formar uma monocamada (40.000 células em meio DMEM-F12 40 & # x003bcl por 30 min em temperatura ambiente), então 3 ml de DMEM-F12 foram adicionados às placas e as placas foram incubadas durante a noite. Neurônios DRG foram adicionados 24 horas depois. As placas foram incubadas por 5 dias, e o meio foi trocado no dia 3 para manter as culturas. No dia 5 da cocultura, o meio foi removido e uma solução de alto K + (5,37 m m KCl, 125 m m NaCl, 24 m m NaHCO3) contendo corante FM (FM1 & # x0201343 Invitrogen) foi adicionado à cultura por 3 min. Uma solução baixa de Ca 2+ (0,5 m m) foi adicionada ao prato, seguida imediatamente pela adição de ADVACEP-7 (Sigma) por 5 min para extinguir a fluorescência de fundo. As soluções foram removidas e uma lavagem adicional com baixo Ca 2+ foi realizada por 10 min. A fluorescência foi fotografada em um microscópio Leica DMI6000 (AF). Em seguida, a solução foi removida e alto K + foi adicionado sem corante por 3 min. A fluorescência foi fotografada novamente. O software ImageJ foi usado para delinear todo o neurônio e comparar a intensidade do pixel dentro do neurônio antes e depois da estimulação com ou sem corante.

Lisado celular para Western blot.

As células NG2 + foram cultivadas até a confluência em placas de cultura de células pré-tratadas com 1 & # x000d7 PLL por 48 h. Para células que foram pré-tratadas com ch'ase, a enzima foi adicionada (0,1 U) ao meio 1 h antes de adicionar o tampão RIPA. As células foram lavadas com PBS gelado e incubadas em gelo com tampão RIPA (Thermo Scientific) e cocktail inibidor de protease 1: 500 (Abcam) durante 1 min. Raspadores de células estéreis foram usados ​​para raspar as células do prato de cultura de células. As células suspensas em tampão RIPA foram então agitadas por 30 min a 4 & # x000b0C e centrifugadas a 14,1 rcf por 20 min. O sobrenadante foi salvo de cada grupo e a concentração de proteína foi avaliada usando um kit BCA (Thermo Scientific).

Western blot.

Os lisados ​​de NG2 foram desnaturados com & # x003b2-mercaptoetanol a 80 & # x000b0C por 10 min. Dez microgramas de proteína foram corridos em um gel de TGX 7,5% (Bio-Rad) por 1,5 h a 125 V. A transferência ocorreu durante a noite a 12 V em membranas de PVDF. Membranas de PVDF foram bloqueadas (Thermo Scientific Super Blocker) por 1 h de agitação à temperatura ambiente e incubadas a 4 & # x000b0C durante a noite com um anticorpo NG2 (NG2 Millipore). A membrana foi então lavada com 1 & # x000d7 PBS e 0,1% Tween 20 três vezes durante 15 min cada à temperatura ambiente com agitação. Anticorpo anti-coelho HRP (Millipore Bioscience Research Reagents) foi adicionado durante 2 h, agitando à temperatura ambiente. Thermo Scientific ECL foi então usado para desenvolver o blot. Em seguida, os blots foram lavados em PBS-Tween 20 e incubados em um agitador orbital em Thermo Scientific Restore Stripping Buffer por 15 min em temperatura ambiente seguido por três lavagens com PBS-Tween 20 por 15 min cada. Os blots foram então bloqueados usando Thermo Scientific Blocking Buffer por 2 h em temperatura ambiente no agitador orbital antes da incubação com anticorpo primário anti-2B6 (diluição Seikagaku 1: 1000) durante a noite a 4 & # x000b0C. Antes do desenvolvimento com substrato de Western blotting ECL, os blots foram incubados com um anticorpo secundário conjugado a HRP por 2 dias à temperatura ambiente após três lavagens de 15 min com PBS-Tween 20.

Cultura de neurônios corticais e ensaio de aprisionamento.

As lamínulas foram revestidas com PLL e depois banhadas em substratos de laminina de várias concentrações (0 & # x003bcg / ml, 1 & # x003bcg / ml ou 5 & # x003bcg / ml) por 2 h a 37 & # x000b0C. Células NG2 + da medula espinhal de camundongo adulto foram semeadas nas lamelas a uma densidade de 10.000 células / lamela e incubadas a 37 & # x000b0C por 24 h. Os córtices inteiros de camundongos BALBC / B6 / 129S de 0 a 4 dias de idade (The Jackson Laboratory) foram dissecados em um banho de HBSS e quinurenato e incubados em uma solução contendo papaína, quinurenato e cisteína por 30 min a 37 & # x000b0C . Os neurônios foram então lavados em HBSS-CMF, triturados e filtrados. Após uma breve centrifugação em baixa velocidade, os neurônios dissociados foram ressuspensos em meio Neurobasal A contendo suplemento B-27, GlutaMAX e penicilina & # x02013 estreptomicina (Invitrogen) e plaqueados em lamínulas a uma concentração de 2.000 células por lamela. As lamelas foram tratadas com um agente antimitótico (5 & # x02032fluoro-2 & # x02032-desoxi-uridina / uridina) no momento do plaqueamento do neurônio e a condroitinase ABC foi adicionada ao meio (0,1 U / ml Seikagaku) ​​quando indicado. As lamelas foram incubadas por 24 h antes da fixação com paraformaldeído 4% e imunomarcadas.

Esmagamento da coluna dorsal, lesão de duplo condicionamento e marcação de axônios.

Todas as cirurgias foram realizadas de acordo com os procedimentos e protocolos do Animal Resource Center da Case Western Reserve University. Ratos Sprague Dawley adultos fêmeas (250 & # x02013300 g) receberam uma lesão por esmagamento da coluna dorsal, conforme descrito anteriormente (Horn et al., 2008). Resumidamente, enquanto os animais eram anestesiados com gás isoflurano inalado (2% em oxigênio) e sob técnica asséptica, foi realizada laminectomia T1 para expor a face dorsal do segmento C8. Os dentes da pinça de joalheiro Dumont # 3 foram inseridos através de um orifício na dura-máter com 1,5 mm de distância e 1 mm de profundidade. O cordão foi então esmagado três vezes por 10 segundos cada para criar a lesão. Filme de gel foi colocado sobre o local da lesão e as camadas musculares foram suturadas com fio de náilon 4-0. Foram utilizados grampos cirúrgicos para fechamento da pele, momento em que os animais receberam Marcaína (1,0 mg / kg) por via subcutânea e buprenorfina (0,1 mg / kg) por via intramuscular. Usando 3.000 MW Dextran-Texas Red (Invitrogen), os axônios foram marcados através do nervo ciático direito 2 dias antes de matar o animal. Os animais foram mortos em 7 d, 14 d, 21 d ou 28 d (N = 6 / grupo). O tecido foi então usado para imunohistoquímica ou microscopia eletrônica. Para os estudos de lesão de duplo condicionamento, foi realizado o procedimento de esmagamento da coluna dorsal (DCC), conforme mencionado acima, e imediatamente após a lesão, o nervo ciático direito foi exposto e esmagado. Uma semana depois, o nervo ciático direito foi reexposto e esmagado uma segunda vez, 1 mm proximal ao esmagamento do nervo anterior. Duas semanas depois (3 semanas no total), os animais foram marcados, perfundidos e seccionados conforme descrito acima.

Como a coloração de NG2 diminui ao longo do tempo, conduzimos estudos em paralelo em camundongos que expressam proteína fluorescente verde aumentada sob um promotor NG2. Estes foram obtidos do Dr. Dwight Bergles (Departamento de Neurociência, Universidade Johns Hopkins, Baltimore, MD). Os experimentos de nocaute de NG2 foram realizados em camundongos de nocaute de NG2 obtidos do Dr. William Stallcup (Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA). Para esses experimentos, o DCC foi realizado em T12 e os animais foram mortos após 14 ou 28 dias.

Nos experimentos de duplo condicionamento, a expressão de SV2 foi comparada qualitativamente. Tecido de cinco camundongos diferentes foi examinado para coloração de SV2 visível em fibras marcadas com Dextran encontradas rostral à lesão em comparação com aquelas que permaneceram dentro ou caudal à lesão.

Immunohistochemistry.

Os animais foram perfundidos com PFA a 4%. O cordão foi pós-fixado em PFA a 4% durante a noite, seguido por submersão em sacarose a 30% durante a noite. O tecido foi congelado em meio de montagem OCT e seccionado em um criostato em seções longitudinais de 20 & # x003bcm. As seções foram coradas com anti-GFAP (Accurate Chemical and Scientific Corporation), anti-SV2 (Developmental Studies Hybridoma Bank), anti-PSD-95 (Abcam), anti-SNAP-25 (Sigma), antivimentina (Sigma) , anti-NG2 (Millipore) ou anti-fibronectina (BD Biosciences), seguido por Alexa Fluor 405, 488 ou 633. As imagens foram obtidas usando um microscópio confocal Zeiss LSM510.

Quantificação de terminações distróficas em contato com células NG2 +.

Tecido foi usado de quatro ratos. Os animais foram experimentados 7 dias após a lesão, conforme descrito acima. ZAs imagens da pilha foram obtidas usando um microscópio confocal Zeiss LSM510. O número de endballs marcados com Dextran-Texas Red em contato com uma célula NG2 + foi contado e comparado com o número total de endballs observados.

Microscópio eletrônico.

Para a análise de TEM, as células foram semeadas em um ACLAR Embedding Film esterilizado (Eletron Microscopy Sciences), que foi cortado em pedaços de tamanho apropriado para caber em uma placa de 24 poços. As células NG2 + adultas foram semeadas em 1 & # x003bcg / ml laminina a uma concentração de 40.000 células por lamela. Vinte e quatro horas depois DRGs (3500 por deslizamento) foram adicionados à lamela e as culturas foram colocadas em um 37 & # x000b0C, 10% CO2 incubadora e permitiu atingir & # x0223c80% confluência. Depois que as células atingiram este nível de confluência (3 d ou 5 d em cocultura), as folhas ACLAR com suas células anexadas foram imersas em fixador. O fixador inicial era glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato 0,1 m, pH 7,3. A amostra foi pós-fixada em tetróxido de ósmio a 1% com redução de ferrocianeto (Karnovsky, 1971). Após imersão em acetato de uranila acidificado (Tandler, 1990), a amostra foi desidratada em etanol, passada por óxido de propileno e embebida em Poly / Bed. Seções finas foram coradas primeiro com acetato de uranila acidificado em metanol a 50% (Tandler, 1990), depois com a coloração de chumbo triplo de Sato modificado por Hanaichi et al. (1986). Essas seções foram examinadas em um microscópio eletrônico JEOL 1200 EX.

Análise estatística.

Todos os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos pelo menos duas vezes. O investigador estava cego antes de analisar os dados. Os dados foram analisados ​​pelo Aluno t teste, o teste de duas proporções ou ANOVA de dois fatores com Tukey post hoc teste usando o software Minitab 15 ou com o teste Kruskal & # x02013 Wallis seguido pelo teste Mann & # x02013 Whitney você teste com SPSS, conforme apropriado. Todos os dados são apresentados como média & # x000b1 SEM. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando o p o valor era & # x0003c0.05.


1 resposta 1

UMA: Nem todos os neurônios têm muitos dendritos curtos e um único axônio longo. Na verdade, a maioria deles não tem esse formato. As células granulares cerebelares, que são os neurônios mais numerosos no cérebro (as estimativas de seu número total são em média em torno de 50 bilhões, o que significa que constituem cerca de 3/4 dos neurônios do cérebro) [Ref 1,2,3], não têm esta forma. Eles têm um axônio que se ramifica em longas fibras paralelas, conforme mostrado no diagrama abaixo (modificado a partir da figura na Ref 2). As formas dos neurônios variam muito. Isso ocorre porque os neurônios desenvolveram suas estruturas para atender às suas funções:

Podemos aprender muito sobre o que um neurônio faz observando sua morfologia (ou seja, forma). Por exemplo, um neurônio com grandes dendritos ramificados provavelmente está integrando informações de um grande número de entradas, enquanto um neurônio que tem dendritos que se ramificam perto do soma, mas não se estendem muito longe, provavelmente só está integrando informações dele perto de vizinhos. A mesma coisa com os axônios, os neurônios de projeção têm axônios longos que permitem que eles se comuniquem com os neurônios em regiões distantes do cérebro, enquanto um interneurônio local será um axônio curto que se ramificará apenas localmente, permitindo que se comunique com as células próximas. Algumas células do sistema nervoso periférico têm axônios saindo diretamente dos dendritos, permitindo-lhes transmitir informações de um para o outro com eficiência. [Ref 4] (A figura abaixo também é da Ref 4)

Assim, os neurônios desenvolveram suas várias formas para realizar suas funções. Acho que se a única forma dessas, conforme questionada neste tópico, ou muitas ou todas essas formas estão certas ou erradas para usarmos para modelar redes neurais, não é uma resposta agora. Mas acho que devemos estudar e aprender com eles porque é o melhor modelo que temos. Lembre-se de que esses neurônios, com suas várias formas e conexões, conseguem criar um dos fenômenos mais maravilhosos deste universo: nossa mente consciente.

Richard H. Masland. Tipo de célula neuronal. Biologia atual. 2004 Vol 14 No 3: R497-R500.

Masland RH. Olhando para a Neurons Brown University. Neuroscience in Action: Understanding Our Brain and Nervous System.


RESULTADOS

Pioneiros longitudinais da mosca CNS

Conexões longitudinais intersegmentais no SNC da mosca são iniciadas por quatro interneurônios, pCC, MP1, dMP2 e vMP2 (Fig. 1A) (Jacobs e Goodman, 1989a Jacobs e Goodman, 1989b Lin et al., 1995 Hidalgo e Brand, 1997). dMP2 e vMP2 nascem no meio de cada gânglio segmentar ("neurômero") e começam a estender os axônios durante o estágio 12. O axônio dMP2 cresce posteriormente e vMP2 cresce anteriormente, projetando-se em direção aos axônios vMP2 e dMP2 que partem do próximo segmento. Simultaneamente, o pCC envia seu axônio anteriormente em associação com vMP2, enquanto o axônio MP1 envolve o dMP2 e se estende posteriormente em associação com ele. O encontro de pioneiros de segmentos sucessivos estabelece a primeira conexão intersegmentar no início do estágio 13. As funções pioneiras desses quatro axônios são amplamente redundantes, pois todos devem ser ablacionados para produzir um defeito grave no nervo maduro (Lin et al., 1995 Hidalgo e Brand, 1997). Abaixo, vamos nos concentrar em dMP2 e vMP2.

O entalhe é necessário para formar conexões longitudinais no CNS

A remoção de Notch no meio da embriogênese, usando uma mutação sensível à temperatura, evitou a formação de tratos axônicos longitudinais maduros (Fig. 1B, C) (Giniger et al., 1993 Giniger, 1998). O exame de embriões no estágio inicial 13 revelou que o Entalhe o fenótipo é aparente nos primeiros estágios do pioneirismo desses tratos. Em embriões com mudança de temperatura, os axônios dMP2 e vMP2 cresceram na direção apropriada, mas pararam, falhando em fazer contato mesmo no estágio final 13 (Fig. 1D-F). A expressividade desse fenótipo depende do momento da mudança de temperatura (Crowner et al., 2003). Ajustamos as condições para dar uma expressividade muito modesta (13 ± 1,1% das conexões hemissegmentais iniciais ausentes) para minimizar defeitos do SNC não relacionados. A falha em estabelecer conexões intersegmentares não é devida à transformação das identidades de vMP2 e dMP2, conforme mostrado pela direção do crescimento do axônio e pela coloração para o marcador molecular Odd skipped (Spana e Doe, 1996) (dados não mostrados). Estagnação de pioneiros longitudinais também foi observada em Delta ts (Fig. 1G).

O entalhe é necessário para o crescimento e orientação dos pioneiros longitudinais. (UMA) Quatro neurônios pioneiros estabelecem conexões intersegmentais no Drosófila CNS: pCC, MP1, dMP2 e vMP2. Dois neurômeros e a região intersegmentar entre eles são mostrados. As linhas tracejadas verdes e brancas indicam o alinhamento do esquema à micrografia em B. Anterior está no topo. (B,C) Padronização do axônio no cordão nervoso embrionário maduro. Tipo selvagem (WT B) ou Notch ts (C) embriões foram deslocados para 32 ° C antes que os axônios pioneiros se estendam, crescidos até o estágio 15/16, fixados e corados com mAb BP102. As setas em C indicam lacunas entre os segmentos adjacentes no mutante em comparação com o tipo selvagem (pontas de seta em B). O colchete indica um único neurômero. (D,E,G) Padronização do axônio no início do SNC. WT (D), Notch ts (E) ou Delta ts (G) embriões foram deslocados para 32 ° C, em seguida, fixados no estágio intermediário 13 e corados com mAb 22C10 para revelar axônios pioneiros. As setas amarelas indicam conexões longitudinais ausentes nos mutantes em comparação com o tipo selvagem (ponta de seta em D). Setas brancas destacam cones de crescimento de dMP2 e vMP2 paralisados ​​em Notch ts . (F) neurônios dMP2 e vMP2 em Notch ts . Um estágio intermediário de 13 Notch ts embrião expressando mCD8-GFP em dMP2 e vMP2 sob controle de GAL4-15J2 foi preparado conforme descrito para D, E e visualizado com anti-GFP. As setas indicam cones de crescimento MP2 parados. Filetes de projeções de um cone de crescimento de vMP2 paralisado são circundados. (H) Embrião de estágio inicial 13 de tipo selvagem carregando um lacZ repórter para atividade de sinalização Notch [E (spl) mδ-lacZ], marcado com anti-β-galactosidase (β-gal vermelho) e mAb22C10 (verde). As setas destacam a proximidade de cones de crescimento pioneiros às células com sinalização Notch ativada (lacZ + ). (eu,J) Embriões de estágio 13 portadores do E (spl) mδ-lacZ repórter, marcado com anti-β-gal (vermelho) e marcadores para interface glia, anti-Prospero (I, verde) ou anti-Repo (J, azul). Os círculos destacam os aglomerados de células β-gal-positivas. (K) Notch ts embriões portadores dos transgenes indicados foram preparados conforme descrito para D, E e as conexões intersegmentais que não se formaram no estágio intermediário 13 foram quantificadas. Todos os desvios de Notch ts são estatisticamente significativos (P& lt0,05 ANOVA). A linha vertical fina no Entalhe barra mostra s.e.m. Nenhum dos transgenes produziu defeitos dominantes em um fundo de tipo selvagem sob essas condições (& lt2% dos hemisegmentos).

O entalhe é necessário para o crescimento e orientação dos pioneiros longitudinais. (UMA) Quatro neurônios pioneiros estabelecem conexões intersegmentais no Drosófila CNS: pCC, MP1, dMP2 e vMP2. Dois neurômeros e a região intersegmental entre eles são mostrados. As linhas tracejadas verdes e brancas indicam o alinhamento do esquema à micrografia em B. Anterior está no topo. (B,C) Padronização do axônio no cordão nervoso embrionário maduro. Tipo selvagem (WT B) ou Notch ts (C) embriões foram deslocados para 32 ° C antes que os axônios pioneiros se estendam, crescidos até o estágio 15/16, fixados e corados com mAb BP102. As setas em C indicam lacunas entre os segmentos adjacentes no mutante em comparação com o tipo selvagem (pontas de seta em B). O colchete indica um único neurômero. (D,E,G) Padronização do axônio no início do SNC. WT (D), Notch ts (E) ou Delta ts (G) embriões foram deslocados para 32 ° C, em seguida, fixados no estágio intermediário 13 e corados com mAb 22C10 para revelar axônios pioneiros. As setas amarelas indicam conexões longitudinais ausentes nos mutantes em comparação com o tipo selvagem (ponta de seta em D). Setas brancas destacam cones de crescimento de dMP2 e vMP2 paralisados ​​em Notch ts . (F) neurônios dMP2 e vMP2 em Notch ts . Um estágio intermediário de 13 Notch ts embrião expressando mCD8-GFP em dMP2 e vMP2 sob controle de GAL4-15J2 foi preparado conforme descrito para D, E e visualizado com anti-GFP. As setas indicam cones de crescimento MP2 parados. Filetes de projeções de um cone de crescimento de vMP2 paralisado são circundados. (H) Embrião de estágio inicial 13 de tipo selvagem carregando um lacZ repórter para atividade de sinalização Notch [E (spl) mδ-lacZ], marcado com anti-β-galactosidase (β-gal vermelho) e mAb22C10 (verde). As setas destacam a proximidade de cones de crescimento pioneiros às células com sinalização Notch ativada (lacZ + ). (eu,J) Embriões de estágio 13 portadores do E (spl) mδ-lacZ repórter, marcado com anti-β-gal (vermelho) e marcadores para interface glia, anti-Prospero (I, verde) ou anti-Repo (J, azul). Os círculos destacam os aglomerados de células β-gal-positivas. (K) Notch ts embriões contendo os transgenes indicados foram preparados conforme descrito para D, E e as conexões intersegmentais que não se formaram no estágio intermediário 13 foram quantificadas. Todos os desvios de Notch ts são estatisticamente significativos (P& lt0,05 ANOVA). A linha vertical fina no Entalhe barra mostra s.e.m. Nenhum dos transgenes produziu defeitos dominantes em um fundo de tipo selvagem sob essas condições (& lt2% dos hemisegmentos).

Para verificar onde Notch é ativado neste estágio no tipo selvagem, examinamos um repórter transcricional para a atividade Notch, E (spl) mδ-lacZ (Cooper e Bray, 1999), e encontraram a expressão de β-galactosidase em um subconjunto da interface da glia. Essas glias alinhavam o caminho que os axônios pioneiros longitudinais em avanço seguirão e estavam presentes quando esses axônios estavam crescendo (Fig. 1H) (Jacobs e Goodman, 1989a Hidalgo e Booth, 2000). As células β-galactosidase + foram identificadas como interface glia com base na posição e morfologia (Fig. 1H), e por co-marcação para Prospero e Repo (Fig. 1I, J). A expressão de β-galactosidase mais proeminente está na glia dentro dos neurômeros (Griffiths e Hidalgo, 2004), mas neste estágio também havia expressão na interface da glia entre os neurômeros, ao longo da via do axônio presumida (Fig. 1H, setas).

A ativação de Notch na interface da glia foi surpreendente porque a expressão de Notch em neurônios suprime o fenótipo axonal do SNC de estágio avançado de Notch ts (Giniger, 1998 Le Gall et al., 2008). Remarkably, we now found we could efficiently rescue the early axon phenotype of Notch ts by expressing Notch either just in the glia [repo-GAL4 (all glia): 72% rescue htl-GAL4 (interface glia): 92% rescue] or just in the dMP2 and vMP2 pioneers (15J2-GAL4: 85% rescue P<0.01 in all cases t-test) (Fig. 1K). We verified that in wild type Notch is expressed in interface glia and in both dMP2 and vMP2 (data not shown). We also verified that Notch activity in both cell types is physiologically relevant using loss-of-function experiments (Fig. 1K): RNAi against Entalhe in interface glia significantly enhanced the Notch ts phenotype (2.5-fold P<0.005), and cell-autonomous reduction of functional Notch in dMP2 and vMP2 by cis-inhibition (Sprinzak et al., 2010) using expression of Delta lacking its intracellular domain (Itoh et al., 2003) enhanced the Notch ts phenotype by 92% (P& lt0.05). RNAi was not effective on the relevant timescale in dMP2 and vMP2 using 15J2-GAL4.

How can Notch rescue the growth of longitudinal pioneer axons both autonomously, acting in the pioneers, and non-autonomously, acting in the glia? We will first dissect the action of Notch in glia, and then turn to the Notch mechanism in pioneers.

Glial development in Notch ts

Notch becomes activated in interface glia by contact en passant with the axons of Delta-expressing commissural interneurons (Thomas and van Meyel, 2007). Interface glia were contacted by Delta + axons and displayed activated Notch signaling by early stage 13, in time to modulate growth of longitudinal pioneers (Fig. 2A). Moreover, expression in the glia of a Notch derivative lacking the ligand-binding domain could not rescue longitudinal axons (21% of intersegment connections were absent in Notch ts repo-GAL4UAS-Notch Δ EGF(10-12) versus 13% for Notch ts , consistent with previous evidence showing a mild dominant-negative effect of this transgene) (Le Gall et al., 2008).

ByM6A__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt="Interface glia recruit a cap of Frazzled+ neuronal processes. The CNS of stage 13 Drosophila embryos was analyzed by immunofluorescence. Embryos in E-G and J are very early stage 13, other panels are mid-stage 13. (A) Stage 13 embryos bearing E(spl)mδ-lacZ reporter, labeled with anti-β-gal (red) and anti-Delta (green). A z-projection is shown in A. White arrowheads indicate Delta-positive axons coursing medially from lateral neurons. Anterior is to the right. AL shows a longitudinal cross-section at the position of the yellow triangles. AT shows a transverse cross-section at the position of the orange triangles. Thin white arrows indicate Delta-positive axons (green) as they contact Notch signaling-positive glia (red). (B) Wild-type (WT) or Notchts embryos were temperature-shifted, fixed and labeled with anti-Repo. Each white bracket indicates one segment. White arrow indicates midline. Wild-type and Notchts embryos each have approximately ten Repo+ interface glia per hemisegment. A few non-interface glia are also visible in this section. (C) Wild-type or Notchts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Htl. (D) Wild-type or Notchts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Prospero. Five to six Pros+ cells are visible in each segment in wild type and in Notchts (bracket). Only one focal plane is shown so not all Pros+ cells are visible in all segments. (E-E″″) Wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia, under the control of htl-GAL4, labeled with anti-GFP (green), anti-Frazzled (red) and mAb 22C10 (blue). E shows the overlay of all channels. E′-E″″ are higher magnification views of the boxed region. Thin white arrows indicate the growth cones of dMP2 and vMP2. Glia (GFP, green) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E′. Anti-Frazzled (red) is shown in E″. Anti-Frazzled (red) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E‴. E″″ is the overlay of all markers. Yellow arrows highlight the gap between the vMP2 growth cone and the glial cell. Note close apposition of dMP2 and vMP2 growth cones with Frazzled. (F) Three-dimensional rendering of an image stack of an embryo prepared as described for E. vMP2 growth cone (mAb 22C10, cyan) migrates through a bed of Frazzled+ processes (red) that separate it from the associated interface glia (GFP green). Image has been inverted to put glia beneath axon. (G-G″″) Wild-type embryo labeled with anti-Frazzled (green), anti-HRP (red) and mAb BP102 (blue). G shows overlay of all channels. A single optical section is shown (

Interface glia recruit a cap of Frazzled + neuronal processes. The CNS of stage 13 Drosófila embryos was analyzed by immunofluorescence. Embryos in E-G and J are very early stage 13, other panels are mid-stage 13. (UMA) Stage 13 embryos bearing E(spl)mδ-lacZ reporter, labeled with anti-β-gal (red) and anti-Delta (green). UMA z-projection is shown in A. White arrowheads indicate Delta-positive axons coursing medially from lateral neurons. Anterior is to the right. UMAeu shows a longitudinal cross-section at the position of the yellow triangles. UMAT shows a transverse cross-section at the position of the orange triangles. Thin white arrows indicate Delta-positive axons (green) as they contact Notch signaling-positive glia (red). (B) Wild-type (WT) or Notch ts embryos were temperature-shifted, fixed and labeled with anti-Repo. Each white bracket indicates one segment. White arrow indicates midline. Wild-type and Notch ts embryos each have approximately ten Repo + interface glia per hemisegment. A few non-interface glia are also visible in this section. (C) Wild-type or Notch ts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Htl. (D) Wild-type or Notch ts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Prospero. Five to six Pros + cells are visible in each segment in wild type and in Notch ts (bracket). Only one focal plane is shown so not all Pros + cells are visible in all segments. (E-E″″) Wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia, under the control of htl-GAL4, labeled with anti-GFP (green), anti-Frazzled (red) and mAb 22C10 (blue). E shows the overlay of all channels. E′-E″″ are higher magnification views of the boxed region. Thin white arrows indicate the growth cones of dMP2 and vMP2. Glia (GFP, green) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E′. Anti-Frazzled (red) is shown in E″. Anti-Frazzled (red) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E‴. E″″ is the overlay of all markers. Yellow arrows highlight the gap between the vMP2 growth cone and the glial cell. Note close apposition of dMP2 and vMP2 growth cones with Frazzled. (F) Three-dimensional rendering of an image stack of an embryo prepared as described for E. vMP2 growth cone (mAb 22C10, cyan) migrates through a bed of Frazzled + processes (red) that separate it from the associated interface glia (GFP green). Image has been inverted to put glia beneath axon. (G-G″″) Wild-type embryo labeled with anti-Frazzled (green), anti-HRP (red) and mAb BP102 (blue). G shows overlay of all channels. A single optical section is shown (

0.7 μm). G′-G″″ show higher magnification views of the boxed region. G′ shows the overlay of channels G″-G″″ show separate channels as indicated. (H-I) An embryo expressing mCD8-GFP in interface glia (htl-GAL4), labeled with anti-GFP (green) and anti-Frazzled (red). H is a z-projection. Arrows highlight the correspondence of glial position and Frazzled. H′ is a magnified view of the region indicated in H. I shows a three-dimensional rendering of H, viewed obliquely. Frazzled is ventral to the glia (arrows). (J-J″) z-projection of an early stage 13 wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia (GAL4-605), labeled with anti-GFP (green) and anti-Frazzled (blue). Frazzled + cap is beginning to fill-in between successive segments (asterisks). J shows the overlay of channels. Arrows indicate an intersegmental region in which Frazzled is not yet detected but a glial cell is already present. J′ shows GFP signal in glia and J″ shows anti-Frazzled staining. At early stage 13 GAL4-605 is expressed primarily in interface glia later it will also be in some neurons.

Notch ts embryos had the normal number of interface glia, as assayed with anti-Repo (Fig. 2B). Moreover, the position and morphology of those glia appeared largely normal, and they expressed Htl and (where appropriate) Prospero (Fig. 2C,D). Thus, failure of overall glial development does not underlie the Entalhe axonal phenotype.


Neural activity promotes brain plasticity through myelin growth, study finds

Steve Fisch

Michelle Monje is senior author of a paper that found neuronal activity causes changes in myelin, cells that insulate nerve fibers and make them more efficient.The brain is a wonderfully flexible and adaptive learning tool. For decades, researchers have known that this flexibility, called plasticity, comes from selective strengthening of well-used synapses — the connections between nerve cells.

Now, researchers at the Stanford University School of Medicine have demonstrated that brain plasticity also comes from another mechanism: activity-dependent changes in the cells that insulate neural fibers and make them more efficient. These cells form a specialized type of insulation called myelin.

“Myelin plasticity is a fascinating concept that may help to explain how the brain adapts in response to experience or training,” said Michelle Monje, MD, PhD, assistant professor of neurology and neurological sciences.

The researchers’ findings are described in a paper published online April 10 in Science Express.

“The findings illustrate a form of neural plasticity based in myelin, and future work on the molecular mechanisms responsible may ultimately shed light on a broad range of neurological and psychiatric diseases,” said Monje, senior author of the paper. The lead authors of the study are Stanford postdoctoral scholar Erin Gibson, PhD, and graduate student David Purger.

Sending neural impulses quickly down a long nerve fiber requires insulation with myelin, which is formed by a cell called an oligodendrocyte that wraps itself around a neuron. Even small changes in the structure of this insulating sheath, such as changes in its thickness, can dramatically affect the speed of neural-impulse conduction. Demyelinating disorders, such as multiple sclerosis, attack these cells and degrade nerve transmission, especially over long distances.

Myelin-insulated nerve fibers make up the “white matter” of the brain, the vast tracts that connect one information-processing area of the brain to another. “If you think of the brain’s infrastructure as a city, the white matter is like the roads, highways and freeways that connect one place to another,” Monje said.

In the study, Monje and her colleagues showed that nerve activity prompts oligodendrocyte precursor cell proliferation and differentiation into myelin-forming oligodendrocytes. Neuronal activity also causes an increase in the thickness of the myelin sheaths within the active neural circuit, making signal transmission along the neural fiber more efficient. It’s much like a system for improving traffic flow along roadways that are heavily used, Monje said. And as with a transportation system, improving the routes that are most productive makes the whole system more efficient.

In recent years, researchers have seen clues that nerve cell activity could promote the growth of myelin insulation. There have been studies that showed a correlation between experience and myelin dynamics, and studies of isolated cells in a dish suggesting a relationship between neuronal activity and myelination. But there has been no way to show that neuronal activity directly causes myelin changes in an intact brain. “You can’t really implant an electrode in the brain to answer this question because the resulting injury changes the behavior of the cells,” Monje said.

The solution was a relatively new and radical technique called optogenetics. Scientists insert genes for a light-sensitive ion channel into a specific group of neurons. Those neurons can be made to fire when exposed to particular wavelengths of light. In the study, Monje and her colleagues used mice with light-sensitive ion channels in an area of their brains that controls movement. The scientists could then turn on and off certain movement behaviors in the mice by turning on and off the light. Because the light diffuses from a source placed at the surface of the brain down to the neurons being studied, there was no need to insert a probe directly next to the neurons, which would have created an injury.

By directly stimulating the neurons with light, the researchers were able to show it was the activation of the neurons that prompted the myelin-forming cells to respond.

Further research could reveal exactly how activity promotes oligodendrocyte-precursor-cell proliferation and maturation, as well as dynamic changes in myelin. Such a molecular understanding could help researchers develop therapeutic strategies that promote myelin repair in diseases in which myelin is degraded, such as multiple sclerosis, the leukodystrophies and spinal cord injury.

“Conversely, when growth of these cells is dysregulated, how does that contribute to disease?” Monje said. One particular area of interest for her is a childhood brain cancer called diffuse intrinsic pontine glioma. The cancer, which usually strikes children between 5 and 9 years old and is inevitably fatal, occurs when the brain myelination that normally takes place as kids become more physically coordinated goes awry, and the brain cells grow out of control.

Other Stanford co-authors of the paper are Hannes Vogel, MD, professor of pathology and of pediatrics Ben Barres, MD, PhD, professor and chair of neurobiology, as well as professor of developmental biology and of neurology and neurological sciences postdoctoral scholar Bradley Zuchero, PhD graduate students Christopher Mount, Grant Lin, Lauren Wood and Gregor Bieri and undergraduate students Andrea Goldstein, Sarah Miller and Ingrid Inema.

This research was funded by the National Institutes of Health (K08NS070926 and R01EY10257) the California Institute for Regenerative Medicine Alex’s Lemonade Stand Foundation the McKenna Claire Foundation The Cure Starts Now the Lyla Nsouli Foundation the Dylan Jewett, Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, Wayland Villars and Jennifer Kranz Memorial Funds the Ludwig Foundation the Stanford Medical Scientist Training Program the Stanford Institute for Neuro-Innovation and Translational Neurosciences the Lucile Packard Foundation for Children’s Health Stanford’s Clinical and Translational Science Award (UL1RR025744) the Howard Hughes Medical Institute Fellowship of the Life Sciences Research Foundation the Bezos Family Foundation the Child Health Research Institute at Stanford and the Anne T. and Robert M. Bass Endowed Faculty Scholarship.


Notch Signaling

Ryoichiro Kageyama , . Toshiyuki Ohtsuka , in Current Topics in Developmental Biology , 2010

2.1 Hes7 oscillations by negative feedback

Somites are segmental axial structures of vertebrate embryos that give rise to vertebral column, ribs, skeletal muscles, and subcutaneous tissues. A bilateral pair of somites forms periodically at the anterior ends of the presomitic mesoderm (PSM), located at the caudal part of embryos ( Fig. 10.2A ). During this process, mesenchymal cells of the PSM are transformed into the epithelial sheet (mesenchymal–epithelial transition) at each somite border, which segments a block of somitic cells from the PSM (segmentation). A bilateral pair of somites is formed once every 2 h in mice, every 90 min in chick, and every 30 min in zebrafish. Thus, the segmentation period differs from species to species. In addition, the period becomes longer at lower temperatures ( Jiang et al., 2000 ), indicating that it is also temperature dependent. However, within each species, the period length remains precise during development, so that the number of somites is used to identify the embryonic stages. The biological clock that regulates this periodic segmentation is called the segmentation clock ( Pourquié, 2003 ) its molecular mechanisms have been analyzed intensively in zebrafish, chick, and mice ( Dequéant and Pourquié, 2008 Mara and Holley, 2007 ).

Figure 10.2 . Hes7 oscillations in the PSM during somite segmentation. (A) The anterior ends of the PSM are segmented every 2 h in mouse embryos, forming a bilateral pair of somites (asterisk). Hes7 gene transcription is initiated in the posterior end of the PSM (phase I) and is propagated into the anterior region (phase II), stopping near the anterior end (phase III). Hes7 gene transcription and Hes7 protein expression occur in a mutually exclusive manner in all three phases, indicating that Hes7 gene transcription is repressed by Hes7 protein. (B) Dynamic Hes7 expression is caused by oscillation in individual cells [indicated by a dot in (A)]. Hes7 gene transcription and Hes7 protein expression oscillate in an antiphase manner. (See Color Insert.)

In mouse embryos, both Hes1 e Hes7 are expressed dynamically in the PSM ( Bessho et al., 2001a Jouve et al., 2000). The expression cycle is initiated in the posterior tip of the PSM and is propagated toward the anterior, ending near the anterior boundary of the PSM, after which segmentation of one bilateral pair of somites occurs ( Fig. 10.2A ). This dynamic expression of Hes1 and Hes7 is caused by synchronized oscillation in PSM cells ( Fig. 10.2B ). Of these two genes, Hes7 is functionally more important than Hes1 for somite segmentation: somites fail to segment and thus are severely fused in the absence of Hes7 but not in the absence of Hes1 ( Bessho et al., 2001b ). Interestingly, sustained expression of Hes7 also leads to severe somite fusion, suggesting that the oscillating expression of Hes7 is the key for maintaining periodic somite segmentation ( Niwa et al., 2007 ).

What is the mechanism producing Hes7 oscillations? In the PSM, Hes7 gene transcription and translation are mutually exclusive ( Fig. 10.2A,B ), and in the absence of a functional Hes7 protein, the Hes7 gene is continuously transcribed in the PSM ( Bessho et al., 2003). Ativação de Hes7 promoter induces synthesis of Hes7 mRNA which is then translated to generate Hes7 protein Hes7 protein levels reach a peak within about 1 h. Hes7 protein binds to the multiple N box sequences located in the Hes7 promoter, repressing its own expression ( Fig. 10.3 ). This repression leads to disappearance of Hes7 mRNA, and then the Hes7 proteins disappear within an hour by the ubiquitin–proteasome-mediated degradation. The disappearance of Hes7 protein relieves autorepression, allowing Hes7 transcription to restart. As a result, Hes7 expression oscillates with a period of about 2 h. Thus, the negative regulation of Hes7 expression by Hes7 protein forms a negative feedback loop that is critical for maintaining oscillations.

Figure 10.3 . Hes7 oscillations are regulated by negative feedback and rapid degradation of gene products. Ativação de Hes7 promoter induces synthesis of both Hes7 mRNA and Hes7 protein. Hes7 protein then binds to multiple N box sequences of Hes7 promoter and represses its own expression. This repression leads to disappearance of Hes7 mRNA and Hes7 protein because they are extremely unstable. Hes7 protein is polyubiquitinated and degraded by proteasome. Disappearance of Hes7 protein relieves negative autoregulation, allowing the next round of expression. As a result, Hes7 expression oscillates in the PSM.


Olfactory ensheathing cells: Biology in neural development and regeneration

Olfactory ensheathing cells (OECs) constitute a unique population of glia that accompany and ensheath the primary olfactory axons. They are thought to be critical for spontaneous growth of olfactory axons within the developing and adult olfactory nervous system, and have recently emerged as potential candidates for cell-mediated repair of neural injuries. Here, based on the current research, we give an overview of the biology of OECs in neural development and regeneration. This review starts with a detailed description of the cellular and molecular biological properties of OECs. Their functions in olfactory neurogenesis, olfactory axonal growth and olfactory bulb formation are sequently discussed. We also describe therapeutic applications of OECs for the treatment of a variety of neural lesions, including spinal cord injury, stroke, degenerative diseases, and PNS injuries. Finally, we address issues that may foster a better understanding of OECs in neural development and regeneration.

Research highlights

▶ Olfactory ensheathing cells (OECs) constitute a unique population of glia that accompany and ensheath the primary olfactory axons. ▶ They are thought to be critical for growth of olfactory axons within the developing and adult olfactory nervous system, and have recently emerged as potential candidates for cell-mediated repair of neural injuries. ▶ In this article we review current knowledge of OEC biology, including their molecular and cellular properties, and their role in olfactory development. ▶ We also describe therapeutic applications of OECs for a variety of neural lesions. ▶ This review, we think, may foster a better understanding of OECs biology in neural development and regeneration.


How are Interactions Between Neural Cells Established and Maintained?

The human embryo is a collection of clusters of non-specific cells, which then develop into the tissues of the adult human. In particular immature, non-specific neuroblasts must be differentiated into the highly specialised cells of the nervous system, each with a unique structure, function and synaptic interactions (Whatson 2004).

The whole function of the nervous system relies on the synaptic and other interactions between neural cells being developed appropriately and maintained throughout life. This account covers the initial development of specific neural cells from immature precursor stem cells and also the methods by which the growing specialised neurons grow along the correct routes to form their interactions with other cells, both neuronal and non neuronal.

Establishing neural cells from stem cells

Progenitor or stem cells are non-specific immature cells that are able to differentiate and form specialised cells in the adult organism. There are relatively few types of neural stem cells, with the potential to differentiate into many different types of specialised neural cells, depending on specific, localised requirements. Multipotent (able to form many types of daughter cells) neural stem cells were first identified in the early 1990s (Imitola et al. 2004) and subsequent research has focussed on specific examples of these immature progenitor cells.

Neural stem cells can give rise both to different types of mature cell, as a result of asymmetric cell division, as well as identical daughter cells via simple symmetric cell replication (Gage 2000). The exact form of the adult cell is controlled by the location of progenitors during differentiation, as well as by diffusible factors acting from a more distant site, usually the final location to which the differentiated cells will migrate.

Signalling molecules influence the differentiation of neural stem cells. For instance valproic acid (VPA) actively suppresses glial differentiation, instead encouraging the development of adult neurons, via upregulation of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor (Hsieh, Gage 2004).

The mesenchymal stem cell (MSC) is derived from bone marrow and able to self regenerate and differentiate into several different types of cells in vivo (Kondo et al. 2005). MSCs are able to form both neuronal and glial cells the difference relating to the presence or absence or voltage gated ion channels indicative of the potential to develop into a full neuronal cell. Furthermore the presence of specific signalling molecules in the cell milieu can influence the development of specific types of neuronal cells. One such example involves the sonic hedgehog and retinoic acid signalling molecules, which have been shown to cause MSCs to define neurons adapted for the peripheral nervous system (Kondo et al. 2005). It is believed that this guidance of development occurs via the promotion of specific transcription factors appropriate to the adult neuronal cells. The diffusible signalling molecules would switch on the transcription factors.

A growing axon has an area of active tissue on the tip, known as the growth cone (Whatson 2004). It is the interactions between the growth cone and the surrounding structures and chemicals that govern the route along which the axon grows. Chemotactic guidance is the name given to guidance derived from close physical contact between the growth cone and structures it comes into contact with. For instance, physical obstacles such as bones or cartilage may prevent the axon from continuing along a specific route. Instead the filopodia (thin membrane extensions) would literally feel around for a route that the axonal growth could take.In the case of growth of the axons of the optic nerve, the growth of retinal neurites is influenced by the presence of laminin and fibronectin. Axons interact with these extracellular matrix components differently according to their origin with some adhering more strongly to laminin, with others showing greater allegiance to fibronectin (Whatson 2004). Hence some retinal neurites cross the optic chiasm whilst others do not.

Chemotactic guidance does not, however, operate in isolation, instead being linked to the presence of chemical signalling molecules, many of which are similar to those affecting the initial stem cell differentiation.

The idea that the gradient of chemical substances secreted by a target cell might be responsible for the ability of growth cones to find their way to a target cell was initially proposed by Ramon y Cajal more than a century ago (Ming et al. 2002). These chemotropic (literally movement in response to a chemical factor) factors are present in the extracellular matrix and act to either attract or repel the growth cone, along a chemical gradient. One example is netrin-1, which causes isolated xenopus spinal neurones to turn towards the greater concentration. However too high a concentration of netrin-1 (eg 5ng/ml-1 compared to 5 (g/ml-1) appears to desensitise the neurones, which no longer exhibit turning on a gradient (Ming et al. 2002). Netrin-1 (also known as unc-6) is also required by the worm C-elegans in order for differentiating neuroblasts to migrate along the dorsoventral axis the final direction determined by interactions between the neuroblasts and specific receptors (Hatten 2002).

Crossing the midline a detailed example

In the fruit fly drosophila the genes roundabout (deficient mutant – robo), commissureless (deficient mutant – comm) and slit (deficient mutant – sli) work together to influence axonal growth across the CNS midline (Kidd, Bland & Goodman 1999). Axons may cross the midline and become commissural or remain ipsilateral as longitudinal axons. Figure 1 below illustrates the effect that removal of each of the 3 chemotropic factors has on the appearance of longitudinal and commissural axons within the CNS axon scaffold, described as follows:

Wild type (all genes thus chemotropic factors intact) shows neat crossing of the midline, resulting in 2 commissures per segment and balanced commissural and longitudinal axons.

comm – no axons cross the midline, all remain longitudinal.

sli – axons enter the midline but then continue as longitudinal axons, within the midline.

robo – axons cross and recross the midline resulting in excessive commissural axons and very few longitudinal axons.

The authors concluded that slit acted as a short range repellent of axons with respect to the midline, thus was a chemotropic factor (Kidd, Bland & Goodman 1999). Subsequent research has shown that robo is actually repelled from the midline in response to slit, which has been found to be a large protein expressed by midline glia (Kraut, Zinn 2004).

Neuronal and Glial cell interactions

Much recent research into the methods by which developing neurons form interactions with other neural cells as well as the glial support cells, has come from study of insects such as drosophila.

Glia are crucial in the correct development of the developing eye disc in insects. The diffusible factors decapentaplegic and hedgehog both strongly influence glial proliferation, with decapentaplegic also having a role in glial motility. Glia motility is particularly crucial as axons will extend and grow in the correct direction in response to diffusible factors but will not enter the optic stalk without the chemotactic guidance of glia (Oland, Tolbert 2003).

Maintaining the connections in the adult nervous system

It has recently become apparent that, as a neuron matures, it’s responsiveness to signalling molecules such as netrin-1 changes (Salinas 2003). There is logic to this, as a maturing axon would expect to receive specific guidance cues to establish connections with other cells whereas a mature axon would not seek to continue to migrate towards the cells, rather wishing to maintain accurate connections. As there is a need to replace dead cells throughout life it would not be appropriate to completely switch off signalling molecules such as netrin-1, as every new axon would need to migrate towards the correct connections, but would then benefit from becoming effectively immune to the signalling capabilities of netrin-1 as there would be no need for further migration.

The importance of accurate migration from the stem cell germinal site to the area of axon-target interaction relates to the need for accurate synaptic connections in the adult nervous system. Organisms with a more simplistic nervous system have a low extent of migration, whilst the vertebrate nervous system involves a high degree of migration (Hatten 2002). Thus the eventual nervous system depends heavily on the accuracy of the guidance provided by both the signalling molecules and the chemotactic scaffold.

Whilst there is immense potential in understanding how stem cells develop, in terms of replicating this in order to replace damaged cells in the human adult thus far the research underlying the regulation of endogenous stem cells is in its infancy and mechanisms are poorly understood. Further, the method by which differentiated cells are able to accurately locate their target connections is also an area of current mystery.


Materiais e métodos

Zebrafish lines

Embryos and larvae were obtained by natural spawning from wild-type, Tg(Raposa D3:GFP) [12, 30], Tg(flh:eGFP) Tg(foxD3:GFP) [12], Tg(h2afz-GFP) [31], or Tg(ET16:GFP) fish (a gift from Dr Vladimir Korzh). The ET16 enhancer trap line carries a Tol2-GFP insertion and labels a subset of habenular neurons [32, 33]. Embryos were reared and staged according to standard procedures [34] and occasionally 0.002% phenylthiourea was added to the fish water from 24 hpf to inhibit pigment formation.

Dye labeling

Carbocyanine dye labeling of habenular efferent axons was performed as described previously [16].

Laser ablation

Laser ablation of parapineal precursors was performed at 24–28 hpf in Tg(flh:eGFP) Tg(foxD3:GFP) transgenic embryos as described previously [12]. Larvae were subsequently examined by laser-scanning confocal microscopy at 3 or 4 dpf to determine if any parapineal cells remained. Larvae lacking all parapineal cells were classed as 'ablated' whereas those retaining one or more parapineal cell(s) were classed as 'failed ablated'.

Focal electroporation

The electroporation technique was adapted from [35] to enable the efficient transfer of DNA to single cells or small group of cells in embryonic zebrafish CNS. Embryos at 48–72 hpf were mounted in 2% low melting point agarose (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) and using a microsurgical blade, a small chamber of agarose was cut out to expose the dorsal diencephalons/mesencephalon. Micropipettes with a tip diameter of 1–2 μm were pulled on a P-87 micropipette puller (Sutter Instrument Company, CA, USA) using AlSi glass capillaries containing a filament. Micropipettes were filled with a solution containing purified plasmid DNA resuspended in H2O at a concentration of 1 μg/μl. For most habenular neuron electroporations we used pCS2-GAP43-GFP (a gift from Dr E Amaya). GFP synthesized from this construct is localized to the cell membrane by virtue of two amino-terminal palmitoylation signals from the GAP43 protein. To visualize presynaptic terminals, we used a 1:1 mixture of pCS2-GAL4 plasmid DNA (a gift from Dr Masahiko Hibi) and pCS2-Syp:GFP-DSR [17]. This latter construct encodes both cytoplasmic DsRed fluorescent protein and a Syp-GFP fusion protein, driven from separate UAS elements. For IPN electroporations we used pCS2-lyn-Cherry, which encodes a membrane-targetted Cherry fluorescent protein (a kind gift from Henry Roehl). Micropipettes were guided into either the L or R habenula or the IPN using an MX3000 Huxley-style micromanipulator (Soma Scientific Instruments, Irvine, CA, USA) under ×40 water-immersion DIC optics (Axioskop 2 FS microscope, Carl Zeiss). The following stimulation parameters were used: 1–2 s long trains of 2 ms square pulses at 200 Hz and a potential difference of 30 V. Trains were delivered 3–5 times with approximately 0.5 s interval between trains. Pulses were generated with a Grass SD9 stimulator (Grass-Telefactor, West Warwick, RI, USA). After electroporation, embryos were cut out from the agarose and returned to embryo medium.

Whole mount no local hybridization and immunostaining

No local hybridization, antibody staining and histological sectioning were performed according to standard methods [36]. For antibody stainings, mouse anti-acetylated tubulin (T6793 Sigma) and rabbit anti-GFP (TP401 Torrey Pines Biolabs, San Diego, CA, USA) were used at 1:1,000 dilutions and rabbit anti-DsRed (632496 ClonTech, Palo Alta, CA, USA) was used at 1:600.

Microscopy and image manipulation

Fluorescent labeling was imaged by confocal laser-scanning microscopy (Leica SP2) using ×40 and ×63 water-immersion objective lenses. z-stacks were typically acquired at 1–2 μm intervals for epithalamic labeling and fluorescent dye-labeling of habenular axons or 0.5–1 μm intervals for imaging axonal arbors or IPN neurons labeled by electroporation. Em alguns casos, z-stacks were deconvolved using Huygen's Essential software (Scientific Volume Imaging, Hilversum, The Netherlands). Three-dimensional projections were generated from the stack of images using Volocity software (Improvision, Coventry, UK).

No local hybridization staining and plastic sections were photographed using a Jentopix C14 digital camera attached to a Nikon Eclipse E1000 compound microscope. For presentation, image manipulation was performed using Photoshop CS2 (Adobe) software.

Morphometric analyses

Radial distribution of neurites

To quantify the distribution of neurite branches from the center to periphery of each terminal arbor, we developed a method similar to Sholl analysis. Three-dimensional reconstructions of each arbor were orientated such that the base of the arbor lay on a flat plane and a two-dimensional image of the reconstruction, parallel to this plane, was used for further analysis. The incoming axon was cropped where it extended beyond the maximum width and length of the arbor. Next, the image was thresholded and the convex hull method was used to define the arbor perimeter (ImageJ software, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA Hull and Circle plug-in by A Karperien and TR Roy). Using custom-written MATLAB software (The MathWorks, Inc., Natick, MA, USA), a series of 10 equally spaced concentric shells were defined, centered upon the centroid of the convex hull (see Figure 3g, for example). The number of pixels (representing axon signal) in each shell was taken as a measure of axon density. This generated a plot of cumulative fraction of axon density versus radius, for each arbor. This method is resistant to differences in the absolute area covered by the arbor and the total axonal length. Because we analyzed two-dimensional images, our method will underestimate axon density where axon segments are aligned above or below one another. This occurs rarely for L-typical arbors but is more common at the perimeter of R-typical arbors. Thus, although our method detects a greater peripheral localization of axonal length in R-typical arbors, if anything this difference between the arbor sub-types is likely to have been underestimated.

To describe the distribution profiles for the different sub-types of arbor (L-typical, R-typical and Ab-L, Ab-R) non-linear regression was used to fit fourth order polynomial models to the raw data with the y-intersect constrained to zero (at 0% radius the cumulative fraction of axon density must be zero). To compare the curves for the different arbor sub-types, we used the AIC method [37, 38]. Briefly, we used the AIC method to compare two models an AICc score is computed for a 'global' model that treats all the data from two arbor sub-types as a single data set and for a second model with individual curves fit to each data set. A large difference in the AICc scores, ΔAICc, indicates there is a high probability of the model with the lower AICc score being correct. If this is the model with separate fits for the two arbor sub-types it follows that the sub-types can be considered distinct. In the Results text we report ΔAICc and the probability that the 'individual' model, with separate polynomial fits for the two arbor sub-types, is correct.

Width/length ratio

The maximum length (measured along the AP axis) and maximum width (measured perpendicular to the AP and DV axes) were measured (Volocity, Improvision). Width/Length ratios were compared using one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

Profundidade

The depth over which each axon elaborated its terminal arbor was measured in YZ projections made using Volocity software. For L-typical arbors located in the dIPN, depth was measured parallel to the DV axis of the brain. Because the neuropil domain of the vIPN is inclined relative to the DV axis, accurate depth measurements for ventrally located R-typical, Ab-L and Ab-R arbors were made perpendicular to the plane of the vIPN neuropil domain. Depths were compared using one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

Branching

The number of branch points was counted by hand in three-dimensional reconstructions of axonal arbors. Branch points giving rise to small filopodial extensions (less than 5 μm in length) were excluded from the analysis. Average numbers of branch points were compared by one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

Estatisticas

All statistical comparisons, nonlinear regression and comparison of curves using the AIC method were performed using Prism 4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).


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