Em formação

Posso criar imagens de Coomassie e GFP em géis ao mesmo tempo com um scanner de fluorescência?

Posso criar imagens de Coomassie e GFP em géis ao mesmo tempo com um scanner de fluorescência?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estou trabalhando com uma proteína marcada com GFP e estou rotineiramente usando um imageador de fluorescência (GE Typhoon) e um scanner óptico padrão para capturar imagens fluorescentes e de absorção, respectivamente, dos meus géis SDS-PAGE. O Typhoon oferece suporte a vários canais, então há alguma maneira de fazer a varredura para os dois no mesmo dispositivo (GFP + proteína total)? Presumo que não posso fazer absorção em um scanner de fluorescência ...

Eu poderia registrar manualmente as duas imagens, mas seria trabalhoso, pois elas estão em resoluções diferentes, rotações ligeiramente diferentes, e o gel pode esticar levemente ao ser colocado no cilindro.


O azul Coomassie fica fluorescente no infravermelho quando ligado à proteína, portanto, se o seu leitor tiver o conjunto de filtros apropriado, isso deve ser possível.


Ensaio de dobramento rápido de proteínas usando proteína fluorescente verde

A formação do cromóforo da proteína fluorescente verde (GFP) depende do dobramento correto da proteína. Nós construímos um vetor "repórter dobrável", no qual uma proteína de teste é expressa como uma fusão N-terminal com GFP. Usando um painel de teste de 20 proteínas, demonstramos que a fluorescência de Escherichia coli as células que expressam tais fusões de GFP estão relacionadas ao dobramento produtivo dos domínios de proteína a montante expressos isoladamente. Usamos este indicador fluorescente de dobramento de proteínas para desenvolver proteínas que são normalmente propensas a agregação durante a expressão em E. coli em proteínas intimamente relacionadas que se dobram de forma robusta e são totalmente solúveis e funcionais. Esta abordagem para melhorar o enovelamento de proteínas não requer ensaios funcionais para a proteína de interesse e fornece uma rota simples para melhorar o enovelamento e expressão de proteínas por evolução direcionada.


Opções de acesso

Obtenha acesso completo ao diário por 1 ano

Todos os preços são preços NET.
O IVA será adicionado mais tarde no check-out.
O cálculo do imposto será finalizado durante o checkout.

Obtenha acesso limitado por tempo ou ao artigo completo no ReadCube.

Todos os preços são preços NET.


Imagens

1. Prepare um GFP recombinante 150 & mul com várias concentrações (0,00074 nM - 6,21 & muM) em tampão de ensaio e equilibre a 25 & degC. (Tampão de ensaio: Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM, azida de sódio 0,02%.)

2. Leia em comprimentos de onda de excitação 485 nm e emissão 535 nm.

- Microplaca de poliestireno de 96 poços, preta

3 ug de ab84191 reduzido em SDS-PAGE, corado com Coomassie Blue.


Limpeza de tecido e preservação de GFP no coração

O rápido desenvolvimento e uso de técnicas de limpeza de tecido está relacionado ao rápido desenvolvimento de métodos de imagem, como microscopia confocal e microscopia de luz. Juntos, esses métodos podem ser usados ​​para reconstruir a anatomia 3D do tecido (Costantini et & # x000a0al., 2019).

Um dos principais organismos modelo na pesquisa biológica é o modelo do camundongo, com sua ampla gama de modificações genéticas possíveis, incluindo a inserção de proteínas marcadas com fluorescência (por exemplo, GFP) como genes repórter. Os primeiros métodos de limpeza de tecido desenvolvidos usaram compostos hidrofóbicos, que desidratam o tecido e a desidratação extingue as proteínas fluorescentes introduzidas (isto é, GFP). Para evitar esse fenômeno, várias soluções de limpeza hidrofílicas (à base de água) foram desenvolvidas. No entanto, os métodos à base de água tiveram um desempenho de limpeza de tecido inferior (Silvestri et & # x000a0al., 2016), preservando a fluorescência. As Figuras 2 C e 2D ilustram a preservação da fluorescência de GFP em coração embrionário de diferentes estágios (ED10.5 e ED14.5) pelo método de limpeza de tecido CUBIC. Além de usar uma solução de limpeza hidrofílica, outra abordagem para manter a fluorescência é um método de transformação de tecido envolvendo a incorporação do tecido em gel de acrilamida & # x02014CLARITY (Chung et & # x000a0al., 2013).

Exemplos de imunocoloração e preservação de fluorescência de GFP com limpeza de tecido no coração de camundongo em desenvolvimento

(A e B) Imuno-histoquímica combinada com BABB em embrião de camundongo ED 9.5, anticorpo de actina de músculo liso (SMA) em marcação vermelha do miocárdio, CD31 (PECAM-1) em coloração verde do endocárdio (B) e coloração nuclear DAPI (não muito distinto nesta baixa ampliação) em azul.

(C e D) Preservação de fluorescência GFP natural com limpeza de tecido CUBIC em ED 10.5 (C) e ED 14.5 (D) em corações de embrião de Connexina 40 - GFP (Cx40-GFP) com autofluorescência sobreposta em vermelho. As trabéculas ventriculares e os átrios são positivos para Cx40 nesses estágios. O sangue autofluorescente está presente nos ventrículos (C). Todas as imagens foram capturadas com microscopia confocal. A barra de escala representa 100 & # x000a0 & # x003bcm em todas as figuras.

A análise detalhada da preservação da fluorescência por vários métodos de limpeza foi realizada por Xu e colegas (Xu et & # x000a0al., 2019b) em tecidos intestinais. Eles confirmaram que a maioria dos métodos de clareamento aquoso tem um desempenho melhor na preservação da fluorescência do que os baseados em solvente orgânico. Ao medir a relação sinal / fundo após a limpeza do tecido, eles descobriram que o melhor método para preservar a fluorescência era FRUIT, seguido por ScaleS e SeeDB. No entanto, CUBIC e PACT preservaram níveis semelhantes de fluorescência como 3DISCO e uDISCO, que são os agentes de limpeza hidrofóbicos orgânicos. Eles não incluíram CLARITY e suas variações em seus testes. Embora o estudo incluísse tecido cardíaco, a parte sobre preservação da fluorescência foi realizada no intestino, que pode reagir de maneira diferente do tecido cardíaco denso e altamente vascularizado. Portanto, é necessária uma análise mais aprofundada de 3DISCO, uDISCO e FRUIT no tecido cardíaco. Uma visão geral é resumida na Figura & # x000a01.

Apenas alguns estudos analisaram diretamente a compatibilidade da limpeza do tecido e preservação da fluorescência no tecido cardíaco adulto ou embrionário. Em nosso estudo anterior (Kolesova et & # x000a0al., 2016), usamos os métodos de limpeza CLARITY, SCALE, CUBIC e DBE e comparamos sua capacidade de preservação de fluorescência GFP em corações embrionários (ilustrados nas Figuras 2 C, 2D e & # x200B e 3B 3 B com limpeza de tecido CUBIC em Cx40: trabéculas de GFP e vasculatura coronária em corações embrionários). Descobrimos que CUBIC limpou o tecido em um nível mais profundo em comparação com ESCALA e, portanto, era mais adequado para análise de corações intactos. No entanto, embora SCALE também tenha preservado o sinal de GFP, ele apenas limpou as camadas superficiais do coração, o que pode ser suficiente para estudos dos grandes vasos da vasculatura coronária (Kolesova et & # x000a0al., 2016). A diferença entre SCALE e CUBIC era mais óbvia nos corações pós-natal, onde CUBIC efetivamente passou por todo o coração, enquanto SCALE não (Shaikh Qureshi et & # x000a0al., 2016). Outro estudo testou a capacidade do CUBIC de preservar vários sinais fluorescentes no tecido cardíaco (Nehrhoff et & # x000a0al., 2016). Eles descobriram que a limpeza CUBIC também pode preservar outras proteínas fluorescentes, como TdTomato e GFP em seções de coração de 750 - & # x003bcm de espessura.

Visualização da vasculatura coronária nos corações em desenvolvimento

(A) A vasculatura foi injetada com DiI em um embrião ED9 de codorna.

(B) As artérias coronárias foram visualizadas na superfície do coração de um embrião de camundongo ED18.5 Cx40-GFP limpo com CUBIC. Imaginado em um microscópio confocal.

(C) Análise do coração injetado DII com vasos coronários pseudocolorados para indicar a profundidade dentro da parede ventricular, embrião de codorna ED13.

(D) Coração de camundongo juvenil com vasculatura coronária injetada com Microfil e artérias coronárias principais indicadas com a cor: Artéria coronária direita (laranja) e seu ramo, artéria septal (vermelha) e artéria coronária esquerda (amarela). Obtido por imagem em um scanner micro-CT.

CLARITY também demonstrou preservar muitas proteínas fluorescentes, como GFP, mCherry, mOrange e Cerulean no tecido cardíaco (Sereti et & # x000a0al., 2018). Além disso, protocolos CLARITY modificados foram usados ​​para analisar o tecido cardíaco. SUT (atualização do esquema em transparência do tecido, combinação de CUBIC e CLARITY) tem sido usado para analisar a cura fibrótica no infarto do miocárdio (Wang et & # x000a0al., 2018). SCM (Simplified CLARITY Method) foi usado para analisar o tecido cardíaco (Sung et & # x000a0al., 2016), no entanto, melhores resultados foram obtidos quando o sangue foi lavado do coração antes da fixação, pois a descoloração do heme usando tratamento com aminoálcool reduziu a fluorescência de YFP em amostras de coração (Sung et & # x000a0al., 2016).


A Next-Generation Sequencing Facility (NGSF) é uma instalação de genômica de alto rendimento localizada na Universidade de Saskatchewan. É apoiado pela Saskatchewan Cancer Agency e pela University of Saskatchewan, College of Medicine. O objetivo principal do NGSF é promover a pesquisa básica e clínica, fornecendo acesso a tecnologias de sequenciamento de alto rendimento e especialização.

Além dos serviços de preparação e sequenciamento de bibliotecas, serviços de análise de dados e bioinformática também estão disponíveis, em conjunto ou individualmente.

Visite a página principal do NGSF para obter mais informações, incluindo uma lista de equipamentos compartilhados (Qubit, Tapestation, qPCR, iSeq, NextSeq e mais). Entre em contato conosco para discutir os objetivos do seu projeto e obter uma cotação de serviço.

     


Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M. & amp Yan, H. Desafios e oportunidades para nanotecnologia de DNA estrutural. Nat. Nanotecnol. 6, 763–772 (2011).

Wang, Z. G., Song, C. & amp Ding, B. Functional DNA nanostructures for photonic and biomedical applications. Pequena 9, 2210–2222 (2013).

Remaut, H. et al. A troca da fita doadora na montagem do pêlo assistida por um acompanhante prossegue por meio de um mecanismo de deslocamento da fita beta combinada. Mol. Célula 22, 831–842 (2006).

Baranova, E. et al. A estrutura SbsB e a reconstrução da rede revelam a montagem da camada S desencadeada por Ca2 +. Natureza 487, 119–122 (2012).

King, N. P. & amp Lai, Y. T. Abordagens práticas para projetar novos conjuntos de proteínas. Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 632–638 (2013).

Howorka, S. Rationally engineering natural protein assemblies in nanobiotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 485–491 (2011).

Main, E. R., Phillips, J. J. & amp Millership, C. Repita a engenharia de proteínas: a criação de nanoestruturas / biomateriais funcionais a partir de blocos de construção modulares. Biochem. Soc. Trans. 41, 1152–1158 (2013).

Lai, Y. T. et al. Estrutura de uma gaiola de proteína projetada que se auto-monta em um cubo altamente poroso. Nat. Chem. 6, 1065–1071 (2014).

Sinclair, J. C., Davies, K. M., Vénien-Bryan, C. & amp Noble, M. E. Generation of protein lattices por fusão de proteínas com correspondência de simetria rotacional. Nat. Nanotecnol. 6, 558–562 (2011).

King, N. P. et al. Projeto preciso de co-montagem de nanomateriais de proteína de múltiplos componentes. Natureza 510, 103–108 (2014).

King, N. P. et al. Projeto computacional de nanomateriais protéicos de automontagem com precisão de nível atômico. Ciência 336, 1171–1174 (2012).

Der, B. S. & amp Kuhlman, B. Strategies to control the binding mode of de novo designed protein interations. Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 639–646 (2013).

Lai, Y. T., Cascio, D. & amp Yeates, T. O. Structure of a 16-nm cage desenhada usando oligômeros de proteína. Ciência 336, 1129 (2012).

Voet, A. R. et al. Projeto computacional de uma proteína de hélice β simétrica de automontagem. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 111, 15102–15107 (2014).

Matsunaga, R., Yanaka, S., Nagatoishi, S. & amp Tsumoto, K. Nanochains Hyperthin compostas por algemas de proteína autopolimerizáveis. Nat. Comum. 4, 2211 (2013).

Oohora, K., Onoda, A. & amp Hayashi, T. Sistemas de montagem supramolecular formados por interações heme-heme pocket in hemoproteins. Chem. Comum. 48, 11714–11726 (2012).

Carlson, J. C. et al. Auto-montagem quimicamente controlada de nanorings de proteínas. Geléia. Chem. Soc. 128, 7630–7638 (2006).

Brodin, J. D. et al. Montagem dirigida por metal, quimicamente sintonizável de matrizes de proteínas cristalinas uni, bidimensionais e tridimensionais. Nat. Chem. 4, 375–382 (2012).

Lai, Y. T., King, N. P. & amp Yeates, T. O. Principles for desining Order protein assemblies. Trends Cell Biol. 22, 653–661 (2012).

Modica, J. A., Skarpathiotis, S. & amp Mrksich, M. Modular assembly of protein building blocks to create precisamente definidas megamoléculas. Chembiochem 13, 2331–2334 (2012).

Hou, C. et al. Construção de nanofios de proteína através de interações altamente específicas hospedeiro-hospedeiro baseadas em urila [8]: uma abordagem para a montagem de proteínas funcionais. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 5590–5593 (2013).

Fierer, J. O., Veggiani, G. & amp Howarth, M. SpyLigase peptide-peptide ligation polimeriza affibodies para aumentar a captura magnética de células cancerígenas. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 111, 1176–1181 (2014).

Fegan, A., White, B., Carlson, J. C. & amp Wagner, C.R. Chemically controlada protein assembly: technical and applications. Chem. Rev. 110, 3315–3336 (2010).

Hoersch, D., Roh, S.H., Chiu, W. & amp Kortemme, T. Reprogramming an ATP-driven protein machine into a light-gated nanocage. Nat. Nanotecnol. 8, 928–932 (2013).

Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C. & amp Waldo, G. S. Engineering and Characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24, 79–88 (2006).

Cabantous, S., Terwilliger, T. C. & amp Waldo, G. S. Marcação e detecção de proteínas com fragmentos de automontagem projetados de proteína fluorescente verde. Nat. Biotechnol. 23, 102–107 (2005).

Kent, K. P., Childs, W. & amp Boxer, S. G. Deconstructed green fluorescent protein. Geléia. Chem. Soc. 130, 9664–9665 (2008).

Sample, V., Newman, R. H. & amp Zhang, J. The structure and function of fluorescent protein. Chem. Soc. Rev. 38, 2852–2864 (2009).

Ibraheem, A. & amp Campbell, R. E. Designs and applications of fluorescent protein-based biossensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 30–36 (2010).

Lawrence, M. S., Phillips, K. J. & amp Liu, D. R. Supercharging proteínas podem conferir resiliência incomum. Geléia. Chem. Soc. 129, 10110–10112 (2007).

Fasting, C. et al. Multivalência como organização química e princípio de ação. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10472–10498 (2012).

Mammen, M., Choi, S.-K. & amp Whitesides, G. M. Polyvalent interações em sistemas biológicos: implicações para design e uso de multivalentes ligantes e inibidores. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2754–2794 (1998).

Kiessling, L. L., Gestwicki, J. E. & amp Strong, L. E. Synthetic multivalent ligands as probes of signal transduction. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2348–2368 (2006).

Levine, P. M., Carberry, T. P., Holubb, J. M. & amp Kirshenbaum, K. Crafting precise multivalent architectures. Med. Chem. Comum. 4, 493–509 (2013).

Englund, E. A. et al. Exibição multivalente programável de ligantes de receptor usando nanofaixas de ácido nucleico de peptídeo. Nat. Comum. 3, 614 (2012).

Jung, Y., Lee, J. M., Jung, H. & amp Chung, B. H. Auto-dirigida e auto-orientada imobilização de anticorpo por conjugado de proteína G-DNA. Anal. Chem. 79, 6534–6541 (2007).

Munoz, E. M., Correa, J., Riguera, R. & amp Fernandez-Megia, E. Avaliação em tempo real de mecanismos de ligação em interações multivalentes: uma abordagem cinética de ressonância de plasmon de superfície. Geléia. Chem. Soc. 135, 5966–5969 (2013).

Li, M.H., Choi, S.K., Leroueil, P.R. & amp Baker, J.R.J. Evaluating binding avidities of populations of heterogeneous multivalent ligand-functionalized nanoparticles. ACS Nano 8, 5600–5609 (2014).

Hartman, N. C. & amp Groves, J. T. Signaling clusters in the cell membrana. Curr. Opin. Célula. Biol. 23, 370–376 (2011).

Conway, A. et al. Ligantes multivalentes controlam o comportamento das células-tronco in vitro e in vivo. Nat. Nanotecnol. 8, 831–838 (2013).

Shaw, A. et al. Controle espacial da função do receptor de membrana usando nanocalímeros de ligantes. Nat. Métodos 11, 841–846 (2014).

Cho, M. H. et al. Um interruptor magnético para o controle da sinalização de morte celular em sistemas in vitro e in vivo. Nat. Mater. 11, 1038–1043 (2012).

Spangler, J. B. et al. O tratamento combinado com anticorpos desregula o receptor do fator de crescimento epidérmico ao inibir a reciclagem endossômica. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 107, 13252–13257 (2010).

Friedman, L. M. et al. Regulação negativa sinérgica de tirosina quinases receptoras por combinações de mAbs: implicações para a imunoterapia do câncer. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 102, 1915–1920 (2005).

Oliveira, S. et al. Regulação negativa de EGFR por uma nova plataforma multivalente de nanocorpo-lipossoma. J. Liberação de controle 145, 165–175 (2010).

Bharde, A. A. et al. Nanopartículas magnéticas como mediadores da ativação livre de ligante da sinalização de EGFR. PLoS One 8, e68879 (2013).

Li, P. et al. Transições de fase na montagem de proteínas sinalizadoras multivalentes. Natureza 483, 336–340 (2012).

Dustin, M. L. & amp Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immun synapse. Annu. Rev. Biophys. 41, 543–556 (2012).


Discussão

Neste artigo, descrevemos a criação de um andaime de ligação baseado em GFP. Ao usar elementos de ligação derivados de anticorpos HCDR3s e inseri-los em até quatro posições definidas de uma forma de GFP desenvolvida para estabilidade e robustez de dobramento, combinamos as vantagens dos anticorpos (ligação específica de alta afinidade) com as de GFP (fluorescência intrínseca , estabilidade e altos níveis de expressão). No entanto, ao contrário das proteínas de fusão do fragmento de anticorpo GFP 22, a fluorescência é intrínseca ao ligante de ligação. A transição do estado desnaturado para o estado dobrado foi acompanhada pela reaquisição da atividade de ligação e da fluorescência, permitindo-nos determinar as concentrações de fluorocorpos funcionais, bem como determinar as afinidades (Figs. 5c, d). Embora este seja provavelmente o estado usual, sabe-se que o dobramento de GFP para a estrutura da lata-β é relativamente rápido (t / 2 = 10 min), assim como a formação subsequente do cromóforo reduzido. No entanto, a criação do cromóforo fluorescente oxidado é muito mais lenta (t / 2 = 76 min) 23, sugerindo que se a conformação correta das alças de ligação for gerada ao mesmo tempo que o dobramento da lata β, pode ser possível criar artificialmente um estado intermediário de fluorocorpo de curta duração no qual existe atividade de ligação sem fluorescência, embora seja improvável que exista em circunstâncias normais. Não foi determinado se pode ser possível eliminar a atividade de ligação na presença de fluorescência contínua por, por exemplo, clivagem proteolítica das alças de ligação.

A partir de uma pequena (10 7) biblioteca de fluorocorpos, selecionamos ligantes específicos contra vários antígenos diferentes com afinidades nanomolares. Estes fluorocorpos eram funcionais em diferentes formatos experimentais nos quais os anticorpos são tradicionalmente usados, com a vantagem de que apenas uma única incubação é necessária e que a leitura da ligação é imediata, em vez de dependente de reagentes secundários. É muito encorajador que as afinidades de fluorocorpo obtidas foram semelhantes às de bibliotecas de anticorpos de tamanho semelhante 4,24. Isso está em contraste com muitos outros scaffolds que, a menos que sejam baseados na dobra da imunoglobulina 25,26,27, tendem a ter afinidades não maiores do que micromolar. Embora não tenha sido demonstrado formalmente, atribuímos essas altas afinidades às características de design do fluorocorpo: CDRs de anticorpos usados ​​como elementos de ligação em uma extremidade de um andaime estável com uma pegada semelhante (ver Fig. 1) para o domínio Fv do anticorpo.

Uma diferença notável entre os fluorocorpos e os anticorpos, entretanto, é a diversidade dos ligantes obtidos. Dos 25 fluorocorpos anti-ubiquitina sequenciados, todos eram diferentes, uma diversidade não encontrada em bibliotecas de anticorpos muito maiores 5,28,29, a menos que muitos mais clones sejam analisados ​​no início do processo de seleção. Esta restrição na diversidade na seleção de anticorpos é provavelmente devido às influências seletivas negativas de toxicidade e efeitos de crescimento. É provável que os fluorocorpos, sem a toxicidade dos fragmentos de anticorpos e com níveis de expressão muito melhores, não sofram desses problemas, permitindo a sobrevivência de uma gama mais ampla de clones, mesmo após várias rodadas de seleção.

Tentativas anteriores de usar GFP como um andaime de ligação geralmente encontraram resultados ruins 9,10, com fluorescência fortemente reduzida ou ausente após a inserção de ligantes ou peptídeos aleatórios em locais específicos ou aleatórios. O sucesso de nossa estratégia deve-se provavelmente ao uso de loops de ligação precisamente definidos, em vez de aminoácidos aleatórios, e ao uso de um GFP altamente estável como suporte (superfolder GFP, S. Cabantous, H. Cai, T. Terwilliger e GSW, não publicado, contém seis mutações adicionais que aumentam a estabilidade e dobramento (consulte Métodos Suplementares online para mais detalhes). Além dos experimentos relatados aqui, também criamos uma biblioteca usando oligonucleotídeos degenerados (NNK) que codificam seis aminoácidos em cada posição no mesmo andaime GFP (dados não mostrados). A porcentagem de colônias verdes foi menor nesta biblioteca (20%), mais rodadas de seleção foram necessárias para obter ligantes positivos e a diversidade de clones selecionados foi considerada muito menor. Isso talvez não seja surpreendente, dado que uma alta porcentagem de códons de parada (79%) seria esperada em 24 códons degenerados.

Mostramos que os fluorocorpos têm propriedades de excitação / emissão de fluorescência muito semelhantes ao andaime GFP usado, exceto que alguns dos fluorocorpos pareciam ter apenas 50% de brilho. Mudanças na fluorescência relativa com mutações GFP são comuns (ver ref. 30 para uma revisão) e, desse ponto de vista, os fluorocorpos são mutações GFP. Embora os fluorocorpos descritos aqui emitam fluorescência verde, não há razão para que os fluorocorpos de outras cores também não possam ser criados, seja pela introdução de mutações conhecidas em fluorocorpos verdes selecionados (por exemplo., Y66H para criar a proteína fluorescente azul), ou criando bibliotecas de fluorobody semelhantes com base em cores alternativas de andaime.

Nós usamos a exibição de fago para selecionar fluorocorpos funcionais, no entanto, como eles são muito bem expressos tanto no citoplasma quanto no periplasma, qualquer formato de exibição (bacteriana, levedura, ribossomo ou exibição baseada em puromicina) é provável que seja adequado, incluindo estratégias genéticas, tais como levedura ou sistemas de dois híbridos bacterianos 31. A facilidade com que os fluorocorpos podem ser selecionados, expressos, purificados e usados ​​facilitará sua aplicação em experimentos de biologia em sistemas de alto rendimento. Em particular, os fluorocorpos devem se provar especialmente úteis em uma série de formatos de matriz, incluindo anticorpos, tecidos ou matrizes de formato reverso, evitando a necessidade de marcação e etapas adicionais.

Os fluorocorpos são funcionais em todos os ensaios primários nos quais os anticorpos são tradicionalmente usados. Para imunofluorescência e citometria de fluxo, os resultados são indistinguíveis daqueles obtidos usando reagentes tradicionais, e eles provavelmente serão reagentes eficazes para imunoprecipitação e espectrometria de massa, como mostrado anteriormente para scFvs 32. No entanto, seu uso na imunização intracelular para criar nocautes condicionais, para os quais anticorpos têm sido tradicionalmente usados, é provavelmente especialmente eficaz. Além de evitar a necessidade de criar bibliotecas especializadas de anticorpos que são estáveis ​​e funcionais no meio intracelular 33, os fluorocorpos também fornecerão informações sobre a localização do alvo em virtude de sua fluorescência intrínseca, bem como fornecerão confirmação instantânea da expressão apropriada dos fluorocorpos. Nesse sentido, é provável que forneçam dados complementares ao RNAi 34, que é incapaz de fornecer qualquer informação sobre a localização e recentemente demonstrou afetar genes fora do alvo 35,36,37. Vantagens semelhantes provavelmente pertencem ao seu uso em estudos de microinjeção.

Em resumo, os fluorocorpos prometem ser ligantes de ligação extremamente eficazes, tanto para pesquisas padrão quanto para sistemas de alto rendimento. Sua fluorescência intrínseca os torna imediatamente aplicáveis ​​em muitos ensaios baseados em fluorescência atualmente usados ​​na validação de alvos e desenvolvimento de drogas e eles têm um potencial claro em diagnósticos, biossensores e na Vivo imagem.


Serviços

Temos um amplo conjunto de instrumentos de microscopia, incluindo microscópios de campo amplo, microscópios de incubadora, um scanner de lâmina digital, um leitor de alto conteúdo, um microscópio confocal, um microscópio de super-resolução e tecnologias de folha de luz.

Nossa equipe pode fornecer consultoria, treinamento, desenvolvimento ou sessões assistidas.

Imagem da equipe principal da Cellular Imaging

Operamos dois scanners e software dedicado para a imagem e análise quantitativa de géis, blots e placas, incluindo aplicações como Northern blots, Southern e Western blots, Westerns In-Cell e muito mais.

Nossa equipe oferece treinamento para todos os usuários iniciantes. Mediante solicitação, nossa equipe pode escanear e analisar seus blots.

Imagem da equipe principal da Cellular Imaging

Cariótipo é a análise dos cromossomos em uma célula. Um cariótipo determina o número e a aparência dos cromossomos e detecta anormalidades cromossômicas, como cromossomos ausentes ou extras (aneuploidias), bem como uma variedade de aberrações cromossômicas (como deleções e translocações). Oferecemos um serviço limitado de cariótipo apenas para pesquisa - por exemplo, para testar linhas de células. Fazemos cariótipo de células humanas e de camundongo e podemos considerar outras espécies.

Imagem da equipe principal da Cellular Imaging


BiFCcomplementação de fluorescência bimolecular
BiLCcomplementação de luminescência bimolecular
BRETtransferência de energia de ressonância de bioluminescência
CBBCoomassie azul brilhante
CFPciano FP
coBiFCcolocalização de complexos BiFC
ECLquimio luminescência melhorada
FPproteína fluorescente
FP C Fragmento C-terminal FP
FP N Fragmento N-terminal de FP
FRETtransferência de energia de ressonância de fluorescência
GFPFP verde
iBiSCisolamento de complexos estabilizados por BiFC
mcBiFCBiFC multicolorido
OD600densidade óptica em 600 nm
PCAensaio de complementação de fragmento de proteína
PPIinteração proteína-proteína
PVDFfluoreto de polivinilideno
RFPFP vermelho
RLucRenilla reniformis luciferase
SUSsistema de divisão de ubiquitina
TEVprotease do vírus da gravura do tabaco
UbFCcomplementação de fluorescência mediada por ubiquitina
Y2Hfermento-dois-híbrido
YFPFP amarelo

1 Antes de gerar construções de fusão BiFC, use recursos da web para analisar topologia, localização subcelular e sinais de direcionamento de proteínas de interesse (por exemplo, http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/ [100] http: // www .expasy.ch / [101] e seus links). A fusão de marcadores BiFC na extremidade terminal errada pode mascarar os sinais de direcionamento e afetar a localização da proteína. Por outro lado, os níveis de expressão de algumas proteínas são drasticamente reduzidos quando uma determinada orientação de tag é usada. Recomenda-se gerar construtos de fusão FP de comprimento total em um esqueleto de vetor semelhante aos vetores BiFC usados ​​e analisar a localização adequada e a expressão de proteínas de fusão antes de gerar os construtos BiFC. Se a expressão e a localização adequada puderem ser confirmadas por análises microscópicas, o uso de uma orientação de etiqueta BiFC semelhante é recomendado. Se nenhuma informação sobre a localização da proteína estiver disponível, gere construções de fusão FP com as respectivas orientações de tag FP de terminal N e C (por exemplo, CFP-query e query-YFP) e execute análises de colocalização. Se ambas as orientações de tag forem possíveis, use fusões de tag BiFC de terminal C (query-BiFC), pois as fusões de tag BiFC de terminal N podem resultar em sinais de fundo mais elevados (Waadt e Kudla, resultados não publicados).

Controles adequados são a chave para análises BiFC semiquantitativas adequadas, pois BiFC é irreversível e pode estabilizar complexos de proteínas formados aleatoriamente (9, 39). O melhor controle negativo é o uso de um membro da família diferente de uma das proteínas investigadas. As mutações pontuais que interrompem as construções de interação ou exclusão do domínio de interação também podem ser adequadas. É importante que o controle negativo esteja localizado no mesmo compartimento celular e exiba um nível de expressão semelhante ao da proteína de referência. O uso de controles de vetor vazio não é recomendado, pois a expressão de fragmentos FP por si só não cumpre os requisitos mencionados acima.

2 A fim de suprimir as respostas imunes das plantas, pode-se também considerar a co-expressão do Pseudomonas Syringae tipo III efetor AvrPto (102).

3 Além da infiltração de plantas de tipo selvagem, experimentos BiFC também podem ser conduzidos em plantas mutantes, em plantas GVG-AvrPto (102) que permitem a supressão da resposta imune induzível por dexametasona ou na rdr6-11 mutante (103) que é deficiente no silenciamento do gene pós-tradução.

4 N. benthamiana as plantas podem ser cultivadas na estufa ou em uma sala de crescimento com condições de dias longos, 90 & # x02013 120 & # x003bcE m & # x022122 s & # x022121 intensidade de luz e 22 & # x02013 27 & # x000b0C.

Condições ótimas de crescimento para Arabidopsis as plantas são condições de dias curtos (8 h de luz / 16 h de escuridão) com 90 & # x003bcE m & # x022122 s & # x022121 intensidade de luz a 23 & # x000b0C (94, 95). No entanto, a expressão transiente também é alcançada em condições de dia longo (16 h de luz / 8 h de escuridão) com 50 & # x02013 80 & # x003bcE m & # x022122 s & # x022121 intensidade de luz a 27 & # x000b0C. O mais importante para alcançar altos níveis de expressão de proteína é o uso de folhas jovens de plantas na fase de pré-peneiramento. Dois a três dias antes da infiltração Arabidopsis as plantas devem ser interrompidas de regar e na noite anterior à infiltração as plantas devem ser mantidas sob escuridão constante até o procedimento de infiltração. Isso minimiza a pressão da seringa necessária para o procedimento de infiltração. A alta pressão da seringa durante a infiltração pode danificar as folhas. Depois da infiltração Arabidopsis as plantas precisam ser regadas e mantidas sob alta umidade por meio de borrifos de água e cobertura com cobertura de plástico por pelo menos 24 horas.

A-YFP N / B-YFP C / CFP ou RFP (amostra)

C-YFP N / B-YFP C / CFP ou RFP (controle negativo)

A-YFP N / D-YFP C / CFP ou RFP (controle negativo)

UMAmutação-YFPN / B-YFP C / CFP ou RFP (controle negativo)

A-YFP N / Bmutação-YFPC / CFP ou RFP (controle negativo)

UMAeliminação-YFPN / B-YFP C / CFP ou RFP (controle negativo)

A-YFP N / Beliminação-YFPC / CFP ou RFP (controle negativo)

Aqui, C e D pertencem à respectiva família de proteínas de A e B e a mutação ou deleção indica possíveis modificações nos respectivos domínios de interação. A orientação da etiqueta BiFC deve ser determinada de acordo com a Nota 1. Para infiltração de N. benthamiana, a coinfiltração da cepa supressora de silenciamento p19 é recomendada (97).

6 Para infiltração de N. benthamiana sai do OD600 do Agrobacteria pode ser ajustado entre 0,05 e 2, onde maior OD600 normalmente leva a níveis de expressão mais elevados.

Para infiltração de Arabidopsis sai do OD600 do Agrobacteria pode ser ajustado entre 0,4 e 0,9 para obter um nível de expressão apropriado, mas não deve exceder uma DO total600 de 1,2, pois isso induz formações de necrose fortes. OD600 de 0,3 e inferior, por outro lado, reduz drasticamente as eficiências de expressão transitória (95).

7 A escolha de folhas para infiltração é crítica para a realização de análises BiFC semiquantitativas adequadas em N. benthamiana. N. benthamiana folhas de diferentes idades variam em suas eficiências de expressão transitória. Para comparar as eficiências BiFC de diferentes combinações de construção, é recomendado infiltrar cada combinação de construção em folhas de plantas diferentes, mas com a mesma idade, tamanho e estado fisiológico. O uso de folhas diferentes da mesma planta não é recomendado. Alternativamente, duas combinações diferentes de BiFC podem ser infiltradas em uma folha em ambos os lados da nervura média da folha. Mais de duas infiltrações diferentes por folha não são recomendadas, pois para análises BiFC semiquantitativas, são necessárias amostras da mesma área foliar (ver Nota 8).

8 As análises semiquantitativas de BiFC são críticas para a avaliação de resultados positivos de BiFC. O melhor sistema para realizar análises de quantificação BiFC é N. benthamiana células epidérmicas, uma vez que essas células são fáceis de visualizar e exibir, dependendo das proteínas a serem expressas, uma notável alta eficiência de expressão quando as amostras de BiFC são coexpressas com o supressor de silenciamento p19. Recomenda-se infiltrar as amostras a serem comparadas em folhas de estado fisiológico semelhante. Amostras para análises microscópicas ou western-blot também precisam ser colhidas de áreas foliares semelhantes. Níveis de expressão no infiltrado N. benthamiana as folhas variam dependendo do ponto de tempo após a infiltração. Normalmente, as construções de proteínas fortemente expressas já são detectáveis ​​no dia dois após a infiltração e a expressão aumenta até o dia cinco após a infiltração. No entanto, é altamente recomendável realizar análises BiFC semiquantitativas apenas nos dias 3 e # x02013 4 após a infiltração devido a uma relação sinal / ruído máxima durante essa fase de tempo.

Como um exemplo para análises BiFC em N. benthamiana a interação bem conhecida do sensor de cálcio semelhante à calcineurina B (CBL) CBL10 e a proteína quinase CIPK24 que interage com CBL foi investigada (Figura 2, 49, 104). Como controle negativo o CIPK24NAF & # x00394 construto foi usado, no qual o domínio NAF, que é necessário e suficiente para a interação do sensor de cálcio CBL (105), é excluído. A imagem foi conduzida usando um microscópio confocal de disco giratório invertido. Imagens de visão geral de alta resolução e projeções máximas de um z-stack incluindo 32 planos focais foram tomadas com uma objetiva 60 & # x000d7 (Figura 2a) e indicam formações complexas CIPK24 / CBL10 (amarelo) na membrana vacuolar que é claramente distinguível de SCFP3A (ciano ) localização no citoplasma e núcleo. For semiquantitative analyses images were taken with a 20× objective and quantified 3 days after infiltration ( Figure 2b ). After p19 background subtraction BiFC intensities were normalized to CIPK24/CBL10 interaction. Here, the use of the NAF domain deletion construct (CIPK24NAFΔ) resulted in reduced BiFC intensities of 41 % (BiFC constructs only) and 44 % (co-expressed with SCFP3A). Normalization of the BiFC/SCFP3A (Y/C)-ratios resulted in a reduced BiFC efficiency for CIPK24NAFΔ/CBL10 of 57 %. These data indicate that compared to CIPK24 wild type protein CIPK24NAFΔ interacts less efficient with CBL10 (49, 106). For western analyses, proteins were extracted using 1× SDS sample buffer, separated in 10 % Acrylamide/Bisacrylamide SDS gels and blotted onto PVDF membranes. Immuno detection of the different BiFC and SCFP3A construct combinations resulted in comparable expression levels of the respective fusion proteins ( Figure 2c ). Samples infiltrated only with the p19 strain were used as background controls and did not exhibit a respective signal in the western blots. PageBlue staining of the large RuBisCO subunit was used as loading control.

Taken together, co-expression of a reference FP, here SCFP3A (107), is not necessarily needed for BiFC quantification in N. benthamiana but it could minimize differences in BiFC signals due to differences in expression efficiencies between different leaves or leaf areas. Semiquantitative BiFC analyses in N. benthamiana as presented in Figure 2 are only applicable for PPIs that are localized in the plasma membrane, the cytoplasm, the cytoplasm including the nucleus, the endoplasmatic reticulum and the tonoplast. Such BiFC quantifications are not applicable for smaller compartments or organelles like the nucleus, peroxisomes, chloroplasts, mitochondria and the endosomal compartments as subtraction of the background signals from entire images most likely would lead to undetectable signals. Here, signal intensities of individual organelles from different samples need to be compared.

As transient expression in Arabidopsis is less robust than expression in N. benthamiana, co-expression of a reference FP is recommended for semiquantitative BiFC analyses. In addition, prior to BiFC analyses, it is recommended to infiltrate single FP-fusions of proteins, which should be investigated, to verify proper expression. Infiltration of YN-CIPK24/CBL10-YC into Arabidopsis did not result in detectable BiFC signals, possibly due to silencing or inefficient expression of YN-CIPK24 (data not shown). Type 2C protein phosphatases interact with SnRK2 protein kinases (108�). Interaction of the SnRK2 kinase OST1 (112) and the PP2C phosphatase ABI1 (108, 110) was exemplarily investigated in infiltrated N. benthamiana e Arabidopsis sai. YFP N173 was fused to the N-terminus of OST1 (YN-OST1) and YFP C155 was fused to the N-terminus of ABI1 (YC-ABI1), infiltrated into N. benthamiana e Arabidopsis leaves and analyzed four and seven days after infiltration, respectively ( Figure 2d ). BiFC analyses in both plant species indicate OST1/ABI1 complex formations with similar cytoplasmic and nuclear localization patterns.

9 A representative cell ideally harbors the nucleus in the center of the cell when looking on the z-axis. The nucleus is the best orientation point in a cell because it allows to distinguish between certain localization patterns. Plasma membrane localization of fluorescent proteins or protein complexes is characterized by a fluorescence signal only at the cell border. Here, plasmolysis may allow the appearance of Hechtian strands. Endoplasmatic reticulum localization displays a ring like structure around the nucleus and a net/mesh-like architecture. The vacuolar membrane is characterized by forming a pocket around the nucleus and most likely pushing the nucleus at the cell border. Here also membraneous invaginations and cytoplasmic strands are visible, forming a tunnel system through the large central vacuole (CIPK24/CBL10 complexes in Figure 2a ). In some cases also ring like structures are visible. Cytoplasmic localization is visible by fluorescence of cytoplasmic strands. In addition to that the cytoplasm is forced in close proximity to the cell borders and the nucleus as the central vacuole occupies more than 90 % of the cell volume. Cytoplasmic proteins or protein complexes are often dually localized and also found in the nucleus (SCFP3A in Figure 2a , OST1/ABI1 complexes in Figure 2d ), except of those that have a nuclear export signal or are too large to pass the nuclear pores passively. To distinguish between plasma membrane, vacuolar membrane, cytoplasm and endoplasmatic reticulum it is recommended to search for cytoplasmic strands, fluorescence around the nucleus and to carefully analyze the architecture of the fluorescence signal at the cell border in a top or bottom cell view or in a maximum projection (see Figure 2a ). The nucleus is the largest organelle in the cell and fluorescence is often excluded from the nucleolus. The second largest organelles are chloroplasts. However compared to mesophyll cells, in epidermal cells chloroplasts are smaller and in lower quantity. Chloroplasts exhibit an elliptical structure and are often localized at the cell borders or around the nucleus. Chloroplasts can be easily visualized by chlorophyll auto-fluorescence. However, chlorophyll auto-fluorescence may also appear if too high excitation energy or exposure times are used, especially when FP or BiFC signals are weak. It is more difficult to identify other small cellular organelles like peroxisomes, the golgi apparatus or other endosomes. Here co-localization studies using fluorescent markers are recommended.

For representative images it is recommended displaying one overview image with the focal plane through the nucleus and the cell center. In addition a maximum projection of a z-stack is the first choice to visualize an entire cell, as here multiple focal planes through the cell are merged in one image (see Figure 2 ).


Assista o vídeo: Proteas Coomassie SuperBlue Gel Staining Protocol (Agosto 2022).