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Como as proteínas de membrana encontram seus locais-alvo?

Como as proteínas de membrana encontram seus locais-alvo?



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A pergunta pode ser feita para qualquer tipo de proteína "ligada", mas eu gostaria de restringi-la às proteínas de membrana.

Assumindo que as proteínas da membrana (ou suas partes principais) não (ou não são) constroem no local mas a alguma distância da membrana, eu me pergunto por quais mecanismos eles viajam de seu local de geração até seu destino final dentro da membrana (interna ou externa).

As proteínas que são distribuídas de maneira quase uniforme (ou aleatória) ao longo da membrana não representam um grande problema conceitual: elas poderiam ter ido apenas por difusão, possivelmente de muitos sites de geração, distribuídos de maneira aproximadamente uniforme (ou aleatoriamente) dentro da célula.

Mas e quanto às distribuições desiguais, onde algumas proteínas são mais densamente e não aleatoriamente empacotadas (significativas e funcionais) em alguns locais da membrana do que em outros, por ex.

  • receptores em densidades pós-sinápticas

  • N / D+ canais em locais de iniciação de potencial de ação, como o outeirinho do axônio ou o segmento inicial do axônio

  • N / D+ canais em nós de Ranvier?

Por quais mecanismos (forças, sinais ou estruturas) essas proteínas são levadas a seus alvos?

Talvez dependa, e existem mecanismos diferentes. Estes eu criei (contemplando os primeiros princípios):

  • distribuição desigual de locais de geração dentro da célula (devido a quê?)

  • distribuição desigual das origens dos sinais de atração dentro da membrana (devido a quê?)

  • algumas forças ou sinais de "auto-atração" (levando ao acúmulo por feedback positivo)

  • microtúbulos

Qual mecanismo é - possivelmente - predominante?


Perguntas relacionadas:

  • Ciclo de vida das proteínas

  • Vias de canais de íons controlados por ligante

  • Distribuição de sinapses de neurônios CA1

  • Distribuição de canais de íons geradores de espículas dendríticas na árvore dendrítica

  • Mapas visuais da membrana neuronal

  • Distribuição de bombas de sódio-potássio


Esta é uma grande pergunta. Uma resposta abrangente estaria além do escopo de uma resposta em um fórum como este. Vou resumir o melhor que posso aqui, mas se você estiver realmente interessado nisso, você deve olhar alguns dos trabalhos de Randy Schekman e Tom Rapoport, que fizeram muitos trabalhos pioneiros neste campo e têm artigos de mais de dois décadas atrás em seus sites de laboratório. Falarei sobre proteínas de membrana em geral, mas não tenho certeza de qual é o estado do campo para os canais de Na + especificamente, então não posso comentar muito sobre esse caso em particular. Muitos dos detalhes dos processos que mencionarei ainda são áreas de pesquisa ativa, então tentarei me ater principalmente ao que foi bem caracterizado (até onde sei).

Para reafirmar o problema, as proteínas são geralmente sintetizadas no lúmen do retículo endoplasmático, que é um ambiente aquoso semelhante ao citosol em muitas (mas não em todas) maneiras. No entanto, as proteínas de membrana, que não são estáveis ​​em ambientes aquosos, devem:

1) Encontre um caminho do lúmen ER para uma membrana.
2) Vá do ER para a membrana correta para que eles possam realizar sua função celular.

Começaremos com a etapa 1, mas a chave para ambos é um aspecto crítico, mas frequentemente subestimado, da biologia de proteínas, chamado de peptídeo sinal. O peptídeo sinal é simplesmente uma sequência N-terminal de aminoácidos que precede o que normalmente pensaríamos como o início de uma proteína madura. É relativamente curto, geralmente apenas ~ 30 aminoácidos de comprimento. É clivada da proteína madura por uma protease, uma vez que a proteína é dobrada e na membrana. Até então, o peptídeo sinal serve como um marcador molecular que indica para onde a proteína nascente deve se dirigir e como deve ser manuseada. Não surpreendentemente, existem muitos peptídeos de sinal diferentes que desempenham várias funções e não são usados ​​apenas para proteínas de membrana.

Então, digamos que estejamos no lúmen ER e tenhamos algum código de mRNA para uma proteína de membrana destinada à membrana plasmática. O primeiro aminoácido que emergirá do ribossomo é a sequência de sinal, neste caso uma sequência de sinal específica que indica que se trata de uma proteína da membrana plasmática. Uma vez que a sequência de sinal emerge do ribossomo, ela é reconhecida por um complexo de ribonucleoproteína (isto é, um complexo de RNA e proteína) chamado de partícula de reconhecimento de sinal. Uma vez que o SRP se liga ao peptídeo sinal, a tradução é interrompida e todo o complexo se move para a membrana ER, onde forma um complexo com outro grande complexo de proteína chamado translocon. Não posso entrar nos meandros desses complexos e suas funções apenas nesta resposta, mas a descrição simples é que o translocon contém uma ATPase que pode inserir a proteína de membrana na membrana ER conforme ela é traduzida, com a orientação correta. A hidrólise do ATP fornece energia para mover a cadeia polipeptídica emergente para a membrana hidrofóbica, onde as chaperonas ajudam a dobrar. Este processo é em parte conduzido pelo reconhecimento de regiões transmembranares hidrofóbicas das proteínas pelo translocon. Ele também pode mover proteínas citosólicas solúveis através da membrana por meio de um mecanismo semelhante.

Agora que a proteína foi translocada, uma peptidase irá separar a sequência de sinal da proteína. A partir daqui, os sinais de classificação assumirão o controle. Geralmente, estes são motivos de sequência simples no primeiro domínio transmembranar que agem de forma semelhante a uma sequência de sinal, mas não são clivados. No entanto, os sinais de classificação também podem ser trechos de peptídeo em toda a proteína, em alguns casos.

Esses motivos de sequência serão reconhecidos por máquinas de tráfico de células. Sem entrar em muitos detalhes, as proteínas serão reunidas em vesículas e transportadas para outras organelas. Normalmente, a primeira parada para proteínas é o aparelho de golgi, que é tipicamente onde ocorrem muitas modificações pós-tradução, como glicosilação. Sou bioquímico e não biólogo celular, portanto não sou o mais qualificado para entrar em detalhes sobre o tráfico subcelular. Basta dizer que, uma vez que a proteína tenha acabado de ser processada no golgi, ela será traficada para outras organelas, como a membrana plasmática usando o transporte de vesículas como antes. Do meu entendimento, a proteína será classificada nas vesículas adequadas com base em seus sinais de classificação, bem como outros marcadores (em alguns casos, certas modificações pós-tradução em certas proteínas podem influenciar seu tráfego). As vesículas reconhecem o destino adequado da membrana, em parte pela composição lipídica dessa membrana. Por exemplo, os fosfoinositídeos têm ampla influência no tráfego de membrana e muitas membranas podem ser diferenciadas por sua assinatura de fosfoinositídeo.

De qualquer forma, essa é uma visão geral muito ampla da resposta à sua pergunta. Lamento, mas não posso comentar muito sobre os meandros do tráfico de celulares, não tenho o conhecimento necessário para examinar essa literatura com rapidez suficiente para responder à sua pergunta em um prazo razoável. Espero que isso seja útil para apontar a direção certa e boa sorte!


O transporte ativo é uma resposta? Com sinalização especial e peptídeos de interação dentro da proteína, as proteínas podem ser direcionadas para diferentes sublocações. Se você estiver interessado em como os canais de Na + se acumulam no AIS, leia, por exemplo, Gasser et al. 2012, esse é um artigo muito bom que mostra que o motivo de ligação da anquirina é suficiente para agrupar os canais de Na + no AIS.


Resumo

A identificação de novos alvos de drogas é um dos maiores desafios da proteômica. Os métodos computacionais desenvolvidos na última década aprimoraram o processo de design de medicamentos em termos de tempo e qualidade. A principal tarefa é o projeto de compostos seletivos, que se ligam a alvos mais especificamente, dependendo do modo de ação desejado da droga em particular. Isso torna necessário criar compostos que exibam suas funções em uma única proteína para excluir reatividade cruzada indesejada ou para usar o efeito vantajoso de drogas menos seletivas que têm como alvo numerosas proteínas e, portanto, exibem suas funções em classes inteiras de proteínas. Os principais aspectos na atribuição de interações entre ligantes e alvos putativos envolvem a composição de aminoácidos do sítio de ligação, conservação evolutiva e similaridade na sequência e estrutura de alvos conhecidos. Semelhanças ou diferenças dentro das famílias de proteínas classificadas podem ser a chave para sua função e dar as primeiras dicas para o design de drogas funcionais. Por este meio, a classificação baseada no local de ligação supera as classificações baseadas na sequência, uma vez que locais de ligação semelhantes também podem ser encontrados em proteínas mais distantes. As proteínas da membrana são "alvos difíceis", devido às suas características físico-químicas especiais e à falta geral de informações estruturais. Aqui, descrevemos os avanços recentes nos métodos de modelagem dedicados às proteínas de membrana.

Diferentes descritores de similaridade entre compostos e a similaridade entre sítios de ligação estão em desenvolvimento e elucidam aspectos importantes como dinâmica ou entropia. A importância do design computacional de drogas é indiscutível. No entanto, o processo de design é complicado pelo aumento da complexidade, o que sublinha a importância do conhecimento preciso sobre a (s) classe (s) -alvo endereçada (s) e, particularmente, seus locais de ligação. Um objetivo principal, ao considerar tópicos nomeados, é prever efeitos colaterais putativos e funções errôneas (efeitos fora do alvo) de novos medicamentos, o que requer uma visão holística (biologia de sistemas) sobre as relações entre a via droga-alvo. A seguir, apresentamos um breve resumo sobre a recente discussão sobre as interações entre fármacos e alvos, com ênfase nas proteínas de membrana.


Conteúdo

As proteínas da membrana desempenham uma variedade de funções vitais para a sobrevivência dos organismos: [2]

    proteínas transmitem sinais entre os ambientes interno e externo da célula. mover moléculas e íons através da membrana. Eles podem ser categorizados de acordo com o banco de dados de Classificação do Transporter.
  • As enzimas de membrana podem ter muitas atividades, como oxidorredutase, transferase ou hidrolase. [3] permitem que as células se identifiquem e interajam. Por exemplo, proteínas envolvidas na resposta imune

A localização de proteínas em membranas pode ser prevista com segurança usando análises de hidrofobicidade de sequências de proteínas, isto é, a localização de sequências de aminoácidos hidrofóbicas.

Proteínas de membrana integrais Editar

As proteínas integrais da membrana estão permanentemente ligadas à membrana. Essas proteínas podem ser separadas das membranas biológicas apenas usando detergentes, solventes não polares ou, às vezes, agentes desnaturantes. Um exemplo desse tipo de proteína que ainda não foi funcionalmente caracterizado é o SMIM23. Eles podem ser classificados de acordo com sua relação com a bicamada:

    são proteínas transmembrana que atravessam a membrana mais de uma vez. Essas proteínas podem ter diferentes topologias transmembrana. [4] [5] Essas proteínas têm uma de duas arquiteturas estruturais:
      proteínas, que estão presentes em todos os tipos de proteínas das membranas biológicas, que são encontradas apenas nas membranas externas das bactérias Gram-negativas e nas membranas externas das mitocôndrias e cloroplastos. [6]

    Proteínas de membrana periférica Editar

    As proteínas da membrana periférica estão temporariamente ligadas à bicamada lipídica ou às proteínas integrais por uma combinação de interações hidrofóbicas, eletrostáticas e outras não covalentes. As proteínas periféricas se dissociam após o tratamento com um reagente polar, como uma solução com pH elevado ou altas concentrações de sal.

    Proteínas integrais e periféricas podem ser modificadas pós-tradução, com ácido graxo adicionado, diacilglicerol [8] ou cadeias de prenil, ou GPI (glicosilfosfatidilinositol), que pode ser ancorado na bicamada lipídica.

    Toxinas polipeptídicas Editar

    Toxinas polipeptídicas e muitos peptídeos antibacterianos, como colicinas ou hemolisinas, e certas proteínas envolvidas na apoptose, às vezes são considerados uma categoria separada. Essas proteínas são solúveis em água, mas podem se agregar e se associar irreversivelmente à bicamada lipídica e tornar-se reversível ou irreversivelmente associadas à membrana.

    Proteínas de membrana, como proteínas globulares solúveis, proteínas fibrosas e proteínas desordenadas, são comuns. [9] Estima-se que 20-30% de todos os genes na maioria dos genomas codificam para proteínas de membrana. [10] [11] Por exemplo, cerca de 1000 dos

    4200 proteínas de E. coli são consideradas proteínas de membrana, 600 das quais foram experimentalmente verificadas como residentes na membrana. [12] Em humanos, o pensamento atual sugere que 30% do genoma codifica totalmente as proteínas da membrana. [13]

    As proteínas da membrana são o alvo de mais de 50% de todos os medicamentos modernos. [1] Entre as doenças humanas nas quais as proteínas de membrana foram implicadas estão as doenças cardíacas, Alzheimer e fibrose cística. [13]

    Embora as proteínas de membrana desempenhem um papel importante em todos os organismos, sua purificação tem historicamente, e continua a ser, um grande desafio para os cientistas de proteínas. Em 2008, 150 estruturas únicas de proteínas de membrana estavam disponíveis, [14] e em 2019 apenas 50 proteínas de membrana humanas tiveram suas estruturas elucidadas. [13] Em contraste, aproximadamente 25% de todas as proteínas são proteínas de membrana. [15] Suas superfícies hidrofóbicas tornam a caracterização estrutural e especialmente funcional difícil. [13] [16] Detergentes podem ser usados ​​para tornar as proteínas de membrana solúveis em água, mas também podem alterar a estrutura e a função das proteínas. [13] Tornar as proteínas da membrana solúveis em água também pode ser alcançado através da engenharia da sequência da proteína, substituindo os aminoácidos hidrofóbicos selecionados por outros hidrofílicos, tomando muito cuidado para manter a estrutura secundária ao revisar a carga geral. [13]

    A cromatografia de afinidade é uma das melhores soluções para purificação de proteínas de membrana. A atividade das proteínas de membrana diminui muito rapidamente em contraste com outras proteínas. Portanto, a cromatografia de afinidade fornece uma purificação rápida e específica das proteínas da membrana. O tag de poli-histidina é um tag comumente usado para purificação de proteínas de membrana, [17] e o tag rho1D4 alternativo também foi usado com sucesso. [18] [19]


    Alvo de proteína

    O direcionamento de proteínas refere-se aos métodos que as células usam para levar as proteínas ao local adequado após a síntese. As proteínas desempenham um papel importante na maioria dos processos celulares, mas devem ser localizadas de forma adequada para cumprir suas funções. Saber como as proteínas recém-sintetizadas têm como alvo as células é essencial para compreender a função das proteínas.

    As proteínas são sintetizadas tanto no citosol ou no retículo endoplasmático . Quando sintetizado no citosol em ribossomos , a maioria das proteínas se difunde livremente até que se liguem a um determinado substrato ou montar em um complexo maior. A difusão da proteína no citosol é geralmente rápida, portanto, uma proteína não ligada é capaz de se difundir pela célula em apenas alguns segundos.

    Uma das maneiras pelas quais as proteínas citosólicas são direcionadas dentro das células é pela formação de grandes conjuntos macromoleculares. Muitas proteínas podem existir como monômeros , que se difundem livremente através do citoplasma , ou como polímeros , que formam estruturas em grande escala que se distribuem dinamicamente em locais distintos na célula. As proteínas do citoesqueleto actina e tubulina, por exemplo, têm um par de complementar sítios de auto-ligação em suas superfícies que permitem que eles se polimerizem em longos filamentos helicoidais que se estendem pela célula. Esses filamentos formam o citoesqueleto da célula, que se reorganiza continuamente conforme a célula muda de forma, se divide e responde ao seu ambiente.

    Mudanças conformacionais em uma proteína geralmente levam a mudanças na proteína & # x0027s afinidade em direção a um substrato específico. Este processo pode desempenhar um papel crucial na regulação da localização intracelular de uma proteína. Um exemplo desse tipo de regulação é a proteína fosforilação , ou adição de um grupo fosfato. Isso pode alterar drasticamente a afinidade de uma proteína & # x0027s por um substrato e, portanto, pode levar a mudanças rápidas na localização da proteína & # x0027s. Este tipo de regulação da localização de proteínas é crucial para permitir que as células coordenem suas atividades em diferentes condições de crescimento e durante a divisão celular.

    Algumas proteínas citoplasmáticas são direcionadas a um determinado local da célula porque contêm uma aminoácido sequência que faz com que eles se liguem aos receptores localizados naquele local. Um exemplo de tal sequência de direcionamento é o chamado sinal de localização nuclear (NLS), que consiste em dois trechos curtos de básico aminoácidos divididos por uma região espaçadora de 10 & # x201311 aminoácidos. Esta sequência de aminoácidos permite que uma proteína que a possui se ligue aos receptores de localização nuclear encontrados no núcleo . Uma vez que uma proteína contendo um sinal NLS se liga a um receptor nuclear, ela não é mais capaz de se difundir livremente e se torna & # x0022localizada & # x0022 no núcleo.

    Muitas proteínas estão embutidas ou associadas a membranas. No células eucarióticas , as membranas formam os limites de uma variedade de compartimentos distintos, incluindo o núcleo, mitocôndria , retículo endoplasmático (ER) e complexo de Golgi. Algumas proteínas são sintetizadas no citosol e, então, modificadas com um lípido & # x0022anchor, & # x0022 e associação com membranas é simplesmente uma questão de incorporação na camada lipídica externa da membrana & # x0027s. Moléculas de sinalização, como a proteína Ras de ligação ao GTP, localizam-se nas membranas dessa maneira.

    Todas as outras proteínas que têm como alvo as membranas intracelulares requerem sinais de classificação que direcionam seu transporte do citosol. Por exemplo, as proteínas direcionadas às mitocôndrias contêm uma sequência peptídica específica de 20 & # x201380 aminoácidos que medeia sua importação. Esta sequência é encontrada no terminal amino da proteína e após a importação é rapidamente removida por uma protease.

    As proteínas localizadas dentro dessas membranas envolvidas na endocitose e exocitose são primeiro direcionadas para o RE e, em seguida, usam as vias de transporte da membrana para alcançar outros compartimentos. O direcionamento de proteínas para o ER começa antes do polipeptídeo cadeia é completamente sintetizada. Isso contrasta com a importação de proteínas para mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos, que ocorre após a síntese ser concluída. Um peptídeo sinal ER, localizado no terminal amino dessas proteínas, direciona o ribossomo para se ligar à membrana ER antes que a proteína tenha sido completamente traduzida. O peptídeo sinal ER é guiado para a membrana ER por uma partícula de reconhecimento de sinal (SRP), que se liga ao peptídeo sinal, e um receptor SRP nas membranas ER.

    As proteínas do ER usam uma variedade de mecanismos para alcançar diferentes destinos finais na célula. Proteínas destinadas ao envelope nuclear simplesmente difunda ali e adere, uma vez que o envelope nuclear está em continuidade direta com o ER. Para alcançar o complexo de Golgi, membrana plasmática, endossomos e lisossomas, no entanto, as proteínas devem entrar no via secretora e usar vias de tráfego de membrana. Para proteínas de membrana, acredita-se que a entrada na via secretora requeira sua concentração e classificação nos locais de saída do ER. Em contraste, as proteínas que são solúveis no lúmen ER (espaço interno) se movem por um processo de bulk flow. Depois de deixar o RE, a maioria das proteínas solúveis são eventualmente secretadas pela célula. Muitas proteínas de membrana são direcionadas para organelas dentro das vias secretoras e endocíticas porque contêm sinais de classificação específicos em suas caudas citoplasmáticas, que funcionam como códigos postais. Alternativamente, a classificação pode ser devido às propriedades de um domínio transmembranar da proteína & # x0027s, uma região da proteína que dá sua afinidade para diferentes ambientes lipídicos característicos de diferentes organelos.


    Conteúdo

    Em 1970, Günter Blobel conduziu experimentos sobre a translocação de proteínas através das membranas. Blobel, então professor assistente na Rockefeller University, desenvolveu o trabalho de seu colega George Palade. [5] Palade havia demonstrado anteriormente que proteínas não secretadas eram traduzidas por ribossomos livres no citosol, enquanto proteínas secretadas (e proteínas-alvo, em geral) eram traduzidas por ribossomos ligados ao retículo endoplasmático. [5] As explicações dos candidatos na época postularam uma diferença de processamento entre os ribossomos livres e os ligados ao ER, mas Blobel hipotetizou que o direcionamento da proteína dependia de características inerentes às proteínas, ao invés de uma diferença nos ribossomos. Apoiando sua hipótese, Blobel descobriu que muitas proteínas têm uma curta sequência de aminoácidos em uma extremidade que funciona como um código postal especificando um destino intracelular ou extracelular. [2] Ele descreveu essas sequências curtas (geralmente 13 a 36 resíduos de aminoácidos) [1] como peptídeos de sinal ou sequências de sinal e foi premiado com o Prêmio Nobel de Fisiologia de 1999 por suas descobertas. [6]

    Os peptídeos de sinal servem como sinais de direcionamento, permitindo que a maquinaria de transporte celular direcione as proteínas para localizações intracelulares ou extracelulares específicas. Embora nenhuma sequência de consenso tenha sido identificada para peptídeos de sinal, muitos, no entanto, possuem uma estrutura tripartida característica: [1]

    1. Uma região hidrofílica carregada positivamente próxima ao N-terminal.
    2. Um intervalo de 10 a 15 aminoácidos hidrofóbicos próximo ao meio do peptídeo sinal.
    3. Uma região ligeiramente polar perto do C-terminal, normalmente favorecendo aminoácidos com cadeias laterais menores em posições que se aproximam do local de clivagem.

    Depois que uma proteína atinge seu destino, o peptídeo sinal é geralmente clivado por uma peptidase sinal. [1] Consequentemente, a maioria das proteínas maduras não contém peptídeos de sinal. Enquanto a maioria dos peptídeos de sinal são encontrados no terminal N, nos peroxissomos a sequência de direcionamento está localizada na extensão do terminal C. [7] Ao contrário dos peptídeos de sinal, os patches de sinal são compostos por resíduos de aminoácidos que são descontínuos na sequência primária, mas se tornam funcionais quando o dobramento os reúne na superfície da proteína. [8] Ao contrário da maioria das sequências de sinal, os patches de sinal não são clivados após a classificação ser concluída. [9] Além de sequências de sinalização intrínsecas, modificações de proteínas como glicosilações também podem induzir o direcionamento para regiões intracelulares ou extracelulares específicas.

    Uma vez que a tradução do mRNA em proteína por um ribossomo ocorre dentro do citosol, as proteínas destinadas à secreção ou a uma organela específica devem ser translocadas. [10] Este processo pode ocorrer durante a tradução, conhecido como translocação co-tradução, ou após a tradução ser concluída, conhecido como translocação pós-tradução. [11]

    Edição de translocação co-translacional

    A maioria das proteínas secretoras e ligadas à membrana são co-translacionalmente translocadas. As proteínas que residem no retículo endoplasmático (RE), golgi ou endossomas também usam a via de translocação co-translacional. Este processo começa enquanto a proteína está sendo sintetizada no ribossomo, quando uma partícula de reconhecimento de sinal (SRP) reconhece um peptídeo sinal N-terminal da proteína nascente. [12] A ligação do SRP interrompe temporariamente a síntese enquanto o complexo ribossomo-proteína é transferido para um receptor SRP no RE em eucariotos e a membrana plasmática em procariotos. [13] Lá, a proteína nascente é inserida no translocon, um canal condutor de proteína ligado à membrana composto pelo complexo de translocação Sec61 em eucariotos e o complexo SecYEG homólogo em procariotos. [14] Em proteínas secretoras e proteínas transmembrana tipo I, a sequência de sinal é imediatamente clivada do polipeptídeo nascente, uma vez que foi translocado para a membrana do RE (eucariotos) ou membrana plasmática (procariotos) por sinal peptidase. A sequência de sinal de proteínas de membrana tipo II e algumas proteínas de membrana politópicas não são clivadas e, portanto, são referidas como sequências de âncora de sinal. Dentro do RE, a proteína é primeiro coberta por uma proteína chaperona para protegê-la da alta concentração de outras proteínas no RE, dando-lhe tempo para dobrar corretamente. Uma vez dobrada, a proteína é modificada conforme necessário (por exemplo, por glicosilação), então transportada para o Golgi para processamento adicional e vai para suas organelas alvo ou é retida no ER por vários mecanismos de retenção no ER.

    A cadeia de aminoácidos das proteínas transmembrana, que freqüentemente são receptores transmembrana, passa através de uma membrana uma ou várias vezes. Essas proteínas são inseridas na membrana por translocação, até que o processo seja interrompido por uma sequência de parada-transferência, também chamada de âncora de membrana ou sequência âncora de sinal. [15] Essas proteínas de membrana complexas são atualmente caracterizadas usando o mesmo modelo de direcionamento que foi desenvolvido para proteínas secretoras. No entanto, muitas proteínas multitransmembrana complexas contêm aspectos estruturais que não se enquadram neste modelo. Sete receptores acoplados à proteína G transmembrana (que representam cerca de 5% dos genes em humanos), em sua maioria, não têm uma sequência de sinal amino-terminal. Em contraste com as proteínas secretoras, o primeiro domínio transmembrana atua como a primeira sequência de sinal, que os direciona para a membrana ER. Isso também resulta na translocação do terminal amino da proteína para o lúmen da membrana ER. Esta translocação, que foi demonstrada com opsina com experimentos in vitro, [16] [17] quebra o padrão usual de translocação "co-translacional" que sempre foi mantida para proteínas de mamíferos direcionadas ao RE. Uma grande parte da mecânica da topologia transmembrana e dobra ainda precisa ser elucidada.

    Edição de translocação pós-tradução

    Embora a maioria das proteínas secretoras sejam co-translacionalmente translocadas, algumas são traduzidas no citosol e posteriormente transportadas para o ER / membrana plasmática por um sistema pós-tradução. Em procariotos, este processo requer certos cofatores, como SecA e SecB, e é facilitado por Sec62 e Sec63, duas proteínas ligadas à membrana. [18] O complexo Sec63, que está embutido na membrana ER, causa a hidrólise do ATP, permitindo que as proteínas chaperonas se liguem a uma cadeia de peptídeo exposta e deslize o polipeptídeo para o lúmen ER. Uma vez no lúmen, a cadeia polipeptídica pode ser dobrada adequadamente. Esse processo ocorre apenas em proteínas não dobradas localizadas no citosol. [19]

    Além disso, proteínas direcionadas a outros destinos celulares, como mitocôndrias, cloroplastos ou peroxissomos, usam vias pós-translacionais especializadas. As proteínas direcionadas para o núcleo também são translocadas pós-tradução por meio da adição de um sinal de localização nuclear (NLS) que promove a passagem através do envelope nuclear através dos poros nucleares. [20]

    Mitocôndria Editar

    A maioria das proteínas mitocondriais são sintetizadas como precursores citosólicos contendo sinais de peptídeo de captação. As chaperonas citosólicas entregam pré-proteínas aos receptores ligados a canais na membrana mitocondrial. A pré-proteína com pré-sequência direcionada para a mitocôndria é ligada por receptores e pelo poro de importação geral (GIP), coletivamente conhecido como translocase da membrana externa (TOM), na membrana externa. É então translocado através do TOM como loops em gancho. A pré-proteína é transportada através do espaço intermembrana por pequenos TIMs (que também atuam como acompanhantes moleculares) para o TIM23 ou TIM22 (translocase da membrana interna) na membrana interna. Dentro da matriz, a sequência de direcionamento é clivada por mtHsp70.

    Três receptores de membrana mitocondrial externa são conhecidos:

    1. TOM70: Liga-se a peptídeos de direcionamento interno e atua como um ponto de ancoragem para chaperonas citosólicas.
    2. TOM20: Liga as pré-sequências.
    3. TOM22: Liga as pré-sequências e os peptídeos de direcionamento interno.

    O canal TOM (TOM40) é um canal de alta condutância específico de cátions com um peso molecular de 410 kDa e um diâmetro de poro de 21Å.

    A pré-sequência translocase23 (TIM23) está localizada na membrana mitocondrial interna e atua como uma proteína formadora de poros que se liga a proteínas precursoras com seu N-terminal. TIM23 atua como um translocador para preproteínas para a matriz mitocondrial, a membrana mitocondrial interna, bem como para o espaço intermembranar. O TIM50 está ligado ao TIM23 no lado mitocondrial interno e é capaz de ligar pré-sequências. TIM44 está ligado no lado da matriz e se liga ao mtHsp70.
    A pré-sequência translocase22 (TIM22) liga as pré-proteínas exclusivamente ligadas à membrana mitocondrial interna.

    As sequências de direcionamento da matriz mitocondrial são ricas em aminoácidos carregados positivamente e hidroxilados.

    As proteínas são direcionadas para compartimentos submitocondriais por vários sinais e várias vias.

    O direcionamento para a membrana externa, espaço intermembranar e membrana interna freqüentemente requer outra sequência de sinal além da sequência de direcionamento da matriz.

    Edição de cloroplastos

    A pré-proteína para cloroplastos pode conter uma sequência de importação do estroma ou uma sequência de direcionamento do estroma e tilacóide. A maioria das pré-proteínas são translocadas através dos complexos Toc e Tic localizados dentro do envelope do cloroplasto. No estroma, a sequência de importação do estroma é clivada e dobrada, assim como a classificação intracloroplástica para tilacóides continua. As proteínas direcionadas ao envelope dos cloroplastos geralmente não possuem sequência de classificação clivável.

    Ambos cloroplastos e mitocôndrias Editar

    Muitas proteínas são necessárias tanto nas mitocôndrias quanto nos cloroplastos. [21] Em geral, o peptídeo de duplo direcionamento é de caráter intermediário aos dois específicos. Os peptídeos-alvo dessas proteínas têm um alto teor de aminoácidos básicos e hidrofóbicos, um baixo teor de aminoácidos carregados negativamente. Eles têm um conteúdo mais baixo de alanina e um conteúdo mais alto de leucina e fenilalanina. As proteínas direcionadas duplas têm um peptídeo de direcionamento mais hidrofóbico do que os mitocondriais e cloroplásticos. No entanto, é tedioso prever se um peptídeo tem um alvo duplo ou não com base em suas características físico-químicas.

    Editar Peroxissomos

    Todas as proteínas peroxissomais são codificadas por genes nucleares. [22] Até o momento, existem dois tipos de sinais de direcionamento de peroxissoma (PTS) conhecidos: [23]

    1. Sinal de direcionamento de peroxissoma 1 (PTS1): um tripéptido C-terminal com uma sequência de consenso (S / A / C) - (K / R / H) - (L / A). O PTS1 mais comum é a serina-lisina-leucina (SKL). A maioria das proteínas da matriz peroxissômica possui um sinal do tipo PTS1.
    2. Sinal de direcionamento de peroxissoma 2 (PTS2): um nonapeptídeo localizado próximo ao terminal N com uma sequência de consenso (R / K) - (L / V / I) -XXXXX- (H / Q) - (L / A / F) (onde X pode ser qualquer aminoácido )

    Existem também proteínas que não possuem nenhum desses sinais. Seu transporte pode ser baseado em um mecanismo denominado "piggy-back": tais proteínas se associam a proteínas de matriz possuidoras de PTS1 e são translocadas para a matriz peroxissômica junto com elas. [24]

    O transporte de proteínas é defeituoso nas seguintes doenças genéticas:

    Como discutido acima (ver translocação de proteína), a maioria das proteínas secretoras e ligadas à membrana procariótica são direcionadas à membrana plasmática por uma via de co-tradução que usa SRP bacteriano ou uma via de pós-tradução que requer SecA e SecB. Na membrana plasmática, essas duas vias entregam proteínas ao translocon SecYEG para translocação. As bactérias podem ter uma única membrana plasmática (bactérias Gram-positivas) ou uma membrana interna mais uma membrana externa separada pelo periplasma (bactérias Gram-negativas). Além da membrana plasmática, a maioria dos procariotos carece de organelas ligadas à membrana, como encontradas nos eucariotos, mas eles podem reunir proteínas em vários tipos de inclusões, como vesículas de gás e grânulos de armazenamento.

    Bactérias Gram-negativas Editar

    In gram-negative bacteria proteins may be incorporated into the plasma membrane, the outer membrane, the periplasm or secreted into the environment. Systems for secreting proteins across the bacterial outer membrane may be quite complex and play key roles in pathogenesis. These systems may be described as type I secretion, type II secretion, etc.

    Gram-positive bacteria Edit

    In most gram-positive bacteria, certain proteins are targeted for export across the plasma membrane and subsequent covalent attachment to the bacterial cell wall. A specialized enzyme, sortase, cleaves the target protein at a characteristic recognition site near the protein C-terminus, such as an LPXTG motif (where X can be any amino acid), then transfers the protein onto the cell wall. Several analogous systems are found that likewise feature a signature motif on the extracytoplasmic face, a C-terminal transmembrane domain, and cluster of basic residues on the cytosolic face at the protein's extreme C-terminus. The PEP-CTERM/exosortase system, found in many Gram-negative bacteria, seems to be related to extracellular polymeric substance production. The PGF-CTERM/archaeosortase A system in archaea is related to S-layer production. The GlyGly-CTERM/rhombosortase system, found in the Shewanella, Vibrio, and a few other genera, seems involved in the release of proteases, nucleases, and other enzymes.


    Study challenging interactions with membrane proteins to improve drug design

    Figuring out the role a membrane protein plays in a cellular process requires understanding how it interacts with its ligands. This knowledge also helps in designing drugs that target these processes. The characterization of the interactions with ligands during drug discovery and development with label-free assays and in solution allows researchers to unravel molecular mechanisms and improve drug design.

    Improve drug design to target membrane proteins

    The human PepT1 transporter plays an important role in drug uptake and transport — which makes it a promising pharmacological target. Using DtpA — a bacterial homolog — this team measured the binding of peptides and drugs to DtpA with label-free MST. The data helped them model and improve drug design for the human transporter. Additionally, they looked at how nanobodies stabilized the transporter for crystallization and structure determination with label-free nanoDSF.

    Identify key ligand binding sites in solution

    The NRT1.1 proton-coupled transporter is responsible for nitrogen assimilation and nitrate transport in plants. In nature, it switches between low and high affinity nitrate binding states in response to falling nitrate levels via a process of phosphorylation. To understand this mechanism, researchers used MST to determine how nitrate binding to GFP-fused NRT1.1 in detergent was affected by phosphorylation and point mutations. In combination with crystallography data, they revealed a key amino acid residue for nitrate binding and showed how phosphorylation of the transporter allows it to switch binding states.


    Membrane Protein Overview

    Membrane proteins represent about a third of the proteins in living organisms. Based on their structure, there are main three types of membrane proteins: the first one is integral membrane protein that is permanently anchored or part of the membrane, the second type is peripheral membrane protein that is only temporarily attached to the lipid bilayer or to other integral proteins, and the third one is lipid-anchored proteins (Fig. 1). Here we only describe the first two types of membrane protein.

    Fig. 1 Structural classification of membrane proteins

    According to their their relationship with the bilayer, integral membrane protein can be classified two primary types: integral polytopic proteins and Integral monotopic proteins. Integral polytopic proteins are also known as “transmembrane proteins” which can span across the membrane at least once (Fig. 2). These integral membrane proteins may have different transmembrane topology which refers to orientations (locations of N- and C-termini) of membrane-spanning segments with respect to the inner or outer sides of the biological membrane occupied by the protein. The first three types in the Fig. 2 are common forms in integral membrane proteins, such as, transmembrane α-helix protein, transmembrane α-helical protein and transmembrane β-sheet protein.

    Integral monotopic proteins are one type of integral membrane proteins that are attached to only one side of the membrane and do not span the whole way across. There are 4 types of interaction between Integral monotopic membrane protein and cell membranes: by an amphipathicα-helix paralle, by a hydrophobic loop, by a covalently bound membrane lipid and electrostatic or ionic interaction with membrane lipids (No. 4, 5, 6,7 of Fig. 2). Integral membrane proteins can be separated from the biological membranes only using detergents, nonpolar solvents, or sometimes denaturing agents. Peripheral proteins dissociate following treatment with a polar reagent, such as a solution with an elevated pH or high salt concentrations.

    Fig. 2 Seven types of Integral Membrane protein Structure

    The membrane is represented in yellow. 1. A single transmembrane α-helix (bitopic membrane protein). 2. A polytopic transmembrane α-helical protein. 3. A polytopic transmembrane β-sheet protein. 4. Interaction by an amphipathic α-helix parallel to the membrane plane (in-plane membrane helix). 5. Interaction by a hydrophobic loop. 6. Interaction by a covalently bound membrane lipid. 7. Ionic or electrostatic interactions with membrane lipids.

    Function of Membrane Proteins

    Membrane proteins play crucial roles in all organisms, where they serve as, such as membrane receptors, ion channels , GPCR (G protein–coupled receptors) and various kinds of proteínas de transporte . Membrane receptors that embedded in the cell membranes, which can transmit signals between the cell’s internal and external environments. Membrane transport protein (or transporter) is a kind of membrane protein that involved in the movement of ions, small molecules, or macromolecules across a biological membrane. About membrane transport protein, there is a detailed classification called Transporter Classification Database (or TCDB) approved by International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Ion channels are one of most important type of membrane transport proteins. The functions of ion channel include establishing a resting membrane potential, shaping action potentials and other electrical signals by gating the flow of ions across the cell membrane, controlling the flow of ions across secretory and epithelial cells, and regulating cell volume. Some enzymes are also membranes proteins, for example oxidoreductase, transferase or hydrolase. Cell adhesion molecules that located on the cell surface involved in binding with other cells or with the extracellular matrix (ECM), allow cells to identify each other and interact. For example, proteins including Ig ( immunoglobulin ) superfamily involved in immune response. The following figure 3 summarizes membrane protein functions for easy to understand.

    Fig. 3 Membrane proteins functions

    Owing to their central role in basically all physiological processes, membrane proteins constitute around 60% of approved drug targets, and, therefore, their experimentally determined three – dimensional structures are eagerly sought to assist in structure – based drug design. Despite significant and considerable recent improvements, the expression of functionally folded membrane proteins in sufficient amounts for functional and structural studies is still a challenging task. Compared with soluble cytoplasmic proteins, a variety of difficulties in expression of membrane proteins. 1. Membrane proteins are not just released into the cytosol but must rather be targeted and translocated to their final destinations in membranes. In particular in eukaryotic cells, there is need a more complicated biological process requires sophisticated recognition and sorting mechanisms. 2. Copy number and capacity of prokaryotic and eukaryotic expression systems are limited because of translocation machineries, and translocation can be selective only for distinct groups of membrane proteins. 3. For structural and functional studies or other purposes, it is have to extract membrane protein from cellular after expression, followed by transfer into artificial and defined hydrophobic environments like micelles or liposomes. In this procedure, it is highly critical as membranes have to be disintegrated by relatively harsh detergents which can result in conformational aberrations or in unfolding of membrane proteins. It is therefore not surprising that the structural information obtained from membrane proteins with some 150 unique structures and only

    7% entries in the Protein Data Bank is lacking far behind the data obtained from soluble proteins.

    Core factors that determine the yield, integrity, activity and stability of synthesized membrane proteins mainly are the availability of highly processive transcription and translation machineries, suitable folding environments, the lipid composition of cellular membranes, the presence of efficient targeting systems and appropriate pathways for posttranslational modifications (PTMs). Expression of membrane proteins in expression systems/cellular background as closely related to their origin as possible may be the most reasonable strategy. However, the efficiency and workload of the individual expression systems are quite different, and preparative amounts of membrane proteins are often only obtained with bacterial, yeast or cell-free systems (Fig. 4).

    Fig. 4 Process design of membrane protein expression systems.

    Overview of protocol development for the most popular membrane protein expression systems. Basic optimization parameters characteristic for the individual expression systems are illustrated, and the most critical parts are indicated. Some optimization parameters are not considered: vector or target design, e.g. fusion technologies or modifications of the expression cassettes. Grey bars illustrate the success in obtaining membrane protein structures after using the individual expression systems, while white bars correspond to those membrane protein structures obtained only after recombinant expression. (F. Junge et al.)

    Although choosing an appropriate expression system need to consider many factors which may increase the complexity and time-consuming of research project, Creative Biolabs can provide comprehensive membrane protein production service which can help you decide optimization parameter and systems for your targeted experiments.

    Membrane Protein Antibody

    Membrane proteins represent the vast majority of clinical drug targets and are a focus of pharmaceutical and biotechnological interests. Despite significant and considerable recent improvements, the expression of functionally folded membrane proteins in sufficient amounts for functional and structural studies is still a challenging task. However, there are still many strategies for preparing membrane proteins that have been developed by Specialists from Creative Biolabs. Em termos de anti-membrane protein antibody discovery and production , Creative Biolabs is able to provide various methods from immune antibody library construction by phage display to native antibody discovery by antigen-specific B lymphocytes cytometry technology. If you are interested in discovering novel membrane protein antibodies, please feel free to contact us for more details.


    Resumo

    Cellular organelles in the exocytic and endocytic pathways have a distinctive spatial distribution and communicate through an elaborate system of vesiculo-tubular transport. Rab proteins and their effectors coordinate consecutive stages of transport, such as vesicle formation, vesicle and organelle motility, and tethering of vesicles to their target compartment. These molecules are highly compartmentalized in organelle membranes, making them excellent candidates for determining transport specificity and organelle identity.


    Mapping the folding process of a single membrane protein

    Proteins are huge molecules containing hundreds to thousands of atoms that adopt a unique three dimensional structure, placing chemical groups in just the right place to catalyze reactions or build cellular structures. How all those atoms manage to find the right location -- the so-called folding problem -- has fascinated molecular biologists since the first structures were seen in the 1950s. Moreover, folding has important medical implications because most genetic defects cause protein misfolding.

    About a third of all proteins float around in the cell membrane where they ensure the right chemicals get in the cell in the right amounts. Membrane proteins also provide key information links between the cell and its environment. Indeed, most drugs target membrane proteins. Nevertheless, the folding of membrane proteins has been particularly difficult to study and has rarely been studied in natural environments, leaving the folding process for a large fraction of the protein universe still largely cloaked in mystery.

    Em uma edição recente da Nature Chemical Biology, published on October 19, 2015, a research team led by Tae-Young Yoon of the Department of Physics at the Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) and James U. Bowie of the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of California, Los Angeles (UCLA), report a new method for manipulating the folding of membrane proteins in a membrane environment using a tool called a magnetic tweezer.

    Researchers first attach long DNA handles to the ends of the protein. One handle is attached to a glass surface and the other to a magnetic bead. Using a magnet, they can essentially grab the protein and pull on it, inducing it to unfold. By playing with the bead attached to the protein, they can force the protein to unfold or allow it to refold, and watch all this happening by 3D-tracking of the magnetic bead. With this novel strategy, they were able to quantitatively map the folding energy landscape, the folding kinetic rate, and folding intermediates of a membrane protein in a membrane environment for the first time.

    "I have been dreaming about this experiment for a decade. To see it work so well is really gratifying," said Dr. Bowie.

    One of the major surprises in the study was that essentially all the atoms of the protein jump into the correct structure together. The researchers expected that the protein structure would come together in a more piecemeal fashion, with different parts of the structure forming separately, but that was not the case. It is possible that nature evolved such a smooth, highly cooperative folding process to prevent partially folded forms that could get into trouble in the crowded cell membrane. On the other hand, the cooperative folding seen here might not apply to other membrane proteins.

    "We need to look at more proteins. The technique developed here may allow us to do just that," said Dr. Yoon.

    The single molecule mechanical manipulation technique could enable detailed folding studies of many other membrane proteins. A major barrier to the study of membrane proteins previously is that the proteins tend to stick together and get tangled up, as computer cords lying at your feet tend to do. With the tweezer technique used in this work, the protein cords are held apart from other cords so they can't get knotted up. It is hoped that the new approach will open up an important part of the protein universe to scrutiny, including many proteins that become misfolded in disease states.

    The title of the research paper is "Mapping the energy landscape for second-stage folding of a single membrane protein."


    6 Important Types of Membrane Proteins (With Diagram)

    Some of the most important types of membrane proteins are as follows:

    1. Peripheral (Extrinsic) Proteins 2. Integral (Intrinsic) Proteins 3. Asymmetric Distribution of Membrane Proteins 4. Mobility of Membrane Proteins 5. Enzymatic Properties of Membrane Proteins 6. Isolation and Characterization of Membrane Proteins.

    1. Peripheral (Extrinsic) Proteins:

    Peripheral or extrinsic membrane proteins are gener­ally loosely attached to the membrane and are more readily removed than are the integral proteins. Peripheral proteins are rich in amino acids with hydrophilic side chains that permit interaction with the surrounding water and with the polar surface of the lipid bilayer. Peripheral proteins on the cell’s exterior membrane surface often contain chains of sugars (i.e., they are glycoproteins).

    2. Integral (Intrinsic) Proteins:

    Integral or intrinsic membrane proteins contain both hydrophilic and hydrophobic regions. The hydrophilic portions of the protein interact with the polar heads of the lipid molecules at each surface of the bimolecular leaflet.

    Portions of integral proteins that project be­yond the surface of the lipid bilayer are also rich in hy­drophilic amino acids. Amino acids in that part of the protein projecting from the outer membrane surface may be linked to chains of sugars. Parts of the protein that are buried in the hydrophobic portion of the lipid bilayer are rich in amino acids with hydrophobic side chains.

    These side chains are believed to form hydro­phobic bonds with the hydrocarbon tails of the mem­brane phospholipids. It is speculated that within the hydrophobic interior of the membrane, the secondary structure of integral proteins is alpha helix and/or beta sheet (Fig. 15-12).

    In the alpha helix conforma­tion, amino and carboxyl groups along a stretch of the polypeptide’s backbone form hydrogen bonds with one another in the beta sheet, hydrogen bonds are formed between amino and carboxyl groups in stretches of polypeptide that lie parallel to one another.

    In the absence of such hydrogen bonding, these amino and carboxyl groups would have polar proper­ties, their hydrophilic nature being incompatible with the membrane’s hydrophobic interior. Alpha amino and carboxyl groups that are not “neutralized” by hy­drogen bonding would be expected only in those parts of the integral protein that extend into the aqueous milieu on either side of the membrane.

    Integral Proteins That Span the Membrane:

    M. Bretscher first demonstrated the existence of inte­gral proteins that span the entire membrane. In a se­ries of elegant experiments, Bretscher showed that radioactive ligands specific for membrane proteins of the erythrocyte were bound in smaller quantities to intact cells than to disrupted cells. Disruption of the cells was shown to expose portions of the membrane proteins previously facing the cell interior, thereby al­lowing additional radioactive ligand to associate with the protein.

    T. L. Steck developed a technique for converting fragments of disrupted erythrocyte membranes into small vesicles that were either “right-side-out” (i.e., the external face of the membrane also formed the ex­ternal face of the vesicle) or “inside-out” (Fig. 15-13).

    When proteolytic enzymes were added to separate suspensions of each type of vesicle, certain of their membrane proteins were found to be equally suscepti­ble to digestion and could therefore be enzymatically attacked from either membrane surface. These pro­teins clearly spanned the membrane. Other proteins were susceptible to enzymatic digestion only when present in right-side-out or inside-out vesicles, indicat­ing their differential distribution in the membrane’s outer and inner surfaces.

    Integral proteins that span the entire membrane contain two outer regions that are hydrophilic (i.e., one at each surface of the membrane) the central re­gion is hydrophobic (Fig. 15-12). Carbohydrate asso­ciated with the hydrophilic region facing the cell’s sur­roundings is believed to play a role in maintaining the orientation of the protein within the membrane. The hydrophilic sugars, together with the hydrophilic side chains of amino acids in the out: region of the pro­tein, effectively prevent reorientation of the protein in the direction of the hydrocarbon core of the lipid bi­layer.

    3. Asymmetric Distribution of Membrane Proteins:

    The outer and inner regions of the plasma membrane do not contain either the same types or equal amounts of the various peripheral and integral proteins. For ex­ample, the outer half of the erythrocyte membrane contains far less protein than does the inner, half.

    In addition, various membrane proteins may be present in significantly different quantities the membranes of some cells contain a hundred times as many molecules of one protein species as another. Moreover, regard­less of absolute quantity, all copies of a given mem­brane protein species have exactly the same orienta­tion in the membrane.

    The differential distribution of proteins in the various regions of the plasma mem­brane within a single cell was described earlier in con­nection with liver parenchymal cells and intestinal epithelium. This irregular distribution of membrane proteins is known as membrane asymmetry. Not only are the proteins of plasma membranes asymmetri­cally distributed but so too are the proteins of the mem­branes of the endoplasmic reticulum and vesicular or­ganelles (e.g., mitochondria).

    4. Mobility of Membrane Proteins:

    When cells are grown in culture, there is an occasional fusion of one cell with another to form a larger cell. The frequency of cell fusion can be greatly increased by adding Sendai virus to the cell culture. In the pres­ence of this virus, even different strains of cells can be induced to fuse, producing hybrid cells or heterokaryons. D. Frye and M. Edidin utilized this phenom­enon to demonstrate that membrane proteins may not maintain fixed positions in the membrane but may move about laterally through the bilayer.

    Frye and Edidin induced the fusion of human and mouse cells to form heterokaryons and, using fluorescent antibody labels, followed the distribution of human and mouse membrane proteins in the heterokaryon during the time interval that followed fusion.

    At the onset of fu­sion, human and mouse membrane proteins were re­spectively restricted to their “halves” of the hybrid cell, but in less than an hour both protein types be­came uniformly distributed through the membrane (Fig. 15-14). The distribution of the membrane pro­teins was not dependent on the availability of ATP and was not prevented by metabolic inhibitors, indicating that lateral movement of proteins in the membrane oc­curred by diffusion.

    Although some membrane proteins are capable of lateral diffusion, many are not. G. Nicolson and others have obtained evidence suggesting that many integral proteins are restrained within the membrane by a pro­tein network lying just under the membrane’s inner surface (Fig. 15-9). In many cells, this network is as­sociated with a system of cytoplasmic filaments and microtubules that radiate through the cytosol forming a cytoskeleton.

    5. Enzymatic Properties of Membrane Proteins:

    Membrane proteins have been shown to possess enzy­matic activity. Table 15-1 lists some of the enzymes that are now recognized as constituents of the plasma membrane of various cells. To this list of proteins must be added receptor proteins (such as the insulin- binding sites of the liver plasma membrane) and struc­tural or non-enzymatic proteins.

    Ectoenzymes and Endoenzymes:

    Enzymes disposed in the plasma membrane may be characterized accord­ing to the membrane face containing the enzymatic activity. Accordingly, ectoenzymes are those enzymes whose catalytic activity is associated with the exterior surface of the plasma membrane the activity of plasma membrane endoenzymes is associated with the interior of the cell. Many (perhaps all) plasma membrane ectoenzymes are glycoproteins.

    6. Isolation and Characterization of Membrane Proteins:

    Because of the relative ease with which they may be purified, the plasma membranes of erythrocytes pro­vided much of the early information on the chemistry of proteins (and lipids) present in membranes. Now, however, plasma membranes can be obtained from many cell types in a reasonably uncontaminated state using various forms of density gradient centrifugation.

    Nonetheless, the individual protein constituents of the membrane are not so easily extricated for indi­vidual study because of their high degree of insolubil­ity. Varying degrees of success in extracting proteins from the plasma membrane have been achieved using organic detergents (especially sodium dodecyl sulfate, SDS) and concentrated solutions of urea, n-butanol, and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA).

    These chemicals have a disaggregating effect on membranes and cause the release of many of the membrane pro­teins by dissociating the bonds that link the proteins together or to other membrane constituents. Often, the removal of these agents from a preparation of sol- ubilized membrane proteins is quickly followed by the reassociation or reaggregation of the proteins to form an intractable matrix.

    Once solubilized, the membrane proteins can be sep­arated into discrete classes using electrophoresis, chromatography, or other procedures. This generally demands that the dissociating agents be present in the separating medium (e.g., the electrophoresis gel, the column eluent, etc.) other­wise, application of the membrane extract to the me­dium is followed by membrane protein reaggregation into insoluble complexes that will not separate into distinct fractions.

    For example, the separation of liver plasma membrane proteins is achieved only if the electrophoresis gel contains SDS. The solubility problem has been one of the greatest barriers to progress in isolating and fully characterizing the proteins of membranes.

    Some of the plasma membrane enzymes listed in Table 15-1 have not actually been isolated from the membrane, as removal and isolation of the enzyme is not a prerequisite for establishing its presence. In­stead, the enzyme activity can be measured directly in the (un-solubilized) membrane preparation.


    Assista o vídeo: Proteínas integrales (Agosto 2022).