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17.2A: Produção Industrial de Antibióticos - Biologia

17.2A: Produção Industrial de Antibióticos - Biologia



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Os antibióticos produzidos industrialmente são produzidos por fermentação, onde o microrganismo de origem é cultivado em meio de crescimento líquido grande.

objetivos de aprendizado

  • Descreva como os antibióticos são produzidos na indústria por fermentação

Pontos chave

  • Os antibióticos são os metabólitos secundários dos microrganismos.
  • Durante o processamento, o antibiótico deve ser extraído e purificado em um produto cristalino.
  • Antibióticos úteis são freqüentemente descobertos usando um processo de triagem ou um processo de projeto racional.

Termos chave

  • antibiótico: Qualquer substância que pode destruir ou inibir o crescimento de bactérias e microrganismos semelhantes.
  • fermentação: Qualquer uma das muitas reações bioquímicas anaeróbicas nas quais uma enzima (ou várias enzimas produzidas por um microrganismo) catalisa a conversão de uma substância em outra; especialmente a conversão (usando fermento) de açúcares em álcool ou ácido acético com a evolução do dióxido de carbono.
  • metabólito: Qualquer substância produzida por, ou participando de uma reação metabólica.

Os antibióticos são produzidos industrialmente por um processo de fermentação, onde o microrganismo de origem é cultivado em grandes recipientes (100.000 - 150.000 litros ou mais) contendo um meio de crescimento líquido.

A concentração de oxigênio, temperatura, pH e níveis de nutrientes devem ser ideais e são monitorados de perto e ajustados, se necessário. Como os antibióticos são metabólitos secundários, o tamanho da população deve ser controlado com muito cuidado para garantir que o rendimento máximo seja obtido antes que as células morram. Assim que o processo for concluído, o antibiótico deve ser extraído e purificado em um produto cristalino. Isso é mais simples de se conseguir se o antibiótico for solúvel em solvente orgânico. Caso contrário, deve primeiro ser removido por troca iônica, adsorção ou precipitação química.

Os microrganismos usados ​​na fermentação raramente são idênticos aos seus homólogos na natureza. Isso ocorre porque as espécies são frequentemente modificadas geneticamente para produzir a quantidade máxima de antibióticos. A mutação é freqüentemente usada e estimulada pela introdução de agentes mutagênicos, como radiação ultravioleta, raios-x ou certos produtos químicos. A seleção e posterior reprodução das cepas de maior rendimento ao longo de muitas gerações pode aumentar a produção em 20 vezes ou mais. Outra técnica usada para aumentar os rendimentos é a amplificação de genes, em que cópias de genes que codificam enzimas envolvidas na produção de antibióticos podem ser inseridas de volta em uma célula, por meio de vetores como plasmídeos. Este processo deve estar intimamente ligado a um novo teste da produção e eficácia do antibiótico.

Apesar da grande variedade de antibióticos conhecida, menos de 1% dos agentes antimicrobianos têm valor médico ou comercial. Por exemplo, embora a penicilina tenha um alto índice terapêutico, uma vez que geralmente não afeta as células humanas, esse não é o caso de muitos antibióticos. Outros antibióticos simplesmente carecem de vantagem sobre os já em uso ou não têm outras aplicações práticas.

Antibióticos úteis são frequentemente descobertos por meio de um processo de triagem. Para conduzir tal triagem, isolados de muitos microrganismos diferentes são cultivados e, em seguida, testados para a produção de produtos difusíveis que inibem o crescimento dos organismos de teste. A maioria dos antibióticos identificados em tal triagem já são conhecidos e, portanto, devem ser desconsiderados. O restante deve ser testado quanto a suas toxicidades seletivas e atividades terapêuticas, e os melhores candidatos podem ser examinados e possivelmente modificados.

Uma versão mais moderna dessa abordagem é um programa de design racional. Isso envolve a triagem direcionada para encontrar novos produtos naturais que inibem um alvo específico, como uma enzima encontrada apenas no patógeno alvo, ao invés de testes para mostrar a inibição geral de uma cultura.


O futuro da produção industrial de antibióticos: da mutagênese aleatória à biologia sintética

Os produtos naturais derivados do metabolismo secundário dos micróbios constituem a pedra angular da medicina moderna. Erros de engenharia para produzir esses produtos em grandes quantidades são um grande desafio para a biotecnologia, que geralmente tem sido enfrentada por uma de duas estratégias: mutagênese aleatória iterativa ou design racional. Recentemente, analisamos o transcriptoma de uma cepa de Streptomyces clavuligerus otimizada para a produção do ácido clavulânico inibidor de β-lactamase por múltiplas rodadas de mutagênese e seleção, e descobrimos que as mudanças observadas combinavam surpreendentemente bem com mudanças simples que foram introduzidas nessas cepas por engenharia racional. Aqui, discutimos como, no novo campo da biologia sintética, a mutagênese aleatória e a engenharia racional podem ser implementadas complementarmente de maneiras que podem permitir ir além do status quo que agora foi alcançado por cada método independentemente.


Produção de metabólitos especializados por Streptomyces coelicolor A3 (2)

Geertje van Keulen, Paul J. Dyson, em Advances in Applied Microbiology, 2014

7 explorando S. celicolor como um hospedeiro genérico para a produção de antibióticos

Com o amplo conhecimento prévio da produção de antibióticos por S. celicolor, é um "chassi" atraente para expressar agrupamentos de genes de metabólitos especializados heterólogos. Com isso em mente, cepas foram desenvolvidas especificamente para esse fim (Gomez-Escribano & amp Bibb, 2011). Um problema a ser enfrentado é que as vias endógenas existentes podem competir com as vias introduzidas pelos compostos precursores fornecidos pelo metabolismo primário. Para superar isso e, assim, otimizar os rendimentos de uma via heteróloga, uma cepa sem SCP1 (e, portanto, o mmy e mmf cluster de genes) foi manipulado para excluir o cromossomo agir, vermelho, cda, e cpk clusters. A exclusão dessas vias também facilita a identificação de um novo produto se ele ainda for produzido com baixo rendimento, pois a cepa tem um metaboloma extracelular muito simplificado. Além disso, a promoção da produção de antibióticos rpoB (RNA polimerase) e rpsL (proteína ribossômica S12) mutações foram introduzidas. Estas cepas suportam altos níveis de produção de uma ampla gama de metabólitos especializados de expressão heteróloga de grupos de genes biossintéticos introduzidos, incluindo Act (reintroduzido), cloranfenicol (grupo de genes de S. venezualae Gomez-Escribano & amp Bibb, 2011), congocidina (agrupamento de genes de S. ambofaciens Gomez-Escribano & amp Bibb, 2011), clorobiocina (agrupamento de genes de S. roseocromogenes Flinspach et al., 2010), caprazamicinas (grupo de genes de Streptomyces sp. MK730-62F2 Flinspach et al., 2010), GE2270, um antibiótico tiopeptídeo (grupo de genes de Planobispora rosea Flinspach, Kapitzke, Tocchetti, Sosio, & amp Apel, 2014) e cacibiocina (cluster de gene de Catenulispora acidiphila Zettler et al., 2014). Uma lista mais abrangente que ilustra a diversidade química de compostos que podem ser produzidos pelas cepas hospedeiras genéricas foi publicada recentemente (Gomez-Escribano & amp Bibb, 2014).

Biossíntese combinatória (combinação de genes biossintéticos de diferentes clusters e vias) e mutasíntese (bloqueando a biossíntese de um precursor e alimentando precursores análogos ou sintéticos) para a produção de novos análogos de metabólitos especializados com funcionalidade modificada também foram testados nestes recém-gerados cepas hospedeiras genéricas, bem como no Act-, Red- e Mmy-negative S. celicolor cepas M512 e CH999. Por exemplo, centenas de tiopeptídeos derivados de RiPP "não naturais" (derivados de GE37468) (Young, Dorrestein, & amp Walsh, 2012), lipopeptídeos derivados de NRPS (derivados de CDA) (Micklefield, 2009) e aminocumarinas (derivados de clorobiocina) (Heide, 2009) foram produzidos, alguns dos quais exibiram uma melhor absorção de antibióticos e bioatividade. Estes resultados demonstram que uma combinação de métodos é bem-sucedida para expandir a diversidade estrutural de metabólitos especialmente especializados em peptídeos, uma vez que estes são frequentemente muito complexos para uma modificação sintética eficaz. A capacidade de alterar as características estruturais e bioatividades produzindo novos medicamentos com comportamento farmacocinético melhorado para o pipeline farmacêutico é urgentemente necessária para tratamentos quimioterápicos eficazes de infecções resistentes a medicamentos e cânceres.


História

Embora nosso conhecimento científico sobre antibióticos tenha sido desenvolvido apenas recentemente, a aplicação prática dos antibióticos existe há séculos. O primeiro uso conhecido foi pelos chineses há cerca de 2.500 anos. Durante esse tempo, eles descobriram que aplicar a coalhada mofada de soja em infecções trazia certos benefícios terapêuticos. Foi tão eficaz que se tornou um tratamento padrão. As evidências sugerem que outras culturas usaram substâncias do tipo antibiótico como agentes terapêuticos. A civilização sudanesa-núbia usava um tipo de antibiótico tetraciclina já em 350 DE ANÚNCIOS. Na Europa durante a Idade Média, extratos vegetais brutos e coalhada de queijo também eram usados ​​para combater infecções. Embora essas culturas usassem antibióticos, os princípios gerais da ação dos antibióticos não foram compreendidos até o século XX.

O desenvolvimento de antibióticos modernos dependeu de alguns indivíduos importantes que demonstrassem ao mundo que materiais derivados de microorganismos poderiam ser usados ​​para curar doenças infecciosas. Um dos primeiros pioneiros neste campo foi Louis Pasteur. Em 1877, ele e um associado descobriram que o crescimento da bactéria antraz, causadora de doenças, poderia ser inibido por uma bactéria saprofítica. Eles mostraram que grandes quantidades de bacilos do antraz podiam ser administradas a animais sem efeitos adversos, desde que os bacilos saprofíticos também fossem administrados. Nos anos seguintes, outras observações apoiaram o fato de que alguns materiais derivados de bactérias poderiam prevenir o crescimento de bactérias causadoras de doenças.

Em 1928, Alexander Fleming fez uma das contribuições mais importantes para o campo dos antibióticos. Em um experimento, ele descobriu que uma variedade de verde Penicillium o mofo inibiu o crescimento de bactérias em uma placa de ágar. Isso levou ao desenvolvimento do primeiro antibiótico da era moderna, a penicilina. Alguns anos depois, em 1932, foi publicado um artigo que sugeria um método para tratar feridas infectadas usando uma preparação de penicilina. Embora essas primeiras amostras de penicilina fossem funcionais, não eram confiáveis ​​e eram necessários mais refinamentos. Essas melhorias surgiram no início dos anos 1940, quando Howard Florey e associados descobriram uma nova variedade de Penicillium, que produziu altos rendimentos de penicilina. Isso permitiu a produção em grande escala de penicilina, o que ajudou a lançar a moderna indústria de antibióticos.

Após a descoberta da penicilina, outros antibióticos foram procurados. Em 1939, o trabalho começou no isolamento de produtos antibióticos potenciais das bactérias do solo streptomyces. Foi nessa época que o termo antibiótico foi introduzido. Selman Waxman e associados descobriram a estreptomicina em 1944. Estudos subsequentes resultaram na descoberta de uma série de novos e diferentes antibióticos, incluindo actinomicina, estreptotricina e neomicina, todos produzidos por Streptomyces. Outros antibióticos que foram descobertos desde então incluem bacitracina, polimixina, viomicina, cloranfenicol e tetraciclinas. Desde a década de 1970, a maioria dos novos antibióticos foram modificações sintéticas de antibióticos de ocorrência natural.


Biotecnologia industrial e produtos de commodities

3.52.5 Perspectivas Futuras

O campo da engenharia metabólica mudou o cenário técnico para uma infinidade de diversos processos industriais, como fontes alternativas de energia, produção de produtos químicos e antibióticos, produtos alimentícios enriquecidos com nutrientes e síntese terapêutica de proteínas. Na última década, as aplicações da engenharia metabólica evoluíram significativamente para atender às necessidades humanas de forma sustentável por meio da melhoria da produtividade, redução de custos e diminuição da poluição. Esse progresso pode ser atribuído ao avanço científico e tecnológico e, à medida que as disciplinas de apoio amadurecem, novos desenvolvimentos provavelmente transformarão a engenharia metabólica. O futuro da engenharia metabólica é tremendamente empolgante e sua direção será fortemente ditada pela expansão e aceitação do campo emergente da biologia sintética. De uma perspectiva de engenharia, a biologia sintética visa possibilitar uma engenharia sistemática da biologia para aplicações novas e aprimoradas.

No entanto, antes que a biologia sintética possa ser totalmente realizada, as disciplinas tradicionais da bioengenharia, incluindo genética, proteína e engenharia metabólica, devem ser integradas à biologia de sistemas. Biologia de sistemas é a análise quantitativa de sistemas biológicos envolvendo coleta, análise e integração de conjuntos de dados em escala de genoma completo para criar uma descrição fenotípica quantitativa do sistema biológico. Essa abordagem difere da biologia tradicional, envolvendo experimentação baseada em hipóteses por meio de uma análise por partes dos componentes do sistema. Da mesma forma, a engenharia metabólica evoluiu de mutagênese aleatória tradicional e estratégias de seleção, agora exigindo uma abordagem multifacetada que depende de experimentação de triagem em larga escala e análise computacional de redes metabólicas e regulatórias. Portanto, há um interesse significativo em estudar células e microrganismos no contexto da biologia de sistemas.

Para compreender totalmente o comportamento dos sistemas biológicos, vários componentes precisam ser estudados simultaneamente de forma integrativa, o que requer suporte analítico e ferramentas computacionais. O recente aumento exponencial na disponibilidade de informações biológicas para quantificar a fisiologia tem avançado a biologia de sistemas, e outras descobertas e avanços dependem das ferramentas certas para interpretar conjuntos de dados de alto rendimento. A caracterização de redes biológicas requer o desenvolvimento de princípios matemáticos e mapas detalhados elucidando proteínas, RNAs, reguladores e outras macromoléculas. Redes metabólicas, redes regulatórias e redes de interação de proteínas estão sendo estabelecidas e irão iniciar a formulação de modelos matemáticos detalhados, que são refinados por sistemas iterativos, perturbações e integração de dados baseados em hipóteses. Em um curto período de tempo, o campo testemunhou o desenvolvimento da biologia de sistemas de alto rendimento, forçando os pesquisadores a considerar os processos celulares de forma holística.

Ao apresentar um novo nível de compreensão e uma estrutura intelectual para entender a biologia desde os primeiros princípios, a biologia de sistemas está abrindo o caminho para a biologia sintética. o de novo o projeto e a construção de novos sistemas biológicos envolverão a construção de novas proteínas, circuitos genéticos e redes metabólicas a partir do zero. Atualmente, a biologia sintética está em um estágio relativamente inicial de desenvolvimento com poucos exemplos, como a criação da primeira célula controlada por um genoma sintético (apenas funcional em capacidades reprodutivas) produzido no laboratório do pioneiro da genômica, J. Craig Venter, e a biossíntese econômica de artemisinina, um medicamento antimalárico tradicionalmente colhido de uma plantação de A. annua plantas, em E. coli no laboratório do pioneiro da biologia sintética, Jay D. Keasling. Para obter células sintéticas capazes de funções customizadas para atender às necessidades humanas, serão necessários grandes grupos multidisciplinares trabalhando juntos em problemas coletivos com objetivos comuns.

Em um contexto mais amplo, os princípios da engenharia metabólica também estão sendo reconhecidos na medicina, onde os pesquisadores são desafiados pela integração de dados de pacientes, modelos animais e experimentos de cultura de tecidos. As grandes habilidades de integração de conjuntos de dados aprendidas com a experimentação do metabolismo celular são úteis para estudar doenças como diabetes e obesidade, pois envolvem o metabolismo e o armazenamento do açúcar. Além disso, medições de fluxo, perfil global de transcritos, proteínas e níveis de metabólitos e modelagem de nível de sistemas, necessários para elucidar como diferentes subsistemas afetam uns aos outros e funcionam como um todo, podem ser aplicados a células primárias, tecido intacto ou fluidos corporais. Essas ferramentas podem ser usadas para investigar os efeitos do início, progressão e tratamento da doença, incluindo alvos moleculares para novos medicamentos e marcadores para diagnóstico. A medicina personalizada, que acentua o uso sistemático de dados de pacientes individuais para otimizar os cuidados preventivos e terapêuticos, também avançará com o campo da engenharia metabólica, que progride rapidamente.


Antibióticos: produção comercial de antibióticos

Os antibióticos são produtos do metabolismo secundário que inibem os processos de crescimento de outros organismos, mesmo quando usados ​​em baixas concentrações. O antibiótico penicilina foi descoberto por Fleming em 1929.

Embora mais de 300 compostos antibióticos tenham sido isolados, apenas 123 são atualmente produzidos por fermentação. Além disso, mais de 50 antibióticos são produzidos como compostos semissintéticos, e três antibióticos, cloranfenicol, fosfonomicina e pirrolnitrina, são produzidos completamente sinteticamente.

Inóculo:

Uma cepa de alto rendimento é um pré-requisito para a produção de antibióticos. Portanto, a melhoria constante da tensão é parte integrante das atividades comerciais. O inóculo é preparado geralmente na forma de uma suspensão de esporos, que é transferida para os fermentadores. Via de regra, o número de estágios entre o material preservado e o estágio final do inóculo é mínimo para minimizar o risco de o organismo perder seu potencial de alto rendimento.

Fermentador:

Os antibióticos são geralmente produzidos em fermentadores de aço inoxidável usados ​​no modo lote ou com alimentação. O resfriamento com água é freqüentemente usado para manter a temperatura entre 24-26 ° C. Para a maioria dos produtores de antibióticos. Geralmente, o fermentador é mantido acima da pressão atmosférica, o que reduz o risco de contaminação e aumenta o O2 fornecem.

O fermentador de estágio final é preferencialmente usado para a produção de antibióticos por um período mais longo. Mas os estágios iniciais de fermentação são projetados para um crescimento microbiano considerável, estes são realizados em fermentadores de estágio de semente de tamanho menor. Um ou mais estágios de semente podem ser usados, dependendo do processo e da cepa, para produzir a quantidade máxima de biomassa no estado fisiológico correto para alta produção de antibióticos quando introduzidos no fermentador de estágio final.

Meio de produção:

A produção de antibióticos emprega uma variedade de meios, um diferente para cada estágio da operação (Tabela. 12.2). Um meio típico tem cerca de 10% (p / v) de sólidos. Geralmente, os rendimentos são muito maiores em mídias complexas. Em alguns casos, um precursor adequado para o antibiótico também é fornecido como no caso da produção de penicilina G, onde ácido fenilacético ou ácido fenoxiacético é usado como precursor. Como os antibióticos são metabólitos secundários, o meio de produção é projetado de modo que um nutriente chave se torne limitante em um estágio crítico para iniciar o metabolismo secundário no organismo (por exemplo, glicose para a produção de penicilina e fosfato para vários antibióticos produzidos por Streptomyces.

Na maioria dos processos de produção, o fermentador de produção é executado em um modo de lote alimentado em que um nutriente, por exemplo, glicose é adicionado continuamente ao longo da fermentação para aumentar a duração da produção de antibióticos. Isso é acompanhado pela retirada de pequenos volumes de caldo para verificar o aumento do volume do caldo no fermentador. Os agentes anti-espuma são adicionados no estágio apropriado de fermentação. As características microbiológicas, físicas e químicas selecionadas são monitoradas durante a fermentação para se obter o controle adequado.

No final da incubação do estágio final de produção, o caldo contém apenas uma baixa concentração (3-35% do total de solutos no caldo) do antibiótico. A recuperação do antibiótico é feita pela separação das células do caldo por filtração ou centrifugação, seguida de purificação.


Causa da resistência aos antibióticos

No passado, os antibióticos eram adicionados à ração animal, pois causavam aumento nas taxas de crescimento (por meio da modificação do equilíbrio das bactérias no intestino dos animais) e, portanto, proporcionavam maior lucratividade.

No entanto, essa prática foi proibida porque levava ao desenvolvimento de resistência que poderia ser transmitida a outras bactérias.

Ao tomar antibióticos por razões médicas, também é importante complete o curso do antibióticoé prescrito, a fim de maximizar o benefício do tratamento e não permitir a sobrevivência de algumas bactérias expostas a um subletal concentração.


Uso da tecnologia Staby (®) para desenvolvimento e produção de vacinas de DNA livres do gene de resistência a antibióticos

O surgimento de novos vírus e o custo do desenvolvimento de certas vacinas exigem que novas estratégias de vacinação tenham que ser desenvolvidas. A vacinação de DNA parece ser um método particularmente promissor. Para esta aplicação, o DNA de plasmídeo é injetado no sujeito (homem ou animal). Este DNA de plasmídeo codifica um antígeno que será expresso pelas células do sujeito. Além do antígeno, o plasmídeo também codifica uma resistência a um antibiótico, que é usado durante as etapas de construção e produção do plasmídeo. No entanto, agências regulatórias (FDA, USDA e EMA) recomendam evitar o uso de genes de resistência a antibióticos. A Delphi Genetics desenvolveu a tecnologia Staby (®) para substituir o gene de resistência a antibióticos por um sistema de seleção que depende de dois genes bacterianos. Esses genes são pequenos em tamanho (aproximadamente 200 a 300 bases cada) e, conseqüentemente, codificam duas pequenas proteínas. Eles estão naturalmente presentes nos genomas de bactérias e em plasmídeos. A tecnologia já é utilizada com sucesso para produção de proteínas recombinantes com maior rendimento e sem a necessidade de antibióticos. No campo das vacinas de DNA, temos agora os primeiros dados que validam a inocuidade desta tecnologia Staby (®) para células eucarióticas e a viabilidade de uma produção industrial de uma vacina de DNA sem antibióticos. Além disso, como prova de conceito, os camundongos foram vacinados com sucesso com nossa vacina de DNA sem antibiótico contra uma doença mortal, a pseudo-raiva (induzida pelo herpesvírus Suid-1).

Palavras-chave: Vacina de DNA da doença de Aujeszky Eletrotransferência ccdA ccdB Staby livre de antibióticos.


Produção industrial de antibióticos β-lactâmicos

A produção industrial de antibióticos β-lactâmicos por fermentação nos últimos 50 anos é um dos exemplos notáveis ​​da biotecnologia. Hoje, os antibióticos β-lactâmicos, particularmente penicilinas e cefalosporinas, representam os principais produtos de biotecnologia do mundo, com vendas mundiais de formas farmacêuticas de

65% do mercado mundial total de antibióticos. Nas últimas cinco décadas, grandes melhorias na produtividade dos organismos produtores, Penicillium chrysogenum e Acremonium chrysogenum (sin. Cephalosporium acremonium) e a tecnologia de fermentação aprimorada culminaram em maior produtividade e redução substancial de custos. Estima-se que os principais produtores de fermentação registrem títulos de colheita de 40–50 g / l para penicilina e 20–25 g / l para cefalosporina C. Os rendimentos de recuperação para penicilina G ou penicilina V são agora & gt90%. A tecnologia do processo de hidrólise química e enzimática para o ácido 6-aminopenicilânico ou ácido 7-aminocefalosporânico também é altamente eficiente (

80–90%) com nova tecnologia de enzima levando a grandes reduções de custo na última década. A Europa continua sendo a área de manufatura dominante para penicilinas e cefalosporinas. No entanto, devido aos custos cada vez maiores de mão de obra, energia e matéria-prima, mais manufatura a granel está se mudando para o Extremo Oriente, com China, Coréia e Índia se tornando os principais países produtores, com o preenchimento de formas farmacêuticas se tornando mais dominante em Porto Rico e na Irlanda.

Esta é uma prévia do conteúdo da assinatura, acesso através de sua instituição.


Antibiótico: produção de antibióticos

A produção em massa de antibióticos começou durante a Segunda Guerra Mundial com estreptomicina e penicilina. Agora, a maioria dos antibióticos é produzida por fermentações em etapas nas quais cepas de microrganismos que produzem altos rendimentos são cultivadas em condições ideais em meio nutriente em tanques de fermentação com capacidade para vários milhares de galões. O molde é coado do caldo de fermentação e, em seguida, o antibiótico é removido do caldo por filtração, precipitação e outros métodos de separação. Em alguns casos, novos antibióticos são sintetizados em laboratório, enquanto muitos antibióticos são produzidos pela modificação química de substâncias naturais, muitos desses derivados são mais eficazes do que as substâncias naturais contra organismos infectantes ou são melhor absorvidos pelo corpo, por exemplo, algumas penicilinas semissintéticas são eficazes contra bactérias resistentes à substância original.

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