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Pegando DNA de plasmídeo usando Nanodrop, mas não usando eletroforese

Pegando DNA de plasmídeo usando Nanodrop, mas não usando eletroforese



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No momento, estou tentando ver se 2 bactérias contêm plasmídeos ou não. Eu tinha usado o kit de extração de plasmídeo promega nas bactérias. Fiz uma eletroforese em gel (gel de 0,8%) com o produto do extrato, porém não mostrou a presença de nenhum DNA. Também testei o produto através do Nanodrop (2000) e estes onde as concentrações que obtive:

1: 6,5 ng / ul & 260/280 = 1,56
2: 49,4 ng / ul e 260/280: 1,96

Com base na experiência, quero dizer que o nº 1 não contém plasmídeos; no entanto, o nº 2 pode ter uma pequena concentração de plasmídeos. Por favor, dê-me sua opinião sobre o que concluir. Além disso, se houver outro teste que eu possa tentar fazer para confirmar se o plasmídeo está presente ou não, por favor me avise.


Não sei quanto volume de cultura você usou, mas as quantidades que você tem se parecem mais com um plasmídeo de cópia média / alta. Não sei se é isso que você esperaria de um plasmídeo natural.

Além da outra resposta, também poderia ser DNA genômico fragmentado, cosmídeo (que correria muito alto no seu gel para ver) ou talvez apenas nucleotídeos (se você bagunçou a preparação de alguma forma).

Outra estratégia para descobrir se sua cepa contém plasmídeos depende do que mais você sabe sobre essas cepas. Se você não sabe muito: faça o sequenciamento 16S, pode ser uma cepa conhecida com plasmídeos conhecidos. Se você já sabe que é uma cepa recém-descoberta: sequencie a coisa toda. Mesmo com cobertura relativamente baixa, a presença de plasmídeos será bastante clara. É um pouco mais caro do que um gel prep + de plasmídeo, mas você também obterá muitas outras informações sobre o organismo.


Ter uma leitura positiva no Nanodrop, mas nenhuma banda no gel pode ser devido a uma série de problemas diferentes (não exaustivos):

  1. Uma amostra zerada incorretamente
  2. Coloração incompleta do gel
  3. Contaminação da amostra
  4. Erros humanos no carregamento de amostras

Você deve tentar excluir essas possibilidades por meio de controles positivos, a fim de descobrir a verdadeira razão por trás dos resultados inconsistentes.


Eu recomendaria mudar seu programa de clonagem PCR. Muitas vezes, mesmo depois de purificar DNA e RNA em conjunto com muito cuidado, a PCR pode ser o gargalo para a eletroforese em gel, bem como garantir a qualidade (profundidade, ausência de bordas rombas, etc.) do gel de agarose - 49 ng / ul não é o suficiente para a progressão. Se tudo isso ainda não melhorar o seu caso, então pode ser um problema com o cultivo de culturas bacterianas - depois de purificar plasmídeos de clones bacterianos, os frascos devem parecer muito turvos (8-16 horas foi o meu período de tempo), além disso, certifique-se de evitar exposição à luz no gel de agarose, bem como mantê-lo limpo e submerso em PBS frio antes de inserir seu DNA tamponado (usei 10 microlitros - mas tende a variar dependendo da espessura do seu gel) Além disso, quando eu usaria um maior voltagem durante o gel EP I teria uma chance maior de ter estrias verticais, embora possa ser mais rápido.

Se nada funcionar ... então posso apenas aludir a possíveis erros humanos. Última coisa! Espero que você limpe a nanodrop antes de fazer a contagem, ter proteína em seu produto pode ser um resultado disso. boa sorte! bacterica precisa de amor também!


Dependendo de como você seguiu o protocolo, teoricamente também pode haver DNA genômico bacteriano em sua amostra. Se você seguir estritamente o protocolo, isso não deve acontecer, mas se for, você poderá medir o DNA genômico. No gel de agarose, no entanto, ele geralmente ficaria preso na parte superior, pois é muito grande para migrar.

Agitar a amostra no vórtex antes de carregar a coluna pode causar isso, por exemplo (consulte o manual da Promega PureYield).


20 piadas engraçadas de DNA e frases e # 8230 com explicações

Desde a descompactação de genes até a contaminação por DNA, aqui estão algumas piadas engraçadas sobre DNA e pegam falas.

Aqui estão algumas piadas sobre DNA para todos nós, nerds da biologia molecular e da ciência. As explicações estão incluídas para o resto de nós. Aproveitar!

DNA de Bill Clinton e rsquos

O teste do vestido foi inconclusivo. Todos no Arkansas têm o mesmo DNA.

Explicação: Monica Lewinsky e Bill Clinton tiveram um caso secreto enquanto ele era o presidente dos Estados Unidos. Depois de um encontro com Clinton, Lewinsky salvou um vestido azul que tinha Clinton & rsquos & ldquoDNA & rdquo nele. Clinton é do Arkansas. Às vezes, as pessoas brincam sobre as pessoas no sul serem parentes.

Sem Genes

Explicação: Muitas casas noturnas sofisticadas não admitem clientes vestindo jeans. Jeans e genes são homônimos.

DNA ligase

Os resultados do teste de DNA podem variar

Explicação: Muitas pessoas que tentaram serviços de teste de DNA como 23andMe e AncestryDNA obtiveram resultados surpreendentes.

Pare de me copiar

Cantada: Me apaixonar por você leva menos tempo do que meu DNA leva para se replicar.

Provas de DNA

Explicação: Os testes e evidências de DNA tiveram um impacto dramático na taxa de fechamento de caixas atuais e arquivadas. Como resultado, os criminosos agora têm muito mais dificuldade em escapar impunes dos crimes.

O que o DNA representa?

Contaminação de DNA

Explicação: Um dos maiores desafios para investigadores forenses e cientistas é evitar a contaminação por DNA.

DNA-Spaghetti

Reorganizar o DNA

Cantada: DNA escrito ao contrário é AND, como & hellip me AND you.

Descompacte seus genes

Cantada: Querida, eu queria ser DNA Helicase, para poder descompactar seus genes.

Explicação: Uma DNA helicase é uma enzima que pode & ldquounzip & rdquo uma fita de DNA no meio da hélice.

DNA Helicase e pervertidos

  • P: Quais são os motivos que a DNA helicase e os pervertidos têm em comum?
  • R: Ambos querem descompactar seus genes

Explicação: Uma fita de DNA pode ser & ldquounzipada & rdquo com uma enzima helicase de DNA.

DNA e diarréia

Piada sobre gordura de DNA

Explicação: As palavras jeans e genes são homônimos.

Enzima de restrição

Eu sou adotado?

Fred voltou da universidade em lágrimas.

& ldquoMom, fui adotado? & rdquo

& ldquoNão, claro que não & rdquo, respondeu sua mãe. Por que você pensaria isso?

Fred mostrou a ela os resultados do teste de DNA de sua genealogia. Não era páreo para nenhum de seus parentes e era páreo para uma família que vivia do outro lado da cidade.

Chateada, a mãe ligou para o marido. & ldquoMel, Fred fez um teste de DNA e & hellip e & hellip eu não sei como dizer isso & hellip ele pode não ser nosso filho. & rdquo

& ldquoBem, obviamente! & rdquo ele respondeu.

& ldquoO que você quer dizer? & rdquo

"Em primeiro lugar, foi sua idéia", continuou o marido. & ldquoVocê se lembra daquela primeira noite no hospital quando o bebê não fez nada além de gritar e chorar e gritar e chorar. E assim por diante. E você me pediu para mudá-lo. & Rdquo

& ldquoEu escolhi um bom, eu acho. Sempre muito orgulhoso de Fred. & Rdquo

Impressora de DNA: piadas de teste de DNA

Explicação: Esta piada de teste de DNA mostra duas tiras de papel saindo da impressora formando uma hélice, a mesma forma de DNA.

DNA de massas

Explicação: A forma espiral deste macarrão é semelhante a uma hélice de DNA.

The Petting Zoo

P: O que você ganha quando mistura DNA humano e de cabra?

R: Expulso do zoológico.

Explicação: Desculpe por não explicarmos este.

NERD NOTE : Você já se perguntou: & ldquoO que significa DNA? & Rdquo DNA é a abreviação mais curta de ácido desoxirribonucleico. Seu DNA consiste em dois ácidos nucléicos diferentes. O ácido desoxirribonucléico (DNA) é o ácido principal. O ácido secundário é ácido ribonucleico (RNA).


Resultados

MCS universal e seu design de primer associado

O projeto do UMCS para subclonagem universal é mostrado na Fig. 2a. As principais características deste novo projeto MCS são as seguintes: (1) O comprimento do UMCS é de apenas 48 bp, que é menor do que muitos dos MCSs existentes. A seqüência real a ser sintetizada é de 42 bp para as direções direta e reversa (Fig. 2b). Por emparelhamento e ligação a uma molécula de vetor pré-digerida, o plasmídeo com o UMCS foi reconstituído. (2) Os locais de reconhecimento de enzimas de restrição em ambos os terminais são necessários apenas para integração UMCS. Eles podem ser substituídos livremente de acordo com a compatibilidade MCS original do vetor. (3) O sítio de reconhecimento da enzima de restrição no meio do UMCS é usado apenas para linearização do vetor, que pode ser substituído por quaisquer outras sequências de digestão se forem compatíveis com o vetor. (4) As duas regiões de ligante homólogas foram cuidadosamente otimizadas para ter T próximom e o mesmo conteúdo de GC, que supostamente facilita o PCR. O hairpin e a dimerização dessas regiões também foram minimizados por meio de estudos de otimização. (5) Os iniciadores usados ​​para a amplificação da inserção podem ser facilmente projetados pela introdução de um ligante homólogo em seu terminal 5 ', enquanto o Tm da região de ligação do molde é calculado em aproximadamente 55 ° C (Fig. 2c). (6) Teoricamente, devido à consistência MCS, qualquer vetor com uma sequência UMCS pode ser amplificado pelo par de iniciadores “UMCS-PCR-F + UMCS-PCR-R”, e qualquer inserção clonada no UMCS pode ser amplificada pelo “ Par de primer UMCS-Seq-F + UMCS-Seq-R ”. (7) Ambas as regiões de ligação não contêm códons raros [23, 24]. Se a sequência de ligação deve ser expressa, é improvável que os códons contidos no UMCS afetem a expressão da proteína alvo. Isso é crucial para vetores que expressam tags N-terminal.

Princípio do UMCS e desenho do primer correspondente. uma A sequência UMCS usada neste estudo contém duas regiões ligantes homólogas que são conectadas pelo SalI sequência de reconhecimento. O flanco TraseiroIII e XbaAs sequências de reconhecimento foram projetadas para substituir o MCS original. Todos os três locais de reconhecimento podem ser livremente substituídos por outras sequências. b O UMCS foi primeiro sintetizado como dois ssDNAs (cada um com um comprimento de 42 bp). Após o recozimento e ligação, o UMCS foi incorporado ao vetor, substituindo o MCS original. c O projeto de primer recomendado para maximizar a eficiência da montagem. A região de ligação homóloga (12

15 bp) está incluído no terminal 5 'de cada iniciador, e o Tm da região de ligação do modelo foi projetado para ser de aproximadamente 55 ° C

Construção de pUC19-UMCS-EGFP

Para demonstrar a prova de princípio, primeiro construímos dois tipos de vetores pUC19-UMCS-EGFP (Fig. 3) como ferramentas para estudar a eficiência de transformação. Esses vetores são versões modificadas do pUC19 porque o lacaA sequência Z foi substituída pela primeira vez por UMCS-XhoI sequências com diferentes locais de linearização (Saleu ou EcoRV, conforme mostrado na Fig. 3a e 3b), seguido pela inserção de EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) através de XhoDigestão baseada em I e ligadura. Entre eles, SalEu representei o produto linearizado com extremidades pegajosas, enquanto EcoRV representou extremidades cegas. Juntamente com os vetores linearizados por PCR, o efeito de diferentes métodos de linearização na transformação pode ser esclarecido. Durante a montagem in vivo, se o mCherry CDS for clonado com sucesso no UMCS, a colônia aparecerá em laranja. Caso contrário, será verde ou incolor (por montagem inespecífica). Calculando as colônias de laranja em relação ao número total de colônias, a proporção positiva de transformação pode ser determinada.

Representação esquemática de modelos de plasmídeo baseados em pUC19. Dois projetos diferentes do plasmídeo pUC19-UMCS-EGFP com Saleu ou EcoA sequência de reconhecimento de RV foi usada para digestão de extremidade pegajosa ou cega

Efeitos do método de linearização e comprimento do ligante homólogo

Em seguida, avaliamos os efeitos de diferentes métodos de linearização e o comprimento do ligante homólogo em termos do número de transformantes e a proporção positiva correspondente. Como mostrado na Fig. 4a, quando PCR foi usado como método de linearização, a eficiência de transformação mostrou uma correlação positiva com o comprimento da sequência de ligação. Quando um ligante de 6 pb foi usado, menos de 100 CFU / placa e uma proporção positiva abaixo de 10% foram confirmadas. Em contraste, a eficiência de transformação aumentou para 259 ± 34, 742 ± 132, 1306 ± 123 e 1525 ± 165 CFU / placa, e a razão positiva aumentou dramaticamente para 78 ± 4,2%, 96 ± 1,5%, 95 ± 1,7% e 97 ± 1,9% quando ligantes de 9, 12, 15 e 18 pb foram testados, respectivamente. É evidente que um ligante de 6 pb não é suficiente para a montagem bacteriana in vivo e um comprimento maior que 9 pb é necessário ao realizar tais experimentos. Além disso, não houve diferenças significativas entre o linker de 15 e 18 pb. Considerando o número de colônias e a razão positiva, concluímos que o comprimento do ligante homólogo para o método de PCR foi de 12

15 bp. Por outro lado, quando a linearização foi realizada por digestão de restrição, foi mostrado (Fig. 4b e 4c) que os vetores digeridos com extremidades rombas (EcoRV) rendeu clones muito mais positivos do que extremidades pegajosas em qualquer um dos comprimentos de linker que testamos. De acordo com os dados coletados, quando uma enzima de restrição foi usada para linearização, um 12

O ligante de 15 pb também garantiu transformantes e clones positivos suficientes para a triagem. Nestes casos, não é necessário aumentar ainda mais o comprimento do linker.

Efeitos do método de linearização e comprimento homólogo na eficiência de montagem. uma Eficiência de transformação (mostrada como CFU / placa e razão positiva de colônias) de pUC19-UMCS-S-EGFP linearizado por PCR com a sequência mCherry flanqueada por ligantes homólogos de 6, 9, 12, 15 e 18 pb (n = 4). b e c Eficiência de transformação de SalEu e EcoPUC19-UMCS-S-EGFP e pUC19-UMCS-E-EGFP digerido por RV com a sequência mCherry flanqueada por ligantes homólogos de 9, 12, 15 e 18 pb (n = 4)

Efeitos da relação inserção / vetor na transformação

A razão molar inserto / vetor é considerada um fator crítico para a transformação de alta eficiência [25]. Assim, investigamos ainda mais a influência da PCR, Saleu e EcoDigestão de RV na eficiência de transformação em vários níveis de inserção / vetor. Os rendimentos de transformantes e a razão positiva no comprimento do ligante de 15 pb foram determinados (Fig. 5 e Figura Suplementar S1) com razões molares de 1, 5, 10 e 15. De acordo com os dados mostrados, independentemente do método de linearização usado, a proporção molar ideal permaneceu em 5. Um aumento adicional no uso do inserto não melhorará os resultados, enquanto uma quantidade diminuída do inserto mostra um efeito negativo na eficiência da transformação. Portanto, usamos uma razão molar de 5 em todos os estudos subsequentes, o que é consistente com o achado de Kostylev et al. [26]

Efeitos da relação inserto / vetor na eficiência de montagem. Efeitos da razão molar de inserção / vetor na recombinação de pUC19-UMCS-S-EGFP linearizado por PCR (uma) ou SalEu digestão (b) com a sequência mCherry flanqueada por ligantes homólogos de 15 bp (n = 4)

Efeitos do método de linearização digestiva na fidelidade de montagem

Estávamos interessados ​​na fidelidade da montagem do método de linearização digestiva principalmente com base em três razões: (1) Embora as enzimas de alta fidelidade, como Q5, Phusion ou KOD tenham taxas de incompatibilidade extremamente baixas [27, 28] durante a reação, os produtos de PCR podem ainda sofrem de erros aleatórios introduzidos pela DNA polimerase. Além disso, a possibilidade de introdução de mutações aleatórias durante o processo de PCR aumenta com os ciclos de PCR e o comprimento dos vetores, sendo trabalhoso verificar por sequenciamento. (2) Alguns vetores são difíceis de amplificar por PCR. Por exemplo, o conteúdo de GC do vetor é muito alto ou muito baixo, ou o vetor contém muitas sequências repetitivas, o que afetará o PCR e até mesmo tornará a reação impossível de continuar [29,30,31]. (3) Como mencionado anteriormente, se os vetores não podem ser linearizados por PCR ou a fidelidade é vital para o experimento, os métodos mostrados na Fig. 6 devem ser aplicados. Sob tais circunstâncias, apenas as sequências que flanqueiam o local de linearização são usadas como ligantes homólogos para garantir a versatilidade do UMCS. No entanto, quando as sequências de flanqueamento (15 pb) foram usadas como ligantes homólogos, as bases residuais pós-digestão serviram então como sequências não homólogas. Isso significa que as bases residuais podem deslocar parte da inserção e causar mutações em seu terminal 5 ', terminal 3' (confirmado durante nosso estudo piloto), ou ambos. A frequência de tais eventos é uma grande preocupação para aplicações UMCS, uma vez que o UMCS só é universal quando essa frequência é baixa o suficiente.

Avaliação da fidelidade de montagem de vetores linearizados por digestão de restrição. uma Montagem esquemática de SalPUC19-UMCS-S-EGFP e mCherry CDS digerido por I com ligantes homólogos de 9, 12 e 15 pb. b Os cinco produtos de plasmídeo possíveis que podem ser observados após a transformação de vetores e inserções mencionados em (uma) Entre eles, se o terminal 3′ do mCherry CDS fosse substituído por parte do SalNa sequência de reconhecimento ("TCGAC"), o códon de parada da proteína mCherry seria então destruído, resultando na expressão da proteína de fusão mCherry-EGFP com uma cor amarela característica que pode ser contada com precisão. c Colônias com cores verde, laranja e amarelo podem ser observadas quando as células expressam diferentes proteínas fluorescentes. Observe que as células transformadas com o plasmídeo pUC19 (incolor) também foram espalhadas na placa como referência. d As colônias laranja e amarela contadas após a transformação de vetores e inserções mencionadas em (uma) A fidelidade do método pode ser calculada por um menos o número de colônias amarelas dividido pelo número de colônias laranja (n = 4). Eh Os outros experimentos e resultados seguem o mesmo procedimento descrito em (de Anúncios), exceto que o vetor foi linearizado por EcoDigestão de RV

Portanto, SalI (Fig. 6a-d) e EcoA digestão por RV (Fig. 6e-h) foi tomada como exemplos de extremidades pegajosas e cegas para avaliar a substituição de sequência entre a inserção e as bases residuais após a montagem. Conforme mostrado na Fig. 6, quando o mCherry CDS foi usado como uma inserção, cinco produtos possíveis poderiam ser esperados: (1) se a montagem falhar, a colônia aparecerá verde (apenas expressão de EGFP) (2) se os fragmentos forem montados com sucesso e o mCherry CDS permanece intacto, a colônia aparecerá laranja (apenas a expressão mCherry) (3) se montada com sucesso, mas o terminal 5′ do mCherry CDS é parcialmente substituído, a colônia aparecerá laranja (apenas a expressão mCherry) (4 ) se montada com sucesso, mas o terminal 3′ do mCherry CDS é parcialmente substituído, a colônia parece amarela pela perda do códon de parada mCherry (a proteína de fusão mCherry-EGFP é expressa) e (5) se montada com sucesso, enquanto ambos os terminais 5 'e 3' do mCherry CDS são parcialmente substituídos, a colônia também parece amarela (a proteína de fusão mCherry-EGFP é expressa). Para subclonagem, assumimos que os terminais 5′ e 3′ da inserção serão substituídos na mesma frequência, então a frequência pode ser derivada calculando o número de colônias amarelas em relação às laranja. Assim, a Fig. 6d sugere fortemente que a frequência de mutação no terminal 3 'da inserção é baixa quando SalI é usado para linearização vetorial. Na verdade, menos de 0,75% dos clones positivos continham substituição de sequência no terminal 3 'ou em ambos os terminais 5' e 3 '. Isso indica que a possibilidade de ter pelo menos um terminal mutado é inferior a 1,5% quando o comprimento do ligante é 12 ou 15 bp. Portanto, é muito improvável que alguém pegue um produto mutado por acaso. Além disso, quando EcoRV foi usado para linearização, a frequência de eventos de substituição parecia menor do que a de SalI por ter um valor estatístico inferior a 0,3% em ambos os ligantes de 12 e 15 pb. Em conclusão, após a digestão, as bases residuais afetaram ligeiramente a fidelidade de montagem (um mecanismo assumido de montagem bacteriana in vivo com regiões não homólogas é fornecido na Fig. Suplementar S2), mas a maioria das colônias positivas ainda continham o plasmídeo correto .

Construção de plasmídeo maior com base em UMCS

Para demonstrar ainda mais a versatilidade do UMCS, construímos quatro vetores adicionais contendo UMCS: (1) pET24a (+) - UMCS, o UMCS foi inserido entre os BamOi e XhoLocais de restrição I, resultando em um tamanho de plasmídeo de 5312 bp (2) pACT-UMCS e pBind-UMCS, o UMCS foi inserido entre o original BamOi e XbaI sites de restrição, o último “C” do BamA sequência de reconhecimento HI foi intencionalmente removida para garantir a expressão correta da inserção, resultando no tamanho do plasmídeo de 5578 e 6372 bp (3) pCold TF DNA-UMCS, o UMCS foi inserido entre o original Ndeeu e XbaLocais de restrição I, resultando em um tamanho de plasmídeo de 5757 pb. Juntamente com o pUC19-UMCS-S-EGFP que foi construído anteriormente, examinamos a eficiência de transformação da clonagem de mCherry (711 bp), RXRα (Retinóide X Receptor Alpha, 1389 bp) e p85α (Fosfoinositídeo 3-quinase p85α, 2175 bp) CDS nesses vetores. Durante esses experimentos, cada CDS mais uma região ligante homóloga de 15 pb (como mostrado na Fig. 3a) em ambos os terminais foi amplificado como inserção, cada transformação foi repetida quatro vezes e a PCR de colônia foi realizada em um painel de 24 colônias selecionadas aleatoriamente de cada transformação, seguida por análise de eletroforese em gel de agarose para identificar as colônias positivas e a proporção positiva em conformidade. Os resultados correspondentes são mostrados na Fig. 7. Em resumo, (1) independentemente do método de linearização que tentamos, o rendimento de transformantes diminuiu conforme o tamanho do plasmídeo final aumentou (2) se a PCR foi usada para linearização do vetor, não aparente correlações entre a razão positiva e o tamanho do plasmídeo foram observadas, e as razões positivas foram mantidas em um nível alto (& gt 85%) em todos os experimentos e (3) quando SalFoi utilizada digestão, a proporção positiva diminuiu com o aumento do tamanho do produto final. No entanto, em nosso estudo, essa relação sempre foi mantida em mais de 1/3, o que é suficiente para a triagem de clones positivos por PCR.

Teste de versatilidade adicional para UMCS. a-e A eficiência da montagem in vivo de acordo com 5 vetores diferentes baseados em UMCS e 3 inserções foi avaliada. Todas as combinações de vetor / inserção foram repetidas quatro vezes. Para cada transformação, 24 colônias foram escolhidas aleatoriamente para PCR de colônia e, em seguida, submetidas à análise de eletroforese em gel de agarose. Os produtos de PCR mostrando a mesma banda da inserção foram considerados positivos

Conjunto multi-fragmento

Semelhante aos experimentos de fragmento único, usamos mCherry, RXRα e RLuc (Renilla Luciferase) para o teste de montagem de vários fragmentos. Conforme apresentado na Fig. 8a, o terminal 5 'do primeiro fragmento e o terminal 3' do último fragmento devem ter sequências homólogas correspondentes ao UMCS. Os ligantes de outros fragmentos que precisam ser montados podem ser projetados de acordo com estudos anteriores [6]. Uma vez que a montagem de vários fragmentos reduz significativamente o rendimento de transformantes e clones positivos (Fig. 8b), recomenda-se a PCR como método de linearização ou desfosforilação após digestão enzimática. Enquanto isso, aumentar ainda mais a quantidade de DNA e o número de células componentes pode ser necessário para a montagem de mais de 3 fragmentos de inserção.

Montagem de vários fragmentos. uma Representação esquemática da avaliação de montagem de vários fragmentos. Usamos até 3 fragmentos de inserção diferentes para experimentos de montagem de vários fragmentos. Cada inserção tem uma concentração molar de 5 × do vetor linearizado de PCR. b Os efeitos do fragmento contam com a transformação. O número de transformantes e clones positivos diminui com um número crescente de fragmentos. Para cada transformação, 24 colônias foram escolhidas aleatoriamente para PCR de colônia e, em seguida, submetidas à análise de eletroforese em gel de agarose. Os produtos de PCR que mostram a mesma banda que a (s) inserção (ões) montada (s) foram considerados positivos


Problema de sequenciamento e restrição da digestão enzimática - (07/05/2013)

Olá a todos,
Atualmente recebo meu resultado de sequenciamento, mas encontrei alguns problemas com ele & # 33
Meu trabalho:
obter amostra de DNA - & gt sequência desejada amplificada por nossos primers - & gt executar gel para confirmar se o produto está correto ou não - & gt se correto, vá em frente com a digestão por enzima de restrição (plasmídeo e produto pcr) - & gt executar gel - & gt se correto, vá em frente com a ligação - & gt transformação - & gt escolha colônias - & gt purifique - & gt RE novamente (confirme se o plasmídeo absorve o DNA) - & gt sequenciamento

Minha sequência alvo deve estar em torno de 500b.p. No entanto, após a ligação, eu faço a transformação e a digestão com enzimas de restrição e, finalmente, a eletroforese em gel de agarose novamente, as bandas mostradas não eram de 500 b.p. Bandas em posições diferentes (M.W. baixo e M.w. Elevado) foram mostradas.

Algo contamina a amostra?

Por outro lado, gostaria de perguntar qual é a concentração ideal e a razão de OD para o plasmídeo? Obrigado & # 33

Olá a todos,
Atualmente recebo meu resultado de sequenciamento, mas encontrei alguns problemas com ele & # 33
Meu trabalho:
obter amostra de DNA - & gt sequência desejada amplificada por nossos primers - & gt executar gel para confirmar se o produto está correto ou não - & gt se correto, vá em frente com a digestão por enzima de restrição (plasmídeo e produto pcr) - & gt executar gel - & gt se correto, vá em frente com a ligação - & gt transformação - & gt escolha colônias - & gt purifique - & gt RE novamente (confirme se o plasmídeo absorve o DNA) - & gt sequenciamento

Em minha ligação, experimentei a proporção de 1: 1, 3: 1 de inserto para vetor.
As células competentes foram preparadas e utilizadas por todos os grupos de laboratório.

No entanto, após a transformação, encontramos poucas (1: 1) ou, na verdade, nenhuma colônia (3: 1) para a maioria das placas.
Eu pego uma das únicas colônias brancas e a uso para o processo posterior de digestão com enzimas de restrição.
O resultado da eletroforese em gel não foi bom. Minha sequência alvo deve estar em torno de 500b.p. As bandas mostradas não estavam em 500b.p. Bandas em posições diferentes (M.W. baixo e M.w. Elevado) foram mostradas.

Há algo de errado com nossa técnica de ligadura e transformação?
Por outro lado, gostaria de perguntar qual é a concentração ideal e a razão de OD para o plasmídeo? Obrigado & # 33

Você pode sequenciar diretamente do seu produto de PCR. Purifique o produto e adicione cada um dos dois primers separadamente. Com um fragmento de 500 bp, você provavelmente obterá cobertura completa.

O problema que você tem pode estar em muitos lugares. Existem 5 & # 39 bases fora de seu local de corte RE nos primers? Você purifica o produto de PCR antes da digestão de RE?

Qual é o seu plasmídeo? Existe algum sítio de restrição que você está usando no plasmídeo ou inserção? Quais são as enzimas? Algumas enzimas de restrição têm atividade estelar, se você incubar por muito tempo, isso cortará o DNA.

Devido à restrição de tempo e recursos limitados, não posso enviar meu produto de PCR direto para sequenciamento. No entanto, gostaria de descobrir por que meu resultado de sequenciamento é falso. Purifiquei meu produto antes do último RE. Em meu primeiro RE, a eletroforese em gel mostra que meu PCR e o plasmídeo foram cortados corretamente.

Meu plasmídeo é p-GEM-3z. Eu detonei os resultados do sequenciamento. Eu escolhi o gene humano mais semelhante para análise. Encontrei os locais de restrição usados ​​(bamh1 e ecor1) nesse gene. No entanto, o tamanho desta inserção (

1000b.p.) Não corresponde ao último resultado da eletroforese em gel (onde a banda foi encontrada em

A última enzima de restrição, devido a alguns erros, só incubou cerca de 2 horas e meia, inicialmente eram necessárias 4 horas.

Acho que depois de sequenciar sua inserção, você pode descobrir. Se as bases do sítio de restrição estiverem erradas, você pode não obter seu gene alvo após a digestão. A enzima adicionada à reação pode cortar a enzima presente no vetor pGEMT.

Enzima Gato# Temp NEBuffer fornecido Suplementos % De atividade no NEBuffer BSA SAM 1 2 3 4 BamHI * R0136 37 & degC NEBuffer 3 Sim Não 75 100 100 100 EcoRI * R0101 37 & degC NEBuffer EcoRI No No 100 100 100 100
Recomendação (ões) Double Digest para BamHI + EcoRI:

Observação: A recomendação acima é baseada nos resultados experimentais. Verifique os NEBuffers sugeridos para dupla digestão.
* BamHI tem uma versão de alta fidelidade (R3136)
EcoRI tem uma versão de alta fidelidade (R3101)
Enzimas de restrição de alta fidelidade (HF) foram projetadas para reduzir a atividade estelar
e ter 100% de atividade no buffer 4, o que pode simplificar sua dupla digestão.

christy na quarta-feira, 8 de maio 06:22:08 2013 disse:

Acho que depois de sequenciar sua inserção, você pode descobrir. Se as bases do sítio de restrição estiverem erradas, você pode não obter seu gene alvo após a digestão. A enzima adicionada à reação pode cortar a enzima presente no vetor pGEMT.

A sequência de controle A do resultado do sequenciamento é o vetor p-GEM.
Na sequência do promotor T7, eu explodo os resultados e não é semelhante ao vetor pGEM
Em minhas colônias, tanto brancas quanto colônias foram encontradas. Por que isso aconteceria ??

christy na quarta-feira, 8 de maio 06:23:46 2013 disse:

Enzima Gato# Temp NEBuffer fornecido Suplementos % De atividade no NEBuffer BSA SAM 1 2 3 4 BamHI * R0136 37 & degC NEBuffer 3 Sim Não 75 100 100 100 EcoRI * R0101 37 & degC NEBuffer EcoRI No No 100 100 100 100
Recomendação (ões) Double Digest para BamHI + EcoRI:

Obrigado por sua informação. Inicialmente, eu tendia a digerir por 4 horas a 37 graus Celsius. No entanto, devido a alguns erros, ele só foi digerido por 2 horas. isso levará aos resultados que descrevi? (muitas bandas de M.w. diferentes no meu gel). Obrigado

A maioria das digestões termina em 5 a 15 minutos. Eu nunca digiro mais do que 1 hora, geralmente por 30 minutos. Isso deve ter efeito zero em seu sequenciamento.


Módulo 1: Ferramentas de DNA e biotecnologia

Bem-vindo à palestra de hoje, vamos falar sobre ferramentas de DNA e clonagem de genes, então na aula anterior, você aprendeu sobre os conceitos teóricos da clonagem de DNA, hoje você se familiarizará com as várias etapas que estão envolvidas na execução Clonagem de DNA em configuração de laboratório, você também verá como um gene de interesse é inserido em um vetor, então ele é selecionado com base na presença de um gene de antibiótico. Então, vamos começar a sessão de demonstração de laboratório agora, Olá a todos, hoje vamos discutir sobre o fluxo de trabalho da clonagem molecular. A clonagem molecular tem alguns passos básicos que iremos seguir um por um, então, em primeiro lugar, o que estamos tentando fazer é introduzir um gene estranho em um organismo que normalmente chamamos de inserção, então este é o meu inserir amostra. Então, o que fazemos é pegar nosso DNA de inserção, introduzimos em uma molécula carreadora normalmente conhecida como vetor, portanto, o uso mais comum de vetores inclui plasmídeos, portanto, neste caso, estamos usando um DNA de plasmídeo ao qual vamos para introduzir um gene estranho a nossa inserção, embora sejam, como podemos saber, plasmídeos, eles ocorrem naturalmente em bactérias e ao longo dos anos foram feitos estudos, e você viu que esses plasmídeos também têm algum gene de resistência a antibióticos. Portanto, o que confere uma resistência contra antibiótico particular para a bactéria, então se uma bactéria cresceu sob essa condição de antibiótico, ela vai, ela vai ter seu crescimento não será afetado e vai crescer perfeitamente normal. Então, aqui nós temos um DNA vetor, temos nosso inserto, então para para introduzir meu inserto no vetor, então comecemos com o experimento, pegamos um DNA vetor também, temos um DNA inserido. O que vamos fazer é tratá-los com enzimas de restrição, enzimas de restrição vamos cortem esses DNA e eles vão criar pontas compatíveis, para que o insert e o vetor se juntem e formem uma estrutura perfeitamente circular. Então, vamos realizar a digestão de restrição separadamente para inserir um vetor, então o que precisamos O que fazer é primeiro pegar um vetor, depois adicionar o tampão de enzima de restrição que é necessário para a enzima realizar a digestão. Também adicionamos água para completar o volume e, na última etapa, adicionamos a enzima, geralmente enzima is added in a very small quantity, so I will use a different pipette for thatso, in this case we are using EcoR1 enzyme, so throughout the process we need to makesure that it is carried out using aseptic conditions, so the tip should we autoclaved ,tubes also should be sterile, at the same time we should carry out the entire reactionon ice.So, right now I have made the cocktail restriction digestion cocktail for the vector, I am goingto do the same thing for the insert and then we will keep the tubes at 37 degree whichis the optimum temperature for the enzymes to act.So, right now I am carrying a restriction digestion for the insert, so this is the insert,I am going to add the restriction buffer, so I am adding different volumes for eachof the components.And a ccordingly, I am adjusting the pipette as well, now I am adding water, so the lastthing is the enzyme, so I am going to vortex the tubes, so that the components are mixedproperly, then I am going to give them a short spin, so that whatever has stuck to the wallswill come down.Now, we will incubate the tubes at 37 degree for 1 hour.Now we will incubate the tubes at 37 degree.So, the incubation will be done for 1 hour, so after restriction, digestion has been performed.The next step is ligation of the 2 DNA’s, so we have our vector DNA as well as the insertDNA which has been cleaved by the restriction enzyme, so now we will join the 2 compatibleends using the ligase enzyme.So, here we have all the components of the reaction, first we will take rDNA, vectorDNA, then we will add the insert, so once we have added vector as well as insert, wewill add ligation buffer, so before adding anything, so we just need to pipette it alittle, you need to mix it a little bit.So, this is the ligation buf fer, I will give it a small vortex, I will add this to theligation makes now, the last thing to be added is the ligase enzyme again, we are using asmall pipette because we require very little quantity of the enzyme, I will give it a shortvortex again to the enzyme, now our ligation mix is ready, we will vortex it a little,followed by a short spin.Now, we will incubate this at room temperature for 3 hours.After ligation is done, the next step is transformation, so after ligation the vector and the insertthey form a covalently closed structure and this DNA molecule, the combined DNA moleculewe introduce into a host cell, so in this case you have taken DH5 alpha host cell, whichdoes not have any restriction enzyme, which will chop of any foreign DNA, so we will introduceour DNA into this host cell, so that it can propagate further.So, this step transformation is carried out inside the laminar hood under a sterile conditions,so inside the hood, we have sterile filters, which may keep the i nside air clean.So, before we start with the experiment, first we switch on the UV for 10 minutes, this stepensures that inside the conditions are extremely sterile, this step ensures that inside thelaminar hood conditions are extremely sterile under good for a work.So, after this we will switch off the UV and we switch on the fan and the light button.Now, we will carry out the transmission experiment, so we have our ligated sample, we will alsokeep a negative control water, so in all the experiments, we normally keep a negative control,so we have a competent cells which are the host cells in which we will introduce ourrecombinant molecule, in one of the tubes, we will add our recombinant molecule, in theother tube, we will add a negative control, water.This is our ligation mix which we will add in the competence cells, so now we will incubatethe tubes on ice for 30 minutes.Now, we will give the samples, heat shock treatment, so we will keep tubes at 42 degreeCelsius for 2 minutes.This heat shock treatment helps the host cell to get the foreign DNA this heat shock treatmenthelps the foreign DNA to get introduced inside the host cell.So, now we will perform the plating, so as we can see, we already have plates LB agarplates.These plates, they have a lot of components, which will help the bacteria to grow additionally,we have added the antibiotic ampicillin because a vector, the plasmid DNA has ampicillin resistantgene, so that when we will plate our ligated product onto this, only those colonies willshow up which have our vector.So, for 1 plate, I will be using the ligated sample which has been transformed into theDH5 alpha host cell.For the other plate, I will use the negative control which has been given the same treatmentas our ligated product, so I will take the sample, so I will add the sample in drops,so this is the spreader which I am going to use for plating, so this spreader is alreadydipped in ethanol, so that all the microorganisms if any will get killed, so I will put it toflame, so that the alcohol evaporates, I will wait for the spreader, spreader’s temperatureto get down.Because if it is too hot, it may kill my DNA sample as well, I can touch it here, so thatit becomes cool now, I will start plating, so I will be doing the plating in circularmotions, so that the sample is spreaded uniformly, I will do it till a point where I feel thatthe entire sample is spread uniformly and when the agar seems to look a little dry andthere is some friction at that point I will stop.One needs to ensure that we do not presser too hard else we may end up breaking the agarplate as well, I will show the lid some flame and I will keep it back, I will label my plate.Next, I will plate the negative control sample which is nothing but water, so normally wekeep the plates this way upside down otherwise, if we keep them like this, they sometimesbecause of the loose ends, we may end up having some sort of contamination, so usually wekeep upside down.Right now, I have done plating, so for some time I will keep it like this, straight way,later I will keep it upside down as well.Now, I will take my now I will take the negative control sample again, I will add in the formof little drops, spread it uniformly, I will show my spreader flame, I will wait for fewseconds for the spreader, for the spreader’s temperature to come down, this is how my platelooks like.Now, I have started feeling some friction on the plate, so if I poke it further, itmay break, so at this point, I will stop, now I will take my plates and I will keepthem in the incubator.So, these are the plates which I will keep in the incubator for overnight incubation,so as you can see the temperature ranges from 37 to 38 which is ideal for the bacteria togrow.I can show you another plate, which we have already done transformation yesterday andhow a transform plate looks like.So, this is a transform plate which has a lot of colonies inside, so this in this caseof transformation efficienc y has been very good.In some cases, we do not get as many colonies, so right now, we have kept 2 plates in one,we hope that we have a good transformation efficiency and in the second plate, we shouldexpected to be blind because at it is just water to ensure that our experiments are absolutelyfine and there is no contamination.So, once you have obtained the colonies we need to be sure whether these colonies reflectedto recombinant molecule because as you know once we have done restriction digestion, wecan get different kinds of products.It may happen that during ligation, the vector itself ligates and have a self ligated moleculeor it may happen that there is only the insert that has transformed into the host cell, sowe need to be sure whether these colonies actually have a recombinant molecule, so onething we are sure that there is no insert here because the vector has antibiotic resistanceseen and here, in the media we have an antibiotic ampicillin.So, only those colonies which have t he vector will grow on these, now those colonies canbe the self ligated vector or they can be the recombinant molecule having the insert,for that we will take these colonies, so for that we will take these colonies, we willgrow them, we will isolate the plasmid and we will check their size, so this is the LBmedia, this is the same media which has been, which is already you know in the solidifiedform in this agar plate.So, this LB media has all the components, which is required by the bacteria to grow,so we will pick up a colony, we will added in these LB media, we will also add our antibiotic,the antibiotic for which the resistant gene is already present on the vector, so thatonly our vector grows, no other contamination is seen.So, we will first add the antibiotic this is our antibiotic ampicillin, everything weare doing near the flame, so that there is no contamination, there is no chance of anycontamination now, I will pick up a colony, this again we will incubate at 37 for overnigh talmost 16 hours.So, this is the shaking incubator in which I will keep this tube for overnight incubation.So, you can see the temperature set is 37 which are ideal for the bacterial growth.So, this is how a bacteria culture looks like, you can see it is very turbid and after thisis a sign that the bacteria has grown properly overnight, so this is the tube which we havejust kept for the overnight incubation, you case see the colour of the tube, it is, itis not so turbid, it is transparent but after the grow this is how it looks like.So, in conclusion, I hope now your concepts for the gene cloning is much better and muchclearer now.As I have just seen the lab demonstration session with the advent of technological advancement,the genetic engineering can be performed in a laboratory set up with great ease now, whyit might you know look a straightforward but the cloning a gene often involves you knowlot of thought process and the whole parameter optimisation may take several months timeto really obtain the correct clone.And then you have to ensure that you know the sequence is correct and it is not self-ligatedvector, what you obtain is the right gene of interest which you started with, so ofcourse, the process is straightforward and much simpler but to actually obtain a rightclone in frame does need you know good listener operating protocols and sometime you knowgood experience of knowing the concepts involved in genetic engineering.So, I hope you enjoyed the lab session and we will continue our interactions and discussionabout gene cloning in the next lecture as well, thank you.

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Picking up Plasmid DNA using Nanodrop, but not using Electrophoresis - Biology






The First International Workshop at

Cairo University Research Park
Application of Genetic Engineering in Biotechnology
Genetic engineering techniques have been applied in numerous fields including research, agriculture, industrial biotechnology, and medicine. Enzymes used in laundry detergent and medicines such as insulin and human growth hormone are now manufactured in GM cells, experimental GM cell lines and GM animals such as mice are being used for research purposes, and genetically modified crops have been commercialized.
It is a pleasure to announce that Cairo University Research Park (CURP) will launch a Genetic Engineering Workshop to attract applicants with highest intellectual and scientific skills in the area of biology. This workshop combines the opportunities to perform the latest, as well as commonly used molecular biology techniques for cloning of genes, sequencing, and sequence analysis with gene expression particular attention to the principles underlying each technique.
This workshop will be held from Aug 17th to Sep 5th, 2013 and carried out by the Molecular Genetics Group at Cairo University Research Park.
This workshop's hands-on activities were including:
· Isolation of total RNA and purify the mRNA.
· Construction of cDNA library.
· Gene cloning: specific gene and cDNA library construction.
· Cloning of PCR product in bacterial plasmid.
· Transformation in bacterial cells.
· Colony pick up and colony PCR.
· DNA plasmid extraction.
· Digestion DNA with restriction enzymes.
· DNA gel electrophoresis and data analysis.
· Isolation of novel tissue-specific genes from cDNA libraries.
· DNA sequencing & DNA fingerprinting.
· Gene expression analysis using microarray.
· Single-cell analysis of gene expression by fluorescence microscopy.
· Genomics and bioinformatics.
· Protein expression analysis (Western Blotting and ELISA).
No previous experience in molecular biology is required or expected. Twenty participants will be selected from a variety of disciplines and academic backgrounds, including principal investigators, directors of programs, medical doctors, postdoctoral fellows, graduate students, research assistants, sales associates, equipment engineers, etc.
The three-week long courses cover in-depth DNA cloning, PCR, DNA sequencing, genomics and bioinformatics and gene expression. Learn hands-on techniques used in gene expression analysis including, quantitative RT-PCR, bioinformatics and genomics and protein expression.
Registration deadline is Thursday, July 20th 2013.
Enrollment is limited to 20 participants.
Registration is open to all Nile River and Middle East Countries. Notification of acceptance will be emailed on July 22nd, 2013. Please register only if you are able to attend the entire workshop. Registrants must mail in a reservation check for $100 to guarantee space in the workshop. It will be held and returned at the workshop, but will be forfeited for no-shows. Mail checks to: Faculty of Agriculture Bank Account. You will not be considered for attendance if we do not receive your check.



Organizer:


Picking up Plasmid DNA using Nanodrop, but not using Electrophoresis - Biology

On our homepage, click on the Order or Login tab. Then under the log in box, click Register, fill in the new user registration form, then click Register User at the bottom of the page. You will now be able to log into our website, manage your account, and place orders.

What are the steps for DNA sequencing?

If you want to place an order for our DNA sequencing service, first you will need to make sure you have created an account on our website. Once you are logged into your account, you can fill an online order form, or import the order information from an Excel file.

For your sample, you will want to follow our Sample Preparation Guidelines.

Once your samples are prepared, you can ship your order to our facilities on the west or east coast. We also offer free local pickups in the Bay Area, Boston, Colorado, and Wisconsin. Contact us for our local pickup schedule and locations.

Why should I use Quintara Bio?

Quintara Bio is continuously striving to provide the highest quality DNA sequencing service, fastest turnaround times, and overall value for our customers. Our experienced staff and state-of-the-art equipment run 24/7 to provide you with the superior results you deserve and optimize the most complex reactions.

Other companies may offer lower prices for similar sequencing, but they can only do so by cutting corners, using cheap reagents, and offering no Quality Control. All too often mistakes on their part will leave you with the wrong data, or have you wasting time solving their issues by yourself.

How can I test your service?

We offer 5 free reactions to all new customers that want to try our DNA sequencing service. Just set up an online account, submit an order, and experience the quality Quintara Bio provides.

What equipment do you use?

We use ABI 3730xl DNA Analyzers, the Gold Standard for high throughput genetic analysis. Along with our experienced technicians and QC staff, we deliver the highest quality data.

What is the price?

Our general pricing for our DNA sequencing services can be found on the DNA sequencing service page. We offer many academic and regional discounts, please contact our sales team for a more accurate quote based on your specific order.

What kind of QC do you offer?

We provide two tiers of QC, first our proprietary analytical software will check for all basic parameters of the reactions, and then the QC manager will go through each reaction in trouble shooting for reactions that are not optimal, and you will receive a personalized summary of your order. We will work closely with you to optimize any reaction that you need. Visit our Data Sample page to see the value in our service.

How do I confirm my order was placed?

Once you place your online order you will receive an automated message that will confirm your order. However if you feel the need to double check, feel free to contact us by phone or email and we are happy to ensure your order confirmation.

Can I open an account and submit samples if I live outside the US?

Of course, we serve customers from all over the globe. When you set up your online account, under the State tab, just leave it blank. Ship your samples to our Boston or San Francisco laboratory, and receive your data online.

Hours and holiday schedule?

Our CA Bay Area lab open 24 hours Monday through Saturday every week, and our Boston facility processes orders 7 days a week. Here is our holiday schedule through the year.

  • Dia de Ano Novo
  • President's Day
  • dia Memorial
  • Dia da Independência
  • Dia de trabalho
  • Ação de graças
  • dia de Natal

Where and when are the pickups?

Our pickup schedule varies by territory. We offer free sample pickups in Boston metropolitan area, the San Francisco Bay Area, Denver, Fort Collins, Boulder, and Aurora, CO, Madison, WI, and Indianapolis, IN. Please contact us by email or phone to find out the schedule by territory.

How should I prepare the samples?

To properly prepare your samples for sequencing, please follow our guideline here.

How do I prepare my samples so I will get the best DNA sequencing results?

To improve the sequencing results of your samples, ensure that all information on the sample sheet is correct, and include any important information, e.g. hairpins or high Tm primers. In the event some reactions fail, providing excess sample can improve the turnaround time for repeat reactions.

What types of DNA templates can be sequenced?

We accept plasmids, purified and unpurified PCR, cosmid, BAC samples, and we will accept agar plates with bacterial colonies and bacterial cultures to purify the samples at our lab.

May I submit 8-strip tubes if I am submitting less than 8 samples?

Of course, we encourage the use of strip tubes over individual tubes regardless of the amount of samples.

Can you sequence very short (

Yes, however we recommend sequencing PCR products that are at least 200 bp.

Can you help me if I my sequence is GC-rich and difficult to amplify?

Our experts will work closely with you to optimize complex GC-rich samples, and troubleshoot using proprietary protocols specifically designed for such cases.

How much DNA and primer should I submit?

It will depend on the type of DNA template and the size of the sample, please use our chart for submission guidelines. If you are submitting primers, the recommend concentrations can be found on the same chart.

How long do you keep the samples?

We store all samples for one month after sequencing. We also store customer primers free of charge until completely finished.

How should I label my 8-strip tubes?

Please label each strip with your initials, and sample number on the side of each tube. We also recommend labeling the top of the tubes.

What do I need to provide for you to perform PCR cleanup on my samples?

Just submit your unpurified PCR products with primers in separate labeled tubes. We will perform the clean-up, run each samples on gel, then optimize and sequence each reaction.

Does my vector have a binding site for a universal primer?

Please look at your vector map or the manufacturer’s procedure to see which primer site is present or what primer is recommended for sequencing. We offer 5000+ free primers, check here for a list of our primers.

How do I determine my DNA concentration?

We recommend using gel electrophoresis or a spectrophotometer. If using a spectrophotometer like a NanoDrop, check the A260/A280 to ensure your sample is not contaminated.

What is the primer storage policy?

We will store all of the primers you send us free of charge upon request to use for future orders.

What tips do you have for designing primers?

It is ideal to design primers that have a GC content of 40-60% and Tm of 50-60 o C.

Can you design and order primers for me?

We are happy to work with you to design primers to optimize your sequencing. We will also order your primers for you free of charge from IDT just contact us at [email protected] for more info.

Where do I get primers?

We are working towards synthesizing own custom oligomers. However IDT is a great source for ordering the primers you need.

What universal primers do you have?

We offer 5000+ free primers, check here for a list of our universal primers.

What amount of primer is needed?

It will depend on the number of reactions that primer is being used for, but we will need at least 1 uL with 30ng/uL or higher concentration per reaction.

How soon can I get the sequencing results?

Once we receive the samples in our lab, the average turnaround is 8 hours to complete the sequencing. It will depend on your location for the exact data delivery time, but in most cases it will be next morning delivery. We also offer an express service if you are in a rush, contact us for more info.

How do I get the results?

Data is automatically emailed once the sequencing is complete, then run through our rigorous QC procedure. You can directly download your data in a secure attachment, and you will receive a custom sequence summary from a member of our QC team.

How do I view the sequencing data?

In order to view chromatogram files, you will need to download a suitable viewer (check here). The sequence .txt file can be read with any available text software such as Microsoft Word or Notepad.

What’s the average read length?

The average read length for the sequencing instrument is 800-1000bp. For longer reads ask us about our primer walking service

How come the repeats work when there were no changes to the samples or primer?

There are always possibilities for machine or human error, however we do often change the conditions of failed reaction based on our interpretation of the original results. Please contact us if you have specific questions regarding a particular order.

What should I do about failed reactions?

There are many reasons a reaction could fail. Our QC team will closely analyze your data, and suggest the most probable reason for the reactions that failed and the best course of action, either rerun the sample, or repeat the entire reaction.

What is your repeat policy?

We will optimize samples from orders that didn’t sequence correctly and rerun them later that day. If a reaction needs to be repeated from scratch due to an error on our part, it will be done free of charge. We will ask if you want to rerun any other incomplete reactions.

Why did my reactions fail?

There are many possibilities for failed reactions, and our dedicated QC team will examine each failed reaction to determine the most likely reason for each failed reaction, and relay their findings in their personalized order summary.

What does a poly A-T region resulting in poor sequencing mean?

If a DNA sample contains a homopolymeric region such as poly A, 5 or more in concession, the enzyme can slip from the strand and result in a bad read. We would then recommend sequencing the DNA in the opposite direction to improve results.

How can I optimize my reactions?

It will largely depend on what was the reason for the poor results. We will recommend the best options for optimization based on our expertise, and work closely with you to sequence the most complex reactions.

Do you still have my template from order #?

Please email us your specific order numbers, and we will quickly get back to you informing you if we still have the sample. We typically store all samples for one month.

Who should I talk to in regards to my invoice?

Please contact us by phone (1-415-738-2509) or email([email protected]) if you have any questions about your invoice.

How can I pay for the service?

We accept payment by credit card or Purchase Order (PO). Include the PO# for your group or institution in account info.

I have an order to pick up, not an online order.

We prefer our customers to place their orders online, however if you normally submit orders offline, contact your regional account manager to arrange a pick up.

How do I know if my sample is picked up?

If you submitted your sample after the pickup time, it may not have been picked up. Please contact our lab and we will gladly check for you if we have received your samples.

I missed the drop off time can you pick up my sample?

If you have missed your local drop-off time, we may still be able to pick it up for you. Call or email the local manager, and we will try our best to arrange a pick up.


For the Student:

1. Pick up two clean microfuge tubes. Label one “P+” and the other “P-.”

2. Pick up a Styrofoam cup with crushed ice and place one tube containing 100 μL of competent cells into the ice. It’s important that the cells remain at 0°C. Also, place your P+ and P- tubes into the ice.

3. Pick up your ligated plasmids from the microfuge tube rack labeled “LIG tubes.” Your “LIG” tube should be labeled with your group number and class period.

4. Set the P-200 pipettor to 50 μL (set to “0-5-0”) and place a clean tip onto its barrel. Very carefully resuspend the cells by gently pumping the cells in and out two times. Hold the tube by the upper rim to avoid warming the cells with your fingers.

5. Aliquot 50 μL of the resuspended cells into the prechilled P+ and P- microfuge tubes. Immediately return the aliquoted cells to the wet ice. Hold the tubes by the upper rim to avoid warming the cells with your fingers.

6. Using the P-20 pipette, add 10 μL of your ligated plasmid to the tube labeled “P+.” Gently mix the plasmid with the cell suspension by pumping the cell suspension two times. Immediately return the P+ tube into the ice. Do not add plasmid to the P– tube. The cells in this tube will serve as the “plasmid control.”

7. Keep the cells in ice for 15 minutes.

8. While the cells are incubating in ice, obtain the following: One each of these agar plates: LB, LB/amp (LB + ampicillin) and LB/amp/ara (LB + amp + arabinose)

9. Label the bottoms (plate containing the agar) of all three plates with your group number and class period. Write small and on the edge of the plate. Then divide the LB and amp plates down the middle using two lines. Label one half of each plate “P+” and the other half with a “P-.” See the diagram below. Do not divide the ara plate.

10. Following the 15-minute incubation in ice, carry the ice cup containing the cells to the 42°C water bath. Take the tubes from the ice and hold them in the water bath for 45 seconds. After the 45-second heat shock, place them back into the wet ice immediately for at least one minute.

11. After one minute, use the P-200 pipette to add 150 μL (set to “1-5-0”) of LB broth to the P- tube. Cap the tube and gently flick the lower portion of the tube two or three times to mix.

12. Use a new tip and transfer 150 μL of LB broth to the P+ tube. Close the cap and gently flick the tube to mix.

13. Obtain one package of sterile cell spreaders from your teacher. You are now ready to spread your bacterial cells onto the sterile agar plates.

14. Using the P-200 pipette (set to “0-5-0”), gently pump the pipette two or three times to resuspend the cells then aspirate 50 μL of cells from the P- tube. Open the lid from the LB plate like a “clamshell.” Dispense these cells on the half of the plate marked “P-.” Close the lid.

15. Resuspend the cells by gently pumping the pipette then aspirate a second 50 μL aliquot for the LB/amp plate. Remember, you want to deposit the P– cells on the half of the plate you labeled “P-.” Cover the plate.

16. Open the package of sterile cell spreaders at the end closest to the spreader handles. You will share this package with another group. Remove only one spreader, keeping the others sterile. Hold the spreader by the handle and do not allow the bent end to touch any surface, as this will contaminate the spreader. Close the package to avoid contaminating any of the other spreaders.

17. Open the lid to the LB plate, like a clamshell, and gently using a light, gliding motion spread the cells across the surface of the agar, keeping the cells on the P– side of the plate. Try to spread them evenly and along the sides of the plate as well. Carefully spread the P- cells on the LB/amp plate using the same spreader and technique. Place the used spreader into the biohazard bag.

18. Repeat steps 14 thru 17 to inoculate the LB and LB/amp plates with the P+ culture. Be certain to use the “+” pipette and a new spreader to avoid contamination.

19. Now you’re ready to inoculate the LB/amp/ara plate! Using the P-200 pipette (set to “1-0-0”), transfer 100 μL of the P+ culture onto the surface of the LB/amp/ara plate. Deposit the 100μL of cells on several areas across the agar surface rather than a single spot. Lift the lid, clamshell style, and spread the cells evenly over the surface of the plate. Gently rotate the plate beneath the P+ spreader so that the cells can be spread over the entire surface of this plate. Try to get the cells spread along the wall of the plate as well. Cover the plate when finished.

20. Allow all three plates to sit right-side up for five minutes.

21. Using colored tape, tape all three plates together and place them in the incubator, gel-side up. Be certain that you have clearly labeled your plates with your group number and class period. You can mark the tape to help you find them for the next lab.

22. Discard cell-contaminated waste: spreaders, cell tubes, pipette tips, by placing them into the cell-contaminated waste bag provided by your teacher.


Kandace's Biology Blog

Questions Regarding GATTACA!
1. The following terms were used in the movie. How do they relate to the words we use: degenerate and invalid?
De-gene-erate: What a god child is called
In-valid: The type of person that wasn’t made
Borrowed Ladder: A person that you disguise yourself as

2. Why do you think Vincent left his family, tearing his picture out of the family photo, after winning the swimming race against his brother?
I think he finally left the family so he could start his life over in a sense and prove his point to his brother that he could do whatever he set his mind too even though he was different. However after he finished that he seemed to have the strength to move on with his life, and finish things he thrived to do.

3. Describe the relationship between Vincent and Anton.
Vincent and Anton, were brothers in this movie. They were extremely competitive with one another. Both of the two were always trying to be better than the other at multiple things. Anton just happened to be the detective in Vincent's case which added to this sibling rivalry.

4. When Jerome Morrow said to Vincent/Jerome, “They’re not looking for you. When they look at you, they only see me,” what did he mean? Can you find any parallels to this type of situation in real life?
What he meant by this situation was that technically speaking Vincent no longer existed now that Jerome had become what Vincent once was. Therefor no one realized that Jerome was around because the connection between the two was never made. Also this conversation could have meant that being accused of things would no longer happen to Vincent because his record show him as another person. I would say that the parallel in this situation is when Jerome hears something about his old self. He would more than likely become nervous because he is still the same person overall.

5. Choose your favorite character from the film. Explain why you choose that person. Would you want to be that person? Porque? Por que não?
My favorite character in GATTACA would have to have been Vincent. In my opinion he was the most prominant character with an idea and a mission, which added to the excitement of his character. Also he was very determined to accomplish certain activities and that drive was a great characteristic to me. However I did feel bad for him since he had to change his identity.

6. At the end of the film, you are told that the Doctor knew about Vincent all along. Why did the Doctor go along with the fraud? What would you have done if you were the Doctor?
I would have to say that the doctor went along with the deception the whole time because he was on Vincent's side and he wanted him to accomplish what he set out to do. Personally I would probably have went along with it as well because I wouldn't want to rat someone out that had worked so hard to be an achiever.

7. The technology to do what was done in the movie is definitely possible within the next fifty years. Do you think that Vincent’s world could eventually happen in America? Porque?
I don't think this would necessarily happen in America because we have rights within the government. I'm sure throughout the years this process could happen, especially with how fast our technology changes, so I wouldn't doubt it occurring, but I don't believe it will be that popular in America.

8. What do you think is wrong with the society portrayed in "GATTACA"? What is right?
I don't believe anything was necessarily right in this movie. The whole point of the parents choosing how the baby would be was in my opinion wrong. You should love the baby you conceive without changing it. The discrimination that was presented against the "invalid" ones, was ridiculous to me. After all nothing is perfect. To me it seemed like if you weren't perfect than you weren't good enough and I really disliked that situation.

9. What were the screenwriters trying to tell us through the episode of the 12-fingered pianist? Is anything wrong with engineering children to have 12 fingers if, as a result, they will be able to make extraordinarily beautiful music?
I believe the screenwriters were trying to say that people would start trying to engineer children to be good at certain things and succeed in them, which is obviously wrong because its what the parents want not the children.

10. You and your spouse are having a child and are at the Genetic Clinic pictured in the movie. What characteristics would you want for your child and what would you ask to be excluded? Why would you make those choices?
Normally I woul say that there is no way I would go to a clinic sugh as this because of the ways they discriminate against babies that are yet to even be born. But if I had to choose I would want them to be very athletic, tall and smart. However I would take out my families "mole" gene from the sequence.

11. Picture yourself as either Vincent, Jerome, or Anton. Would you have acted the same or done things differently if you were in the same world as them?
I probably would've acted the same as they all had. Each of them handled each situation in the best way that they could and I don't think anyone should doubt them about their actions. However I would not have committed suicide like Jerome did.


12. How does the society in GATTACA resemble the type of society America was during the height of the eugenics movement?
People were extremely anxious and excited about being able to create their own baby and help make them "better" in their eyes which is just like in GATTACA. However in GATTACA the clinic babies were the only ones who were accepted for the eugenics experiment.

Overall I enjoyed the parts and pieces I seen to the GATTACA movie. It was a very different movie, but it taught me a lot about eugenics. However I hope America never turns into a country where we create our children instead of just conceiving them naturally.