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Análise downstream após RNAseq de patógeno in vivo

Análise downstream após RNAseq de patógeno in vivo



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Realizamos RNA-Seq de amostras bacterianas in vivo e identificamos algumas vias reguladas para cima e para baixo.

Comparamos as bactérias durante a infecção com a placa de ágar convencional.

Quais poderiam ser os próximos passos para validar nossas descobertas? Estamos interessados ​​no desenvolvimento de antibióticos e vacinas.


Ok, primeiro, eu diria a todos que estão planejando um experimento de alto rendimento: primeiro a hipótese, então experimentar. Caso contrário, você está configurando um teste caro e demorado que não responderá às perguntas que você deseja.

Nesse caso, a pergunta que seu experimento deve responder é "Quais genes são cruciais para o crescimento in vivo que não são cruciais para o crescimento em uma placa?", Que provavelmente não é o modelo mais claro para o projeto de vacina / antibiótico.

Eu acho que você poderia dizer que uma diferença entre a amostra da placa e a amostra in vivo é a presença de um hospedeiro e, portanto, é possível que as vias reguladas positivamente representem a adaptação da bactéria ao hospedeiro, e talvez você possa atacar a bactéria atacando sua capacidade de colonizar O hospedeiro. Um gene envolvido na evasão imunológica pode ser um bom alvo.

(Esse é um modelo muito confuso, pois há toneladas de outras diferenças acontecendo, mas como você já executou o experimento, é provavelmente o melhor que você tem.)

Então, use seus dados para uma nova rodada de geração de hipóteses. Pegue seus caminhos e encontre uma maneira que eles possam permitir que a bactéria se adapte ao hospedeiro - talvez uma via secretora que possa estar interferindo com o sistema imunológico alvo, ou algumas moléculas de sinalização de membrana que são reguladas positivamente, ou o que quer que seja.

Agora que você tem uma hipótese, planeje um experimento. Por exemplo, pegue um membro-chave regulado positivamente de um caminho. A hipótese é que é crucial para o crescimento em um hospedeiro, mas não para o crescimento em geral. Então, derrube-o, seja com inibidores químicos ou com edição genômica, e veja se ele é menos eficaz na colonização do hospedeiro.

(Embora a eficácia da colonização do hospedeiro seja muito difícil de medir eticamente se o seu organismo-alvo for humano. Mas você tem algum tipo de proxy ou sistema de modelo para medir isso, certo?)


RNA-seq: da tecnologia à biologia

As tecnologias de sequenciamento de próxima geração estão sendo exploradas não apenas para analisar genomas estáticos, mas também transcriptomas dinâmicos em uma abordagem denominada RNA-seq. Embora essas tecnologias poderosas e em rápida evolução estejam disponíveis há apenas alguns anos, elas já estão fazendo contribuições substanciais para a nossa compreensão da expressão e regulação do genoma. Aqui, descrevemos brevemente os problemas técnicos que acompanham a geração e análise de dados de RNA-seq, destacando as diferenças nas abordagens baseadas em array. Em seguida, revisamos as percepções biológicas recentes obtidas com a aplicação de RNA-seq e abordagens relacionadas a transcriptomas de amostras profundas em diferentes tipos de células ou condições fisiológicas. Essas abordagens estão fornecendo informações fascinantes sobre a regulação gênica transcricional e pós-transcricional e também fornecem uma visão única sobre a riqueza das estruturas de transcrição e do processamento em escala global e em resolução sem precedentes.


Introdução

Os experimentos de transcriptômica medem as assinaturas transcricionais subjacentes responsáveis ​​pelos fenótipos observados [1,2,3]. Ao avaliar os perfis de mRNA, é possível interrogar os processos genéticos específicos subjacentes e dando origem a fenótipos específicos de interesse. O uso da transcriptômica se expandiu para avaliar o perfil transcricional de outras populações de RNA [4], como rRNAs [5], miRNAs [6,7,8], tRNAs [9, 10] e outros pequenos RNAs [11,12 , 13,14]. As análises transcriptômicas tradicionais geralmente identificam alterações transcricionais em um único organismo. No entanto, os processos biológicos frequentemente envolvem as interações de múltiplos organismos, e questionar o perfil transcricional de apenas um organismo de um sistema de múltiplos organismos é insuficiente para compreender completamente o sistema biológico. Isso é especialmente importante no contexto das interações patógeno-hospedeiro, em que uma visão holística do sistema biológico pode auxiliar na melhor compreensão do sistema de formas a fornecer alteração, como o desenvolvimento de novas terapêuticas de tratamento. Mas também é importante no estudo de sistemas hospedeiro-endossimbionte. Para resolver isso, os pesquisadores desenvolveram métodos para interrogar o transcriptoma de vários organismos a partir de uma única amostra. A transcriptômica de espécies duplas ou estudos de seq de RNA duplo usam a transcriptômica para avaliar os perfis transcricionais de múltiplos organismos originários da mesma amostra [15].

Os primeiros estudos de transcriptômica de duas espécies foram usados ​​para analisar as interações entre os organismos eucarióticos e procarióticos em sistemas hospedeiro-patógeno [16,17,18,19]. No entanto, em comparação com estudos de transcriptômica típicos, estudos de transcriptômica de duas espécies são tecnicamente desafiadores devido a uma diferença na proporção de leituras dos organismos principais e secundários no sistema, onde principais e secundários se referem à abundância de transcritos. Os organismos estudados em experimentos transcriptômicos de duas espécies estão presentes em diferentes abundâncias relativas e, embora as proporções de leitura entre os dois organismos difiram por sistema, a maioria dos modelos de infecção, particularmente modelos biologicamente relevantes, têm o conteúdo de RNA total do micróbio hospedeiro muito superior ao número [15 ] Nos casos em que o número de células microbianas é mais limitado, os métodos de enriquecimento são necessários para derivar um número significativo de leituras do organismo menor para análises estatisticamente robustas. À medida que os métodos de enriquecimento da biblioteca melhoraram, os estudos de transcriptômica de duas espécies se expandiram para incluir o estudo dos sistemas eucarioto-eucarioto e procarioto-procarioto. Como exemplo, a transcriptômica de duas espécies tem sido usada para estudar interações de fungos com numerosos mamíferos e plantas [20,21,22,23,24,25]. Em sistemas procariotos-procariontes, a transcriptômica de duas espécies tem sido usada para estudar perfis de transcrição em interações de biofilme procarióticos [26]. Mais recentemente, experimentos de transcriptômica multiespécies foram conduzidos examinando as interações bactérias-eucariotos-eucariotos em um sistema endossimbionte-parasita-vetor [27]. Com essa complexidade crescente, as melhores práticas são necessárias para projetar e conduzir adequadamente uma análise de expressão diferencial em um experimento de transcriptômica multiespécies.

Aqui, descrevemos as melhores práticas para experimentos de transcriptômica multiespécies, desde o projeto experimental inicial até a análise de expressão diferencial a jusante, destacando considerações importantes que devem ser tomadas para essas análises multiespécies quando comparadas às análises transcriptômicas de espécies únicas tradicionais. Embora observemos os kits e ferramentas disponíveis atualmente para cada etapa da análise, nosso objetivo aqui não é fornecer uma lista abrangente de ferramentas para cada tarefa nem definir a melhor ferramenta. Semelhante aos estudos anteriores de melhores práticas de transcriptômica [28, 29], nosso objetivo é fornecer um guia para a realização de um estudo transcriptômico multiespécies do início ao fim, destacando considerações específicas para estudos transcriptômicos multiespécies.


3. RESULTADOS

3.1 Geração de conjuntos de dados simulados

Simulamos conjuntos de dados seq de RNA duplo para investigar se e como seq de RNA duplo pode ser utilizado em sistemas patógenos hospedeiros nos quais os recursos genômicos são limitados. Conjuntos de dados simulados representaram uma combinação fatorial de comprimento de leitura (76 bp vs. 150 bp), configuração de sequenciamento (emparelhada ou de terminação única) e 12 proporções diferentes de leituras de host para leituras de patógenos. No total, 48 conjuntos de dados seq de RNA duplo, cada um com 10 milhões de leituras, foram simulados. Da mesma forma, simulamos conjuntos de dados seq de RNA duplo para Homo sapiens e Candida albicans, e Homo sapiens e Escherichia coli, também com proporções variáveis ​​de leituras de patógenos para leituras de host. Vamos primeiro discutir os principais resultados do single-end de 76 bp A. thaliana e S. octosporus conjuntos de dados relegando as extensões e resultados auxiliares para o suplemento.

3.2 Comparação de mapeamento de leitura bruta

Avaliamos primeiro a precisão dos alinhamentos de leituras brutas de RNA-seq duplas com diferentes alinhadores, representando uma seção transversal de algoritmos de alinhamento, ao usar o genoma alvo correto. Ao mapear leituras brutas para o genoma alvo do patógeno de interesse, os quatro alinhadores tiveram taxas de mapeamento comparáveis ​​de leituras originadas do patógeno (Figura 2a). TopHat2 e MapSplice2 alinhados c. 88% dos patógenos lêem STAR e NextGenMap, cada um alinhando mais de 99% das leituras de patógenos à referência alvo. A taxa de mapeamento de leituras de patógenos não foi afetada pela porcentagem de leituras de patógenos nos conjuntos de dados de sequenciamento. Enquanto STAR e NextGenMap alcançaram uma alta taxa de mapeamento de leituras de patógenos, ambos os alinhadores também mapearam erroneamente leituras de hospedeiros para o genoma da espécie de patógeno alvo (Figura 2b, S3). Para alinhamentos STAR e NextGenMap de conjuntos de dados nos quais havia mais leituras de host do que leituras de patógenos, uma ocorrência comum entre conjuntos de dados seq de RNA duplo real, leituras de host com mapeamento incorreto compreendiam 25-98% do total de leituras mapeadas. Em suma, a maioria das leituras de patógenos de um experimento dual de RNA-seq foram alinhadas por alinhadores comuns, mas os alinhadores que mapearam a maioria das leituras de patógenos para o genoma do patógeno de origem também alinharam incorretamente a maioria das leituras de hospedeiros com o genoma do patógeno.

Como muitas espécies de patógenos não têm recursos genômicos, investigamos o desempenho de cada um dos quatro alinhadores ao mapear o genoma de uma espécie intimamente relacionada ao patógeno. TopHat2 e MapSplice2 tiveram um desempenho ruim, mapeando & lt0,5% das leituras de patógenos ao mapear para qualquer genoma de uma espécie relacionada. STAR e NextGenMap foram capazes de mapear leituras de patógenos ao usar as informações genômicas de uma espécie relacionada como referência (Figura 2a). As taxas de mapeamento de leituras de patógenos não foram afetadas pela porcentagem de leituras de patógenos nos conjuntos de dados de sequenciamento. Ao usar STAR, c. 36% das leituras de patógenos mapeadas para o genoma de S. cryophilus, as espécies mais estreitamente relacionadas às espécies-alvo, S. octosporus. 19% das leituras de patógenos mapeadas para o S. japonicus genoma, e 3% mapeados para o S. pombe genoma (Figura 2a). Ao usar NextGenMap, c. 60% das leituras de patógenos mapeadas para o S. cryophilus transcriptoma, 22% mapeado para o S. pombe transcriptoma e 28% mapeados para o S. japonicus transcriptoma (Figura 2a). Para STAR e NextGenMap, a porcentagem de leituras de patógenos mapeadas geralmente diminuiu conforme a distância evolutiva entre os genomas alvo e de referência aumentava. Assim, há uma bifurcação distinta entre alinhadores que podem e não podem mapear efetivamente leituras de patógenos quando apenas um genoma de referência relacionado está disponível.

Para STAR e NextGenMap, o host lê o mapeamento incorreto para o genoma incorreto aumentou conforme a distância evolutiva entre as espécies de patógenos alvo e as espécies de referência aumentou, enquanto TopHat2 e MapSplice2 mapearam apenas algumas leituras de host (máximo de 19 leituras) para qualquer um dos Schizosaccharomyces genomas de referência sob quaisquer parâmetros de sequenciamento (Figura 2b, S3). Ao alinhar com STAR, c. 21% das leituras do host mapeadas para o S. cryophilus e S. pombe genomas. Embora apenas c. 1% das leituras do host mapeadas para o S. pombe genoma, apenas 3% das leituras de patógenos mapeadas para o mesmo genoma, então a taxa geral de mapeamento foi muito baixa. Ao alinhar com NextGenMap, c. 25% das leituras do host mapeadas para o S. cryophilus e S. japonicus transcriptomas e c. 15% das leituras do host mapeadas para S. pombe. Os efeitos do mapeamento incorreto relacionado à distância evolutiva são maiores em conjuntos de dados nos quais a proporção de leituras de patógenos foi baixa, já que leituras de host compreendem a maioria do total de leituras mapeadas.

3.3 Contagens de genes e análise de expressão diferencial

Para investigar como o insight biológico seria afetado pelo mapeamento incorreto da leitura do hospedeiro, quantificamos as contagens genéticas das leituras do hospedeiro que STAR mapearam incorretamente para o genoma do patógeno alvo. O conjunto de dados de sequenciamento que resultou no maior número de leituras de host mapeadas incorretamente para o genoma do patógeno alvo em que o maior número de leituras de host mapeadas incorretamente foi o conjunto de dados com maior proporção de leituras de host em relação às leituras de patógenos (especificamente, 99% de leituras de host / 1% patógeno lê). A grande maioria das leituras de host mapeadas incorretamente derivam de partes repetitivas do genoma. Conforme determinado por featureCounts, apenas 1,6% de S. octosporus os genes tinham mais de 50 leituras do hospedeiro mapeadas incorretamente para eles (Tabela S5), e esses genes variaram em função biológica (Tabela S4).

Comparamos dois alinhamentos do mesmo conjunto de dados simulado com o genoma alvo de S. octosporus um alinhamento foi executado mapeando leituras brutas para o genoma com TopHat2 (que não mapeou leituras de host incorretamente) e o outro foi realizado mapeando leituras brutas para o genoma com STAR (que incluiu mapeamento incorreto de leituras de host). Uma lista classificada de alterações de dobras regularizadas na escala log2 está no material suplementar (Tabela S3). 97,1% dos genes que foram expressos de forma diferente (alteração acima de 0,1 vezes na escala log2) entre os alinhamentos foram superexpressos no alinhamento em que ocorreu o mapeamento incorreto da leitura do hospedeiro. Isso sugere que o mapeamento incorreto de leituras para a referência errada em seq de RNA duplo pode resultar em desvios para cima nas estimativas da expressão gênica. Assim, em comparação com um controle não infectado, esses genes polarizados para cima pareceriam ser "induzidos" pela infecção.

3.4 Estratégias de mapeamento alternativas podem reduzir problemas de mapeamento

Nós consideramos três abordagens alternativas que poderiam reduzir o mapeamento deficiente e o mapeamento incorreto de dados de seq de RNA duplo. Primeiro investigamos as abordagens que seriam possíveis se um genoma hospedeiro estivesse disponível. Tentamos filtrar as leituras do hospedeiro alinhando primeiro os conjuntos de dados seq de RNA duplo ao genoma do hospedeiro e, em seguida, mapeando as leituras que não foram mapeadas para o genoma do patógeno alvo (ou de espécies relacionadas). Esta abordagem "sequencial" diminuiu a quantidade de mapeamento incorreto de leitura do host apenas ligeiramente (Tabela 2). Para a maioria dos alinhamentos, a porcentagem do total de leituras mapeadas originadas do host diminuiu apenas 1–3%.

Nós investigamos uma segunda abordagem em que as leituras foram mapeadas para genomas concatenados do hospedeiro e do patógeno alvo ou de uma espécie intimamente relacionada ao patógeno. (um design "local para ir"). O método place-to-go resultou em alinhamentos usando STAR e NextGenMap tendo substancialmente menos leituras do hospedeiro e mapeamento incorreto para o genoma do patógeno ou de uma espécie intimamente relacionada ao patógeno em comparação com os alinhamentos de genomas excluindo o genoma do hospedeiro. Além disso, ambos os alinhadores mantiveram sua capacidade de mapear leituras de patógenos para os genomas de espécies intimamente relacionadas ao patógeno alvo (Figura 3, Figura S4). Portanto, o método place-to-go pode superar algumas das limitações do mapeamento para uma referência relacionada em seq de RNA duplo.

Finalmente, investigamos uma terceira abordagem em que as leituras foram primeiro montadas de novo em fragmentos mais longos, então esses fragmentos foram mapeados para os genomas do patógeno e espécies intimamente relacionadas ao patógeno (abordagem de "montagem"). A maioria dos contigs montados era composta inteiramente de leituras de host ou inteiramente de leituras de patógenos (métricas de montagem na Figura S1). Uma pequena fração de contigs eram quimeras, ou seja, uma mistura de leituras de hospedeiro e patógeno (rotuladas como "indeterminadas"). Os alinhamentos desses transcritos montados para cada um dos genomas de referência resultaram em uma diminuição substancial no mapeamento incorreto de leituras do hospedeiro, preservando a capacidade de mapear contigs de patógenos (Figura 4, Figura S5). Em todas as espécies de referência e proporções de leituras de patógenos nos conjuntos de dados originais, & lt1% dos contigs compostos de leituras de host mapeadas com NextGenMap. Além disso, c. 99% dos contigs compostos de leituras de patógenos mapeados para o transcriptoma alvo de S. octosporus. Aproximadamente 79% dos contigs compostos de leituras de patógenos mapeados para S. cryophilus, 29% dos contigs compostos de leituras de patógenos mapeados para S. pombe e 15% dos contigs compostos de leituras de patógenos mapeadas para S. japonicus. Embora alguns dos contigs que não puderam ser identificados como compostos de patógenos ou leituras do host mapeadas, eles representaram uma minoria do número total de contigs mapeados, com um máximo de 2,5%. Com essa redução no mapeamento incorreto de leitura do host, a maioria de todos os contigs mapeados se originou do patógeno. Dado que uma boa montagem de novo é possível, a abordagem de montagem também reduziu claramente o mapeamento incorreto.

3.5 Efeito dos parâmetros de sequenciamento

Para investigar o efeito dos parâmetros de sequenciamento - o tamanho da leitura de sequenciamento, leituras de extremidade emparelhada vs. de extremidade única - nas abordagens acima, simulamos conjuntos de dados de RNA-seq duplos do mesmo sistema com um comprimento de leitura mais longo (150 bp) e com sequenciamento de extremidades emparelhadas (Figura S11-S16). Embora os mesmos padrões amplamente mantidos - que o mapeamento de leitura bruta resultou em mapeamento incorreto de leituras de host ao alinhar com STAR e NextGenMap e mapeamento de leituras para um genoma concatenado ou montagem de leituras de novo antes do mapeamento de mapeamento incorreto de leitura de host substancialmente reduzido - havia algumas diferenças entre os layouts . Especificamente, comprimentos de leitura mais longos não apenas resultaram em taxas gerais de mapeamento incorreto de leitura de host (o que é consistente com os resultados de leituras montadas de mapeamento), mas também resultou em menor taxa de mapeamento de leitura de patógenos, especialmente quando o mapeamento para os genomas de espécies intimamente relacionadas ao patógeno . Além disso, a montagem de 76 leituras de extremidades emparelhadas de novo antes do mapeamento para o Schizosaccharomyces os genomas resultaram em mais leituras que não puderam ser identificadas como do hospedeiro ou patógeno (potencialmente quimeras) compreendendo o grupo de leituras mapeadas. Como esperado, leituras mais pareadas geralmente tiveram um desempenho melhor do que outras configurações.

3.6 Semelhanças e contrastes em outros taxa

As simulações acima focaram em um 'parasita' de fungo infectando um hospedeiro de planta, pois acreditamos que este poderia ser um cenário particularmente problemático, já que plantas e fungos são eucariotos, enquanto outros sistemas patógenos-hospedeiro envolvem espécies mais divergentes. Para investigar se e como os padrões observados acima se estendem a outros sistemas, simulamos mais dois conjuntos de conjuntos de dados seq de RNA duplo. Simulamos conjuntos de dados na mesma faixa de proporção de leituras de patógenos para outro sistema patógeno fúngico-hospedeiro, Homo sapiens e Candida albicans, bem como um sistema patogênico bacteriano, Homo sapiens e Escherichia coli. Enquanto alinhamentos do HumanoCandida leituras brutas para os genomas das espécies-alvo, C. albicans, e duas espécies intimamente relacionadas, C. dublinensis e C. parapsilosis, resultou em um nível comparável de mapeamento incorreto de leitura do host para as análises acima (Figura S6), alinhamentos de humanosE. coli leituras brutas tiveram mínimo, se houver, mapeamento incorreto de leituras de host (Figura S10). Conduzimos as mesmas três abordagens descritas acima para minimizar o mapeamento incorreto de leitura do host com o Human-Candida alinhamentos, e observamos os mesmos resultados descritos acima - que o mapeamento para genomas concatenados do hospedeiro e espécies intimamente relacionadas, bem como a montagem de novo antes do alinhamento, reduzem substancialmente o mapeamento incorreto de leituras do hospedeiro, mantendo a capacidade de mapear leituras de patógenos (Figura S7–9). Portanto, os problemas de mapeamento incorreto em seq de RNA duplo se mantiveram, em vários graus, nos sistemas que investigamos.


Análise downstream após RNAseq do patógeno in vivo - Biologia

Macrófagos ativados alternativamente (AAMφ) são o principal componente da resposta à infecção por helmintos, no entanto, suas funções permanecem mal definidas. Para entender melhor o fenótipo AAMφ induzido por helmintos, realizamos uma análise em nível de sistema de AAMφ derivado in vivo usando um modelo de camundongo estabelecido. Com o sequenciamento de RNA de última geração, caracterizamos os transcriptomas de macrófagos peritoneais de camundongos BALB / ce IL4Rα - / - eliciados pelo nematóide Brugia malayi, ou via injeção intraperitoneal de tioglicolato. Definimos perfis de expressão de citocinas associadas a AAMφ, quimiocinas e seus receptores, fornecendo evidências de que AAMφ contribui para o recrutamento e manutenção da eosinofilia. A análise do caminho destacou o complemento como uma função potencial efetora de AAMφ. Genes mitocondriais regulados positivamente suportam evidências in vitro de associação do metabolismo mitocondrial com ativação alternativa. Mapeamos os locais de início da transcrição de macrófagos, definindo sobre-representados cis- motivos reguladores dentro de promotores associados a AAMφ. Estes incluíram o local de ligação para fatores de transcrição PPAR, que mantêm o metabolismo mitocondrial. Surpreendentemente, o PPARγ, implicado na manutenção de AAMφ, foi regulado negativamente na infecção. A expressão de PPARδ, entretanto, foi mantida. Para explicar como a ativação da transcrição mediada por PPAR pode ser mantida, usamos a lipidômica para quantificar os eicosanóides derivados de AAMφ, potenciais ligantes de PPAR. Identificamos o ligante PPARδ PGI2 como o eicosanóide derivado de AAMφ mais abundante e propõe uma IGP2O eixo -PPARδ mantém AAMφ durante B malayi implantação.

Pré-publicado online como Sangue Artigo da primeira edição, 16 de outubro de 2012

Este artigo contém um suplemento de dados.

Os custos de publicação deste artigo foram custeados em parte pelo pagamento do encargo por página. Portanto, e apenas para indicar esse fato, este artigo é marcado como "anúncio" de acordo com a seção 1734 do 18 USC.


Métodos

Procedimentos de crescimento e amostragem de levedura

Todos os experimentos foram realizados usando a cepa de levedura BY4741 (S288c background MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0), obtido da Open Biosystems. Para comparar os métodos de isolamento de RNA, coletamos três réplicas "técnicas" idênticas de 10 ml para cada réplica biológica (4 réplicas biológicas no total). As células foram cultivadas & gt 8 gerações em 100 ml de meio completo sintético (SC) [16] a 30 ° C com agitação orbital (270 rpm) até a fase exponencial média (OD600 de 0,3–0,6), e amostras de 10 ml foram removidas representando o controle sem estresse. Para o tratamento de choque térmico, um volume de meio de 55 ° C foi adicionado à cultura restante, trazendo imediatamente a temperatura final para 37 ° C, e a cultura foi incubada a 37 ° C por mais 20 min antes de remover as amostras de 10 ml. Tanto as células sem estresse quanto as com choque térmico foram coletadas por centrifugação a 1500 x g por 3 min, e os pellets de células foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ° C até o processamento.

Métodos de isolamento de RNA

Isolamento de fenol quente

As células foram lisadas e o RNA foi isolado usando um método de fenol quente padrão, conforme descrito [17], e um protocolo detalhado pode ser encontrado no repositório protocol.io em DOI dx.doi.org/10.17504/protocols.io.inwcdfe. Resumidamente, 1 volume de fenol saturado com ácido e 1 volume de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM pH 7,4, EDTA 10 mM, SDS a 0,5%) foram adicionados a pellets de células congelados, agitados em vórtex e, em seguida, colocados em um Multi pré-aquecido a 65 ° C -Therm incubado em vórtice (Benchmark Scientific) a 1500 rpm por 45 min. As amostras foram centrifugadas por 10 min a 4 ° C em velocidade máxima em uma microcentrífuga, extraídas mais uma vez com fenol, uma vez com clorofórmio e, em seguida, precipitadas durante a noite a -20 ° C com 0,1 volumes de acetato de sódio (pH 5,2) e 2,5 volumes de Etanol 100%. O ARN precipitado foi lavado uma vez com etanol a 70% e depois ressuspenso em TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). O RNA extraído com fenol foi então "limpo" usando um kit RNeasy Miniprep com tratamento DNase opcional na coluna de acordo com as instruções do fabricante.

Isolamento de RNA com dois kits Miniprep diferentes

O RNA foi extraído usando dois kits diferentes: o Qiagen RNeasy Mini Kit (Cat. 74,104) e o Kit Zymo Research Direct-zol RNA Miniprep (Cat. R2050). As concentrações celulares estavam todas abaixo da recomendação máxima de 5 × 10 7 células de ambos os fabricantes (variando de 2,5 × 10 7 - 4,5 × 10 7 células). Para ambos os kits, lisamos mecanicamente as células com um Beadbeater-24 (3500 oscilações / minuto, 45 s no gelo entre os ciclos). A lise mecânica foi realizada em tubos com tampa de rosca de 2 ml contendo um volume igual (600 μl) de tampão de lise (RLT para RNeasy ou reagente TRI para Direct-zol) e grânulos de vidro lavados com ácido (425-600 μm, Sigma-Aldrich )

O RNA foi então purificado de acordo com o protocolo de cada fabricante para levedura, incluindo a digestão DNase opcional na coluna. Para todas as amostras, o RNA foi quantificado usando um kit de ensaio Qubit RNA HS e fluorômetro Qubit de acordo com as instruções do fabricante. O número de integridade de RNA (RIN) para cada amostra foi medido usando um Agilent 2200 TapeStation. As concentrações de RNA e os valores de RIN para cada amostra podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1.

Sequenciamento e análise de RNA

Bibliotecas de RNA-seq foram preparadas a partir de RNA enriquecido com poliA usando o KAPA Biosystems mRNA HyperPrep Kit (KK8581) e KAPA Single-Indexed Adapter Set A + B (KK8700), de acordo com as instruções do fabricante. Começamos com 500 ng de RNA total, o tempo de fragmentação (6 min) foi otimizado para gerar fragmentos de RNA de 200–300 nt e as bibliotecas foram amplificadas com 9 ciclos de PCR. Todas as bibliotecas foram construídas em um único lote por meio de um robô automatizado de manipulação de líquidos Eppendorf epMotion 5075, e um protocolo detalhado pode ser encontrado em protocol.io em DOI dx.doi.org/10.17504/protocols.io.uueewte. As bibliotecas de cDNA foram sequenciadas em um HiSeq4000 na University of Chicago Genomics Facility, gerando leituras de 50 bp de extremidade única.

As leituras foram cortadas de leituras de baixa qualidade e sequência do adaptador (índices KAPA v1) usando Trimmomatic (versão 0.32) [18], com os seguintes comandos: ILLUMINACLIP: Kapa_indices.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 MAXINFO: 40: 0,4 MINLEN: 40. As leituras foram mapeadas para o genoma S288c (versão Scer3), usando STAR (versão 020201) [19]. As estatísticas de mapeamento podem ser encontradas na Tabela Suplementar 2. Transcrições por milhão (TPM) e contagens esperadas para cada gene foram calculadas usando RSEM (versão 1.3.1) [20]. A saída RSEM pode ser encontrada no Arquivo Adicional 2.

A análise de expressão diferencial foi conduzida usando o pacote Bioconductor edgeR (versão 3.22.3) usando a estrutura de quase-verossimilhança (QL). Para o modelo QL, o tipo de amostra (ou seja, fenol sem estresse, choque térmico de fenol, RNeasy sem estresse ...) e réplica biológica foram usados ​​como fatores. Para contabilizar as diferenças de RIN entre as amostras, também realizamos uma análise separada que incluiu o tipo de amostra, replicação e RIN como fatores no modelo. Para controlar as diferenças na profundidade de sequenciamento entre as amostras, a função edgeR thincounts foi usada para subamostrar aleatoriamente as contagens em todas as amostras para ser igual à amostra com o menor número de contagens totais (8.678.188). Apenas genes com pelo menos 1 contagem por milhão (CPM) em pelo menos uma condição foram incluídos para normalização TMM e análise de expressão diferencial. Todos os dados de RNA-seq estão disponíveis no banco de dados do National Institutes of Health Gene Expression Omnibus (GEO) sob o número de acesso GSE135430 e as saídas edgeR podem ser encontradas no Arquivo Adicional 3.

A análise de componentes principais (PCA) foi realizada usando ClustVis [21] em valores TPM transformados em ln para todas as transcrições incluídas na análise de expressão diferencial, usando escala de variância de unidade e decomposição de valor singular. O clustering hierárquico foi realizado com Cluster 3.0 (http://bonsai.hgc.jp/

mdehoon / software / cluster / software.htm) usando correlação de Pearson não centrada e ligação centróide como métrica [22]. As amostras de RNA-seq foram ponderadas usando um valor de corte de 0,4 e um valor expoente de 1. Enriquecimento funcional das categorias de ontologia gênica (GO) foram realizadas usando GO-TermFinder (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermFinder ) [23], com correção de Bonferroni P-valores & lt 0,01 considerados significativos. Listas completas de categorias enriquecidas podem ser encontradas no Arquivo Adicional 4. O teste de equivalência em proporções de conjuntos de genes foi realizado usando dois testes unilaterais (TOST) por meio do pacote TOSTER R (versão 0.3.4) [24], usando um nível alfa de 0,05 e limites de equivalência de +/− 0,029 (10% da proporção de fundo).

PCR quantitativo

Seis genes com significativamente maior (LAS17, SED1, PRY3) ou inferior (JNM1, EAF7, RRP36) abundância nos dados de fenol vs. kit RNA-seq foram validados por PCR quantitativo em tempo real (q) usando o Maxima SYBR-qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) e um Sistema de detecção de PCR em tempo real Bio-Rad CFX96 Touch como descrito [25]. Resumidamente, o cDNA foi sintetizado a partir das mesmas amostras de RNA usadas para RNA-seq usando 10 μg de RNA total, 3 μg de oligo-dT ancorado (T20VN) e SuperScript III (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Um ng de cDNA foi usado como molde, e qPCR foi realizada usando os seguintes parâmetros de ciclagem térmica: 95 ° C por 3 min, 40 ciclos 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 1 min por 40 ciclos, seguido por um derretimento análise da curva para validar a presença de apenas um único amplicon. Os valores de Cq foram determinados por meio de análise de regressão, com subtração da linha de base via ajuste de curva. A abundância relativa entre as amostras foi determinada usando o método ∆∆Ct [26], normalizando para ERV25 como um gene de controle cuja expressão não é afetada por vários estresses [27]. Um protocolo detalhado está disponível em protocol.io em DOI dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bbgpijvn.


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    Shandong Key Laboratory of Greenhouse Vegetable Biology, Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Institute of Vegetables and Flowers, Jinan, China

    Faculdade de Ciências da Vida e do Meio Ambiente, Universidade Huanshan, Huangshan, China

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    Faculdade de Silvicultura, Universidade de Hainan, Haikou, China

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    Faculdade de Ciências e Tecnologia Agrícola, Universidade de Engenharia e Agricultura de Shandong, Jinan, China

    W. Liu, Faculdade de Ciências e Tecnologia Agrícola, Universidade de Engenharia e Agricultura de Shandong, Jinan 250100, China.

    W. Zhang, Instituto de Vegetais e Flores, Shandong Academy of Agricultural Sciences e Shandong Key Laboratory of Greenhouse Vegetable Biology e Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center, Jinan 250100, China

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    Resumo

    • O oídio é a principal doença que afeta o cultivo do pepino e causa graves perdas econômicas. Até agora, as pesquisas sobre a resistência do pepino ao oídio não produziram soluções viáveis.
    • Este estudo selecionou duas linhagens consanguíneas de pepino, XY09-118 (resistente) e Q10 (suscetível) e investigou suas respostas à infecção por oídio (colhido 24 e 48 h após a inoculação) usando sequenciamento de RNA.
    • Mais de 20.000 genes foram detectados em folhas de pepino com e sem infecção de oídio nos dois pontos de tempo acima. Entre estes, 5478 genes foram identificados como genes expressos de forma diferente (DEGs) entre XY09-118 e Q10. Com base nas bases de dados GO e KEGG, foram analisadas as funções dos DEGs. Além disso, a complexa rede regulatória para resistência ao oídio foi avaliada, que envolve transdução de sinal de hormônio vegetal, biossíntese de fenilpropanóide, interação planta-patógeno e a via de sinalização MAPK. Em particular, os genes que codificam WRKY, NAC e TCP foram destacados. Além disso, genes envolvidos na biossíntese de hormônios vegetais, metabolismo e transdução de sinal, resistência a patógenos e resposta ao estresse abiótico foram analisados.A análise de co-expressão indicou que os fatores de transcrição se correlacionaram com a via e o metabolismo do sinal do hormônio vegetal, defesa e resposta abiótica. A expressão de vários genes foi validada por qRT-PCR. A rede reguladora de resistência a patógenos foi identificada pela comparação de linhagens consanguíneas resistentes e suscetíveis infectadas com oídio.
    • Os dados do transcriptoma fornecem novos insights sobre a resposta do pepino à infecção por oídio e os genes de resistência a patógenos identificados serão altamente úteis para os esforços de cultivo para aumentar a resistência do pepino ao oídio.
    Nome do arquivo Descrição
    documento plb13213-sup-0001-FigS1.docxWord, 1.018,5 KB Figura S1. Análise de cobertura gênica de 24 amostras.
    plb13213-sup-0002-FigS2.docx Documento do Word, 2,9 MB Figura S2. Resultados da análise de saturação de sequenciamento.
    plb13213-sup-0003-FigS3.jpg imagem JPEG, 6,3 MB Figura S3. Coeficientes de correlação entre três réplicas biológicas de cada amostra.
    plb13213-sup-0004-TableS1.xlsxapplication / excel, 10,1 KB Tabela S1. Primers para análise de qRT-PCR.
    plb13213-sup-0005-TableS2.xlsxapplication / excel, 13,9 KB Tabela S2. Verificação dos resultados de RNA-seq com qRT-PCR. Os resultados mostram os valores médios de Ct de 16 genes selecionados aleatoriamente em folhas de pepino.
    plb13213-sup-0006-TableS3.xlsxapplication / excel, 10,9 KB Tabela S3. Eventos mapeados por RNA-seq.
    plb13213-sup-0007-TableS4.xlsxapplication / excel, 147,2 KB Tabela S4. DEGs em Q10 24 h após a inoculação do oídio.
    plb13213-sup-0008-TableS5.xlsxapplication / excel, 55,5 KB Tabela S5. DEGs em Q10 48 h após a inoculação do oídio.
    plb13213-sup-0009-TableS6.xlsxapplication / excel, 148,1 KB Tabela S6. DEGs em XY09-118 24 h após a inoculação do oídio.
    plb13213-sup-0010-TableS7.xlsxapplication / excel, 443,4 KB Tabela S7. DEGs em XY09-118 48 h após a inoculação do oídio.
    plb13213-sup-0011-TableS8.xlsxapplication / excel, 466,6 KB Tabela S8. DEGs em Q10 e XY09-118 24 h após a inoculação de oídio.
    plb13213-sup-0012-TableS9.xlsxapplication / excel, 692,4 KB Tabela S9. DEGs em Q10 e XY09-118 48 h após a inoculação de oídio.
    plb13213-sup-0013-TableS10.xlsxapplication / excel, 380,1 KB Tabela S10. DEGs em Q10 e XY09-118 sob tratamento de controle após 24 h.
    plb13213-sup-0014-TableS11.xlsxapplication / excel, 499,6 KB Tabela S11. DEGs em Q10 e XY09-118 sob tratamento de controle após 48 h.
    plb13213-sup-0015-TableS12.xlsxapplication / excel, 633,3 KB Tabela S12. Os principais termos GO enriquecidos de DEGs em oito comparações de pares.
    plb13213-sup-0016-TableS13.xlsxapplication / excel, 149,2 KB Tabela S13. Análise de co-expressão de fatores de transcrição e genes a jusante em Q10 e XY09-118 24 h após a infecção por oídio.
    plb13213-sup-0017-TableS14.xlsxapplication / excel, 1,3 MB Tabela S14. Análise de co-expressão de fatores de transcrição e genes a jusante em Q10 e XY09-118 48 h após a infecção por oídio.

    Observação: O editor não é responsável pelo conteúdo ou funcionalidade de qualquer informação de suporte fornecida pelos autores. Quaisquer dúvidas (que não sejam de conteúdo ausente) devem ser direcionadas ao autor correspondente do artigo.


    Resultados

    Geração de AAM & # x003c6 e análise de expressão diferencial

    Geramos NeM & # x003c6 e ThioM & # x003c6 implantando camundongos BALB / ce IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 com o nematóide B malayi, ou via administração intraperitoneal de tioglicolato para induzir uma população de macrófagos semelhantes a inflamatórios não polarizados. A estimulação de IL4 aumenta a expressão de superfície F4 / 80 em macrófagos. 5 Para enriquecer para AAM & # x003c6 no ambiente do implante, coletamos a população de macrófagos F4 / 80 + mais brilhante em cada condição (Figura 1 suplementar). A pureza do macrófago foi maximizada por exclusão de células mortas, dupletos, células B (B220 +), eosinófilos (SiglecF +) e células T CD4 + usando gating negativo (Figura 1 A). Nossa estratégia de classificação resultou em uma pureza média de 97,3% (intervalo, 94,9% -99,4%, Tabela suplementar 1). A ativação alternativa de WT-NeM & # x003c6 foi confirmada com coloração de citocina intracelular para RELM & # x003b1 (Figura 1 B-C). Em média, 47% de WT-NeM & # x003c6 foram RELM & # x003b1 positivos, consistentes com 30% -60% de positividade tipicamente observada após B malayi implantar. Bibliotecas de RNA-Seq renderam entre 11 milhões e 30 milhões de leituras emparelhadas de 51 bases. A expressão do gene foi quantificada por mapeamento de leituras para o genoma de referência do mouse usando TopHat. 14 No total, 55% -73% das leituras mapeadas exclusivamente para o genoma, com 7,7-25 milhões de mapeamento dentro de exons de genes conhecidos (Ensembl Versão 58, Tabela 1). Entre 12.553 e 13.520 (56% -59%) genes codificadores de proteínas foram expressos em cada grupo, sendo 12.039 deles comuns a todas as 4 populações (Figura 2 A). Validamos a pureza da amostra avaliando a expressão de genes marcadores de linhagem restrita para potenciais contaminantes eosinófilos, neutrófilos e células B (Tabela suplementar 2). Com esta abordagem, confirmamos contaminação insignificante de neutrófilos ou eosinófilos, no entanto, um baixo nível de Cd19 a expressão foi observada em IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6.

    Tabela 1

    Estatísticas de sequência e mapeamento para dados brutos da Illumina

    TensãoTratamentoRepetirTotal de leiturasNo. mapeado% mapeadoEmparelhado corretamente% devidamente emparelhadoSingletons% singletonsLeituras exclusivas em anotações ensembl v58% leituras únicas em anotações ensembl v58
    BALB / cInfetado135 646 76024 026 74267.418 883 06478.593 802 88215.8313 914 67357.9
    BALB / cInfetado239 663 69426 450 84473.321 349 67280.714 071 57815.3915 261 02857.7
    BALB / cInfetado340 960 17626 670 82665.120 637 67677.384 486 60216.8215 578 57358.4
    BALB / cThio140 398 23226 011 65264.321 817 52083.883 454 42613.2814 732 92056.6
    BALB / cThio248 366 77433 194 64368.626 782 50280.685 494 17316.5519 344 27558.2
    BALB / cThio345 552 29628 796 12963.224 350 13284.564 167 41114.4716 480 89657.2
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 Infetado156 700 55231 428 89655.427 125 04486.314 172 29813.2817 799 75456.6
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 Infetado223 150 35815 076 79765.112 977 82486.081 911 07512.688 493 65956.3
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 Infetado360 376 96042 872 36571.032 888 16276.716 826 78715.9224 849 42657.9
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 Thio140 492 83824 144 54159.619 772 78281.893 547 65314.6913 845 96657.3
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 Thio222 996 48213 033 13456.78 952 74268.692 418 16818.557 725 61959.2
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 Thio336 062 84419 911 07355.214 751 22874.093 874 77519.4611 892 85959.7

    Expressão geral do gene e análise da expressão diferencial. (A) O número de genes expressos em populações de macrófagos onde expresso é considerado como pelo menos 1 mapeamento de leitura para um gene em todas as 3 réplicas de uma condição. (B) Agrupamento hierárquico não supervisionado de pistas individuais demonstrando agrupamento discreto de réplicas biológicas. (C) Resumo dos genes DE (P & # x0003c .01) em cada comparação de pares mostrando o número total de genes DE (interno), e uma divisão mostrando a direção da expressão diferencial tanto para moderadamente (log 2-fold change & # x000b1 2-4) e altamente (log Alteração de 2 vezes & # x0003e 4) Genes DE.

    O agrupamento hierárquico de perfis de expressão gênica global agrupou bibliotecas de RNA-Seq de acordo com a condição biológica, reafirmando a qualidade e reprodutibilidade de nossa análise (Figura 2 B). Após a análise de expressão diferencial, identificamos diferenças transcricionais substanciais entre as populações de macrófagos nas 3 comparações principais (Figura 2 C). Usando um P valor de corte de 0,01 após correção para testes múltiplos (método de Benjamini-Hochberg), identificamos 4571 genes DE entre WT-NeM & # x003c6 e WT-ThioM & # x003c6, 4561 genes DE entre WT-NeM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6, e 3271 genes DE entre WT-ThioM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -ThioM & # x003c6 (Figura 2 C). Uma lista completa de genes e associados P os valores são fornecidos na Tabela suplementar 3. Observamos um maior número de genes DE entre WT-NeM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 do que entre WT- ThioM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -ThioM & # x003c6 (Figura 2 C). Além disso, as magnitudes dessas diferenças foram muito maiores no ambiente de infecção (Figura 7 suplementar). Além disso, uma faixa semelhante de expressão diferencial foi observada entre WT-NeM & # x003c6 e WT-ThioM & # x003c6 como para WT-NeM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. Assim, como esperado, a sinalização dependente de IL4R & # x003b1 levou a alterações importantes no perfil transcricional de macrófagos em resposta a estímulos imunes indutores de Th2.

    Nós interrogamos os perfis de expressão dos genes DE para identificar aqueles explicitamente associados à ativação alternativa. Todos os genes DE das comparações WT-NeM & # x003c6 versus WT-ThioM & # x003c6 e WT-NeM & # x003c6 versus IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 (4571 e 4561, respectivamente) foram agrupados de acordo com suas perfil de expressão usando agrupamento aglomerativo hierárquico. A árvore resultante foi subdividida em 20 clusters, e o perfil de expressão dos genes em cada cluster foi avaliado (Figura 8 suplementar). Identificamos 5 clusters com níveis de expressão aumentados em WT-NeM & # x003c6 em relação a WT-ThioM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. Estes foram classificados como AAM & # x003c6-up (Figura 3 Tabela suplementar 4). Da mesma forma, 5 clusters foram identificados com perfis de expressão inversa e classificados como AAM & # x003c6-down. No total, foram identificados 1.658 genes AAM & # x003c6-up e 1735 AAM & # x003c6-down (Figura 3). É importante ressaltar que podemos afirmar que a expressão de genes em clusters AAM & # x003c6-up e AAM & # x003c6-down é dependente de IL4R & # x003b1. No entanto, como os camundongos IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 não têm expressão de IL4R & # x003b1 em todas as células, não podemos dizer se esses efeitos são autônomos em relação às células e, em alguns casos, podem refletir outras alterações, como a ativação de células Th2 .

    Perfis de expressão de conjuntos de genes associados a AAM & # x003c6 expressos diferencialmente. Os perfis de expressão de conjuntos de genes associados positiva e negativamente com a ativação alternativa (AAM & # x003c6-up e AAM & # x003c6-down). Todos os genes estatisticamente significativos (P & # x0003c .01) entre WT-NeM & # x003c6 e WT-ThioM & # x003c6, e WT-NeM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6, foram agrupados usando agrupamento hierárquico. Cada gene dentro de um cluster de expressão é plotado em azul, e a expressão média para todos os genes dentro de cada cluster é sobreposta em preto. A figura em cada painel representa o número total de genes naquele cluster.

    Expressão diferencial de efetores imunes

    Raciocinamos que uma avaliação descritiva, baseada no conhecimento, de termos GO imunologicamente relevantes (abrangendo citocinas, quimiocinas e seus receptores, termos GO: 0005125, GO: 0008009, GO: 0004896 e GO: 0004950, respectivamente doravante denominados efetores imunes) forneceria informações sobre a função e regulamentação do AAM & # x003c6. Os efetores imunológicos que estavam presentes nos clusters AAM & # x003c6-up e AAM & # x003c6-down foram definidos como associados a AAM & # x003c6. Usando esse critério, identificamos a associação AAM & # x003c6 para 16 citocinas, 11 receptores de citocinas, 10 quimiocinas e 8 receptores de quimiocinas (Figura 4). Aqui, discutimos a função dos principais efetores imunes associados a AAM & # x003c6, fornecendo uma visão sobre as facetas dependentes de IL4R & # x003b1 da resposta de macrófagos à infecção por nematóides da filaria in vivo e definindo genes candidatos para investigações futuras.

    Mapa de calor de efetores imunes modulados por ativação alternativos. Genes efetores imunológicos, citocinas, quimiocinas e seus respectivos receptores (GO: 0005125, GO: 0008009, GO: 0004896 e GO: 0004950, respectivamente), em clusters associados a AAM & # x003c6 foram identificados com base nas anotações de Ontologia Genética. A análise de agrupamento hierárquico revela um perfil de expressão exclusivo de efetores imunes associados a AAM & # x003c6.

    Perfis de expressão de receptores de quimiocinas e quimiocinas.

    O perfil de expressão de quimiocinas AAM & # x003c6 (Figura 4) foi consistente com a manutenção mediada por macrófagos do meio celular na cavidade peritoneal de B malayi& # x02013 camundongos implantados, que é composto principalmente de células B, macrófagos e eosinófilos. 15 Todas as populações de macrófagos testadas abundante e constitutivamente expressas Ccl6 e Ccl9 (Tabela 5 suplementar), que pode servir para manter as populações de macrófagos na cavidade peritoneal. 16 Nos clusters AAM & # x003c6-up, identificamos os quimioatrativos eosinófilos Ccl24 e Ccl8, 16 expressos abundantemente e moderadamente, respectivamente. Cxcl12 e Cxcl13 também foram identificados como associados a AAM & # x003c6, no entanto, foram expressos em níveis muito mais baixos. Consistente com um fenótipo antiinflamatório ou não inflamatório de AAM & # x003c6, 1 os clusters AAM & # x003c6-down continham Ccl3 (Mip1 e # x003b1), Ccl4, Ccl2 (MCP-1), Ccl7 (MCP-3), e Cxcl14, todos envolvidos na fase aguda da inflamação, atraindo principalmente monócitos e neutrófilos. 17

    Curiosamente, os clusters AAM & # x003c6-up eram desprovidos de receptores de quimiocina, com exceção de Cxcr7 (Figura 4). Cxcr7 responde ao Cxcl12 derivado do estroma, afetando a migração e a diferenciação em monócitos. 18 Ccr1 (Receptor MIP-1 & # x003b1, Tabela suplementar 5) também foi altamente expresso por macrófagos, mas não classificado como AAM & # x003c6-associado. Portanto, Cxcr7 e / ou Ccr1 podem ser os principais determinantes da localização de AAM & # x003c6 induzida por nematóides. 17,18 Um grande número de receptores de quimiocinas estava presente nos aglomerados AAM & # x003c6-down. Estes incluíam Ccr2, Cxcr1, Cxcr2, Cxcr3, Ccr5, e Ccrl2, implicando que AAM & # x003c6 estão prejudicados em sua capacidade de responder a várias quimiocinas. Isso sugere que WT-NeM & # x003c6 não migra para as respostas de células T linfáticas primárias, apesar da alta expressão de MHCII e apresentação de antígeno funcional. 19,20

    Perfis de expressão de citocinas e receptores de citocinas.

    A expressão do receptor de citocina foi tipicamente mantida ou aumentada em NeM & # x003c6. AAM & # x003c6-up clusters continham o receptor IL33 Il1rl1 (ST-2) e a subunidade do receptor IL27 Il27ra (WSX-1), ambos previamente caracterizados como associados a AAM & # x003c6. 21,22 AAM & # x003c6-up clusters também incluídos Gfra2 (Receptor da família GDNF & # x003b1-2), envolvido na sobrevivência e diferenciação neuronal, 23 e o receptor de leptina (Lepr) A leptina é uma adipocina envolvida na homeostase energética com amplos efeitos pleiotrópicos. Não há papel descrito para a leptina na imunidade Th2, no entanto, macrófagos de Leprcamundongos deficientes expressam níveis mais elevados de citocinas inflamatórias, 24 sugerindo a possibilidade de que o receptor de leptina contribua para o perfil antiinflamatório de AAM & # x003c6.

    Com relação às citocinas, WT-NeM & # x003c6 produziu significativamente mais Il6, Wnt2, e Bmp6 do que WT-ThioM & # x003c6 ou IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. Bmp6 é pleiotrópico, suprimindo a proliferação de células B 25 e promovendo a produção de IL6 pelos macrófagos. 26 Wnt2 não tem um papel definido na fisiologia dos macrófagos, embora Wnts influencie as decisões de destino das células imunológicas. 27 Assim, Wnt2 e Bmp6 representam novos candidatos promissores para futuras investigações da imunidade Th2.

    AAM & # x003c6 são descritos como amplamente antiinflamatórios, 1 em parte por causa de sua produção de IL10. Surpreendentemente, no cenário crônico de nosso experimento, WT-NeM & # x003c6 não produziu qualquer IL10 (Tabela suplementar 5). No entanto, os clusters AAM & # x003c6-down continham muitas citocinas pró-inflamatórias. Entre estes estavam Tnf, Lif, Il1b, e Il16. 28 & # x0201330 Além disso, a expressão do fator de ativação de macrófagos Tnfsf9 31 e as subunidades IL27 e IL35 Ebi3 foram reduzidos em AAM & # x003c6. Em resumo, AAM & # x003c6 expressou níveis maiores de efetores imunológicos associados ao recrutamento e sobrevivência de eosinófilos e níveis mais baixos de vários agentes pró-inflamatórios.

    Análise da via KEGG

    Para avaliar se as alterações metabólicas em macrófagos observadas anteriormente durante o tratamento com IL4 in vitro também ocorrem in vivo, aplicamos a análise de enriquecimento de conjunto de genes (GSEA) usando o banco de dados da via KEGG juntamente com modificações para dados de RNA-Seq (ver métodos suplementares). Ao considerar a expressão relativa de todos os genes, ao invés de apenas genes DE, GSEA fornece uma métrica sensível para identificar diferenças nas vias bioquímicas e de sinalização celular.

    O complemento e a cascata de coagulação.

    Inesperadamente, o complemento e a cascata de coagulação (via KEGG mmu04610) foi a via mais diferencialmente regulada entre WT-NeM & # x003c6 e WT-ThioM & # x003c6 (Tabela suplementar 6). A característica mais marcante da expressão do complemento em AAM & # x003c6 foi a abundância de transcritos (Figura 5). Por exemplo, C3 e C4 atraiu & # x0003e 100.000 leituras cada, tornando-as entre as transcrições associadas a NeM & # x003c6 mais abundantes. NeM & # x003c6 mostrou regulação positiva de genes complexos C1q (C1qa, C1qb, e C1qc), e impressionante superexpressão de constituintes da via MBL, especificamente FicolinA (FcnA), Cfb, e Cfp (Figura 9 suplementar). Isso sugere um papel para a atividade do complemento dependente de FicolinA na resposta à infecção por helmintos.

    Os componentes do complemento são expressos abundantemente de uma maneira dependente de ativação alternativa. A expressão de genes no complemento e na cascata de coagulação (via KEGG mmu: 04610). Para referência, a mediana e 90º percentis de expressão para todos os genes expressos estão incluídos (linhas vermelhas sólidas e tracejadas, respectivamente). Além disso, genes marcadores altamente expressos Chi3l3 (YM-1) e Retnla (RELM & # x003b1) são incluídos para referência.

    Metabolismo mitocondrial.

    Vinte e três das 27 vias reguladas mais diferencialmente entre WT-NeM & # x003c6 e WT-ThioM & # x003c6 eram metabólicas (Figura 10 suplementar Tabela 6 suplementar). Uma tendência semelhante foi observada entre WT-NeM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6, apoiando um modelo em que uma mudança no fenótipo metabólico é uma característica fundamental da ativação alternativa 4 (Figura 10 suplementar). A segunda via KEGG mais perturbada entre WT-NeM & # x003c6 e WT-ThioM & # x003c6 foi o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (Tabela suplementar 6). Na verdade, a maioria dos genes do ciclo de TCA expressos foram expressos em um nível mais alto em WT-NeM & # x003c6 em relação a WT-ThioM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 (Figura 6 Uma Figura suplementar 11). Um padrão semelhante de expressão gênica também foi observado para genes envolvidos na fosforilação oxidativa (Figura 6 B). Tomados em conjunto, esses achados são consistentes com estudos anteriores que mostram que a IL4 induz a expansão do compartimento mitocondrial em macrófagos in vitro. 32

    AAM & # x003c6 regula positivamente os genes do ciclo do TCA mitocondrial e mostra evidências de transcrição dependente de PPAR in vivo. (A) Esquema do ciclo de TCA mostrando genes DE em WT-NeM & # x003c6 em relação a WT-ThioM & # x003c6. A borda azul representa a borda regulada para cima e a borda amarela e a regulação para baixo. Além disso, um asterisco vermelho indica genes regulados positivamente em WT-NeM & # x003c6 em relação a IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. (B) Mapa de calor mostrando a expressão relativa dos componentes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) entre WT-NeM & # x003c6, IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 e WT-ThioM & # x003c6. A maioria dos componentes ETC são mais expressos em WT-NeM & # x003c6. (C) Os níveis de expressão dos transcritos que codificam para PPAR & # x003b3, PPAR & # x003b4 e a proteína coativadora PGC-1 & # x003b2 mostram que WT-NeM & # x003c6 expressa altos níveis de PPAR & # x003b4 e PGC-1 & # x003b2, mas não PPAR & # x003b3. (D) Confirmação da precisão da previsão do TSS. O gráfico de densidade mostra as distâncias do TSS previsto para cada gene até o TSS Ensembl annoated mais próximo (desvio médio absoluto = 32 bp). (E) Motivos de consenso para os 3 locais de ligação de fator de transcrição sobre-representados em regiões promotoras associadas a AAM & # x003c6 identificadas usando Clover (P & # x0003c .01), comparação de regiões promotoras associadas a AAM & # x003c6 (TSS & # x02212400, +100 bp) contra promotores de macrófagos não associados a AAM & # x003c6.

    PPAR & # x003b3 e PGC-1 & # x003b2, reguladores chave do metabolismo mitocondrial, foram descritos como necessários para a ativação de macrófagos alternativos in vitro. 12,32 Assim, o perfil metabólico que observamos pode ser explicado pela atividade transcricional dos membros da família PPAR (PPAR & # x003b1, PPAR & # x003b3 e PPAR & # x003b4). No entanto, durante B malayi infecção, camundongos PPAR & # x003b3 & # x02212 / & # x02212 específicos para macrófagos não mostram prejuízo na ativação alternativa (D.R., dados não publicados, outubro de 2009). Além disso, embora a expressão de PGC-1 & # x003b2 tenha sido aumentada de um modo IL4R & # x003b1- e dependente de infecção, os níveis de PPAR & # x003b3 foram substancialmente mais baixos em NeM & # x003c6 do que em ThioM & # x003c6 (Figura 6 C). PPAR & # x003b1 não foi expresso por nenhuma das populações de macrófagos testadas (Tabela 5 suplementar). Apenas a expressão de PPAR & # x003b4 foi mantida em NeM & # x003c6, mas não foi regulada para cima (Figura 6 C). Isso sugere que, durante a infecção por helmintos, PPAR & # x003b4 pode compensar, parcial ou completamente, PPAR & # x003b3 reduzido em NeM & # x003c6. Alternativamente, a transcrição independente de PPAR pode manter o metabolismo mitocondrial em NeM & # x003c6.

    Identificação de TSS e análise da região do promotor

    Para determinar se os PPARs facilitam a transcrição de genes dependentes de IL4R & # x003b1 in vivo, analisamos locais de ligação de fator de transcrição (TFBSs) nos promotores de genes associados a AAM & # x003c6. Desenvolvemos e otimizamos um método para identificar com precisão os TSSs usando dados de RNA-Seq (Figura 6 D para detalhes do método e validação, consulte Métodos suplementares). Resumidamente, os transcritos foram definidos usando Cufflinks, 33 e TSSs identificados com base na expressão gênica esperada e na profundidade de leitura de sequenciamento observada em cada posição no gene. As sequências do promotor proximal (300 pb a montante e 100 pb a jusante de cada TSS) foram obtidas a partir de 7817 TSSs de alta confiança e analisadas para TFBSs sobre-representados.

    Validamos nosso método identificando TFBSs sobre-representados em nossos promotores em relação a todos os promotores de camundongos usando Clover, 34 e comparando o conjunto encontrado com os TFBSs restritos à linhagem de macrófagos identificados por Hume et al. 35 Em nossos dados, identificamos 54 motivos que estavam presentes significativamente mais frequentemente do que o esperado (P & # x0003c .01). Hume e cols. 35 usaram uma biblioteca diferente de motivos TFBS e identificaram 27 motivos significativos, 23 dos quais estavam representados na biblioteca que usamos. Nossa análise identificou 18 deles (78%) como super-representados em nossos promotores de macrófagos, reforçando as descobertas do estudo anterior e confirmando a precisão de nossas previsões.

    Os promotores foram categorizados de acordo com as características de expressão de seus genes parentais. Identificamos 682 promotores associados a AAM & # x003c6, derivados de genes regulados positivamente em WT-NeM & # x003c6 em relação a WT-ThioM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. Os 7135 promotores restantes foram classificados como promotores de macrófagos genéricos. Comparamos os promotores associados a AAM & # x003c6 com o conjunto genérico e identificamos apenas 3 motivos TFBS sobre-representados: MZF1, ZNF354c e PPARG: RXRA (também conhecido como elemento de resposta PPAR [PPRE] Tabela 2 Figura 6 E). Usamos o Regulatory Sequence Analysis Toolkit 36 ​​para contar o número de instâncias de cada motivo em nosso conjunto de 682 AAM & # x003c6-promotores associados e descobrimos que 113 (17%) continham elementos PPRE de alta confiança. Como os motivos de consenso MZF1_1-4 e ZNF354c são muito curtos, não foi possível quantificá-los no limite de significância padrão (P & # x0003c .00001). A observação de um PPRE abundante e super-representado identifica a transcrição mediada por PPAR como um componente significativo da regulação da transcrição associada a AAM & # x003c6 in vivo.

    Mesa 2

    As 3 matrizes de peso de posição estatisticamente super-representadas em promotores associados a AAM & # x003c6 em relação a todos os promotores de macrófagos

    Motivo de jasparTrevo P
    MZF1_1-4 coordenação de zinco.000
    PPARG :: RXRA coordenação de zinco.004
    Coordenação de zinco ZNF354C.006

    Trevo P o valor foi determinado por teste de permutação com 1000 iterações.

    Análise e quantificação de eicosanóides derivados de NeM & # x003c6

    GO e KEGG GSEA identificaram expressão aumentada do gene mitocondrial e metabólico, especificamente o ciclo do TCA, como infecção e processos dependentes de IL4R & # x003b1 (Figura 6 A-B). Nossa análise de AAM & # x003c6-associado cis- os recursos regulatórios também apoiaram uma função para o envolvimento do PPAR (Figura 6 E). Juntos, estes sugerem fortemente que a transcrição mediada por PPAR é um componente de condução do fenótipo AAM & # x003c6 in vivo. PPAR & # x003b3 e fosforilação oxidativa são descritos como necessários para ativação alternativa, 4 ainda que a expressão de NeM & # x003c6 PPAR & # x003b3 fosse baixa (Figura 6 C). Como o PPAR & # x003b4 potencializa a célula kupffer alternativa 37 e a ativação de macrófagos do tecido adiposo 38, formulamos a hipótese de que pode compensar PPAR & # x003b3 em NeM & # x003c6. A família PPAR são fatores de transcrição dependentes de ligantes. Assim, embora PPAR & # x003b4 não fosse DE, exploramos a possibilidade de que o aumento da disponibilidade do ligante pode modular a transcrição dependente de PPAR & # x003b4 em NeM & # x003c6.

    A análise da via KEGG identificou o metabolismo do ácido araquidônico (AA), uma fonte conhecida de ligantes PPAR, como regulado positivamente em WT-NeM & # x003c6 (Tabela suplementar 6). Os produtos da cascata de enzimas AA, os eicosanóides, compõem uma ampla variedade de mediadores pró-inflamatórios e antiinflamatórios, incluindo as prostaglandinas, leucotrienos e lipoxinas. Nós caracterizamos uma ampla gama desses compostos produzidos por NeM & # x003c6 e ThioM & # x003c6 usando LC-MS / MS em um experimento homólogo independente (sem o grupo de tioglicolato IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212). Eicosanóides individuais (para uma lista completa de espécies, consulte Métodos suplementares) foram medidos em fluido de lavagem peritoneal e ex vivo em culturas de 12 horas de macrófagos purificados por aderência. Culturas ex vivo mostraram que NeM & # x003c6 produziu significativamente mais eicosanóides do que ThioM & # x003c6 (Figura 7 A), independentemente da expressão de IL4R & # x003b1. Isto não pode ser atribuído à atividade aumentada das enzimas fosfolipase A2 de liberação de AA, uma vez que os transcritos de Pla2 foram expressos em ThioM & # x003c6 em um nível comparável a NeM & # x003c6 (Figura 12 suplementar). Isso sugere que os efeitos independentes de IL4R & # x003b1 de B malayi impulsionar o catabolismo AA.

    Caracterização de eicosanóides derivados de AAM & # x003c6. (A) Quantificação de metabólitos do ácido araquidônico (AA) em culturas de macrófagos purificados de 12 horas (parte superior) e em lavagens peritoneais (parte inferior). (B) gráfico de pontuação de PCA para culturas de 12 horas de macrófagos purificados. (C) Gráfico de carregamento de PCA para o painel B, mostrando como os eicosanóides individuais contribuem para os eixos principais primário e secundário (x e y, respectivamente). (D) Gráfico de pizza mostrando a quebra na produção de metabólitos da ciclo-oxigenase entre WT-NeM & # x003c6 e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. (E) Esquema da cascata AA reproduzida usando VANTED. Caixas quadradas com texto em vermelho representam genes e caixas arredondadas com texto em preto, metabólitos medidos. Setas pretas indicam reações enzimáticas e setas vermelhas, auto-oxidação. Os valores de expressão relativa (normalizados de modo que o total de todas as 3 condições = 1) estão abaixo do gene / metabólito associado. WT B malayi (caixa à esquerda) IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 B malayi implantado (centro) e tioglicolato WT (direita). (F-G) pontuações de PCA e gráfico de carregamento como nos painéis B e C para as lavagens peritoneais.

    A análise de componentes principais (PCA) dos perfis de eicosanóides de macrófagos cultivados mostrou que os 3 grupos de tratamento formaram clusters distintos (Figura 7 B). IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 produziu altos níveis de PGE pró-inflamatório2 e metabólitos a jusante que promovem a inflamação da fase aguda. 39 WT-NeM & # x003c6 foram caracterizados pela produção dos metabólitos HETE derivados de 12/15-lipoxigenase & # x02013, predominantemente 12-HETE (Figura 7 C). Curiosamente, de longe o derivado de Cox mais abundante em WT-NeM & # x003c6 foi 6-ceto-PGF1 e # x003b1, o produto de auto-oxidação da prostaciclina agonista PPAR & # x003b4 (PGI2 39 Figura 7 D).

    A integração dos perfis lipidômicos e dos dados de expressão gênica nos permitiu entender melhor a relação entre os perfis transcricionais e o fenótipo metabólico. Traçamos a expressão gênica e os dados de metabólitos em um mapa da via da cascata enzimática, relacionando o catabolismo de AA à produção de metabólitos. 41 As alterações na expressão do gene da sintase mostraram alta concordância com as abundâncias relativas dos metabólitos filhos (Figura 7 E), com uma exceção notável. Apesar da expressão robusta de Gpx1, Alox5, e Lta4h, não fomos capazes de detectar quaisquer metabólitos derivados de 5-lipoxigenase, 5-HETE 5-OxoETE, LTB4, ou 20-OH LTB4 (Figura 13 suplementar). Assim, os macrófagos peritoneais foram preparados para produzir leucotrienos, mas não o fizeram. A competição de substrato por AA ou controle de nível superior da biossíntese de leucotrieno pode explicar essa observação. Em resumo, a produção de eicosanóides por macrófagos é estimulada em resposta a B malayi. Em vez de afetar a produção total de eicosanóides, a sinalização dependente de IL4R & # x003b1 modulou a arquitetura da cascata enzimática a jusante, levando a um perfil de eicosanóides mais antiinflamatório.

    As interações heterotípicas contribuem para o perfil de eicosanóides in vivo. Para discernir as contribuições relativas de eicosanóides derivados de macrófagos e não derivados de macrófagos, medimos os produtos de AA na lavagem peritoneal dos camundongos no mesmo experimento (Figura 13 suplementar). Os gráficos de PCA (Figura 7 F) não mostraram distinção entre WT tioglicolato injetado e IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -B malayi& # x02013 ratos implantados. O WT B malayi& # x02013 indivíduos implantados, no entanto, agruparam-se distintamente, mostrando que a resposta a B malayi a implantação gerou um ambiente de eicosanóide único, dependente de IL4R & # x003b1. Isso também implica que B malayi não é uma fonte importante de eicosanóides peritoneais totais neste modelo. Camundongos implantados com WT aumentaram HETE, PGD2e TxB2 concentrações (Figura 7 G), os últimos 2 dos quais são quimioatraentes eosinófilos. 42,43 É improvável que o PGD2 foi derivado de macrófagos uma vez que níveis baixos foram produzidos em culturas AAM & # x003c6 ex vivo. TxB2 as concentrações correlacionadas com, e podem ser explicadas por, o aumento no número de macrófagos associados à infecção em um ambiente WT (Figura suplementar 14A-B). Portanto, identificamos um perfil efetor lipídico distinto na resposta à infecção por helmintos. Embora a atividade da 5-lipoxigenase não tenha contribuído para esse perfil, as ações da ciclooxigenase e 12/15-lipoxigenase sim.


    S.D., S.A.S., V.A., G.G., M.L. e M.H. projetou a pesquisa, S.D., S.A., N.H. e S.A.S. fez as experiências, S.D., X.L., S.A.S., A.R.F, V.A., G.G., V.M., M.L. e M.H. realizou análise de dados e S.D., X.L., M.L., M.H. e S.A.S. escreveu o manuscrito. Todos os autores revisaram o manuscrito.

    Os dados que suportam os resultados deste estudo serão compartilhados após a publicação. Os dados de RNA-Seq e Chip-seq serão depositados no arquivo de leitura de sequência.

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    Assista o vídeo: How to analyze RNA-Seq data? Find differentially expressed genes in your research. (Agosto 2022).