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Pedaços de células após tripsinização

Pedaços de células após tripsinização



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Recentemente, encontrei um problema após a tripsinização de minhas células CHO estavelmente transfectadas. Quando adiciono meio para enxaguar as células do fundo do frasco, geralmente há grandes pedaços de células, que quase não consigo ressuspender adequadamente ... Também tentei aumentar o tempo de incubação com tripsina, mas não ajudou muito.

Alguém tem uma solução para isso? A tripsina que uso é o mesmo lote de costume e, entretanto, também descongelei 2 caldos de congelamento diferentes, mas ainda tenho o mesmo problema.

Também experimentei diferentes pipetas, de 25 a 5mL. Mas posso pipetar como um maníaco para cima e para baixo e para cima e para baixo ... ainda há grandes blocos de células flutuando ...


A Gibco tem um agente anti-aglomerante verificado para células CHO, assim como o Lonza, mas eu gosto mais dos reagentes Gibco. As células tendem a se aglomerar por uma série de razões, incluindo DNA extracelular de células lisadas e a presença de íons Ca e Mg (íons importantes para a adesão e agregação celular).

Você pode tentar estes:

1) Lavar e ressuspender em solução salina balanceada sem magnésio ou cálcio. Como a solução salina balanceada de Hank.

ou

2) Trate com DNase I. Eu acho que você poderia ir tão baixo quanto 1 UI / mL por 30min-1hr para estourar uma boa quantidade de aglomeração de DNA. Você pode fazer isso em um meio basal (como RPMI, DMEM, etc.) ou em uma solução salina balanceada. Seu meio pode conter soro somente se o soro foi inativado pelo calor como proteases no soro com a inativação de sua DNase. Incubar com DNase sob agitação suave a 37 ° C (sempre tive um rotador de tubo em uma incubadora para esse propósito, basta colocar suas células em uma cônica de 50mL e agitar por 1h. Você também pode usar um agitador aquecido). Se não tiver essa configuração, você pode agitar à temperatura ambiente, mas talvez por um pouco mais de tempo.

e talvez

3) Uma das outras escolhas óbvias é evitar a passagem de suas células aglomeradas e coletar o resto. Você pode fazer isso colocando todas as suas células em um frasco incl. os aglomerados, agite por um momento e deixe descansar para que os pedaços caiam rapidamente para o fundo e colete tudo mas o material que caiu no fundo.


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A carne produzida em laboratório a partir de cultura de tecidos de células animais é sustentável, usando células sem matar o gado, com menor uso da terra e pegada hídrica. Cientistas japoneses conseguiram cultivar pedaços de carne, usando estimulação elétrica para causar a contração das células musculares e imitar a textura do bife.

Bem-vindo à r / science! Este é um subreddit fortemente moderado para manter a discussão na ciência. No entanto, reconhecemos que muitas pessoas querem discutir como acham que a pesquisa se relaciona com suas próprias vidas pessoais, para dar às pessoas um espaço para fazer isso, anedotas pessoais agora são permitidas como respostas a este comentário. Quaisquer comentários anedóticos em outras partes da discussão continuarão sendo removidos e nossas regras normais de comentários ainda se aplicam a outros comentários.

Eu sou um bot e esta ação foi executada automaticamente. Por favor contate os moderadores deste subreddit se você tiver alguma dúvida ou preocupação.

Eu me pergunto - a carne cultivada em laboratório remove o argumento ético para vegetarianos?

Eu quero ouvir esse debate.

Como vegano, acho que a resposta deve ser “Sim - a questão ética foi removida”.

Compreendo que uma biópsia de algum tipo seja inicialmente necessária, mas presumo que, uma vez que a primeira amostra de tecido tenha sido coletada, ela possa continuar a ser usada indefinidamente.

Então, embora eu ache que ainda há danos aos animais no início, isso é realmente insignificante no decorrer do tempo, especialmente quando balanceado com os benefícios que traz.

Os veganos não são, ou pelo menos não deveriam ignorar, que um grande número de insetos, camundongos, etc. são mortos na produção agrícola comum, o que é inevitável e aceito. A maioria dos argumentos racionais da ética animal não são sobre a abolição completa do sofrimento animal, mas sim sobre como evitá-los, sempre que possível.

Depende do que você entende por & quotthe & quot argumento ético, porque existem várias razões éticas para reduzir ou eliminar o consumo de carne.

Isso provavelmente é mais questionado por não-vegetarianos do que por vegetarianos.

Eu ouvi um vegano dizer não.

Eu ouvi outro dizer & quotSim, contanto que não & # x27 tenha o mesmo impacto ambiental & quot

Alguns podem argumentar que ainda é prejudicial aos animais devido às condições em que são criados ou se uma biópsia viva for usada para obter as células animais, mas presumivelmente eles poderiam coletar células animais sem ferir os animais e sem matá-los, então eu estou certeza de que muitos vegetarianos concordariam com isso. Simplesmente não todos eles.

Acho que é importante entender que vegetarianos não são um só povo. Eu ficaria louco com essas coisas, mas eu conheço pessoas que são vegetarianas que não iriam.

Daqueles com quem conversei, eles não têm nenhum problema com isso. A única coisa que eles mencionam é como as células iniciais são obtidas, o que é bastante justo.

sim. Embora para mim, eu como vegetais porque acho que têm um gosto melhor

Eu sou meio vegetariano, mas não pelos motivos usuais. Eu sou judeu e mantenho-me kosher. A carne kosher é tão absurdamente cara que é realmente mais barato ser vegetariano do que comprar carne kosher. (Especialmente durante a pandemia, quando estou limitando o número de lojas em que compro, já que nem todas vendem carne kosher.)

Eu estaria curioso para saber se esta carne é considerada kosher. Normalmente, existem regras estritas que precisam ser seguidas - desde como o animal é criado, sua saúde e como ele é abatido. A maioria deles seria discutível quando se tratava de carne cultivada em laboratório. Assumindo que a vaca original foi criada de maneira adequada e com boa saúde, toda a linha de carne seria boa? Obviamente, não haveria nenhuma doença com que se preocupar. (Os contaminantes seriam mantidos fora do ambiente de cultivo.) Além disso, o abate não seria um problema, uma vez que não é realmente & # quotalivo & quot da mesma forma que uma vaca. Seria interessante ver se isso torna a carne kosher realmente barata.


Pedaços de células após tripsinização - Biologia

Isolamento de células endoteliais de pulmão de camundongo (MLEC) / células endoteliais de coração de camundongo (MHEC)

  • Frascos T-75 revestidos com fibronectina preparados por umedecimento por & gt1 hr. com 2 mL de FN humano (Gibco # 33016-015, 2,5 ug / mL, filtrado estéril, PBS, $ 0,20 / frasco). Um T-75 para dois ratos e para cada passagem.
  • Os frascos revestidos com gelatina a 0,1% também podem ser usados ​​para o plaqueamento das células. (Não use
    gelatina se as células forem utilizadas para experiências de cromatografia em coluna. Descobrimos que a gelatina obstrui as colunas).
  • Meio de isolamento = Alta glicose DMEM + 20% FCS + Caneta / Strep.
  • Meio de crescimento = mesmo + 100 ug / mL de heparina (Sigma H-3933) + 100 ug / mL
    ECGS (Biomedical Technologies, Stoughton, MA, Cat # BT-203) + 1x aminoácidos não essenciais + 2mM L-glutamina + 1x piruvato de sódio + 25mM HEPES.
  • Instrumentos para dissecção de animais (esterilizados em EtOH 70%): duas tesouras, duas pinças.
  • Instrumentos para dissociação de tecido (autoclavado): pinças pequenas, tesouras pequenas e cânula de metal calibre 14 de 6 & rdquo-long (Fisher # 1482516N) e filtro de células B-D Falcon com tamanho de poro de 70um (Fisher # 08-771-2).
  • A colagenase tipo I (Worthington) do Core, dissolvida 2 mg / mL (150-170 U / mg) em 25 mL de DPBS + Ca / Mg & rarr quente a 37 ° C, 1 hr. & rarr 0,22 um filtro estéril.
  • Dynabeads M-450 IgG de ovelha anti-rato (Dynal # 110,07) em PBS + 0,1% de BSA + 0,02% de NaN3. Concentração: 4 x 10 8 contas / mL.
  • Anticorpo purificado de rato anti-CD102 de camundongo (ICAM-2) (Pharmingen # 553325), 1 mg / 1 mL.
  • Anticorpo purificado de rato anti-CD31 de camundongo (PECAM-1, clone MEC13.3) (Pharmingen # 553369), 0,5 mg / 1 mL.
  • DPBS- sem Ca 2+ e Mg 2+

    Preparação de Dynabeads anti-camundongo ICAM-2 (PECAM-1):

  1. Ressuspenda e alíquota de contas em 2 mL de PBS + BSA 0,1%. Misture bem.
  2. Coloque o tubo no separador magnético (por exemplo, Dynal MPC-S) e deixe por 1-2 min.
  3. Remova o sobrenadante e repita a lavagem 3x.
  4. Ressuspenda as esferas ao volume original com PBS + BSA 0,1%.
  5. Adicione 5 uL de Ab purificado para cada 100 uL de grânulos.
  6. Incubar durante a noite no rotador a 4 ° C (ou 2h à temperatura ambiente).
  7. Repita a lavagem como nas etapas 1 e 3 (4x).
  8. Ressuspender os grânulos no volume original com PBS + BSA 0,1% para manter os grânulos em 4x10 8 grânulos / mL.
  9. Armazene as contas a 4 ° C e use em 1-2 semanas.
  10. Azida sódica 0,02% pode ser adicionada como conservante, mas lembre-se de lavar bem antes de usar.

  1. Sacrifique um camundongo adulto jovem por CO2 inalação.
  2. Molhe a pele com EtOH 70%.
  3. Corte a pele acima do púbis com uma tesoura e remova a pele acima do peito.
  4. Coloque o mouse em posição supina em uma placa de isopor em uma bancada. Remova qualquer pele solta das luvas ou do campo.
  5. Corte o abdômen anterior aberto e abaixe o diafragma anterior com uma tesoura estéril.
  6. Segure os lobos do pulmão e do coração e corte o mediastino (com um novo conjunto de tesouras e pinças).
  7. Coloque os lóbulos / coração em 15 mL de meio de isolamento frio em um prato de 10 cm.
  8. Repita as etapas 1 e 7 para um segundo mouse. Combine lóbulos de dois ratos.

  1. Transfira a placa com lóbulos pulmonares para uma capela de fluxo laminar estéril para o trabalho subsequente.
  2. Com uma tesoura esterilizada nova, corte o coração (tomando cuidado para evitar o máximo possível a aorta). Corte o coração ao meio e coloque em um tubo de 50 mL contendo 40 mL de meio de isolamento frio. Agite suavemente.
  3. Em seguida, corte cuidadosamente os lobos pulmonares de qualquer brônquio visível e tecido conjuntivo mediastinal.
  4. Coloque os lóbulos do pulmão em um prato seco de 10 cm e pique finamente com uma tesoura por 1 min.
    (Repita para o coração em um prato separado).
  5. Coloque pedaços de pulmão em 25 mL de pré-aquecida, 37 & degC Colagenase (2 mg / mL). Lave todos os pedaços do prato. (Repita o mesmo para o coração).
  6. Incubar a 37 & degC com agitação suave por 45 min. (agitação do banho de água ou inversão em um forno híbrido).
  7. Usando uma seringa de 30 cc fixada firmemente à cânula, triturar a suspensão 12 vezes, tomando cuidado para evitar a formação de espuma.
  8. Deixe os pedaços assentarem. Pipete a suspensão através de um filtro celular descartável de 70um (Falcon # 35 2350) em um tubo cônico de 50mL. Lave a peneira com 10 mL de meio.
  9. Girar a suspensão de células a 400g (1300 rpm em rotor GH3.7), 8 min., 4 e degC.
  10. Ressuspender em 2 mL de PBS frio + BSA 0,1%, deixar para trás quaisquer aglomerados teimosos.
  11. Conte as células nucleadas (por exemplo, conte em um contador Coulter adicionando 5 uL de suspensão a 10 mL de tampão isotônico + 3 gotas de Zap-globina).

  1. Ressuspenda as células do coração em 1 ml de DPBS- e as células do pulmão em 2 ml de DPBS-. (Pulmão & ndash 1ml / rato, Coração & ndash 1ml / 2 ratos, 2ml / 3 ratos).
  2. Transfira para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5mL. Adicionar Anti-camundongo PECAM-1 Dynabeads (preparado na Seção A) à suspensão de células a 15 ul de grânulos / mL de suspensão de células.
  3. Incubar em um rotador, RT, 10 min.
  4. Monte o tubo em um separador magnético (por exemplo, Dynal MPC-S) e deixe por 1-2 min.
  5. Remova o sobrenadante. As contas + células devem parecer um tanto espumosas se houver um bom rendimento da seleção positiva.
  6. Remova o tubo do separador magnético e ressuspenda as esferas + células em 3 mL de meio por trituração vigorosa. A menos que você seja vigoroso, obterá muitas células contaminantes. (Mais relevante para os MLECs)
  7. Monte no separador magnético por 1-2 min.
  8. Repita as etapas 5 a 7 até que o sobrenadante esteja claro (geralmente 4 a 5 lavagens).
  9. Ressuspender em meio de crescimento e grânulos de placa + células em um frasco T75 revestido de gelatina para pulmões e um frasco T75 revestido de gelatina para coração.
  10. No dia seguinte, enxágue o frasco três vezes com meio de isolamento para remover quaisquer células frouxamente aderentes.

  1. Alimente com meio de crescimento na segunda, quarta e sexta-feira.
  2. Deixe as células crescerem até se aproximar da confluência em 5-9 dias após o plaqueamento. Você deve ver ninhos de & ldquocobblestone & rdquo EC compreendendo células de 10-90%. Outras células mesenquimais são notáveis ​​pela maneira como se acumulam e não formam monocamadas.
  3. Separe as células com Tripsina: EDTA (0,05%: 0,5 M) enxaguando 3x com tampão livre de Ca / Mg e, em seguida, deixe a nova Tripsina: EDTA ligada apenas o tempo necessário para obter uma suspensão de células.
  4. Adicione 10mL de meio de isolamento para inativar a Tripsina.
  5. Transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL e gire a 1300 por 8 min.
  6. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 2 mL de DPBS-.
  7. Adicionar Dynabeads SAR revestidas com ICAM-2 à suspensão de células (15 µl / ml). Incubar por 10 min. RT.
  8. Coloque no ímã e deixe por 1-2 min. Remova o sobrenadante.
  9. Lave suavemente 2x em mídia de 3 mL.
  10. Após a lavagem final ressuspender em 10 mL de meio MEC e placa em T75 revestido com gelatina. (Divida na proporção de 1: 2 se a recuperação das células for boa).

  1. Alimente com meio de crescimento na segunda, quarta e sexta-feira.
  2. Divida as células em 1/3 com Tripsina: EDTA quando atingirem 75-100% de confluência.
  3. Refaça as células endoteliais em um T75 revestido de gelatina. É importante manter o revestimento de alta densidade para evitar um grande número de células senescentes.


Perguntas sobre a divisão da cultura celular - por que você centrifuga as células após neutralizar a tripsina? E tendo problemas com novas técnicas de laboratório. Sou apenas eu?

Olá r / biology, eu & # x27m novo aqui. Acabei de começar uma posição de assistente de pesquisa em um laboratório de ciências básicas em células e, claro, é difícil me sentir inútil no início, porque todos os residentes de pesquisa e técnicos estão ocupados com o aprendizado de novas técnicas (blots, PCRs, etc.) ou ocupados com seus próprios projetos.

Minha maior pergunta, porém, é na divisão celular - por que você centrifuga após a tripsinização das células? Eu sempre aprendi em minha posição anterior no laboratório, que após a tripsinização das células, neutralizando a tryspin com mídia, você tem que centrifugá-la por cerca de 4 minutos. Em seguida, você descarta o sobrenadante, remixa o pellet em um novo 10mL de mídia e, em seguida, distribui em placas. O laboratório aqui não centrifuga, eles apenas pipetam para cima e para baixo por 5 minutos e depois apenas injetam a mistura nas placas.

Quanto a mim, anteriormente, trabalhei 2 anos em um laboratório de células-tronco de ciência básica, 3 anos atrás, e a única coisa que fiz realmente bem foi dividir / plaquear / manter culturas de células. Meu antigo supervisor era super anal sobre ser esterilizado e limpo e limpar tudo com álcool, sempre usando luvas, sempre descartando as coisas corretamente, seja pipetando mídia ou algo realmente perigoso. Especialmente em técnicas de cultura de células.

No meu novo laboratório, além de me sentir inútil, percebi que há grandes diferenças na forma como eles realizam os experimentos. Por exemplo, quando eles pipetam no capô, eles descartam as pontas aleatoriamente em algum canto do capô em vez de em um tubo de 50 mL (como fui ensinado) ou em um frasco de pontas. Ou quando eles removem a mídia velha de uma placa, eles não usam uma pipeta de vácuo + pasteur (queimada para ser estéril), mas sim pipeta. Eles não borrifam suas micropipetas com EtOH com a mesma freqüência quando movem as coisas para dentro e para fora do capô. Não tenho certeza se estou apenas passando por problemas de ajuste ou algo assim ..

É frustrante porque eu sou a pessoa mais inferior do laboratório, não tenho nenhuma habilidade além da cultura de células, mas não quero ser encarregado de células de outras pessoas ainda. E eles (compreensivamente) não acreditaram em mim quando disse que costumava centrifugar células. Há mais coisas, mas sinto que cada vez que pergunto essas coisas, é um pouco irritante para eles. Como & quotoh bem, este é o atalho & quot e eu costumava ser treinado para fazê-lo de certa maneira pelo meu gerente de laboratório anterior há 2,5 anos, que era extremamente habilidoso.


Fundo

Os ensaios clonogênicos e MTT são testes bem conhecidos para avaliação de estudos de quimiorradiação e radiossensibilidade [1–4]. Ensaios clonogênicos são comumente usados ​​para investigar a sobrevivência de células cancerosas irradiadas, enquanto os ensaios de MTT são bem conhecidos para estudar quimiossensibilidade [5] ou toxicidade [6] de drogas em linhagens de células tumorais humanas. O ensaio é menos comum para estudar a sobrevivência de células cancerosas após a irradiação, em particular quando o ensaio MTT é realizado para estudar a proliferação de células tratadas.

O objetivo deste estudo é comparar o ensaio clonogênico bem estabelecido com uma versão adaptada do ensaio de proliferação de MTT para superar limitações como longa duração do experimento, baixo rendimento da amostra, nível de erro limitado e contagem demorada de clones.

O ensaio de MTT é baseado na formação de corante formazan de cor escura pela redução do sal de tetrazólio MTT por células metabolicamente ativas [7]. Após alguma incubação, o corante formazan insolúvel em água forma cristais, que podem ser dissolvidos em um solvente orgânico e a quantidade pode ser determinada de forma semi-automática usando um leitor de microplaca. As leituras de absorvância estão relacionadas ao número de células [8], portanto, fornecendo a possibilidade de usar o ensaio de MTT como um ensaio de proliferação para avaliar o crescimento celular após a irradiação. No presente estudo, nossa versão adaptada do ensaio MTT é comparada ao ensaio clonogênico para abrir a possibilidade de substituição de um pelo outro.

Na literatura podem ser encontrados diversos estudos sobre comparabilidade do MTT e ensaio clonogênico. Lá, o ensaio de MTT é feito como um ensaio de ponto único após um tempo definido após o tratamento. Nesse caso, muitas informações sobre o comportamento de crescimento das células são perdidas (tempo de duplicação, fase de latência, comportamento de crescimento etc.). Em contraste, com nosso ensaio MTT múltiplo, coletamos todos esses dados e os usamos para uma interpretação mais detalhada.


Discussão

Neste manuscrito, delineamos um protocolo para gerar e propagar esferas da próstata (prostatosferas) a partir de tecidos da próstata e linhagens de células humanas e murinas de PCa. Este ensaio depende da capacidade das células-tronco de sobreviver em uma matriz de cultura 3D (por exemplo, Matrigel & # x02122) em meio baixo ou sem soro, enquanto as células diferenciadas crescem em culturas aderentes em monocamada e meio contendo FBS. O plaqueamento primário da suspensão de células únicas em uma matriz 3D não confirma a existência de uma subpopulação de células-tronco enriquecida, que é caracterizada por sua capacidade de autorrenovação e potencial de diferenciação. Propagações múltiplas e em série das esferas são necessárias para confirmar a existência de CSCs dentro de um tumor ou uma linha celular, dependendo de encontrar um SFU / SFE relativamente constante dentro de cada geração.

A questão da autorrenovação representa uma característica central das CSCs e está intimamente associada à sua capacidade patológica de regenerar tumores após o tratamento. Representa a capacidade dessas células de se reproduzir indefinidamente, mantendo sua capacidade multipotente de se diferenciar. 45 discutiram essa questão em termos de propagação e autorrenovação de células-tronco neuronais adultas, cultivadas como neuroesferas em suspensão. (45) Eles argumentam corretamente que as células progenitoras não-tronco retêm a capacidade de autorrenovação e podem de fato se propagar em esferas secundárias ou terciárias (G2 e G3, respectivamente). Teoricamente, as células-tronco da próstata devem manter a capacidade de autorrenovação indefinidamente. Devido às limitações técnicas enfrentadas em vitro, a propagação de esferas derivadas de células da próstata ao longo de cinco gerações (ou mais) pode ser prático para isolar e propagar CSCs da próstata; a capacidade de formação de esferas das células progenitoras diminui subsequentemente, enquanto a das CSCs da próstata é mantida.

A origem clonal das esferas formadas é outro aspecto importante deste ensaio. Trabalhos anteriores mostraram a tendência das neuroesferas de se aglutinarem e se fundirem quando cultivadas em suspensão. Para a geração de colônias clonais a partir de células cultivadas em suspensão para cultura de neuroesferas, a deposição de uma única célula por poço apresentou o critério ouro para atingir esse objetivo (39). Estudos anteriores cultivaram com sucesso prostatosferas em cultura em suspensão isenta de soro, a partir de linhas de células de CaP (51, 52). No entanto, esse problema não foi resolvido adequadamente. O protocolo aqui proposto sugere o crescimento de células em matriz semissólida, para evitar sua migração e agregação, e superar a carga técnica de cultivo de esferas não aderentes a partir de uma única célula por poço. Esferas discretas foram cultivadas e monitoradas a partir de uma suspensão de célula única (Vídeo S1). Matrigel & # x02122 fornece uma matriz enriquecida que contém diferentes glicoproteínas e fatores de crescimento vistos na membrana basal, incluindo colágeno IV, laminina e fator de crescimento de fibroblastos, fornece uma matriz semissólida capaz de simular o rico meio extracelular de células na Vivo (53). O uso de Matrigel & # x02122 foi ainda mais implicado na cultura de organóides de longo prazo, outra modalidade de cultura 3D que espelha de perto o na Vivo próstata de células derivadas de murinos e humanos (54). Além disso, Matrigel & # x02122 foi usado para facilitar o estabelecimento de xenoenxertos tumorigênicos derivados de linhas de células humanas em camundongos imunocomprometidos (53).

Um estudo anterior descobriu que as esferas sólidas 3D de glândulas mamárias, cultivadas em Matrigel & # x02122, poderiam ser usadas para repovoar almofadas de gordura mamária sem glândulas em camundongos atingindo uma frequência de enxerto de 71% (55). Isso significa que as esferas formadas podem ser usadas para transplantes de tecido e que este ensaio pode ser desenvolvido no futuro para ser aplicável em enxertos de tecido humano. Curiosamente, também foi descoberto que o ensaio da esfera poderia ser usado para comparar os mecanismos celulares de células normais e malignas através da decifração de vias ativas e padrões de diferenciação. Verificou-se que as esferas derivadas de tecido pulmonar normal, cultivadas em Matrigel & # x02122, foram capazes de formar um lúmen, enquanto as esferas derivadas de linhagens celulares e biópsias tumorais de câncer de pulmão não foram (56), mostrando um uso potencial da esfera -ensaio de formação para comparar os processos celulares subjacentes que regem as CSCs e aqueles em células-tronco do tecido normal e suas implicações fisiopatológicas na progressão da doença. Outro estudo, de Hur et al. descobriram que hematosferas poderiam ser isoladas do sangue e cultivadas em Matrigel & # x02122 para permitir a formação de uma rede de vasos (57), propondo potenciais implicações terapêuticas para tratar oclusões de artérias coronárias ou artérias ateroscleróticas, por terapias de substituição de vasos.

Como o uso de SFA foi implementado recentemente na avaliação de propriedades semelhantes a células-tronco em tumores, não tem havido muito foco em tratamentos com drogas direcionadas a essas células de auto-renovação. No entanto, houve vários estudos que se concentraram em testar drogas específicas em esferas geradas. SFA foi usado, juntamente com diferentes ensaios, para mostrar que a Nigericina, um antibiótico que suprime a função de Golgi em células eucarióticas, suprime a metástase do câncer colorretal ao inibir a transição epitelial-mesenquimal (EMT) (58). A droga Metformina demonstrou inibir o crescimento das células do carcinoma da tireoide, suprimir a propriedade de auto-renovação das CSCs da tireoide e atuar como um suplemento potencializador dos agentes quimioterápicos (43). Além disso, foi comprovado que Eckol suprime a manutenção das propriedades das células-tronco e malignidades em células do tipo-tronco de glioma, sugerindo, portanto, uma chance reduzida de recorrência do câncer (42). Além disso, descobriu-se que esferas de origem tumoral esofágica envolvem células semelhantes a tronco com elevada atividade de aldeído desidrogenase (59). Berberis libanotica Ehrenb (BLE) extratos também demonstraram ter alto potencial terapêutico em direcionar o CaP e erradicar a capacidade de auto-renovação de CSCs altamente resistentes (35). Todos os exemplos mencionados usaram SFA para avaliar o efeito de drogas nas CSCs ou populações semelhantes a células-tronco em tumores. Esses estudos basearam-se principalmente em dois critérios principais em sua avaliação: o volume médio das esferas geradas e o número médio de esferas formadoras unidades (SFU). Ainda assim, a maioria dos estudos se concentra em testar drogas específicas em esferas geradas para uma única geração, sem avaliar o efeito em esferas propagadas por várias gerações, que possuem propriedades enriquecidas de células-tronco / progenitoras.

Para enfatizar a importância do uso de SFA na pesquisa de células-tronco e câncer, reunimos um protocolo detalhado de como conduzir um ensaio de formação de esferas semissólido com base em Matrigel & # x02122 na ausência ou presença de drogas, consecutiva ou alternativamente, no contexto das células-tronco do CaP. A vantagem de usar esta formação de esfera em vitro ensaio é isolar, propagar, purificar e amplificar populações específicas de normais prostáticos e CSCs. Ele permite estudar células-tronco em diferentes estágios de sua formação (em diferentes gerações) e detectar marcadores de suas vias de sinalização. Também depende exclusivamente da propriedade funcional intrínseca das células-tronco na formação de uma estrutura complexa em um ambiente 3D, ou seja, capacidade de autorrenovação e potencial de diferenciação.


Craig Venter, pioneiro da genômica, prevê o futuro da vida sintética

NOVA YORK - A vida é um sistema de software de DNA, disse o cientista do genoma Craig Venter em um auditório lotado aqui no Museu Americano de História Natural na noite de segunda-feira (21 de outubro). Em sua palestra, Venter ofereceu uma visão longínqua da criação e digitalização da vida sintética.

Criar vida sintética é apenas uma conquista da carreira de Venter e da evolução do campo da biologia. Em 2000, Venter liderou uma das duas equipes que sequenciaram o genoma humano, o projeto de vida. Então, em 2010, sua equipe transplantou DNA feito pelo homem em uma célula bacteriana para criar o primeiro organismo sintético.

Para criar uma célula sintética, disse Venter, ele e seus colegas tiveram que encontrar uma maneira de escrever o software de DNA e inicializá-lo. E essa tecnologia abriu uma série de aplicações práticas, ele explica em seu novo livro "Life at the Speed ​​of Light" (Viking Adult, 2013), no qual Venter conta a história desses marcos e especula sobre o futuro da biologia no idade digital. [Desvendando o genoma humano: 6 marcos moleculares]

Teletransporte biológico

Suas ideias só ficam mais incomuns a partir daí. E se, especulou Venter, alguém pudesse enviar um genoma através do sistema solar à velocidade da luz e reconstituí-lo do outro lado? Por exemplo, se um rover descobrisse vida em Marte, ele poderia sequenciar o DNA da forma de vida e enviar o código de volta para a Terra, onde os cientistas poderiam reconstruir o organismo.

Claro, Venter estava falando sobre formas de vida simples, como bactérias. "Não estamos prontos para transportar humanos pelo universo tão cedo", disse ele.

Mas a realidade ainda é impressionante. A capacidade de sintetizar vida a partir de seu DNA sozinho pode acelerar muito a produção de vacinas, disse Venter. Os cientistas poderiam sequenciar um vírus de gripe emergente em qualquer lugar do mundo e enviar essa sequência pela Internet para empresas farmacêuticas que poderiam desenvolver uma vacina contra ele. Em última análise, disse ele, as pessoas podem ser capazes de baixar sequências genéticas para uma máquina que produz vacinas em suas próprias casas.

Venter e seus colegas lançaram as bases para esses desenvolvimentos, desenvolvendo as ferramentas necessárias para construir células vivas.

Sintetizando a vida

O primeiro passo, explicou Venter, foi fazer um software que pudesse construir seu próprio hardware. Sua equipe criou um bacteriófago sintético, um vírus que infecta bactérias, e o injetou em E. coli células de bactérias. As células incorporaram o DNA sintético em seus genomas e começaram a formar bacteriófagos. [5 tecnologias malucas que estão revolucionando a biotecnologia]

O próximo projeto de Venter foi ambicioso: sua equipe modificou um cromossomo da bactéria Mycoplasma mycoides e o inseriu na célula da bactéria Mycoplasma capricolum. Para fazer isso, sua equipe teve que desenvolver novas técnicas genéticas sofisticadas.

Uma vez inserido no host, M. mycoides“O DNA começou a produzir instruções para enzimas que destruíam o genoma da bactéria hospedeira. O resultado? "Nós transplantamos o genoma de uma célula para outra espécie e, no processo de fazer isso, convertemos uma espécie na outra", disse Venter.

A etapa final foi juntar um cromossomo bacteriano inteiro e colocá-lo em uma célula onde se replicaria - o que não era fácil. Para fazer isso, Venter e sua equipe criaram grandes pedaços de DNA bacteriano e os montaram dentro de uma célula de levedura. Após vários bloqueios de estradas e anos de tentativa e erro, os cientistas produziram a primeira célula sintética em 2010.

O genoma sintético continha uma sequência de "marca d'água" que incluía os nomes dos cientistas que trabalharam nele. Também incluiu citações dos físicos Richard Feynman e Robert Oppenheimer, e esta citação do escritor James Joyce: "Viver, errar, cair, triunfar, recriar vida fora da vida."

Brincando de Deus?

Na medida em que a equipe criou um organismo capaz de prosperar e se auto-replicar, Venter e seus colegas criaram vida.

"No sentido restrito em que mostramos com esse experimento como Deus era desnecessário para a criação de uma nova vida, suponho que sim", escreve Venter em seu novo livro.

Mas, para Venter, sintetizar a vida é apenas o resultado lógico de anos de ajustes genéticos.

A biologia moderna nasceu, acredita Venter, quando o físico austríaco Erwin Schr & oumldinger deu uma série de palestras intitulada "O que é a vida?" em Dublin, em 1943. Schr & oumldinger propôs que os cromossomos eram uma espécie de "script de código", que poderia ser tão simples quanto o código Morse.

Em 1944, três cientistas canadenses e americanos - Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty - realizaram um experimento que provou que o DNA, e não as proteínas, era o material hereditário das células. E em 1953, o biólogo americano James Watson e seu colega britânico Francis Crick descobriram a estrutura do DNA, com base no trabalho de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins.

As décadas de 1960 e 1970 testemunharam enormes avanços na compreensão do DNA e da tecnologia do DNA recombinante. Com base nessas fundações, o grupo de Venter e o Projeto Genoma Humano, financiado publicamente, produziram o primeiro rascunho da sequência do genoma humano em 2000.


Citotoxicidade de ciclodipeptídeos de Pseudomonas aeruginosa PAO1 leva à apoptose em linhas celulares de câncer humano

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista de plantas e animais, que produz fatores de virulência para infectar ou colonizar seus hospedeiros eucarióticos. Ciclodipeptídeos (CDPs) produzidos por P. aeruginosa exibem propriedades citotóxicas para células tumorais humanas. Neste estudo, avaliamos o efeito de uma mistura de CDP, composta de ciclo (L-Pro-L-Tyr), ciclo (L-Pro-L-Val) e ciclo (L-Pro-L-Phe) que foram isolado de P. aeruginosa, em duas linhas de células cancerígenas humanas. Nossos resultados demonstraram que a mistura de CDP promoveu a morte celular em culturas das linhagens celulares de adenocarcinoma cervical HeLa e adenocarcinoma colorretal Caco-2 de maneira dose-dependente, com concentração inibitória de 50% (IC50) de 0,53 e 0,66 mg / mL, para células HeLa e Caco-2, respectivamente. A análise de citometria de fluxo, usando anexina V e iodeto de propídio como indicadores de apoptose e necrose, respectivamente, mostrou claramente que as células HeLa e Caco-2 exibiram características apoptóticas quando tratadas com a mistura de CDP em uma concentração & lt0,001 mg / mL. IC50 os valores para células apoptóticas em células HeLa e Caco-2 foram 6,5 × 10 −5 e 1,8 × 10 −4 mg / mL, respectivamente. Nossos resultados indicam que uma via apoptótica está envolvida na inibição da proliferação celular causada pelo P. aeruginosa Mix CDP.

1. Introdução

Pseudomonas aeruginosa coloniza muitos ambientes biológicos, como solo, plantas e tecido animal, sendo um importante patógeno envolvido em infecções oportunistas em humanos [1] e uma das principais causas de infecções nosocomiais [2]. Vários mecanismos para impulsionar a infecção no hospedeiro foram atribuídos a P. aeruginosa, and, among these, the production of toxins, adhesins, pyocyanin, and other virulence factors plays an important role in infecting different hosts, from plants to animals [3, 4]. P. aeruginosa produces and senses N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) for cell-to-cell communication via a regulatory mechanism known as quorum sensing (QS), which links the perception of bacterial cell density to gene expression. QS coordinates many physiological processes, such as symbiosis, production of virulence factors, resistance to oxidative stress, antibiotic resistance, motility, biofilm formation, and the progression of P. aeruginosa infection in animals [5, 6].

The cyclodipeptides (CDPs) cyclo(D-Ala-L-Val) and cyclo(L-Pro-L-Tyr) have been identified in P. aeruginosa cultures, which led to the proposition that CDPs have the ability to inhibit the activity of regulatory LuxR-type proteins that are involved in AHL-dependent QS signaling. This in turn led to the proposition that CDPs and their derivatives, the diketopiperazines (DKPs), represent a new class of QS signals and that they could potentially act as interkingdom signals. However, the mechanism of action and physiological relevance of CDPs are poorly understood [7, 8].

DKPs are cyclized molecules comprising two amino acids bound by two peptide bonds they are produced by a wide range of organisms, from bacteria to fungi and animals (Figure 1(a)) [9, 10]. DKPs belong to the nonribosomal peptides that are synthesized in microorganisms by a multifunctional assembly of enzymes known as nonribosomal peptide synthases [10] and by CDP synthases, another kind of enzymes that utilizes aminoacylated transfer RNAs as substrates instead of free amino acids [11].

CDPs are structurally diverse, and they have been implicated in multiple functions the CDPs cyclo(D-Ala-L-Val) and cyclo(L-Pro-L-Tyr) have been identified as a new class of QS autoinducers in Pseudomonas strains, based on their ability to activate AHL-dependent biosensors [12–14]. The CDP cyclo(L-Phe-L-Pro) isolated from Lactobacillus plantarum exhibited an antifungal effect against Fusarium sporotrichioides e Aspergillus fumigatus [15], while the CDPs cyclo(L-Leu-L-Pro), cyclo(L-Phe-L-Pro), cyclo(L-Val-L-Pro), cyclo(L-Trp-L-Pro), and cyclo(L-Leu-L-Val) isolated from the deep-sea bacterium Streptomyces fungicidicus showed antifouling effects [16]. Moreover, synthetic CDPs such as cyclo(Phe-Pro) induced apoptosis in the HT-29 colon cancer cell line [17], and cyclo(L-Cys-L-Leu) exhibited potential for scavenging free radicals [18]. Recently, it was reported that P. aeruginosa is capable of interacting with the plant Arabidopsis thaliana via the secretion of CDPs such as cyclo(L-Pro-L-Tyr), cyclo(L-Pro-L-Val), and cyclo(L-Pro-L-Phe), appearing to mimic the biological role of auxin, a natural plant hormone [12] (Figure 1(b)). No Staphylococcus aureus, the aureusimines A/B, comprised of the CDP cyclo(L-Val-L-Tyr) and cyclo(L-Val-L-Phe), respectively, are involved in the regulation of bacterial virulence factors in a murine host [19] similarly, the CDP cyclo(L-Phe-L-Pro) in Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, e V. harveyi is involved in controlling the expression of genes that are important in pathogenicity [20]. Moreover, it was reported that CDPs and DKPs may induce cell death in several cancer cell lines [21], by affecting biological processes such as microtubule polymerization for example, cyclo(D-Tyr-D-Phe), isolated from Bacilo species, induced apoptosis via caspase-3 activation in the A549 pulmonary adenocarcinoma cell line [22]. In addition, it was reported that the CDPs cyclo(L-Leu-L-Pro) and cis-cyclo(L-Phe-L-Pro) isolated from Lactobacillus exhibited antiviral activity against the influenza A (H3N2) virus [23].

Although, in the context of bacteria-mammalian interaction, it has been suggested that CDPs could play an important role in bacterial pathogenesis, bacteria-host signaling, or mammalian cell growth, the mechanisms involved are unknown. Therefore, in this study, we focused on investigating the cellular effect of CDPs produced from P. aeruginosa strain PAO1, a pathogenic bacterium in humans that is capable of secreting the CDPs, cyclo(L-Pro-L-Tyr), cyclo(L-Pro-L-Val), and cyclo(L-Pro-L-Phe) into the culture medium (Figure 1(b)). The biological effects of these CDPs on the growth and/or pathogenesis of mammalian cells remain unknown the P. aeruginosa CDPs could be involved in bacterial host colonization phenomena during disease episodes, where antiproliferative or anti-immune properties of these compounds could affect the host organism. In this regard, we employed the HeLa cervical adenocarcinoma and Caco-2 colorectal adenocarcinoma cell lines as host models in this study.

2. Materials and Methods

2.1. Produtos Químicos e Reagentes

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), antibiotic antimycotic solution (100X) penicillin, streptomycin, and amphotericin B were purchased from Sigma-Aldrich Co. 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) were purchased from Sigma-Aldrich Co. Alexa Fluor 488 annexin V and the PI/dead cell apoptosis kit were obtained from Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Tissue-culture plastic ware was acquired from Corning (Tewksbury, MA, USA).

o P. aeruginosa CDP mix was characterized as described previously [12]. Briefly, the P. aeruginosa WT strain was placed in 100 mL of Luria Bertani (LB) medium and incubated for 24 h at 30°C for bacterial growth. Cell-free supernatants were prepared by centrifugation (10,000 ×g, 25°C for 10 min). The resulting supernatant was extracted twice with ethyl acetate supplied with acetic acid (0.1 mL/L). The extracts were evaporated to dryness using a rotavapor at 60°C (Buchi Co., Lawil, Switzerland). The residue was solubilized in methanol : acetonitrile (1 : 1) and analyzed by GC-MS as described [12]. The CDP mix is constituted by the cyclo(L-Pro-L-Tyr), cyclo(L-Pro-L-Val), and cyclo(L-Pro-L-Phe) in a 1 : 1 : 1 molar ratio. For dose-response assays, the CDP mix was evaporated to dryness, weighed out, and dissolved with DMSO to prepare a 100 mg/mL concentration as stock solution.

2.2. Cell Line Growth

The human cancer cell lines HeLa and Caco-2 were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cell procedures were performed under class II biological safety cabinets. Cells were cultured in DMEM supplemented with 10% (v/v) FBS (complete medium) and 1% antibiotic (10,000 units of penicillin, 10 mg streptomycin, and 25 µg of amphotericin B per mL) solution. The cultures were fed twice a week and maintained at 37°C under 80% humidity and incubated in an atmosphere of 5% CO2. HeLa and Caco-2 cells were collected by trypsinization using trypsin/EDTA buffered solution for 5 min at room temperature, followed by the addition of 5 mL of serum-enriched medium (CM) to stop trypsin action. After trypsinization the cells were collected and washed with CM. Finally, cells were counted in a hemocytometer chamber and incubated in fresh CM media.

2.3. Cell Viability Assay

Cell viability was determined by the MTT colorimetric method using thiazolyl blue tetrazolium bromide (Sigma-Aldrich Co). Briefly, HeLa and Caco-2 cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 3 × 10 4 cells per well in 200 µL of CM and incubated for 24 h at 37°C as described above. Then, the medium was removed and replaced with new CM or serum-free medium (SS). Then, cells were incubated with CDP mix solution at indicated concentration. Cells were incubated for another 24 h at 37°C. To determine cell viability, 10 µL of 5 mg MTT per mL in PBS was added to each well and incubated for 4 h at 37°C. Finally, 100 µL of 2-propanol/1 M HCl (19 : 1 v/v) was added to dissolve the formazan crystals. Absorbance measurements were conducted utilizing a microplate spectrophotometer (IMarK Microplate Reader, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) at 595 nm.

2.4. Necrosis and Apoptosis Assay

HeLa and Caco-2 cell lines were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 3 × 10 4 cells per well in 200 µL of CM and incubated for 24 h at 37°C. Then, cells were synchronized with SS medium for 12 h at 37°C and were incubated with different concentrations of CDPs mixture. DMSO was used as control at same concentration used to dissolve the CDP mix. To determinate the apoptotic effect, cells were collected by centrifugation at 2,000 ×g for 10 min. The pellet was suspended in 20 µL of SS medium and treated with annexin V and propidium iodide (PI) (Dead Cell Apoptosis Kit Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) following the indications recommended by the manufacturer. Fluorescence was immediately quantified by flow cytometry (FC) using a BD Accuri C6 Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). The populations of cells for each of the treatments were gated in forward scatter and side scatter dot plots to eliminate cell debris. Populations corresponding to auto- or basal-fluorescence were located in the left quadrant and cells with emission of fluorescence increasing at least one log unit value were located in the right quadrant of the dot plots. In addition, the percentage of fluorescent cells (PFC) and median fluorescence intensity (FI) were determined in monoparametric histograms of fluorescence emission obtained from the dot plots and labeled as PFC and as relative units of fluorescence. The equipment was calibrated using Spherotech 8-peak (FL1–FL3) and 6-peak (FL-4) validation beads (BD Accuri, San Jose, CA, USA). For apoptosis and necrosis assays, fluorescence for annexin V in emission fluorescence channel FL1 at 495/519 nm and for propidium iodide in the FL2 channel at 535/617 nm was monitored. A minimum of 20,000 cellular events were analyzed.

2,5. Cell Image Captures

HeLa and Caco-2 cells were seeded in 12-well flat-bottomed plates with sterile-covered round objects covered with collagenase at a density of 1 × 10 4 cells per well with one mL of CM and incubated for 24 h at 37°C. Cells were incubated with serum-free medium (SS) for 12 h at 37°C and an atmosphere of 5% CO2 and incubated with different concentrations of the CDP mix. After 12 h of treatment, the cells were washed with PBS. Cells were fixed with paraformaldehyde (PFA at 4%) for 10 min on ice. Then, cells were incubated with DAPI (1 : 1,000) for 10 min at room temperature. Finally, cells were washed with PBS, and the cover glass was removed and placed into a holder with a drop of PBS and glycerol 1 : 1. Cultured cells were photographed using an inverted phase-contrast microscope (Carl-Zeiss HB0-50, San Diego, CA, USA) equipped with an AxioCam/Cc1 digital camera. Cultures of HeLa and Caco-2 cells were grown in CM and incubated with DAPI and visualized using a confocal microscope (Olympus FV1000, Center Valley, PA, USA). The cells were observed by fluorescence emission between 405 and 505 nm.


Detailed product information

Em geral

Handling information

Each type of cell or cell line responds to Trypsin-EDTA for Primary Cells in a unique manner. For optimum results, continuously observe the cells during the dissociation process to prevent damage. For cell-specific information, please refer to the product sheet supplied with the cells or cell line.

  1. Bring the DPBS, the Trypsin-EDTA for Primary Cells, and the Trypsin Neutralizing Solution to room temperature before use. Warm the complete growth medium to 37°C prior to use with the cells.
  2. For each flask, carefully aspirate the spent media without disturbing the monolayer. If the cell culture medium contains serum, each flask should be rinsed with DPBS twice prior to adding the Trypsin-EDTA for Primary Cells.
  3. Using 1 to 2 mL for every 25 cm2, add the appropriate volume of trypsin-EDTA solution to each flask (e.g., each T-25 flask would be dissociated with 1 to 2 mL trypsin-EDTA).
  4. Gently rock each flask to ensure complete coverage of the trypsin-EDTA solution over the cells, and then aspirate the excess fluid off of the monolayer do not aspirate to dryness.
  5. Observe the cells under the microscope. When the cells pull away from each other and round up (typically within about 3 to 6 minutes), remove the flask from the microscope and gently tap the culture flask from several sides to promote detachment of the cells from the flask. Do not over-trypsinize as this will damage the cells.
    1. Some strongly adherent cell types, such as keratinocytes, may take much longer and may require trypsinization at 37°C.
    2. Some cell types may require more vigorous tapping.
    1. Do not over centrifuge cells as this may cause cell damage.
    2. After centrifugation, the cells should form a clean loose pellet.

    Quality control specifications

    Legal disclaimers

    The product is provided 'AS IS' and the viability of ATCC ® products is warranted for 30 days from the date of shipment, provided that the customer has stored and handled the product according to the information included on the product information sheet, website, and Certificate of Analysis. For living cultures, ATCC lists the media formulation and reagents that have been found to be effective for the product. While other unspecified media and reagents may also produce satisfactory results, a change in the ATCC and/or depositor-recommended protocols may affect the recovery, growth, and/or function of the product. If an alternative medium formulation or reagent is used, the ATCC warranty for viability is no longer valid. Except as expressly set forth herein, no other warranties of any kind are provided, express or implied, including, but not limited to, any implied warranties of merchantability, fitness for a particular purpose, manufacture according to cGMP standards, typicality, safety, accuracy, and/or noninfringement.

    This product is intended for laboratory research use only. It is not intended for any animal or human therapeutic use, any human or animal consumption, or any diagnostic use. Any proposed commercial use is prohibited without a license from ATCC.

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    Assista o vídeo: El subcultivo de células en monocapa. Video 2 (Agosto 2022).