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Qual é o protocolo CRISPR / Cas9 mais atualizado?

Qual é o protocolo CRISPR / Cas9 mais atualizado?



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Estou coletando literatura para iniciar um novo projeto de edição de genes CRISPR / Cas9. Devo montar um protocolo para começar e pretendo usar o seguinte papel como orientação:

"Engenharia do genoma utilizando o sistema CRISPR-Cas9". Nature Protocol 8 (11): 2281-308 · Novembro de 2013

Você poderia indicar se este é o protocolo geral publicado mais confiável e recente para o sistema CRISPR / Cas9.


Realmente depende do que você deseja fazer com ele. Seguindo a engenharia do genoma em células humanas, Nature Protocol 8 (11): 2281-308 · Novembro de 2013 é o padrão de fato. Uma melhoria que sugiro é substituir o "Ensaio Surveyor" pela análise de deconvolução de traços de sequenciamento usando TIDE.


Terapia genética CRISPR / Cas

Correspondência Baohong Zhang, Departamento de Biologia, East Carolina University, Greenville, NC 27858, EUA.

Departamento de Biologia, East Carolina University, Greenville, Carolina do Norte, EUA

Correspondência Baohong Zhang, Departamento de Biologia, East Carolina University, Greenville, NC 27858, EUA.

Resumo

Agrupadas repetições palindrômicas curtas com espaçamento regular (CRISPR) / enzima associada a CRISPR (Cas) é uma ferramenta de edição de genoma de ocorrência natural adotada a partir do sistema de defesa imune adaptativo procariótico. Atualmente, a edição do genoma baseada em CRISPR / Cas9 tem se tornado uma das ferramentas mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas humanas, incluindo doenças cardiovasculares, neuro-desordens e cânceres. Como a modificação rápida do sistema CRISPR / Cas9, incluindo o sistema de entrega, a terapia genética baseada em CRISPR / Cas9 foi extensivamente estudada em tratamentos pré-clínicos e clínicos. A edição do genoma CRISPR / Cas também é uma ferramenta robusta para criar modelos genéticos animais para estudar e tratar doenças genéticas humanas, particularmente doenças associadas a mutações pontuais. No entanto, desafios significativos também permanecem antes que a tecnologia CRISPR / Cas possa ser rotineiramente empregada na clínica para o tratamento de diferentes doenças genéticas, que incluem toxicidade e resposta imune de células tratadas ao componente CRISPR / Cas, método de entrega de alto rendimento e potencial impacto fora do alvo . O efeito fora do alvo é uma das principais preocupações para a terapia genética CRISPR / Cas9, mais pesquisas devem ser focadas em limitar esse impacto, projetando gRNAs de alta especificidade e usando alta especificidade de enzimas Cas. Modificar o método de entrega CRISPR / Cas9 não só tem como alvo um tecido / célula específico, mas também limita potencialmente o impacto fora do alvo.


Resumo

As malformações congênitas são a principal causa de mortalidade infantil nos Estados Unidos e na Europa. Devido aos rápidos avanços na genômica humana, podemos agora identificar com eficiência as variantes de sequência que podem causar doenças nesses pacientes. No entanto, estabelecer a causalidade da doença permanece um desafio. Além disso, no caso de doença cardíaca congênita, muitos dos genes candidatos identificados são novos para o desenvolvimento embrionário ou não têm função conhecida. Portanto, há uma necessidade premente de desenvolver tecnologias baratas e eficientes para rastrear esses genes candidatos à fenocopia da doença em sistemas modelo e realizar estudos funcionais para descobrir seu papel no desenvolvimento. Para este propósito, procuramos testar a edição de genes baseada em F0 CRISPR como uma estratégia de perda de função para fenocopia de doença no organismo modelo de sapo, Xenopus tropicalis. Demonstramos que o sistema CRISPR / Cas9 pode modificar com eficiência ambos os alelos na geração F0 dentro de algumas horas após a fertilização, recapitulando até mesmo os fenótipos iniciais da doença que são altamente semelhantes aos knockdowns de morfolino oligos (MOs) em quase todos os casos testados. Descobrimos que injetar proteína Cas9 é dramaticamente mais eficaz e menos tóxico do que cas9 mRNA. Concluímos que a modificação do gene F0 baseada em CRISPR em X. tropicalis é eficiente e com boa relação custo-benefício e recapitula prontamente a doença e os fenótipos de MO.


Referências

Porteus, M. Edição de genoma: uma nova abordagem para a terapêutica humana. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56, 163–190 (2016).

Porteus, M.H. Rumo a uma nova era na medicina: edição terapêutica do genoma. Genome Biol. 16, 286 (2015).

Naldini, L. Ex vivo transferência e correção de genes para terapias baseadas em células. Nat. Rev. Genet. 12, 301–315 (2011).

Cox, D.B.T., Platt, R.J. & amp Zhang, F. Edição terapêutica do genoma: perspectivas e desafios. Nat. Med. 21, 121–131 (2015).

Cong, L. et al. Engenharia de genoma multiplex usando sistemas CRISPR / Cas. Ciência 339, 819–823 (2013).

Jinek, M. et al. Uma endonuclease de DNA guiada por RNA duplo programável na imunidade bacteriana adaptativa. Ciência 337, 816–821 (2012).

Hendel, A. et al. Os RNAs guia quimicamente modificados aumentam a edição do genoma CRISPR-Cas em células primárias humanas. Nat. Biotechnol. 33, 985–989 (2015).

Osborn, M.J. et al. Avaliação da edição do gene TCR alcançada por TALENs, CRISPR / Cas9 e nucleases megaTAL. Mol. Ther. 24, 570–581 (2016).

Schumann, K. et al. Geração de células T humanas primárias knock-in usando ribonucleoproteínas Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 112, 10437–10442 (2015).

DeWitt, M.A. et al. Edição do genoma livre de seleção da mutação falciforme em células-tronco hematopoéticas / progenitoras humanas adultas. Sci. Tradução Med. 8, 360ra134 (2016).

Gundry, M.C. et al. Edição de genoma altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas humanas e murinas por CRISPR / Cas9. Cell Rep. 17, 1453–1461 (2016).

Porteus, M.H. & amp Baltimore, D. As nucleases quiméricas estimulam o direcionamento de genes em células humanas. Ciência 300, 763 (2003).

Rouet, P., Smih, F. & amp Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease estimula a recombinação homóloga em células de mamíferos. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91, 6064–6068 (1994).

Kass, E.M. & amp Jasin, M. Colaboração e competição entre DNA double-strand break repair pathways. FEBS Lett. 584, 3703–3708 (2010).

Dever, D.P. et al. Direcionamento do gene β-globina CRISPR / Cas9 em células-tronco hematopoéticas humanas. Natureza 539, 384–389 (2016).

Hendel, A. et al. Quantificar resultados de edição de genoma em loci endógenos com sequenciamento SMRT. Cell Rep. 7, 293–305 (2014).

Barzel, A. et al. O direcionamento de genes sem promotor sem nucleases melhora a hemofilia B em camundongos. Natureza 517, 360–364 (2015).

Miller, D.G., Petek, L.M. & amp Russell, D.W. O direcionamento de genes humanos por vetores de vírus adeno-associados é aprimorado por quebras de fita dupla de DNA. Mol. Célula. Biol. 23, 3550–3557 (2003).

Russell, D.W. & amp Hirata, R.K. Direcionamento de genes humanos por vetores virais. Nat. Genet. 18, 325–330 (1998).

Song, L. et al. Transdução de alta eficiência de células-tronco hematopoéticas humanas primárias e expressão restrita à linhagem eritróide por vetores de sorotipo AAV6 otimizados em vitro e em um modelo de xenoenxerto murino na Vivo. PLoS One 8, e58757 (2013).

Wang, J. et al. Edição de genoma impulsionada por homologia altamente eficiente em células T humanas, combinando mRNA de nuclease de dedo de zinco e entrega de doador AAV6. Nucleic Acids Res. 44, e30 (2016).

Sather, B.D. et al. Modificação eficiente de CCR5 em células hematopoéticas humanas primárias usando uma nuclease megaTAL e modelo de doador AAV. Sci. Tradução Med. 7, 307ra156 (2015).

De Ravin, S.S. et al. Adição de genes direcionados em células hematopoéticas CD34 + humanas para correção de doença granulomatosa crônica ligada ao X. Nat. Biotechnol. 34, 424–429 (2016).

De Ravin, S.S. et al. Reparo do gene CRISPR-Cas9 de células-tronco hematopoéticas de pacientes com doença granulomatosa crônica ligada ao X. Sci. Tradução Med. 9, aah3480 (2017).

Baum, C.M., Weissman, I.L., Tsukamoto, A.S., Buckle, A.M. & amp Peault, B. Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89, 2804–2808 (1992).

Doulatov, S., Notta, F., Laurenti, E. & amp Dick, J.E. Hematopoiesis: a human perspective. Célula-tronco 10, 120–136 (2012).

Majeti, R., Park, C.Y. & amp Weissman, I.L. Identificação de uma hierarquia de progenitores hematopoiéticos multipotentes no sangue do cordão umbilical. Célula-tronco 1, 635–645 (2007).

Notta, F. et al. Isolamento de células-tronco hematopoéticas humanas únicas capazes de enxerto multilinha a longo prazo. Ciência 333, 218–221 (2011).

Shultz, L.D., Ishikawa, F. & amp Greiner, D.L. Camundongos humanizados na pesquisa biomédica translacional. Nat. Rev. Immunol. 7, 118–130 (2007).

Genovese, P. et al. Edição de genoma direcionado em células-tronco hematopoéticas de repovoamento humano. Natureza 510, 235–240 (2014).

Hoban, M.D. et al. Correção da mutação da doença falciforme em células-tronco hematopoéticas humanas / células progenitoras. Sangue 125, 2597–2604 (2015).

Bak, R.O. & amp Porteus, M.H. Integração mediada por CRISPR de cassetes de genes grandes usando vetores doadores AAV. Cell Rep. 20, 750–756 (2017).

Ran, F.A. et al. Engenharia do genoma usando o sistema CRISPR-Cas9. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013).

Ran, F.A. et al. Na Vivo edição do genoma usando Staphylococcus aureus Cas9. Natureza 520, 186–191 (2015).

Kleinstiver, B.P. et al. Nucleases CRISPR-Cas9 projetadas com especificidades PAM alteradas. Natureza 523, 481–485 (2015).

Elliott, B., Richardson, C., Winderbaum, J., Nickoloff, J.A. & amp Jasin, M. Tratos de conversão de genes de reparo de quebra de fita dupla em células de mamíferos. Mol. Célula. Biol. 18, 93–101 (1998).

Rago, C., Vogelstein, B. & amp Bunz, F. Genetic knockouts and knockins in human somatic cells. Nat. Protoc. 2, 2734–2746 (2007).

Khan, I.F., Hirata, R.K. & amp Russell, D.W. Métodos de direcionamento de genes mediados por AAV para células humanas. Nat. Protoc. 6, 482–501 (2011).

Hirata, R.K. & amp Russell, D.W. Projeto e empacotamento de vetores de direcionamento de genes de vírus adeno-associados. J. Virol. 74, 4612–4620 (2000).

Hollywood, J.A., Lee, C.M., Scallan, M.F. & amp Harrison, P.T. Análise de tratos de reparo de genes de quebras de fita dupla Cas9 / gRNA no gene CFTR humano. Sci. Rep. 6, 32230 (2016).

Hubbard, N. et al. A edição de genes direcionados restaura a função regulada de CD40L na síndrome de hiper-IgM ligada ao X. Sangue 127, 2513–2522 (2016).

Grieger, J.C., Choi, V.W. & amp Samulski, R.J. Produção e caracterização de vetores virais adeno-associados. Nat. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).

Gregorevic, P. et al. Entrega sistêmica de genes para músculos estriados usando vetores virais adeno-associados. Nat. Med. 10, 828–834 (2004).

Aurnhammer, C. et al. PCR em tempo real universal para a detecção e quantificação de sequências de repetição terminal invertidas derivadas do sorotipo 2 do vírus adeno-associado. Zumbir. Gene Ther. Métodos 23, 18–28 (2012).

Lock, M. et al. Caracterização de um material padrão de referência de tipo 2 de vírus adeno-associado recombinante. Zumbir. Gene Ther. 21, 1273–1285 (2010).

Park, C.Y., Majeti, R. & amp Weissman, I.L. Na Vivo avaliação da hematopoiese humana através do xenotransplante de células-tronco hematopoiéticas purificadas do sangue do cordão umbilical. Nat. Protoc. 3, 1932–1940 (2008).

Notta, F., Doulatov, S. & amp Dick, J.E. Engraftment of human hematopoietic stem cells é mais eficiente em receptores fêmeas NOD / SCID / IL-2Rgc-null. Sangue 115, 3704–3707 (2010).

Chicaybam, L., Sodre, A.L., Curzio, B.A. & amp Bonamino, M.H. Um método eficiente e de baixo custo para transferência de genes para linfócitos T. PLoS One 8, e60298 (2013).

Danet, G.H., Pan, Y., Luongo, J.L., Bonnet, D.A. & amp Simon, M.C. Expansão de células humanas de repovoamento de SCID em condições de hipóxia. J. Clin. Investir. 112, 126–135 (2003).

Koller, M.R., Bender, J.G., Papoutsakis, E.T. & amp Miller, W.M. Efeitos de combinações sinérgicas de citocinas, baixo oxigênio e estroma irradiado na expansão dos progenitores do cordão umbilical humano. Sangue 80, 403–411 (1992).

Strober, W. Teste de exclusão de azul tripan de viabilidade celular. Curr. Protoc. Immunol. Apêndice 3, Apêndice 3B http://dx.doi.org/10.1002/0471142735.ima03bs21 (2001).

Reinisch, A. et al. Um modelo de xenotransplante de ossículo de medula óssea humanizado permite o enxerto aprimorado de células hematopoéticas humanas saudáveis ​​e leucêmicas. Nat. Med. 22, 812–821 (2016).

Psaila, B. et al. O perfil de uma única célula de progenitores eritroides de megacariócitos humanos identifica vias distintas de diferenciação de megacariócitos e eritroides. Genome Biol. 17, 83 (2016).

Bak, R.O. et al. Engenharia genética multiplexada de células-tronco hematopoéticas humanas e células progenitoras usando CRISPR / Cas9 e AAV6. Elife 6, e27873 (2017).


Conteúdo

Primeiros estudos em Caenorhabditis elegans [1] e Drosophila melanogaster [2] [3] viram triagens de perda sistemática de função (LOF) em larga escala realizadas por meio de mutagênese de saturação, demonstrando o potencial desta abordagem para caracterizar vias genéticas e identificar genes com funções únicas e essenciais. A técnica de mutagênese de saturação foi posteriormente aplicada em outros organismos, por exemplo peixe-zebra [4] [5] e camundongos. [6] [7]

Abordagens direcionadas para knockdown de genes surgiram na década de 1980 com técnicas como recombinação homóloga, [8] [9] ribozimas de clivagem trans, [10] [11] e tecnologias antisense. [12] [13]

No ano 2000, a tecnologia de interferência de RNA (RNAi) surgiu como uma técnica rápida, simples e barata para o knockdown de genes direcionados e estava sendo usada rotineiramente para estudar na Vivo função do gene em C. elegans. [14] [15] [16] [17] De fato, no espaço de apenas alguns anos após sua descoberta pelo Fogo et al. (1998), [18] quase todos os

19.000 genes em C. elegans foram analisados ​​usando knockdown baseado em RNAi. [19]

A produção de bibliotecas de RNAi facilitou a aplicação desta tecnologia em uma escala ampla do genoma, e métodos baseados em RNAi se tornaram a abordagem predominante para telas knockdown em todo o genoma. [ citação necessária ]

No entanto, as abordagens baseadas em RNAi para telas knockdown em todo o genoma têm suas limitações. Por um lado, os altos efeitos fora do alvo causam problemas com observações falso-positivas. [20] [21] Além disso, como o RNAi reduz a expressão gênica no nível pós-transcricional ao direcionar o RNA, as triagens baseadas em RNAi resultam apenas na supressão parcial e de curto prazo dos genes. Embora o knockdown parcial possa ser desejável em certas situações, uma tecnologia com eficiência de direcionamento aprimorada e menos efeitos fora do alvo era necessária. [ citação necessária ]

Desde a identificação inicial como um sistema imune adaptativo procariótico, [22] o sistema de repetições de palíndromo curtas regularmente intercaladas (CRISPR) / Cas9 do tipo II bacteriano se tornou uma ferramenta simples e eficiente para gerar mutações LOF direcionadas. [23] Ele foi aplicado com sucesso para editar genomas humanos e começou a substituir o RNAi como a ferramenta dominante em estudos com mamíferos. [24] No contexto de telas nocaute de todo o genoma, estudos recentes demonstraram que as telas CRISPR / Cas9 são capazes de atingir depleção de proteína completa e altamente eficiente e superar os problemas fora do alvo vistos com telas de RNAi. [25] [26] Em resumo, o recente surgimento do CRISPR-Cas9 aumentou drasticamente nossa capacidade de realizar telas LOF em grande escala. A versatilidade e a programabilidade do Cas9, juntamente com o baixo ruído, alta eficiência de nocaute e mínimos efeitos fora do alvo, tornaram o CRISPR a plataforma de escolha para muitos pesquisadores envolvidos na segmentação e edição de genes. [24] [27]

Edição de perda de função CRISPR / Cas9

O sistema de repetições de palíndromo curtas regularmente espaçadas (CRISPR) / Cas9 é uma tecnologia de edição de genes que pode introduzir quebras de fita dupla (DSBs) em um locus genômico alvo. Ao usar um único RNA guia (sgRNA), a endonuclease Cas9 pode ser entregue a uma sequência de DNA específica onde cliva a cadeia de nucleotídeos. [28] A especificidade do sgRNA é determinada por uma sequência de 20 nt, homóloga ao locus genômico de interesse, e a ligação a Cas9 é mediada por uma região de esqueleto constante do sgRNA. O local alvo desejado deve ser seguido imediatamente (5 'a 3') por um motivo adjacente de protoespaçador de 3 nucleotídeos conservado (PAM). [29] [30] Para reparar os DSBs, a célula pode usar a união terminal não homóloga altamente propensa a erros, ou recombinação homóloga. Ao projetar sgRNAs adequados, inserções ou deleções planejadas podem ser introduzidas no genoma. No contexto de telas LOF de todo o genoma, o objetivo é causar a interrupção e o nocaute do gene. [ citação necessária ]

Bibliotecas sgRNA Editar

Construindo uma Edição de Biblioteca

Para realizar nocautes CRISPR em uma escala ampla do genoma, coleções de sgRNAs conhecidas como bibliotecas de sgRNA, ou bibliotecas nocaute CRISPR, devem ser geradas. A primeira etapa na criação de uma biblioteca de sgRNA é identificar regiões genômicas de interesse com base em regras de direcionamento de sgRNA conhecidas. [31] Por exemplo, os sgRNAs são mais eficientes quando direcionados às regiões codificantes dos genes e não às UTRs 5 'e 3'. Exons conservados apresentam-se como alvos atraentes e a posição em relação ao local de início da transcrição deve ser considerada. [31] Em segundo lugar, todos os locais PAM possíveis são identificados e selecionados. [31] A atividade dentro e fora do alvo deve ser analisada, assim como o conteúdo de GC, e alongamentos de homopolímero devem ser evitados. [31] A endonuclease Cas9 mais comumente usada, derivada de Streptococcus pyogenes, reconhece uma sequência PAM de NGG. [32]

Além disso, nucleotídeos específicos parecem ser favorecidos em locais específicos. A guanina é fortemente favorecida em relação à citosina na posição 20, ao lado do motivo PAM, e na posição 16, a citosina é preferida à guanina. [33] Para o nucleotídeo variável no motivo NGG PAM, foi demonstrado que a citosina é preferida e a timina desfavorecida. [33] Com tais critérios levados em consideração, a biblioteca sgRNA é projetada computacionalmente em torno dos sites PAM selecionados. [31] [33] [34]

Vários sgRNAs (pelo menos 4-6) devem ser criados contra cada gene para limitar a detecção de falso-positivo, e sgRNAs de controle negativo sem alvos conhecidos devem ser incluídos. [31] [33] Os sgRNAs são então criados por no local síntese, amplificado por PCR e clonado em um sistema de entrega de vetor.

Bibliotecas existentes Editar

O desenvolvimento de uma nova biblioteca sgRNA é um processo trabalhoso e demorado. Na prática, os pesquisadores podem selecionar uma biblioteca existente dependendo de sua finalidade experimental e linhagens celulares de interesse. Em fevereiro de 2020, os recursos mais amplamente usados ​​para telas nocaute CRISPR em todo o genoma foram as duas bibliotecas CRISPR Knock-Out (GeCKO) em escala de genoma criadas pelo laboratório Zhang. [35] Disponível através do addgene, essas bibliotecas lentivirais visam, respectivamente, exons humanos e de camundongo, e ambas estão disponíveis como um sistema de um vetor (onde os sgRNAs e Cas9 estão presentes no mesmo plasmídeo) ou como um sistema de dois vetores (onde o sgRNAs e Cas9 estão presentes em plasmídeos separados). Cada biblioteca é entregue como duas meias-bibliotecas, permitindo aos pesquisadores fazer a triagem com 3 ou 6 sgRNAs / gene. [36]

Além do GeCKO, várias outras bibliotecas CRISPR foram geradas e disponibilizadas através do addgene. Os laboratórios Sabatini & amp Lander têm atualmente 7 bibliotecas separadas para humanos e camundongos, incluindo sub-bibliotecas direcionadas para subconjuntos distintos, como quinases e genes ribossômicos (Addgene # 51043–51048). Além disso, as melhorias na especificidade dos sgRNAs resultaram em bibliotecas de 'segunda geração', como as bibliotecas Brie (Addgene # 73632) e Brunello (Addgene # 73178) geradas pelos laboratórios Doench e Root e a biblioteca Toronto knockout (TKO) (Addgene # 1000000069) gerado pelo laboratório Moffat. [36]

Vetores lentivirais Editar

O nocaute de gene direcionado usando CRISPR / Cas9 requer o uso de um sistema de entrega para introduzir o sgRNA e Cas9 na célula. Embora vários sistemas de entrega diferentes estejam potencialmente disponíveis para CRISPR, [37] [38] telas de perda de função em todo o genoma são predominantemente realizadas usando vetores lentivirais de terceira geração. [35] [39] [40] Esses vetores lentivirais são capazes de transduzir com eficiência uma ampla gama de tipos de células e se integrar de forma estável ao genoma de células em divisão e não divisão. [41] [42] Partículas lentivirais de terceira geração são produzidas por co-transfecção de células de rim embrionário humano (HEK) com:

  1. dois plasmídeos de empacotamento, um codificando Rev e o outro Gag e Pol
  2. um plasmídeo de envelope intercambiável que codifica para uma glicoproteína de envelope de outro vírus (mais comumente a proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV-G))
  3. um ou dois (dependendo da biblioteca aplicada) plasmídeos de transferência, codificando para Cas9 e sgRNA, bem como marcadores de seleção. [35] [43] [44]

O sobrenadante contendo partículas lentivirais é colhido, concentrado e subsequentemente usado para infectar as células alvo. [45] O protocolo exato para a produção de lentivírus irá variar dependendo do objetivo da pesquisa e da biblioteca aplicada. [35] [43] [44] Se um sistema de dois vetores for usado, por exemplo, as células são transduzidas sequencialmente com Cas9 e sgRNA em um procedimento de duas etapas. [35] [44] Embora mais complexo, tem a vantagem de um título mais alto para o vírus da biblioteca sgRNA. [35]

Seleção fenotípica Editar

Em geral, existem dois formatos diferentes de telas nocaute CRISPR em todo o genoma: agrupadas e agrupadas. Em uma tela com matriz, cada poço contém um sgRNA específico e conhecido direcionado a um gene específico. [46] Uma vez que o sgRNA responsável por cada fenótipo é conhecido com base na localização do poço, os fenótipos podem ser identificados e analisados ​​sem a necessidade de sequenciamento genético. Este formato permite a medição de fenótipos celulares mais específicos, talvez por fluorescência ou luminescência, e permite aos pesquisadores usar mais tipos de biblioteca e métodos de entrega. [46] Para telas LOF em grande escala, no entanto, formatos matriciais são considerados de baixa eficiência e caros em termos de recursos financeiros e materiais porque as populações de células devem ser isoladas e cultivadas individualmente. [46]

Em uma tela agrupada, as células cultivadas em um único vaso são transduzidas em massa com vetores virais contendo coletivamente toda a biblioteca de sgRNA. Para garantir que a quantidade de células infectadas por mais de uma partícula contendo sgRNA seja limitada, uma baixa multiplicidade de infecção (MOI) (tipicamente 0,3-0,6) é usada. [46] [47] As evidências até o momento sugeriram que cada sgRNA deve ser representado em um mínimo de 200 células. [48] ​​[23] As células transduzidas serão selecionadas, seguidas por uma seleção positiva ou negativa para o fenótipo de interesse, e o sequenciamento genético será necessário para identificar os sgRNAs integrados. [46]

Sequenciamento de última geração e análise de hit de amp Editar

Após a seleção fenotípica, o DNA genômico é extraído dos clones selecionados, ao lado de uma população de células de controle. [23] [46] [49] Nos protocolos mais comuns para nocautes em todo o genoma, uma 'biblioteca de sequenciamento de próxima geração (NGS)' é criada por uma reação em cadeia da polimerase (PCR) em duas etapas. [23] [46] A primeira etapa amplifica a região de sgRNA, usando primers específicos para a sequência de integração lentiviral, e a segunda etapa adiciona as sequências Illumina i5 e i7. [23] NGS dos produtos de PCR permite que os sgRNAs recuperados sejam identificados, e uma etapa de quantificação pode ser usada para determinar a abundância relativa de cada sgRNA. [23]

A etapa final na tela é avaliar computacionalmente os sgRNAs significativamente enriquecidos ou esgotados, rastreá-los de volta aos seus genes correspondentes e, por sua vez, determinar quais genes e vias podem ser responsáveis ​​pelo fenótipo observado. Vários algoritmos estão disponíveis atualmente para esse propósito, sendo o mais popular o método de análise baseada em modelo de CRISPR / Cas9 Knockout (MAGeCK). [50] Desenvolvido especificamente para telas nocaute CRISPR / Cas9 em 2014, MAGeCK demonstrou melhor desempenho em comparação com algoritmos alternativos da época, [50] e desde então demonstrou resultados robustos e alta sensibilidade em diferentes condições experimentais. [51] A partir de 2015, o algoritmo MAGeCK foi estendido para introduzir medições de controle de qualidade e levar em conta a eficiência de eliminação de sgRNA anteriormente negligenciada. [51] Uma ferramenta de visualização baseada na web (VISPR) também foi integrada, permitindo aos usuários explorar interativamente os resultados, análises e controles de qualidade. [51]

Mecanismos de sinalização celular Editar

Nos últimos anos, a tela CRISPR de todo o genoma surgiu como uma ferramenta poderosa para estudar as intrincadas redes de sinalização celular. [52] A sinalização celular é essencial para vários processos biológicos fundamentais, incluindo crescimento, proliferação, diferenciação e apoptose celular.

Um exemplo prático é a identificação de genes necessários para a sinalização proliferativa em células cancerosas. As células são transduzidas com uma biblioteca de sgRNA CRISPR e estudadas para crescimento ao longo do tempo. Ao comparar a abundância de sgRNA em células selecionadas com um controle, pode-se identificar quais sgRNAs se esgotam e, por sua vez, quais genes podem ser responsáveis ​​pelo defeito de proliferação. Essas telas foram usadas para identificar genes essenciais do câncer na leucemia mieloide aguda [53] e no neuroblastoma, [54] e para descrever diferenças específicas do tumor entre as linhas de células cancerosas. [55]

Identificando parceiros letais sintéticos Editar

As terapias direcionadas ao câncer são projetadas para atingir os genes, proteínas ou ambientes específicos que contribuem para o crescimento ou sobrevivência das células tumorais. Após um período de tratamento prolongado com essas terapias, no entanto, as células tumorais podem desenvolver resistência. Embora os mecanismos por trás da resistência aos medicamentos contra o câncer sejam mal compreendidos, as causas potenciais incluem: alteração do alvo, degradação do medicamento, escape de apoptose e alterações epigenéticas. [56] A resistência é bem reconhecida e representa um problema sério no tratamento do câncer. [ citação necessária ]

Para superar esse problema, um parceiro letal sintético pode ser identificado. As telas LOF de todo o genoma usando CRISPR-Cas9 podem ser usadas para rastrear parceiros letais sintéticos. [57] Para isso, uma linha de células de tipo selvagem e uma linha de células de tumor contendo a mutação causadora de resistência são transduzidas com uma biblioteca de sgRNA CRISPR. As duas linhas de células são cultivadas e quaisquer células sub-representadas ou mortas são analisadas para identificar potenciais genes parceiros letais sintéticos. Um estudo recente de Hinze et al. (2019) [58] usaram este método para identificar uma interação letal sintética entre a asparaginase e dois genes da via de sinalização Wnt, NKD2 e LGR6.

Fatores de dependência do hospedeiro para infecção viral Editar

Devido a seus pequenos genomas e número limitado de proteínas codificadas, os vírus exploram as proteínas do hospedeiro para entrada, replicação e transmissão. A identificação de tais proteínas do hospedeiro, também denominadas fatores de dependência do hospedeiro (HDFs), é particularmente importante para a identificação de alvos terapêuticos. Nos últimos anos, muitos grupos usaram com sucesso o CRISPR / Cas9 de todo o genoma como uma estratégia de triagem para HDFs em infecções virais. [59]

Um exemplo é fornecido por Marceau et al. (2017), [60] que teve como objetivo dissecar os fatores do hospedeiro associados à infecção por dengue e hepatite C (HCV) (dois vírus na família Flaviviridae) ELAVL1, uma proteína de ligação ao RNA codificada pelo gene ELAVL1, foi considerada um receptor crítico para a entrada do HCV, e uma notável divergência nos fatores de dependência do hospedeiro foi demonstrada entre os dois flaviviridae. [60]

Outras aplicações Editar

Aplicações adicionais relatadas de triagens CRISPR de todo o genoma incluem o estudo de: metabolismo mitocondrial, [61] resistência à toxina bacteriana, [62] fatores genéticos de metástase, [63] resistência a drogas contra o câncer, [64] morte celular induzida pelo vírus do Nilo Ocidental, [65] e redes de genes de células imunológicas. [66] [67]

Esta seção abordará especificamente as telas CRISPR de todo o genoma. Para uma revisão das limitações do CRISPR, consulte Lino et al. (2018) [38]

A biblioteca sgRNA Editar

As telas CRISPR de todo o genoma serão, em última análise, limitadas pelas propriedades da biblioteca de sgRNA escolhida. Cada biblioteca conterá um conjunto diferente de sgRNAs e a cobertura média por gene pode variar. As bibliotecas atualmente disponíveis tendem a ser tendenciosas para sgRNAs direcionados aos exons codificadores de proteínas precoces (5 '), em vez daqueles direcionados aos domínios de proteínas mais funcionais. [58] Este problema foi destacado por Hinze et al. (2019), [58] que observaram que os genes associados à sensibilidade à asparaginase não conseguiram pontuar em sua triagem de todo o genoma de células de leucemia resistentes à asparaginase.

Se uma biblioteca apropriada não estiver disponível, a criação e amplificação de uma nova biblioteca de sgRNA é um processo demorado que pode levar muitos meses. Os desafios potenciais incluem: (i) projeto de sgRNA eficaz (ii) garantir cobertura abrangente de sgRNA em todo o genoma (iii) projeto de backbone do vetor lentiviral (iv) produção de quantidades suficientes de lentivírus de alta qualidade (v) superação de baixa eficiência de transformação (vi) dimensionamento adequado da cultura bacteriana. [68]

Manter a cobertura de sgRNA celular Editar

Um dos maiores obstáculos para a triagem CRISPR de todo o genoma é garantir a cobertura adequada da biblioteca de sgRNA em toda a população de células. [23] As evidências até agora sugeriram que cada sgRNA deve ser representado e mantido em um mínimo de 200-300 células. [23] [48]

Considerando que o protocolo padrão usa uma multiplicidade de infecção de

0,3, e uma eficiência de transdução de 30-40% [44] [23], o número de células necessárias para produzir e manter uma cobertura adequada torna-se muito grande. A título de exemplo, a biblioteca sgRNA humana mais popular é a biblioteca GeCKO v2 criada pelo laboratório Zhang [30], que contém 123.411 sgRNAs. Estudos usando esta biblioteca comumente transduzem mais de 1x10 8 células [58] [59] [69]

Como o CRISPR continua a exibir baixo ruído e efeitos fora do alvo mínimos, uma estratégia alternativa é reduzir o número de sgRNAs por gene para uma triagem primária. Cortes menos rigorosos são usados ​​para a seleção de ocorrências e sgRNAs adicionais são usados ​​posteriormente em uma tela secundária mais específica. Esta abordagem é demonstrada por Doench et al. (2016), [33] que descobriram que & gt92% dos genes recuperados usando o protocolo padrão também foram recuperados usando menos sgRNAs por gene. Eles sugerem que essa estratégia pode ser útil em estudos em que o aumento de escala é proibitivamente caro. [ citação necessária ]

Limitações lentivirais Editar

Os vetores lentivirais têm certas limitações gerais. Por um lado, é impossível controlar onde o genoma viral se integra ao genoma do hospedeiro, e isso pode afetar funções importantes da célula. Vannucci et al. [70] fornecem uma excelente revisão dos vetores virais junto com suas vantagens e desvantagens gerais. No contexto específico das telas CRISPR de todo o genoma, a produção e a transdução das partículas lentivirais é relativamente trabalhosa e demorada, levando cerca de duas semanas no total. [44] Além disso, como o DNA se integra ao genoma do hospedeiro, a entrega lentiviral leva à expressão de Cas9 em longo prazo, potencialmente levando a efeitos fora do alvo. [ citação necessária ]

Telas agrupadas e agrupadas Editar

Em uma tela com matriz, cada poço contém um sgRNA específico e conhecido direcionado a um gene específico. As telas organizadas, portanto, permitem o perfil detalhado de uma única célula, mas são limitadas pelos altos custos e pelo trabalho necessário para isolar e cultivar o alto número de populações de células individuais. [46] As telas CRISPR combinadas convencionais são relativamente simples e econômicas de realizar, mas são limitadas ao estudo de toda a população de células. Isto significa que os fenótipos raros podem ser mais difíceis de identificar, e apenas os fenótipos brutos podem ser selecionados para, e. sobrevivência celular, proliferação ou expressão do gene repórter. [ citação necessária ]

Editar mídia cultural

A escolha do meio de cultura pode afetar a relevância fisiológica dos resultados dos experimentos de cultura de células, devido às diferenças na composição e concentração de nutrientes. [71] Um viés sistemático em conjuntos de dados gerados foi recentemente mostrado para CRISPR e telas de silenciamento de gene RNAi (especialmente para genes metabólicos), [72] e para perfis metabólicos de linhas de células cancerosas. [71] Por exemplo, uma dependência mais forte de ASNS (asparagina sintetase) foi encontrada em linhas celulares cultivadas em DMEM, que carece de asparagina, em comparação com linhas celulares cultivadas em RPMI ou F12 (contendo asparagina). [72] É possível evitar esse viés usando uma mídia uniforme para todas as linhas de células selecionadas e, idealmente, usando um meio de crescimento que represente melhor os níveis fisiológicos de nutrientes. Recentemente, tais tipos de mídia, como Plasmax [73] e Human Plasma Like Medium (HPLM), [74] foram desenvolvidos.

Edição de CRISPR + RNA-seq de célula única

Tecnologias emergentes têm como objetivo combinar telas CRISPR agrupadas com a resolução detalhada de sequenciamento de RNA de célula única maciçamente paralelo (RNA-seq). Estudos utilizando "CRISP-seq", [75] "CROP-seq", [76] e "PERTURB-seq" [77] demonstraram leituras genômicas ricas, identificando com precisão as assinaturas de expressão gênica para nocautes de genes individuais em um conjunto complexo de células . Esses métodos têm o benefício adicional de produzir perfis de transcrição das células induzidas por sgRNA. [ citação necessária ]


Protocolos para edição do genoma CRISPR em seu sistema de modelo

Procurando por protocolos de edição de genoma CRISPR? Leia sobre nossa crescente biblioteca de protocolos e métodos de usuário - podemos ter o que você precisa para começar. E, se você tiver um novo protocolo para usar Alt-R CRISPR RNA e / ou nucleases, descubra como compartilhá-lo com a comunidade de pesquisa.

A pesquisa em aplicações usando sistemas CRISPR-Cas para edição de genoma está se expandindo rapidamente. Isso apresenta uma necessidade de reagentes e protocolos eficazes para uma ampla variedade de sistemas modelo além de células de cultura de mamíferos.

Vantagens dos RNAs e proteínas Alt-R CRISPR para edição do genoma

RNAs de guia CRISPR. Use RNAs Alt-R CRISPR para direcionar a edição potente do genoma no alvo. These length-optimized RNAs are chemically synthesized, which allows addition of modifications for increased nuclease resistance and reduced innate immune responses.

CRISPR proteins. Choose from several recombinant variants of Cas9 (Streptococcus pyogenes), as well as Cpf1 (Acidaminococcus sp. BV3L6) endonucleases. Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS is suitable for most genome editing studies. Some experiments may benefit from use of Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease, a high-fidelity nuclease that has been engineered to reduce off-target effects while retaining the on-target potency of wild-type Cas9. Alt-R A.s. Cpf1 Nuclease 2NLS provides additional genome editing target sites, because it recognizes an AT-rich protospacer adjacent motif (PAM) rather than the CG-rich Cas9 PAM sequence.

If you are interested in knock-in experiments or other applications requiring homology-directed repair (HDR), consider using an Alt-R Cas9 nickase to create single-strand breaks. Use of a nickase variant with a pair of guide RNAs reduces off-target effects by requiring specific binding of 2 ribonucleoproteins (RNPs), and promotes homology-directed repair, in part, by creating overhanging DNA breaks. However, you will need 2 potent CRISPR target sites at an appropriate distance from your HDR target site.

Alt-R CRISPR RNPs. While the Alt-R CRISPR RNAs are compatible with CRISPR proteins from any source (e.g., cells that stably express CRISPR protein, or CRISPR proteins expressed from DNA or mRNA constructs), we recommend delivery of CRISPR reagents as RNPs by lipofection (e.g., Figure 1), electroporation, or microinjection. Cas9 RNPs are compatible with all 3 methods however, for Cpf1 RNPs, we recommend electroporation and microinjection delivery methods.

Advantages of using Alt-R RNPs include:

  • Efficient, on-target genome editing
  • Precise control of editing complex delivery&mdashcells will not contain templates that express unregulated levels of CRISPR RNAs or endonucleases
  • Lower activation of cellular immune responses and, therefore, reduced toxicity&mdashtoxicity is often observed when using em vitro transcribed Cas9 mRNA or single guide RNAs (sgRNA)

Protocols and starting points are increasingly available

IDT scientists have developed detailed lipofection and electroporation protocols for using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and the Alt-R CRISPR-Cpf1 System in mammalian cells (Table 1). With help from our collaborators, we also make user-submitted methods available for genome editing in other model systems. These protocols and methods are a good starting point for protocol optimization for your studies, and often offer tips for all aspects of genome editing experiments, from growth conditions through genome editing detection.


Accurate evaluation of CRISPR genome editing

Credit: Unsplash/CC0 Public Domain

CRISPR technology allows researchers to edit genomes by altering DNA sequences and by thus modifying gene function. Its many potential applications include correcting genetic defects, treating and preventing the spread of diseases and improving crops.

Genome editing tools, such as the CRISPR-Cas9 technology, can be engineered to make extremely well-defined alterations to the intended target on a chromosome where a particular gene or functional element is located. However, one potential complication is that CRISPR editing may lead to other, unintended, genomic changes. These are known as off-target activity. When targeting several sites in the genome, off-target activity can lead to translocations, unusual rearrangement of chromosomes, as well as other unintended genomic modifications.

Controlling off-target editing activity is one of the central challenges in making CRISPR-Cas9 technology accurate and applicable in medical practice. Current measurement assays and data analysis methods for quantifying off-target activity do not provide statistical evaluation, are not sufficiently sensitive in separating signal from noise in experiments with low editing rates, and require cumbersome efforts to address the detection of translocations.

In the May 24th issue of the journal Nature Communications, a multidisciplinary team of researchers from the Interdisciplinary Center Herzliya and Bar-Ilan University report the development of a new software tool to detect, evaluate and quantify off-target editing activity, including adverse translocation events that can cause cancer. The software is based on input taken from a standard measurement assay, involving multiplexed PCR amplification and Next-Generation Sequencing (NGS).

Known as CRISPECTOR, the tool analyzes next generation sequencing data obtained from CRISPR-Cas9 experiments, and applies statistical modeling to determine and quantify editing activity. CRISPECTOR accurately measures off-target activity at every interrogated locus. It further enables better false-negative rates in sites with weak, yet significant off-target activity. Importantly, one of the novel features of CRISPECTOR is its ability to detect adverse translocation events occurring in an editing experiment.

"In genome editing, especially for clinical applications, it is critical to identify low level off-target activity and adverse translocation events. Even a small number of cells with carcinogenic potential, when transplanted into a patient in the context of gene therapy, can have detrimental consequences in terms of cancer pathogenesis. As part of treatment protocols, it is therefore important to detect these potential events in advance," says Dr. Ayal Hendel, of Bar-Ilan University's Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences.

Dr. Hendel led the study, together with Prof. Zohar Yakhini of the Arazi School of Computer Science at Interdisciplinary Center (IDC) Herzliya. "CRISPECTOR provides an effective method to characterize and quantify potential CRISPR-induced errors, thereby significantly improving the safety of future clinical use of genome editing." Hendel's team used CRISPR-Cas9 technology to edit genes in stem cells relevant to disorders of the blood and the immune system. In the process of analyzing the data, they became aware of the shortcomings of the existing tools for quantifying off-target activity and of gaps that should be bridged to improve applicability. This experience led to the collaboration with Prof Yakhini's leading computational biology and bioinformatics group.

Prof. Zohar Yakhini, of IDC Herzliya and the Technion, says, "In experiments utilizing deep-sequencing techniques that have significant levels of background noise, low levels of true off-target activity can get lost under the noise. The need for a measurement approach and related data analysis that are capable of seeing beyond the noise, as well as of detecting adverse translocation events occurring in an editing experiment, is evident to genome editing scientists and practitioners. CRISPECTOR is a tool that can sift through the background noise to identify and quantify true off-target signals. Moreover, using statistical modeling and careful analysis of the data, CRISPECTOR can also identify a wider spectrum of genomic aberrations. By characterizing and quantifying potential CRISPR-induced errors our methods will support the safer clinical use of genome editing therapeutic approaches."


New, rapid CRISPR/Cas9 method identifies key genes in zebrafish spinal cord regeneration

A new, rapid screening approach uses CRISPR/Cas9 technology to identify immune system-related genes that play a crucial role in repairing zebrafish spinal cord injuries. Marcus Keatinge and Themistoklis Tsarouchas of the University of Edinburgh, U.K., and colleagues present these findings in the open-access journal PLOS Genetics.

In humans and other mammals, severed spinal-cord nerve connections do not heal, so a spinal cord injury may lead to permanent paralysis. In contrast, zebrafish are capable of recovering from spinal cord injury in a process that involves inflammation controlled by macrophages -- a type of immune system cell. However, the precise process by which macrophages aid spinal cord regeneration in zebrafish remains mysterious.

To help clarify this process, Keatinge, Tsarouchas and colleagues developed a new method for rapidly identifying macrophage-related genes that are involved in zebrafish spinal cord regeneration. The strategy employs CRISPR/Cas9 technology, which enables researchers to target and disrupt specific genes, thereby revealing their function. Molecules known as synthetic RNA Oligo CRISPR guide RNAs (sCrRNAs) enable this gene-specific targeting.

The researchers applied the new method to study spinal cord regeneration in larval zebrafish. Key to the method was a prescreening step in which they tested over 350 sCrRNAs that target genes already known to potentially play an important role in inflammation-related spinal cord regeneration. Introducing these sCrRNAs to the zebrafish enabled identification 10 genes that, when disrupted, impaired recovery from spinal cord injury.

Further analysis narrowed the list to four genes that appear to be crucial for repair of severed spinal nerve connections, validating the novel method. One gene in particular, tgfb1, appears to play an essential signaling role in controlling inflammation during the recovery process.

The new method and findings could help deepen understanding of spinal cord regeneration in zebrafish. The researchers also say the method could be adapted to screen for genes that play important roles in other biological processes, as well.

The authors add, "Zebrafish can fully regenerate their spinal cords after injury. Using a new and very rapid screening platform, we discover genes of the immune system that are essential for regeneration. We envision our findings to lead to new insights into the inability of mammals to regenerate and our versatile screening platform to be adapted to other disease or injury models in zebrafish."


Broad Institute

The ability to precisely edit the genome of a living cell holds enormous potential to accelerate life science research, improve biotechnology, and even treat human disease.

Methods for genome editing — primarily zinc finger nucleases and Transcription Activator-Like Effector (TALE) Nucleases — have existed for several years, but in 2013 these were quickly eclipsed by the efficiency, effectiveness and precision of the engineered CRISPR-Cas9 system that was first harnessed for mammalian genome editing by Feng Zhang of the Broad Institute and MIT.

The CRISPR system

Like zinc fingers and TALEs, CRISPR systems are natural products. However, CRISPR-Cas differs from zinc fingers and TALEs in one crucial aspect that makes it superior for genome editing applications: whereas zinc fingers and TALEs bind to DNA through a direct protein-DNA interaction, requiring the protein to be redesigned for each new target DNA site, CRISPR-Cas achieves target specificity through a small RNA that can easily be swapped for other RNAs targeting new sites.

In nature, CRISPR-Cas systems help bacteria defend against attacking viruses (known as bacteriophage or just phage). They consist of two components, the CRISPR (clustered, regularly interspaced palindromic repeats) array and Cas (CRISPR-associated) proteins. CRISPR sequences bookend short stretches of DNA that bacteria have copied from invading phages, preserving a memory of the viruses that have attacked them in the past. These sequences are then transcribed into short RNAs that guide Cas proteins to matching viral sequences. The Cas proteins destroy the matching viral DNA by cutting it. There are a number of different types of CRISPR-Cas systems in nature, which vary in their components the CRISPR-Cas9 system uses just a single protein, Cas9, to find and destroy target DNA. In 2015, Zhang and colleagues successfully harnessed a second system, called CRISPR-Cpf1, which has the potential for even simpler and more precise genome engineering.

Engineering the CRISPR toolbox

In early 2011, Feng Zhang was just starting his own research group at the Broad Institute and MIT, where he is an investigator at the McGovern Institute for Brain Research and a faculty member in the departments of Brain and Cognitive Sciences and Biological Engineering. After learning about existing CRISPR research at a scientific meeting at the Broad, he quickly realized that the system, with a single RNA-guided protein, could be a game changer in genome editing technology. He was already working on DNA targeting methods, having helped to develop the TALE system as a Junior Fellow at Harvard. This system could target and activate genes in mammalian genomes.

Zhang and his team focused on harnessing CRISPR-Cas9 for use in human cells. In January 2013, he reported the first successful demonstration of Cas9-based genome editing in human cells in what has become the most-cited CRISPR paper (Cong et al., Science, 2013). Researchers from George Church’s lab at Harvard University reported similar findings in the same issue of Science (Mali et al., Science, 2013). The Zhang and Church papers showed that Cas9 could be targeted to a specific location in the human genome and cut the DNA there. The cut DNA was then repaired by inserting a new stretch of DNA, supplied by the researchers, essentially achieving “find and replace” functionality in the human genome.

In September, 2015, Zhang and partners described a different system, Cpf1, which appears to have significant implications for research and therapeutics. The Cpf1 system is simpler in that it requires only a single RNA. The Cpf1 enzyme is also smaller than the standard SpCas9, making it easier to deliver into cells and tissues.

Refining and sharing CRISPR tools

The CRISPR toolbox is continuing to expand rapidly, opening new avenues for biomedical research. Since the first publications in early 2013, the Zhang lab and other researchers have engineered a number of improvements to the system. For example, Cas9 has been modified so that instead of cutting the target DNA, it can turn gene expression on by recruiting transcriptional activators to its genomic location (Konermann, et al., Nature, 2014).

At the Broad Institute, the system has also been used for genome-wide screens to identify genes involved in resistance to cancer drugs and dissect immune regulatory networks. CRISPR has been used to rapidly create mouse models of cancer that arise from multiple gene alterations (Platt et al., Cell, 2014). In 2015, Zhang and his team reported success with Cas9 derived from a different bacterium, Staphylococcus aureus (SaCas9). SaCas9 is smaller than the original Cas9, which has advantages for gene therapy (Ran et al., Nature, 2015).

The Zhang lab has trained thousands of researchers in the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology through direct education and by sharing more than 40,000 CRISPR-Cas9 components with academic laboratories around the world to help accelerate global research that will benefit human health. In September 2015, the Zhang lab also began to share Cpf1 components.

Users can obtain guide sequences for knock-outs and transcriptional activation as well as information about genome-wide libraries for CRISPR-based screening. The Zhang lab plasmids can be obtained via Addgene, a non-profit plasmid repository dedicated to improving life science research. Additional information about materials can be found on the Zhang laboratory website.


Transfect, enrich, screen, and publish—using our GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kit. The CRISPR Nuclease system offers a ready-to-use, all-in-one expression vector system with a Cas9 nuclease expression cassette and a guide RNA cloning cassette for fast cloning of a target-specific crRNA. This system allows you to edit and engineer the genomic locus of your choice in a sequence-specific manner from a single plasmid. After relevant targets have been identified with GeneArt CRISPRs, the biologically-relevant mutations can be validated with GeneArt TALs to reduce potential off-targeting.

GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kits are reporter vector systems for expression of the functional components needed for CRISPR-Cas genome editing. The kits make it easy to express noncoding guide RNA (including crRNA and tracrRNA), using a plasmid vector that also expresses Cas9 endonuclease.

The GeneArt CRISPR Nuclease Vector with OFP (orange fluorescent protein) for flow cytometry–based sorting of crRNA-expressing cell populations, whereas GeneArt CRISPR Nuclease Vector with CD4 enables bead-based enrichment of crRNA-expressing cells.

GeneArt CRISPR Nuclease Vectors. (UMA) GeneArt CRISPR Nuclease: OFP Reporter Plasmid map and features of GeneArt CRISPR Nuclease: OFP Reporter. The vector is supplied linearized between nucleotides 6,732 and 6,752, with 5 bp 5´ overhangs on each strand as indicated. (B) GeneArt CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment Plasmid map and features of GeneArt CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment. The vector is supplied linearized between nucleotides 7,336 and 7,355, with 5 bp 5´ overhangs on each strand as indicated. The linearized GeneArt CRISPR Nuclease Vectors provide a rapid and efficient way to clone double-stranded oligonucleotides encoding a crRNA representing a desired target into an expression cassette that allows sequence-specific targeting of the Cas9 nuclease.

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There are different methods to verify that your plasmid construct is correct, i.e. PCR, restriction digestion or sequencing. The choice depends on whether you are interested in determining if the plasmid contains your DNA insert, is the insert in the right orientation, or does the insert have the correct sequence. We provide molecular biology tools to implement any analysis method you may choose.