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Sexagem de peixes a partir de uma amostra de tecido

Sexagem de peixes a partir de uma amostra de tecido



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Sou membro de um clube de peixes local, temos muitos peixes de aquário diferentes e gostaria de trocá-los entre nós. Todos nós temos alguns peixes que não formam pares e gostaríamos de ver se eles formam pares com os de outra pessoa. Mas, como você pode imaginar, manter o controle de todos os peixes seria extremamente difícil e inútil se eles fossem do mesmo sexo, então alguém sugeriu que deveríamos comprar um microscópio e sexá-los através de tecido ou amostra de sangue. Mas nenhum de nós tem experiência em fazer isso ou se é mesmo possível, por isso precisamos de alguns conselhos de especialistas sobre o assunto.

Eu gostaria de saber se você pode dizer o sexo de um peixe a partir de um tecido ou amostra de sangue e de que equipamento você precisa (quanto aumento em um microscópio)? Trabalhamos com discus e outros ciclídeos, e inúmeros peixes de aquário marinho.

Para ser mais específico, restrinjo minha pergunta aos peixes Discus, no entanto, gostaria de saber se existem quaisquer princípios gerais de identificação baseada em amostras de tecido, para diferentes espécies de peixes.


Como já apontado por Remi, você pode identificar o sexo a partir de uma amostra de tecido apenas se houver um sistema de determinação de sexo genético (como cromossômico) (usando técnicas como PCR ou no local hibridização). No entanto, diferentes espécies de peixes empregam diferentes mecanismos de determinação do sexo:

O foco ou o apego a sistemas genéticos envolvendo os cromossomos X e Y devem ser rapidamente descartados em estudos de determinação do sexo em peixes devido à diversidade de mecanismos utilizados e, ao fazer isso, o pesquisador pode explorar mecanismos reguladores alternativos que contêm pistas importantes para a compreensão determinação do sexo em geral. A biologia e a ecologia dos peixes são suficientemente diversificadas para fornecer exemplos únicos de mecanismos de determinação do sexo, embora eles possuam muitos dos mesmos processos e vias que são usados ​​em outros sistemas vertebrados.


Devlin, Robert H. e Yoshitaka Nagahama. "Determinação e diferenciação sexual em peixes: uma visão geral das influências genéticas, fisiológicas e ambientais." Aquicultura 208.3 (2002): 191-364.

Embora Devlin e Nagahama comentem (acima) que os peixes também empregam as mesmas vias de sinalização que outros vertebrados para a determinação do sexo, o estudo dessas vias para determinar o sexo seria extremamente difícil, pois você deve estar ciente de que a sinalização celular e as redes reguladoras de genes são altamente complexos.

Os peixes são sexualmente dimórficos (incluindo Discus) e o sexo pode ser facilmente identificado (com alguma prática) por inspeção visual. A identificação microscópica exigiria dinheiro e tempo. A identificação baseada na morfologia pode ser automatizada (quando a máquina é suficientemente treinada). Você pode dar uma olhada neste artigo1 que se refere ao uso de análise de imagens para pontuar salmões.


1. Merz, Joseph E. e William R. Merz. "Características morfológicas usadas para identificar o sexo do salmão Chinook durante a passagem do peixe." The Southwestern Naturalist 49.2 (2004): 197-202.


Cai Lab

A biologia é definida pela organização espacial em muitas escalas, variando de metros - o tamanho do corpo humano - a nanômetros (bilionésimos de um metro) - o tamanho das moléculas. Desenvolvemos e utilizamos tecnologias inovadoras que nos permitem observar a organização dentro das células e os processos que conduzem as funções das células.

Nossos métodos respondem ao desafio técnico de como criar imagens abrangentes da atividade celular em seu ambiente nativo. Somos capazes de aplicar nossas tecnologias a alguns dos problemas mais desafiadores da biologia do desenvolvimento, imunologia, neurociência, biologia do câncer e microbiologia.


Princípio:-

O isolamento do DNA geralmente começa com a lise de células ou tecidos para destruir as estruturas da proteína e permite a liberação de ácidos nucléicos do núcleo. A lise é realizada em uma solução de lise contendo ingredientes importantes: cloreto de sódio que fornece um choque osmótico às células Tris HCl, que é um tampão para reter pH EDTA constante, que sequestra os íons metálicos bivalentes necessários para a atividade da nuclease e, portanto, inibindo sua ação é um detergente, geralmente SDS, que rompe a membrana celular e o envelope nuclear, fazendo com que as células se abram e liberem seu DNA. O DNA ainda é batido fortemente em torno das proteínas histonas. Proteinase K (uma serina protease) é a enzima comum usada na extração de DNA que separa as histonas para liberar o DNA e, finalmente, resulta na quebra das células e na dissolução das membranas.

Os ácidos nucléicos são então purificados do complexo proteína-ácido nucléico por extração de fase com uma mistura de solventes orgânicos, ou seja, fenol, clorofórmio e álcool isoamílico em uma proporção de 25: 24: 1. O fenol dissocia as proteínas do DNA. O clorofórmio desnatura as proteínas e os lipídios e ajuda a manter a separação das fases orgânica e aquosa. Também torna o DNA menos solúvel no fenol, reduzindo as perdas para a fase orgânica. O álcool isoamílico é frequentemente adicionado para prevenir a formação de espuma. Em pH 7-8, o DNA se divide para a fase aquosa enquanto a proteína é desnaturada e extraída para a fase orgânica imiscível em água, que é separada do ácido nucleico contendo a fase aquosa por centrifugação. Quando grande quantidade de proteína está presente, ela forma um precipitado branco entre a fase orgânica e a fase aquosa.

O DNA é então precipitado com etanol frio ou isopropanol após ajuste com acetato de sódio 3M e centrifugação. O DNA é insolúvel no álcool e sai da solução, e o álcool serve como uma lavagem para remover os sais residuais. O álcool é então removido e o DNA é armazenado em um tampão biológico, como o tampão TE (Tris-EDTA). O RNA contaminante na amostra de DNA pode ser eliminado por digestão com uma RNase.

No entanto, uma vez que as forças de cisalhamento são geradas em cada etapa, as moléculas de DNA resultantes na preparação final raramente excedem 100-150 kb de comprimento. O DNA desse tamanho é adequado para a análise Southern em géis de agarose padrão, como um modelo em PCRs e para a construção de bibliotecas de DNA genômico em vetores de bacteriófago e lambda.


Você pode gostar também

O hospital onde trabalho mantém vários tipos de trituradores à disposição. Diferentes tipos de tecido requerem diferentes métodos de homogeneização, por isso é bom manter uma variedade de moedores em estoque.

Um desses tipos de moedor usado para homogeneizar o tecido é o tipo com um cabo oco. Esta alça deve ser preenchida com gelo. O gelo diminuirá a quantidade de estresse colocado nas células, manterá sua visibilidade e aumentará a quantidade de células viáveis ​​que podemos obter da amostra. Moedores com gelo são os melhores para o tecido do coração, fígado e intestino.

O tecido resistente precisa de um moedor de tecido cônico. O tecido dos músculos, pulmão e coração requer uma fricção mais forte para separá-los. Moedores de tecido cônicos são de vidro sobre vidro. O design cônico longo minimiza o esforço enquanto maximiza a eficiência. wavy58 29 de junho de 2011

Eu vi uma centrífuga realizar a homogeneização de tecidos quando nossa turma de saúde fez uma viagem de campo para o laboratório. A ideia por trás disso é simples.

Vários tubos de amostras de tecido são colocados na centrífuga, que só funciona por alguns minutos em um pequeno motor que não aquece muito as amostras. As esferas são colocadas nos tubos com as amostras.

Conforme a centrífuga gira, as bolas agitam os tubos de amostra. Isso faz com que os grânulos dentro dos tubos saltem e atuem como agentes de moagem. É assim que uma centrífuga separa os tecidos. StarJo 28 de junho de 2011

Eu trabalho em um laboratório de hospital. Freqüentemente, usamos um almofariz e um pilão para homogeneizar o tecido.

A ação de trituração com almofariz e pilão é mais suave do que alguns outros métodos de homogeneização de tecidos. O uso desse método nos permite preservar organelas, moléculas grandes e vírus.

Além de manter os corpos-de-prova mais intactos, o almofariz e o pilão também produzem menos atrito. Isso, por sua vez, produz menos calor do que outros métodos e também nos ajuda a preservar os espécimes de que precisamos.


Seccionando o mais rápido possível

No entanto, mesmo que uma amostra seja congelada rapidamente como vítreo, pode não permanecer assim. O gelo vítreo é um estado instável. Acima de -121˚C, o gelo amorfo começa a se reestruturar gradualmente como gelo cúbico e se expandir. Acima de -80˚C, o gelo cúbico começa a se reestruturar como gelo hexagonal e se expande novamente. Felizmente, este é um processo de conversão lento, dependendo dos gradientes de temperatura e da pureza da água.

Na maioria das aplicações comuns, o tecido deve ser aquecido acima da temperatura de congelamento instantâneo para seccioná-lo (-9 a -19˚C para o cérebro, mas dependendo do tipo de tecido). Caso contrário, é muito frio para cortar e se estilhaça quando dobrado pelo chanfro da faca. O sintoma visível de corte muito frio são “venezianas” ou marcas de estilhaços paralelos à lâmina da faca. O corte deve começar assim que o tecido estiver quente o suficiente para ser cortado. O tecido nunca deve ser deixado durante a noite ou por longos períodos em um criostato, mesmo que não haja ciclo de degelo. A conversão de gelo vítreo em grandes cristais hexagonais começará. Os cristais expandem o gelo e danificam as células.


Centro de Educação Clínica

O POC inteiro ou uma parte do POC contendo membrana placentária, vilosidades, cordão umbilical e partes fetais é ideal. Em casos de perda gestacional precoce, membranas e vilosidades podem ser o único tecido fetal disponível. Na perda posterior da gravidez, outros tecidos fetais, incluindo cordão umbilical, pele, cartilagem (costela), pericárdio, membrana interna e diafragma, também devem ser submetidos, se disponíveis. As amostras de placenta devem ser coletadas do lado fetal da placenta. Líquido amniótico, sangue do cordão umbilical e / ou sangue cardíaco também podem ser submetidos, usando um código de teste diferente. Para escolher o código de teste apropriado ou para discutir um caso particular com um conselheiro genético, ligue para 866-GENE-INFO.

Questão 2.Qual é o procedimento de coleta de amostras POC?

As amostras de POC devem ser coletadas da maneira mais estéril possível e imediatamente colocadas em meio de transporte em um copo de urina estéril ou outro recipiente estéril para reduzir a morte celular e a contaminação. A Quest Diagnostics fornece & quotPOC Transport Media & quot mediante solicitação (uma solução salina balanceada suplementada com antibióticos e um antimicótico). No entanto, qualquer solução salina balanceada estéril é aceitável (solução de Ringer & # 39s, solução salina balanceada de Hanks, etc.). A água não é um meio de transporte aceitável. Se vários tipos de tecido estiverem disponíveis em um POC, coloque cada tipo de tecido em seu próprio recipiente. Cada recipiente deve ser claramente rotulado com o tipo de tecido específico e o nome do paciente. Todos os tipos de tecido podem ser enviados sob a mesma requisição e código de teste, a menos que haja gestações múltiplas. Se houver gestações múltiplas, envie POC de cada gestação sob requisições separadas.

Pergunta 3. Como as amostras POC devem ser armazenadas e transportadas?

Armazene e transporte as amostras POC em um recipiente bem fechado para evitar que a amostra seque. Armazene e transporte em temperatura refrigerada (2-8 ° C). O armazenamento à temperatura ambiente não é recomendado e as amostras nunca devem ser congeladas. Transporte o mais rápido possível, de preferência menos de 48 horas após a coleta.

Questão 4. Quais espécimes de POC não podem ser usados ​​para estudo de cromossomos?

Quaisquer espécimes comprometidos que não produziriam células metafásicas analisáveis, por exemplo, espécimes fixados em formalina, amostras congeladas, tecido necrótico ou espécimes obviamente contaminados, não podem ser usados ​​para estudo de cromossomos. Os estudos cromossômicos só podem ser realizados em células em divisão cultivadas a partir de amostras de tecido fresco.

Questão 5. Que informações devem ser enviadas junto com as amostras POC?

Envie o histórico clínico e de gravidez da paciente, qualquer histórico familiar significativo e informações sobre a idade gestacional.

Questão 6. Múltiplas anomalias fetais foram detectadas por ultrassom ou autópsia, mas a análise cromossômica estava normal. Existem outros estudos que podem ser feitos para testar uma doença genética no feto?

Sim, existem outros estudos que podem ser apropriados. Existem muitas causas de anomalias fetais, algumas das quais são genéticas. Na ausência de suspeita clínica de um distúrbio genético específico, uma análise de microarranjos pode ser realizada nos produtos da concepção (POC) para detectar deleções e duplicações sutis (código de teste 90929, Microarray cromossômico, POC, ClariSure & reg Oligo-SNP). Se houver suspeita clínica de um distúrbio específico, pode haver outros testes genéticos disponíveis. Entre em contato com 866-GENE-INFO para discutir o caso com um conselheiro genético e para obter informações sobre como adicionar outro teste.

Pergunta 7. Meu paciente tem história pessoal ou familiar de anomalia cromossômica. A análise cromossômica em produtos do tecido da concepção foi relatada como normal. Esses resultados garantem que o feto não apresentava a anomalia cromossômica na família?

Não. Ligue para 866-GENE-INFO para discutir este caso com um conselheiro genético. A documentação da anormalidade genética específica na família será necessária para determinar a precisão do teste realizado no feto.

Questão 8. A análise do cromossomo do tecido foi relatada como uma falha de crescimento. Existem outros estudos que podem ser tentados no tecido para determinar se o feto tem uma anomalia cromossômica?

Quando o tecido não cresce, é impossível realizar uma análise cromossômica padrão. Existem dois testes que podem ser considerados para fornecer algumas informações sobre os cromossomos fetais em amostras de tecido que não crescem. FISH, Products of Conception Panel (código de teste 14820X) fornecerá informações sobre o número de cópias dos cromossomos 13,16,18,21,22, X e Y. Um Microarray Cromossômico, POC, ClariSure & reg Oligo-SNP (código de teste 90929 ) pode ser realizado para detectar deleções e duplicações sutis de material cromossômico. Entre em contato com 866-GENE-INFO para discutir o caso com um conselheiro genético e para obter informações sobre como adicionar testes adicionais.


8 métodos envolvidos na separação de células inteiras (com diagrama)

Temos nos preocupado com os métodos usados ​​para separar e isolar partículas liberadas de células e tecidos rompidos.

Até bem recentemente, pouca atenção era dirigida a um problema relacionado - a saber, como separar células viáveis ​​inteiras umas das outras quando o tecido ou cultura em estudo é composto de forma heterogênea.

Por exemplo, um órgão como o fígado é composto de muitos tipos diferentes de células, incluindo células hepáticas, células de Kupffer, células do tecido conjuntivo, células do músculo liso, células do sangue e assim por diante. Portanto, um homogenato de tecido hepático contém partículas subcelulares de diversos tipos de células.

Mesmo uma cultura do mesmo tipo de célula pode ser heterogênea em relação à idade das células e, portanto, é representativa de um amplo espectro de características morfológicas e / ou atividade fisiológica.

O desenvolvimento de métodos para separar diferentes tipos de células presentes em um tecido ficou atrás dos avanços tecnológicos na área de fracionamento subcelular. Na seção seguinte, examinaremos alguns dos problemas associados às separações de células inteiras e alguns dos métodos mais importantes que evoluíram para efetuar tais separações.

1. Desagregação do tecido:

Se o tecido a ser fracionado consiste em suspensões de células individuais (por exemplo, uma cultura de microrganismos, certas culturas de tecidos, células sanguíneas e certos tumores), o problema da separação de células inteiras é muito menos difícil do que quando as células compreendem um sólido tecido (como fígado, rim, cérebro, etc.). Portanto, não é surpreendente que, até o momento, a maioria dos esforços direcionados para separações de células inteiras tenham envolvido suspensões naturais de células como o material de partida. Algum sucesso foi obtido com tecidos sólidos, empregando agentes químicos que induzem a desagregação do tecido - principalmente enzimas digestivas e agentes quelantes.

Esses materiais enfraquecem as conexões entre as células vizinhas, tornando possível dispersar mecanicamente o tecido em células individuais sem quebra de células apreciável. O tecido pode ser tratado após sua remoção do animal, embora a perfusão do órgão com uma solução do agente desagregador antes da excisão do órgão seja mais frequentemente preferida.

Uma vez que o tecido foi reduzido a uma suspensão de células individuais, segue-se o fracionamento em subpopulações. Se o objetivo do experimento é isolar uma determinada subpopulação de células para estudo posterior, então as células restantes na suspensão podem ser destruídas seletivamente ou removidas por meios químicos. Por exemplo, os leucócitos de sangue podem ser separados dos eritrócitos por destruição seletiva dos eritrócitos usando lise osmótica ou química. A purificação de uma subpopulação particular de células também pode ser alcançada tirando vantagem da aglutinabilidade celular diferencial na população mista.

Simplesmente congelar e descongelar uma suspensão de células pode lisar diferencialmente subpopulações específicas. Em geral, os procedimentos químicos causam algumas mudanças em todas as células na população mista, de modo que o método de escolha é mais geralmente aquele que consegue uma separação por meios físicos moderados.

Entre os métodos mais populares estão aderência e filtração, centrifugação convencional e zonal, elutriação centrífuga, separação por gravidade unitária, distribuição de contracorrente, eletroforese e seleção de células ativadas por fluorescência.

2. Aderência e Filtração:

Separações de células usando diferenças em fenômenos de aderência ou propriedades de filtração estão entre os procedimentos físicos mais antigos usados. Algumas células aderem prontamente a contas de vidro, lã de náilon, lã de vidro e assim por diante e podem ser separadas das células não aderentes passando a suspensão de células por uma coluna de vidro oca cheia desses materiais.

O sucesso também foi obtido revestindo esferas de vidro ou plástico com anticorpos, antígenos ou haptenos, de modo que as células sejam adsorvidas diferencialmente às esferas com base nas interações químicas entre a membrana plasmática e o material de revestimento. As peneiras de vários diâmetros de poros também podem ser usadas para separar populações de células com base nas diferenças no diâmetro das células.

3. Centrifugação convencional e zonal:

Devido ao seu tamanho relativamente grande (isto é, em comparação com organelas e macromoléculas) células inteiras sedimentam muito rapidamente. Consequentemente, as tentativas de fracionar suspensões de células usando centrifugação envolvem rotação a baixas rpm (isto é, RCF pequeno) por curtos períodos de tempo (tipicamente menos de 500 g por alguns minutos).

Tal como acontece com os fraccionamentos centrífugos subcelulares, a maior resolução é obtida usando gradientes de densidade nos quais a mistura de células na zona de partida é separada em subpopulações com base nas diferenças no tamanho médio das células e / ou densidade.

A maioria das células se comporta como osmômetros em miniatura, de modo que deve ser dada atenção estrita à seleção do soluto gradiente.Os sais são raramente usados ​​para preparar gradientes de densidade para separações de células por causa de seus efeitos osmóticos deletérios.

Polímeros grandes, impermeáveis ​​e biologicamente inertes, como Percoll e Ficoll, são as escolhas mais frequentes. Por oferecerem a vantagem de um tamanho de amostra muito maior, os rotores zonais reogradados têm sido usados ​​com grande sucesso para separar diferentes populações de células.

4. Elutriação Centrífuga (Centrifugação Contra Fluxo):

A elutriação centrífuga é uma técnica engenhosa pioneira na década de 1940 por P. E. Lindahl e trazida ao seu estado da arte atual principalmente através do trabalho de C. R. McEwen. Na elutriação centrífuga, uma suspensão de células é bombeada para uma câmara de rotor especialmente projetada através de uma porta de entrada localizada marginalmente (Fig. 12-15), e isso é seguido por um fluxo contínuo de meio de suspensão.

A sedimentação centrífuga das células é oposta pelo fluxo centrípeto do meio de suspensão. Ambos os efeitos variam em magnitude ao longo da dimensão radial da câmara do rotor, porque (1) a força centrífuga aumenta com a distância do eixo do rotor e (2) a taxa de fluxo de líquido centrípeto varia de acordo com a área da seção transversal da câmara ( a área aumenta exponencialmente à medida que o líquido se desloca em direção ao eixo do rotor).

Dependendo de sua posição inicial na câmara e de seu coeficiente de sedimentação, cada célula sedimentará radialmente sob a força centrífuga ou será transportada centrípeta pelo fluxo de líquido. Como resultado, as células migram através da câmara para posições onde essas duas forças se cancelam.

Algumas células (por exemplo, as menores) podem ser varridas da câmara do rotor inteiramente e outras formam uma zona dentro da câmara do rotor e podem ser coletadas para estudo posterior. A elutriação centrífuga foi aplicada com sucesso a separações de células sanguíneas, algas, leveduras e outras células em cultura.

5. Separação por gravidade unitária:

A separação das partículas com base nas diferenças da taxa de sedimentação pode não exigir centrifugação se as partículas forem suficientemente grandes. Por exemplo, células inteiras sedimentam rapidamente, mesmo a 1 g (isto é, em gravidade unitária). Os procedimentos de gravidade unitária têm sido usados ​​com eficácia para separar diferentes tipos de células sanguíneas, células de cultura de tecidos e populações de microrganismos em subpopulações.

A separação é obtida colocando a mistura de células em camadas no topo de um gradiente de densidade estacionário e permitindo que as células se acomodem no gradiente por algum período de tempo. O gradiente e as populações de células separadas são coletadas como uma série de frações. Dispositivos usados ​​para separar células em gradientes de densidade em unidade de gravidade são chamados de dispositivos & # 8220sta-put & # 8221 e variam de câmaras cilíndricas simples a aparelhos mais elaborados com tampas de extremidade cônicas móveis. O princípio é ilustrado na Figura 12-16.

Não só é possível separar misturas heterogêneas de células usando esta abordagem simples, mas uma população de um único tipo de célula (por exemplo, uma cultura de células) pode ser fracionada de acordo com a idade celular quando idade e tamanho estão relacionados. Desta forma, os eventos que ocorrem durante as fases sucessivas do ciclo celular podem ser estudados examinando as células presentes nas diferentes frações coletadas.

Vários métodos para separar e isolar os constituintes moleculares das células. Alguns desses métodos foram apropriadamente modificados e aplicados com vários graus de sucesso às separações dos diferentes tipos de células que compõem uma distribuição de contracorrente de tecido e eletroforese.

6. Distribuição contracorrente:

As células (e outras partículas) podem ser separadas umas das outras com base nas diferenças em sua partição entre dois líquidos imiscíveis, esta técnica é chamada de distribuição em contracorrente (CCD). Naturalmente, se as células devem ser separadas sem danos indevidos, o meio selecionado deve ser compatível com as células no que diz respeito à composição iônica, concentração, pressão osmótica e assim por diante.

Esta demanda restringe sensivelmente a seleção de líquidos imiscíveis utilizáveis ​​para separações CCD de células, especialmente em comparação com a gama de opções disponíveis quando a distribuição em contracorrente é empregada para separações moleculares.

O maior sucesso foi obtido com fases consistindo de polietilenoglicol e soluções aquosas de dextrano (poliglucose em que a maioria das ligações glicosídicas são 1 → 6). A técnica tem sido especialmente frutífera na separação de diferentes microrganismos e diferentes células sanguíneas.

7. Eletroforese:

A eletroforese é um dos métodos mais populares usados ​​para separar diferentes espécies moleculares, especialmente proteínas. No entanto, a eletroforese pode ser usada para separar células inteiras. As separações de células usando esta técnica são baseadas no fato de que as membranas plasmáticas das células contêm grupos ionizados (por exemplo, proteínas, ácido siálico e cadeias curtas de carboidratos) que conferem uma carga eletrostática líquida à superfície da célula.

Diferentes tipos de células possuem diferentes cargas líquidas, de modo que, quando colocadas no meio condutor apropriado e submetidas a uma corrente elétrica, migrarão através do meio em taxas diferentes. Conseqüentemente, eles são separados em subpopulações que podem ser coletadas para estudo posterior.

Várias substâncias químicas podem ser aplicadas às células para alterar seletivamente sua distribuição de carga superficial normal e auxiliar em sua separação eletroforética. A eletroforese foi aplicada com sucesso a separações de microrganismos, células sanguíneas, células tumorais ascíticas, células HeLa e outras células em cultura.

8. Classificação de células ativadas por fluorescência:

Os corantes fluorescentes, como a fluoresceína, podem reagir e ligar-se às superfícies das células. O tipo e a quantidade de corante ligado variam para os diferentes tipos de células. Esta propriedade diferencial tem sido usada há anos para distinguir visualmente diferentes tipos de células em uma população mista e, muito recentemente, foi empregada em um elegante instrumento que separa fisicamente as células.

O instrumento, conhecido como classificador de células ativado por fluorescência (ou & # 8220multi parâmetro & # 8221) e representado diagramaticamente na Figura 12-17, tem uma história complexa, mas seu desenvolvimento pode ser creditado às contribuições combinadas de MJ Fulwyler, LA Herzenberg, RG Sweet, WA Bonner e HR Hulett. A suspensão de células tratada com fluoresceína é misturada com solução eletrolítica (& # 8220 fluido de revestimento & # 8221) e forçada para baixo através de um minúsculo bico vibrando a 40.000 ciclos por segundo.

As vibrações do bocal quebram a corrente emergente em gotículas uniformes aproximadamente iguais em número à frequência de vibração (isto é, 40.000 gotículas por segundo). A densidade populacional da suspensão de células original e a taxa de fluxo são ajustadas de modo que cada gota não contenha mais do que uma célula (na verdade, a maioria das gotas não contém células).

Pouco antes da formação das gotículas, o fluxo é iluminado com um feixe de laser de íons de argônio que excita o material fluorescente nas superfícies das células. Dois detectores medem respectivamente a quantidade de luz fluorescente e o volume da célula e disparam um pulso elétrico que carrega cada gota que contém a célula à medida que é formada.

A quantidade e o sinal da carga eletrostática carregada pela gota dependem do tamanho da célula arrastada e do número de moléculas de fluoresceína ligadas à sua superfície. Esses parâmetros de carga podem ser selecionados pelo operador e efetivamente dividir as gotas em três classes: carregadas positivamente, carregadas negativamente e não carregadas.

As gotas então passam entre duas placas eletrostáticas, as gotas carregadas são adequadamente desviadas conforme passam pelo campo entre essas placas e as gotas não carregadas continuam em seu curso original. Finalmente, os três fluxos de gotículas são coletados em reservatórios.

Os fluxos esquerdo e direito contêm diferentes populações de células e o fluxo central não refletido consiste principalmente em gotículas vazias, células indesejadas e detritos. O classificador de células ativadas por fluorescência pode separar cerca de 5000 células por segundo.


Elizabeth spiteri

COMPROMISSOS

Professor Associado Clínico, Patologia

Diretor de Citogenética / Laboratório FISH

Membro, Maternal & amp Child Health Research Institute (MCHRI)

ÁREAS DE ATUAÇÃO

CONTATO


Relação do patógeno hospedeiro: 3 estágios

Durante o estágio de pré-penetração, o patógeno (inóculo) na chegada à superfície do hospedeiro interage nitidamente com o ambiente circundante e com o próprio hospedeiro. O ambiente, que é um agregado de todas as condições externas, incluindo temperatura, umidade (umidade relativa), luz e os microrganismos concorrentes, afeta a vida e a forma do patógeno do inóculo.

A condição ambiental ideal para o crescimento ideal de um patógeno varia novamente com a natureza do patógeno e da superfície do hospedeiro. Por exemplo, o desenvolvimento e a abstração de conídios são favorecidos pela alta temperatura e umidade do ar no míldio.

Já no oídio, tanto o número de esporos quanto sua germinação são maiores à luz do sol. No cereal enferruja, o uredosporo germina a baixa temperatura, mas o processo de infecção é atrasado a esta temperatura. Mais uma vez, o pH do solo desempenha um papel vital no crescimento do patógeno bacteriano da planta na rizosfera (área do solo imediatamente ao redor das raízes).

Se um patógeno sobreviverá e crescerá na superfície do hospedeiro também depende de seu comportamento com os exsudatos da superfície do hospedeiro e da população microbiana presente nela. Os exsudatos da superfície do hospedeiro podem estimular ou inibir o crescimento do patógeno. Os exsudatos radiculares, principalmente açúcares e aminoácidos, são nutrientes para o crescimento de fungos e bactérias.

Mas exsudatos de raiz como o ácido cianídrico, vários ácidos orgânicos e antibióticos são antifúngicos e antibacterianos. Por exemplo, esporos de Rhizopus arrhizus germinam apenas na presença de prolina (aminoácido) presente na região da rizosfera, enquanto exsudatos de raízes de variedades de cebola inibem a germinação de esporos de Colletotrichum circinaus.

As folhas também exalam substâncias que podem ser a favor ou contra o crescimento do patógeno. As glândulas dos pêlos das folhas de grama contêm ácido málico, que é antifúngico e impede o crescimento de Uromyces ciceris arietini.

O ácido protocatecuico, um exsudato da casca da cebola, também é antifúngico. O patógeno precisa neutralizar esses exsudatos ou ser resistente a eles para sobreviver. Além desses, a região da rizosfera contém população microbiana que é antagônica ao crescimento do patógeno. Como tal, o patógeno tem que superar as barreiras acima durante o estágio de pré-penetração antes de poder sobreviver à penetração do hospedeiro.

Uma vez que uma relação favorável seja estabelecida com a superfície do hospedeiro, a multiplicação ou crescimento do patógeno começa. A rápida proliferação de células do patógeno bacteriano resulta em um período de tempo relativamente curto. As células bacterianas assim formadas sendo estruturas delicadas podem ser facilmente mortas em condições desfavoráveis.

Conseqüentemente, eles sobrevivem sob camadas de limo. Novamente, o desenvolvimento do fitopatógeno fúngico geralmente inclui a germinação de esporos pelo tubo germinativo que cresce produzindo hifas de infecção como resultado do crescimento da ponta das hifas ou pode dar origem a um aspersório que ancora o fungo na superfície do hospedeiro.

A cavilha de penetração é produzida a partir do aspersório com o qual o patógeno causa a penetração no hospedeiro. Mas a multiplicação dos vírus ocorre apenas nas células hospedeiras vivas.

2. Estágio de penetração:

O sucesso da penetração do hospedeiro levando ao desenvolvimento da doença é um processo muito complicado que é um efeito combinado de vários fatores como:

(i) A natureza e o comportamento do patógeno, incluindo sua capacidade de multiplicação,

(ii) Condições físicas favoráveis, e

De todos esses fatores, o fator natureza e comportamento do patógeno é o mais importante que controla o desenvolvimento geral da doença. A natureza e o comportamento do patógeno abrangem o potencial de inóculo do patógeno. O potencial de inóculo é novamente uma medida da energia biológica disponível para a colonização de um hospedeiro.

(i) Densidade de inóculos, que se refere ao número de propágulos viáveis ​​por unidade de área de folha ou caule ou por unidade de volume de solo

(ii) Os nutrientes disponíveis para as unidades infecciosas que lhes permitem germinar ou crescer

(iii) O ambiente (faixa de temperatura de 15 a 25 ° C, teor de umidade de 70 por cento e umidade relativa de 90 a 95 por cento)

(iv) A virulência (agressividade e timidez) ou capacidade genética do patógeno para causar doenças e

(v) A susceptibilidade e timidez do hospedeiro.

Além disso, o estado fisiológico do hospedeiro pode afetar a capacidade do patógeno de atacá-lo ou até que ponto um patógeno pode prejudicá-lo. O conceito que engloba esse fenômeno é denominado predisposição.

Os fatores envolvidos na predisposição são:

(ii) Condições ambientais às quais o patógeno foi exposto, ou seja, luz, umidade, ambiente do solo e temperatura

(iii) Infecção por outros patógenos e

(iv) Presença de produtos químicos, ou seja, pesticidas, herbicidas.

Geralmente, as condições adversas predispõem uma planta a uma maior suscetibilidade ao ataque de um patógeno. O fenômeno de predisposição à temperatura na natureza é extremamente variável, dependendo da natureza do hospedeiro e do patógeno. Na maioria das doenças bacterianas e fúngicas, a umidade livre é necessária para o desenvolvimento do patógeno.

Os casos mais conhecidos de predisposição geralmente resultam em aumento da suscetibilidade de plantas geneticamente resistentes. São conhecidos alguns casos em que um tratamento predisponente tem uma resistência muito aumentada e aumentada de plantas que eram geneticamente suscetíveis.

Certos patógenos fúngicos exibem especificidade na parte da infecção do tecido do hospedeiro. Por exemplo, alguns deles podem permanecer restritos no tecido cortical apenas durante todo o período de ataque e causar danos a ele. Mais uma vez, outros permanecem restritos apenas ao tecido vascular. Enquanto outros ainda não atacam a planta a menos que sua madeira do coração esteja desenvolvida e o patógeno permaneça confinado lá causando danos.

Com o potencial de inóculo favorável associado à agressividade sob predisposição favorável, o patógeno entrará agora no tecido do hospedeiro, o que é designado como penetração do hospedeiro. A entrada do patógeno no tecido do hospedeiro é essencial para o sucesso da infecção.

A penetração do hospedeiro e o estabelecimento da relação hospedeiro-patógeno e o subsequente desenvolvimento dos sintomas da doença envolvem uma interação química entre o hospedeiro e o patógeno.

O patógeno emprega armas químicas ofensivas para romper as barreiras do hospedeiro. O parasitismo e a resistência do hospedeiro são paralelos e inseparáveis.

Uma espécie de guerra bioquímica continua entre o hospedeiro e o patógeno, na qual um tenta enganar o outro. Enzimas, toxinas, reguladores de crescimento, polissacarídeos, antibióticos são as importantes armas bioquímicas ofensivas secretadas pelos patógenos (fungos e bactérias). Os fungos produzem grande variedade de enzimas, sem dúvida relacionada à natureza dos materiais colonizados.

As normalmente produzidas têm sido chamadas de enzimas constitutivas, em oposição às enzimas adaptativas ou indutivas, cuja formação é estimulada pela presença do substrato apropriado. As enzimas catalisam muitos dos processos bioquímicos dos organismos vivos e, portanto, desempenham um papel fundamental na interação patógeno-hospedeiro.

Eles estão preocupados não apenas com a entrada inicial do patógeno e sua disseminação dentro do hospedeiro, mas também com a degradação do tecido do hospedeiro em metabólitos que o patógeno pode utilizar. As enzimas quebram as paredes das células e as camadas celulares anticoncepcionais.

Eles também afetam seriamente os processos respiratórios, crescimento, troca iônica da célula hospedeira causando interferência com a permeabilidade celular e outras funções normais. Os vírus, entretanto, devido à sua natureza básica, não podem produzir nenhuma dessas substâncias. Eles se multiplicam direcionando a célula hospedeira para a fabricação de ácido nucléico viral e proteína viral.

A penetração do hospedeiro ocorre:

(i) Por meio de aberturas naturais,

(iii) Por penetração direta de células de superfície causando desintegração do tecido, e

(iv) Por meio de partes ou órgãos específicos.

Tanto as bactérias quanto os vírus entram no tecido do hospedeiro principalmente por meio de feridas. Ao passo que os fungos patógenos ganham entrada no hospedeiro através de aberturas naturais, feridas e por penetração direta através da cutícula e da parede externa das células superficiais, ou pelos da raiz, ou através de partes ou órgãos específicos do hospedeiro.

O processo de penetração direta é mais complicado do que a entrada por aberturas naturais e feridas. É realizado quebrando as barreiras estruturais do hospedeiro por meio de uma ampla gama de ações químicas.

(i) Entrada por aberturas naturais:

Tanto as bactérias quanto os fungos entram no hospedeiro através de aberturas naturais como: estômatos, lenticelas, hidátodos, nec e tímidos, cicatrizes foliares, estigma, etc. É um processo em que os patógenos têm fácil acesso ao hospedeiro, exceto nos casos em que cabelos subestomáticos podem causar resistência contra a entrada do hospedeiro.

(ii) Entrada através de feridas:

Os ferimentos causados ​​por calamidades naturais (tempestade, incêndio, etc.) durante as operações de campo por insetos, por quebra acidental de peças ou outros, oferecem passagens fáceis de patógenos no hospedeiro. Mas, no que diz respeito aos vírus, a entrada do host ocorre apenas por meio de feridas.

(iii) Entrada por penetração direta de células de superfície:

A entrada do patógeno por penetração direta na parede externa das células da superfície do hospedeiro é um processo difícil para o qual o patógeno geralmente requer alta umidade ou fornecimento de água livre. É ainda mais difícil em folhas com cobertura cerosa em sua superfície, o que permite que a água escorra livremente.

Os patógenos fúngicos penetram no hospedeiro perfurando a parede externa da superfície celular ou a penetração é efetuada por pressão e, às vezes, devido ao amolecimento químico ou solubilização da barreira causada pela ação solvente de enzimas secretadas pelo órgão infectante.

Depois que a hifa fez contato com uma superfície hospedeira adequada, ocorre algum crescimento em contato próximo com ela. Isso é seguido pelo desenvolvimento de um aspersório ou aumento no diâmetro da hifa servindo como área aderente a partir da qual se desenvolve o tubo de penetração.

O tubo de penetração penetra através da cutícula em um ponto amolecido pela ação enzimática e seguido por pressão mecânica. Em alguns casos, o lubrificante germinativo produzido pela germinação dos esporos desce entre a parede racial das células adjacentes sem realmente entrar nas células.

Outros fungos enviam apenas haustona na célula epidérmica através da parede cutinizada externa. Em alguns outros, a hifa de penetração que penetra na cutícula induz a formação de um inchaço interno local da parede de celulose subjacente, de modo que uma pequena papila se projeta da parte inferior da parede na célula.

Essa papila é penetrada pela hifa de penetração que entra na célula hospedeira e, por fim, se desenvolve em um haustório.

As bactérias são, em sua maioria, parasitas fracos que não podem empregar a força para efetuar a penetração e a shitração. Sua penetração é efetuada por ação química.Os nemátodos parasitas de plantas perfuram a superfície do hospedeiro com lanças ou estiletes.

Todo o processo de penetração direta, no entanto, depende de:

(a) A natureza das camadas da parede celular,

(b) As potencialidades do sistema enzimático do patógeno, e

(c) A força potencial que o patógeno pode exercer.

Os principais componentes da parede celular do hospedeiro são pectina, celulose, hemicelulose, lignina e pequena quantidade de proteína. As três principais enzimas amolecedoras ou solubilizantes encontradas nos fungos são: pectolítica, celulolítica e lignolítica. A camada externa da célula da planta hospedeira pode ter uma camada de cera que é seguida pela cutícula impregnada com cera.

A cutina diminui gradualmente com a profundidade da epiderme e é substituída pela pectina que ocorre como uma camada homogênea em alguma planta hospedeira. Posteriormente, na parede secundária da célula, a pectina é substituída por celulose. As camadas de celulose contêm quantidades apreciáveis ​​de proteína.

Nenhum patógeno secreta enzimas que degradariam a cera. Apenas a entrada mecânica pode permitir que um patógeno rompam esta camada. A camada de cutina é penetrada por pressão (exercendo força mecanicamente) ou pela ação de enzimas degradantes: cutinase, cutin esterase e carboxyl cutin esterase. A cutinase quebra a cutina em ácido graxo e ácido hidroxigordo.

As substâncias pécticas que formam o material básico da lamela média, paredes primárias e secundárias são degradadas por enzimas pectinolíticas.

As enzimas pectinolíticas atuam contra a pectina e substâncias pécticas em várias etapas:

(a) As enzimas pectina metil esterases (PME) hidrolisam as substâncias pécticas em metanol e ácido péctico

(b) As enzimas pectina glicosidases, poligalacturonases (PG) e polimetil galacturonases (PMG) degradam o ácido péctico e as cadeias metiladas da pectina. Além disso, a enzima modificadora de parede (WME) modifica o material péctico para subsequente degradação e tímido.

A degradação de substâncias pécticas fornece nutrientes para muitos patógenos fúngicos e, devido ao enfraquecimento da parede celular, facilita a invasão inter e intracelular pelas hifas. As enzimas pécticas são produzidas de forma constitutiva e adaptativa. A alta proporção C / N do substrato favorece o aumento do crescimento micelial e a baixa síntese de enzimas, enquanto as razões mais baixas proporcionam um crescimento mais pobre, mas aumentam a síntese de enzimas.

As enzimas pécticas não têm efeito no protoplasto e, portanto, não podem matar muito as células hospedeiras. Eles podem ser secretados por alguns dos patógenos envolvidos na mancha e mancha das folhas, embora o efeito macerador possa ser mascarado pela necrose causada por toxinas.

A celulose forma a estrutura estrutural das paredes celulares. As enzimas celulolíticas atuam sobre a celulose e a quebram em compostos simples, abrindo caminho para a fácil penetração do patógeno na célula hospedeira. Existem duas teorias para explicar o mecanismo de degradação e maceração da celulose por enzimas celulolíticas que são enzimas adaptativas: a teoria das unienzimas e a teoria das multienzimas.

De acordo com a teoria da unienzima, a degradação completa da cllulose em unidades de glicose ocorre por uma única enzima: Celulose Celulose Celobiose Celobiase Glicose. Já a teoria multienzimática explica a degradação da celulose em uma série de etapas por meio de dois grupos de enzimas.

Um grupo de enzimas solta as fibrilas de celulose da área cristalina por mecanismo hidrolítico. O outro grupo de enzimas penetra na rede de celulose e causa clivagem hidrolítica da ligação de hidrogênio.

Nos espaços entre as microfibrilas de celulose da parede celular, estão presentes hemiceluloses que são degradadas por clivagem hidrolítica pelas enzimas hemicelulases.

A degradação das hemiceluloses pelas enzimas hemicelulases produz açúcares mais simples. Nas doenças vasculares, as moléculas liberadas pela degradação da celulose podem causar obstrução dos vasos.

O composto químico mais complexo na parede celular da planta é a lignina, que ocorre principalmente na matriz que envolve as fibrilas de celulose. É um dos biopolímeros mais estruturalmente complexos, cuja degradação é causada por polifenoloxidases produzidas por fungos que apodrecem a madeira. Mas os fungos não podem utilizar os produtos de degradação.

O ataque de nematóides é interno e externo. Tanto os nematóides endofíticos quanto os ectofíticos usam a força e também as enzimas para dissolver ou quebrar a parede celular e entrar em contato com o protoplasma celular através de seu estilete. Mas os nematóides endofíticos entram fisicamente na célula hospedeira, enquanto os ectofíticos permanecem fora do hospedeiro.

(iv) Entrada através de partes ou órgãos específicos:

Em tais casos, os patógenos expelem a especificidade das partes ou órgãos do hospedeiro (caule, folha, pêlos da raiz, partes florais, coleóptilo, botões, etc.) durante sua entrada no hospedeiro.

Alguns exemplos são:

Synchytrium endobiuticwn infecta e permanece confinado nas células epidérmicas do tubérculo da batata, Erysiphe graminis infecta as células epidérmicas das folhas de cereais e gramíneas, Ustilago nuda causa infecção apenas nas flores de trigo, Claviceps purpurea infecta os ovários da flor de centeio, certas madeiras em decomposição os fungos são & # 8211 Merulius lacrimans e Fomes annosus solo que habitam patógenos entre os pêlos das raízes & # 8211 Plasmodiophora brassicae.

Além destes, existem fungos parasitadores de insetos altamente especializados - membros da ordem Entomophthorales e Laboul beniales.

3. Estágio Pós-Penetração:

Normalmente, com o sucesso do processo de penetração, a pós-penetração é bem-sucedida. Mas a entrada do patógeno no tecido do hospedeiro nem sempre garante a infecção imediata que leva ao desenvolvimento da doença. O processo pode ser atrasado ou pode haver falha por vários motivos.

O retardo pode ser nos casos em que o patógeno tenha período de incubação e a infecção se instale somente após o término do período de incubação. O sucesso do processo de pós-penetração depende amplamente da competição do patógeno pela nutrição e da produção de enzimas e substâncias tóxicas e seus efeitos nas atividades metabólicas do hospedeiro.

Novamente, devido ao efeito tóxico do citoplasma do hospedeiro, o patógeno pode falhar em estabelecer uma relação biológica com o hospedeiro. A interação hospedeiro-patógeno também pode resultar em hipersensibilidade do tecido do hospedeiro, por meio da qual a morte rápida das células afetadas impede a propagação do patógeno devido à falta de nutrição.

Mas na maioria das doenças de plantas, a infecção do hospedeiro é seguida por invasão, uma condição quando um patógeno cresce rapidamente no tecido do hospedeiro. Por exemplo, as bactérias invadem os tecidos intracelulares do hospedeiro e os destroem. Ao passo que o micélio fugal invade inter ou intracelular, mas pode ou não causar destruição imediatamente após a invasão. Os vírus sempre invadem os tecidos intracelulares do hospedeiro.

Eles se multiplicam nas células hospedeiras vivas, direcionando-as para a fabricação de ácido nucléico viral e proteína viral, seu movimento e tímido de célula para célula é através de plasmodesmos. Mais uma vez, hifas e esporos de fungos e células bacterianas podem se mover através dos tecidos vasculares assim que entrarem neles. A invasão bem-sucedida do patógeno pelo hospedeiro está invariavelmente associada a síndromes de doenças de vários tipos em graus variados.

Depois de penetrar nas paredes das células do hospedeiro, o patógeno entra em contato com o citoplasma do hospedeiro, de onde obtém a nutrição necessária. Em resposta às atividades do patógeno, os processos metabólicos do hospedeiro (osmorregulação, respiração, fotossíntese, etc.) são perturbados.

Dependendo da natureza do hospedeiro e da virulência do patógeno e sua relação, o hospedeiro interage da seguinte maneira:

(i) Aumentar a frequência respiratória:

O nível de muitas enzimas associadas ao aumento da respiração, resultando no acúmulo e oxidação de fenóis. A quebra do ATP é acelerada, causando um aumento na frequência respiratória. Uma relação hospedeiro-patógeno é conhecida como relação incompatível quando o aumento da frequência respiratória ocorre no estágio inicial da infecção.

Novamente é designada como relação compatível onde o patógeno é um parasita obrigatório e há pouca mudança na taxa respiratória do tecido infectado.

(ii) Desequilíbrio do processo fotossintético:

O processo fotossintético é prejudicado pela quebra da clorofila pela enzima clorofilase, causando clorose. Também pode haver aumento na quantidade de clorofila exibida por ilhas verdes na superfície da folha afetada.

(iii) Deslocamento do crescimento normal:

A síntese normal de substâncias promotoras de crescimento e tímidas (auxinas, giberelinas e citocininas) é desequilibrada, resultando em crescimento excessivo e tímido, crescimento subnormal e sintomas correlacionados. Pode haver rápido desenvolvimento e retração de inibidores de crescimento (dormin e outras substâncias), levando ao amadurecimento prematuro dos frutos e causando a formação de camadas de abscisão, resultando na queda prematura de folhas, flores e frutos.

(iv) Influência nas estruturas reprodutivas:

Pode haver interrupção do desenvolvimento das estruturas reprodutivas (aborto) ou devido a infecção localizada ou sistêmica, pode haver destruição dos ovários.

(v) Efeito no transporte de órgãos:

Os órgãos de transporte são afetados de várias maneiras:

(a) Obstrução e ruptura dos vasos do xilema devido ao crescimento do patógeno em seu lúmen

(b) A presença de patógenos no tecido vascular causa a formação de toxinas e o desenvolvimento de tilos nos vasos do xilema do parênquima adjacente, causando obstrução à passagem de água

(c) A infecção vascular produz enzimas pécticas nos vasos do xilema, cuja lamela média é degradada, liberando ácido péctico e outras substâncias que formam géis e gomas para obstruir o lúmen dos vasos do xilema

(d) Os polissacarídeos secretados por patógenos vasculares têm sido mais frequentemente considerados como & # 8220wilt toxins & # 8221, dissolvidos ou suspensos na seiva do xilema exercem sua ação à distância das células do patógeno.

Murcha bacteriana e fúngica são freqüentemente associadas e tímidas com o movimento do patógeno e a colonização de elementos vasculares do hospedeiro. Mais uma vez, a necrose do floema causada por vírus obstrui o movimento dos carboidratos sintetizados nas folhas, causando muitas deformidades na superfície da folha.

(vi) Deslocamento de tecidos:

A secreção de enzimas líticas causa perda de coerência dos tecidos, quebra das paredes celulares e morte de protoplastos. A morte de partes aéreas pode resultar do transporte de substâncias tóxicas dos tecidos doentes ou do desequilíbrio iônico causado pela falha da absorção seletiva.

(vii) Resultado de crescimento anormal:

O aumento ou diminuição no número e tamanho da célula hospedeira são atribuídos ao desequilíbrio do metabolismo, independentemente de as perturbações do crescimento serem causadas por infecção fúngica, bacteriana, viral ou nematóide. & # 8217 O desequilíbrio do metabolismo perturba o equilíbrio hormonal normal. O hormônio cinetina atua em conjunto com o ácido indolacético (IAA) para a expansão e divisão celular, causando a proliferação do tecido.

(viii) Causa destruição do tecido:

À medida que o patógeno cresce no tecido do hospedeiro, enzimas que degradam a parede celular, como celulases, hemicelulases, pectinases, etc., induzem processos de maceração. A desintegração do tecido do hospedeiro continua ainda mais acompanhada pela atividade de várias enzimas oxidativas, como peroxidase, polifenol oxidase e ácido ascórbico oxidase.

Talvez o tipo mais refinado de patogênese possa ser observado com os vírus. Com a ajuda de seus ácidos nucléicos, eles fornecem às células hospedeiras informações incorretas que causam danos. À medida que o patógeno cresce, ele também interfere no metabolismo das proteínas do tecido do hospedeiro, causando redução no nível de proteína e nitrogênio no tecido afetado.

Durante o estágio de pós-penetração, armas bioquímicas ofensivas - enzimas, toxinas, reguladores de crescimento, polissacarídeos e antibióticos são empregados simultaneamente pelo patógeno para degradar e macerar a parede celular do hospedeiro e, por fim, matar e / ou interagir com as células hospedeiras.

Esse comportamento do patógeno, além de causar desequilíbrio nos processos metabólicos do hospedeiro, também desencadeia vários sistemas metabólicos nas células do hospedeiro resultando na formação de substâncias químicas de defesa fenólicas com as quais o hospedeiro tenta repelir o ataque do patógeno. Esses dois processos continuam simultaneamente. Esses aspectos são tratados separadamente em títulos separados.

Essa destruição e maceração da parede celular são feitas por várias enzimas. Esses processos são seguidos de perto pela ação de toxinas e outras armas bioquímicas ofensivas.

As toxinas são substâncias bioquímicas produzidas por patógenos durante a infecção do hospedeiro. Eles são responsáveis ​​por sintomas de doenças na planta hospedeira. Que as toxinas são responsáveis ​​pela morte das células hospedeiras foi apontado pela primeira vez por DeBary (1886). O termo toxina pode ter significados diferentes para diferentes trabalhadores. Owens definiu as toxinas como substâncias não enzimáticas que danificam as células vegetais ou interrompem seu metabolismo.

As toxinas também inativam as reações enzimáticas do tecido do hospedeiro.

Eles são produzidos por microorganismos (fungos e bactérias) em uma variedade de ambientes e são prejudiciais ou letais em baixa concentração para macroorganismos. Portanto, é o suspeito, um macroorganismo, em vez de um microorganismo que distingue as toxinas dos antibióticos.

Mais uma vez, as substâncias que são tóxicas em doses excessivas, embora sejam excretadas por microrganismos, não são consideradas toxinas. A toxina pode, portanto, ser definida como uma substância química produzida por microrganismos durante sua interação com o hospedeiro. Afeta o metabolismo do hospedeiro de maneira sutil.

A toxina também atua diretamente no proto & tímplasma do hospedeiro vivo para influenciar o curso do desenvolvimento da doença ou a expressão dos sintomas. Uma toxina tem baixo peso molecular, é extremamente móvel e atinge facilmente os níveis subcelulares dos hospedeiros. As toxinas são diferentes das enzimas porque não atacam a integridade estrutural do tecido da mangueira, mas afetam as atividades metabólicas das células hospedeiras.

Eles podem ser antimetabólitos em ação e podem reduzir a quantidade de fator de crescimento específico. Eles também perturbam as relações osmóticas das células hospedeiras e a maioria delas afeta a respiração direta ou indiretamente.

Em contraste com as enzimas, o efeito das toxinas é direto no protoplasto. Scheffer e Briggs (1981) definiram a toxina (para fins fitopatológicos) como um produto micro e tímido diferente da enzima, que causa danos óbvios aos tecidos da planta e que é conhecido com razoável confiança por estar envolvido no desenvolvimento de doenças. A maioria das toxinas não é específica em sua ação.

Eles prejudicam muitas espécies pertencentes a diferentes gêneros ou famílias não relacionadas. Algumas toxinas são específicas da espécie. Eles afetam apenas as plantas suscetíveis às plantas resistentes ao patógeno não são danificadas. Toxinas específicas do hospedeiro também são designadas por alguns pesquisadores como patotoxinas.

Essas toxinas são capazes de produzir em plantas hospedeiras suscetíveis todos os sintomas característicos de doenças, mas têm pouco ou nenhum efeito sobre as espécies resistentes, a menos que sejam usadas em concentrações massivas. O patógeno e as patotoxinas exibem especificidade de hospedeiro semelhante. A virulência da cepa patogênica varia diretamente com sua capacidade de produzir toxinas. As toxinas específicas do hospedeiro são produtos químicos complexos.

É relativamente difícil isolar qualquer uma dessas toxinas na forma pura e ainda reter a propriedade de toxicidade específica. Alguns deles são peptídeos de baixo peso molecular. Eles agem rapidamente tanto na célula quanto na membrana plasmática, causando alterações na permeabilidade e na respiração dos tecidos doentes.

Algumas toxinas afetam vários tipos de tecido vegetal, enquanto outras danificam um único tipo de tecido. Eles podem induzir uma síndrome particular quando aplicados a plantas em concentrações adequadas.

Murcha, por exemplo, é um efeito comum de muitas toxinas que causam a perda do turgor celular e da flacidez das folhas e, eventualmente, uma murcha geral de todo o broto. Essas toxinas são conhecidas como marasmins ou toxinas murchas. Lycomarasmin e ácido fusárico também fazem parte desta categoria de toxinas. Mais uma vez, as toxinas que causam necrose são as necrotoxinas e são produzidas pelas espécies de Altemaria, Phytophthora e Pseudomonas.

A concentração de toxinas pode não estar correlacionada com a virulência. Uma única toxina pode induzir todos os sintomas. A capacidade de um microrganismo de produzir uma toxina ou enzima é, obviamente, fixada geneticamente, mas certos produtos químicos podem ser capazes de reprimir a ativação da informação genética ou impedi-la de funcionar no metabolismo celular.

As toxinas são classificadas em três categorias:

(i) Toxinas ou zootoxinas animais, produzidas por animais

(ii) Toxinas vegetais ou fitotoxinas, produzidas por fungos ou plantas superiores e

(iii) Toxinas microbianas, produzidas por microrganismos.

As fitotoxinas podem ser (a) patotoxinas que são capazes de produzir todos os sintomas da doença, e (b) as vivotoxinas produzem parte do sintoma da doença in vivo.

Segundo Diamond e Waggoner (1963), a vivotoxina é uma substância produzida no tecido do hospedeiro infectado pelo patógeno e / ou seu hospedeiro, que atua na produção de doenças, mas não é ela mesma o agente desencadeante inicial da doença.

As fitotoxinas têm propriedades como:

(a) Pode induzir a mesma resposta da planta, mas pode ter diferentes mecanismos de ação

(b) Diferentes patógenos podem sintetizar a mesma fitotoxina

(c) A maioria das fitotoxinas são compostas de carboidratos simples e / ou resíduos de aminoácidos

(d) O patógeno e a toxina podem não exibir a mesma gama de hospedeiros

(e) A concentração de toxinas e a timtração podem não estar correlacionadas com a virulência

(f) A toxigenicidade nem sempre é um requisito para a patogenicidade

(g) As taxas de síntese e degradação podem variar dependendo da natureza do microrganismo, ambiente e hospedeiro

(h) Pode não agir sozinho, mas em conjunto com outras substâncias produzidas por patógenos e hospedeiros em um sistema dinâmico e inter-relacionado

(i) Têm baixo peso molecular e são móveis nos tecidos vegetais

(j) Talvez intrinsecamente instável

(k) Pode estar reagindo irreversivelmente com constituintes celulares e

(l) pode atuar em combinação com outros componentes encontrados no tecido doente.

Outros tipos de toxinas são: endotoxinas, toxinas intracelulares formadas em células bacterianas e não são liberadas até que estas morram e exotoxinas, toxinas extracelulares que se difundem da célula bacteriana viva.

A maioria das toxinas produzidas por fitopatógenos parecem ser pleiotrópicas, ou seja, têm múltiplos efeitos nas células hospedeiras, mas o & # 8216wildfire & # 8217 A toxina produzida por Pseudomonas tabaci é monotrópica, assim como muitas das toxinas produzidas por bactérias que atacam os animais. Esta é uma toxina instável.

Os diversos mecanismos pelos quais as toxinas microbianas danificam um hospedeiro não são claramente compreendidos. No entanto, as toxinas devem eventualmente influenciar adversamente o sistema de membrana, sejam estas as membranas citoplasmáticas limitantes, o citoesqueleto membranoso interno ou as diversas membranas de organelas, incluindo vacúolos. As toxinas danificam a permeabilidade das membranas vegetais.

As fitotoxinas bacterianas respondem às plantas em apenas alguns dias, principalmente pelo desenvolvimento de clorose, anormalidades de crescimento, necrose, encharcamento ou murcha. A resposta dependerá da concentração da fitotoxina, das condições ambientais e / ou do estado fisiológico do hospedeiro.

Essas respostas da planta não são apenas limitadas em espécie, mas são inespecíficas, pois diferentes agentes agindo de maneiras diferentes podem induzir a mesma resposta.

Vários fungos de armazenamento, bem como alguns outros fungos, são conhecidos por produzir substâncias que têm efeitos tóxicos em animais e humanos. Essas substâncias tóxicas são conhecidas como micotoxinas e as doenças que causam em animais são as micotoxicoses.

O interesse pelas micotoxinas resultou da descoberta da aflatoxina, um meta & shybolite de Aspergillus flavus Link ex Fries produzido em grãos de amendoim, relatado pela primeira vez por K. Sargeant e outros (1961). & # 8220Aflaroot & # 8221 A doença induzida por A. flavus, que é uma doença do amendoim transmitida pela semente e pelo solo, causa problemas de afla e shitoxina pós-colheita no amendoim, desenvolvendo-se em cascas e grãos mal secos.

As aflatoxinas são assim produzidas em grãos de amendoim, particularmente em frutos secos de maneira inadequada. A ocorrência natural de aflatoxinas foi relatada em uma ampla gama de condições de conservação, particularmente em vagens e sementes inadequadamente secas, tanto no campo quanto nas condições de armazenamento.

Com o passar do tempo, a contaminação de alimentos e rações por aflatoxina representou um problema de armazenamento, pois o consumo de alimentos contaminados por aflatoxina produz efeitos tímidos e desagradáveis. Entre os vários derivados, a aflatoxina B1 é o mais tóxico e gene & timidamente produzido em maiores quantidades. As micotoxinas em geral, e as aflatoxinas em parti & shycular, em alimentos e rações têm propriedades carcinogênicas e toxinogênicas.

Algumas das micotoxinas produzidas por fungos de armazenamento são: esterigmatocistina, ocratoxina, citinina e patulina.

Existem semelhanças entre as infecções bacterianas e fúngicas e os sintomas resultantes. Em geral, a infecção por vírus reduz a capacidade do hospedeiro para sin & shítese do amido acompanhada por degeneração reduzida do amido, resultando no acúmulo de amido na folhagem e outras partes da planta. A infecção por vírus também aumenta a atividade respiratória e altera os níveis de auxina nas células hospedeiras.

A interação hospedeiro-patógeno, em última análise, pode produzir sintomas como:

O patógeno também pode estabelecer uma relação ou associação com o hospedeiro de tal maneira que nenhuma das condições acima seja produzida. Depois de parte de seu crescimento, ou pelo menos quando atinge um determinado órgão do hospedeiro, ou ambos, apenas o patógeno produz sintomas que serão visíveis de fora.

Em tecidos verdes infectados, a clorofila pode ser reduzida ou destruída tornando-se marrom. Ou, em certas áreas, devido à ação conservante de certos parasitas no aparato da clorofila dos tecidos foliares, há formação marcada de ilhas verdes de tecidos após o resto do tecido verde murchar, isso é conhecido como efeito de ilha verde.

Há evidências de que não apenas a clorofila é preservada, mas também os cloroplastos são estimulados a um aumento da atividade pelo patógeno. Pode haver desenvolvimento de pigmento vermelho ou roxo devido à formação de antocianina resultante da infecção.

Há um grupo de fungos que dissolvem a celulose e que são responsáveis ​​pelo apodrecimento da madeira. Este é um grande grupo composto por parasitas e saprófitas. Embora suas atividades sejam mais ou menos restritas à celulose e substâncias semelhantes à celulose da madeira, eles também atacam todos os principais componentes das paredes celulares da madeira.

Não há uniformidade de sequência ou proporção de sua destruição. Alguns atacam os principais componentes da madeira simultaneamente, enquanto outros causam deslignificação antes que a celulose se esgote, outros mostram novamente uma deslignificação retardada. As variações são devidas a diferenças na natureza e tempo em que a enzima se torna ativa e seu curso de ação.

A madeira, que é um substrato orgânico rico, fornece uma base alimentar adequada para fungos. Os fungos obtêm sua nutrição do material da parede celular, que decompõe por atividade enzimática.

As hifas exalam várias enzimas em seu substrato. Essas enzimas convertem o material quimicamente complexo da parede em produtos mais simples solúveis em água, que são posteriormente atuados por endoenzimas no curso do metabolismo do fungo. As enzimas são seletivas em ação. A capacidade dos fungos de atacar vários componentes da madeira é determinada pela natureza das enzimas que eles secretam.

Existem vários estágios de decomposição, à medida que a madeira muda de sólida para completamente decomposta. No estágio inicial ou incipiente, também conhecido como decadência incipiente, a madeira parece normal, exceto em alguns casos por uma mudança de cor. Este estágio pode ser facilmente esquecido e, como tal, a decomposição incipiente é perigosa.

A partir deste estágio, a madeira fica visivelmente afetada até que finalmente mude completamente em estrutura e aparência. Este é o estágio avançado de decadência.

A mudança na cor da madeira nem sempre é um critério de decomposição, uma vez que pode ser devido a outras causas, sejam parasitárias, por exemplo, fungos que causam manchas de seiva na madeira ou devido à ação química. Algumas cáries estão associadas à formação de linhas de zona marrom-escuras a pretas e também possuem odor de cogumelo. Em decadência incipiente, a madeira nem sempre pode enfraquecer.

Mas em um estágio avançado de decomposição, todas as propriedades mecânicas da madeira são seriamente afetadas e tal madeira é inútil para qualquer propósito de botânica universitária onde a força é necessária.

A decomposição resulta na diminuição da gravidade específica da madeira, de modo que a quantidade de substância de madeira por unidade de volume se torna menor. A madeira em decomposição, com base no volume, tem, portanto, menor valor calorífico e rende um combustível de baixo teor. Os caracteres micro e shyscopic de decadência incluem a presença de hifas nas células.

As hifas passam de uma célula para outra, consumindo materiais alimentícios durante a decomposição, ocorrendo a penetração provavelmente por ação química, resultando em furos na parede.

Ao utilizar o material da parede celular como alimento, as hifas causam marcas de corrosão, espessura irregular das paredes secundárias levando à sua desintegração, aumento das fossas e dissolução das cavidades contornadas. O dano na parede celular é responsável principalmente pela redução da resistência da madeira em decomposição.

Além das enzimas, para causar decomposição, os fungos requerem uma concentração ótima de ar (oxigênio) e umidade para seu crescimento. O ar insuficiente pode atuar como um fator limitante e se o ar for removido por saturação da madeira com água, os fungos morrem. Os fungos não podem crescer na madeira se a umidade estiver abaixo de 20%, com base no peso da madeira seca no forno.

Se, no entanto, a madeira infectada for seca ao ar, o fungo não morre, mas seu crescimento ativo cessa e pode permanecer inativo por vários anos nessa condição. Se essa madeira for umedecida, o fungo pode reviver e continuar seu crescimento na madeira.

Com relação à temperatura, os fungos que apodrecem a madeira têm ótimo desenvolvimento em uma faixa de 60 ° F. a 90 ° F. temperatura. A precipitação também influencia muito a ocorrência de fungos apodrecedores. Uma certa quantidade de umidade no substrato e na atmosfera é necessária para que os fungos desenvolvam esporóforos.

Em localidades secas, portanto, como nos desertos, os fungos apodrecedores são poucos. Em condições tropicais com altas temperaturas e chuvas, os fungos apodrecedores são diversos e também em grande número. Eles permanecem ativos durante a maior parte do ano. Nas regiões temperadas, os fungos são menos numerosos. Eles permanecem ativos por um período mais curto, ou seja, durante o verão.

Alguns fungos apodrecedores de madeira que podem tolerar uma ampla faixa de temperatura são:

Fomes lividus, Polyporus gilvus, P. hirsutus. Outros, como F. ​​badius, F. pachyphloeus, Ganoderma lucidum, Polyporus palustris, P. tulipiferae, prosperam em altas temperaturas. Os fungos que se desenvolvem em baixas temperaturas são: Fomes annosus, F. robustus, F. roseus, F. pini, Lenzites sepiaria, Merulius lacrymans, Polyporus abietinus, P. pargamems, P. versicolor, Poria monticola, P. xantha.

Para fins práticos, dois tipos de decomposição da madeira são geralmente reconhecidos:

Podridão branca e podridão parda. Ambos os tipos de cárie são causados ​​por grande número de Ascomicetes e Basidiomicetos. Em ambos os tipos de decomposição da madeira, as hifas penetram profundamente nos tecidos da madeira e habitam o lúmen dos vasos das células hospedeiras.

Eles passam de célula em célula por meio de furos. A podridão branca que causa a decomposição da lignina dos fungos com óxidos e exoenzimas tímidas. Eles também removem uma pequena quantidade de carboidratos estruturais levando a um clareamento da madeira. Mas os fungos indutores da podridão parda removem os carboidratos estruturais como a celulose e as hemiceluloses, deixando a lignina relativamente inalterada.

Portanto, a madeira, após a decomposição, parece mais marrom do que a madeira normal. Em ambos os casos, a degradação da madeira está geralmente associada a uma mudança de cor. No caso de podridão branca a cor é branqueada e no caso de podridão parda a cor escurece. O escurecimento inicial causado pelos fungos da podridão branca pode ser devido à oxidação dos fenóis. A madeira deteriorada encolhe. Isso ocorre mais em caso de podridão parda do que de podridão branca.

No caso de cárie causada por fungos da podridão parda, no estágio inicial não há adelgaçamento da parede celular. A podridão branca pode ser fibrosa ou esponjosa (podridão fibrosa ou esponjosa branca) ou podem desenvolver-se bolsas na madeira em que os tecidos são brancos e fibrosos e essas bolsas são delimitadas por finas áreas marrons, menos deterioradas (podridão de bolsa branca).

A madeira apodrecida também se quebra em todas as direções em blocos cuboidais, que facilmente se tornam pulverulentos sob pressão. Quando tal decadência ocorre em madeiras estruturais, como em edifícios, é denominado podridão seca. O termo podridão seca é um nome impróprio, uma vez que tal podridão & # 8217, bem como outras, ocorrem apenas em condições úmidas. Existe outra forma de decomposição na madeira, denominada podridão mole, que é reconhecida por sua fratura frágil quando quebrada no grão.

Os fungos atacam principalmente a celulose e as hifas são principalmente confinadas à parede secundária, na qual ocorre a dissolução na forma de covas ou cavidades. Os fungos que causam podridão mole pertencem aos Ascomicetes e Deuteromicetos. Os fungos da podridão mole estão quase restritos à superfície da parede secundária e ali prosperam, produzindo grandes cavidades por enzimas que ficam paralelas às microfibrilas.

O diagnóstico de cárie pode ser feito quando a cárie está em estágio avançado, por caracteres grosseiros. A decomposição incipiente pode ser determinada por caracteres microscópicos da madeira em decomposição e pelo isolamento do fungo em cultura.

Os fungos podem atacar o alburno ou o cerne das árvores ou madeiras. A decomposição do cerne é - apodrecimento do coração. Os fungos que atacam as árvores podem ou não decompor a madeira após a conversão. Quando essa podridão ocorre na madeira convertida, o termo & # 8216 podridão inativa & # 8217 pode ser aplicado a ele.

Os fungos de manchas de seiva formam outro grupo, causando defeitos em árvores e madeira.

Eles não atacam a parede celular, mas vivem do conteúdo celular armazenado no alburno, apenas assim o cerne, onde nenhum tal material alimentar está presente, permanece inalterado. Como a parede celular não é atacada, a maioria das propriedades da madeira, exceto impensadas, permanecem inalteradas. No entanto, a mancha deprecia o valor da madeira devido à aparência desagradável. Seiva. a mancha é causada por alguns membros dos Ascomicetes e Deuteromicetos.

A colonização célula a célula de células mesófilas pode causar sintomas de manchas nas folhas, murcha pode se desenvolver se as células vasculares forem invadidas ou uma podridão mole pode ser causada pela quebra das células parenquimatosas vivas do córtex ou medula.

Mudanças no sistema vascular:

O sistema vascular de uma planta livre de doenças serve como uma via para o movimento dos nutrientes que transportam a água.

Mas, em algumas plantas doentes e tímidas, o sistema vascular pode servir como uma via para o movimento dos patógenos. Novamente, a via da água e dos nutrientes pode ser obstruída por metabólitos produzidos pelo patógeno, pelo próprio patógeno por seu crescimento ou pelos fragmentos do tecido do hospedeiro produzidos pela infecção e pelo patógeno. Em última análise, isso resultará no murchamento da planta.

As doenças murchas têm uma multiplicidade de causas, em vez de uma única causa, mas são em grande parte devidas à deficiência de abastecimento de água. A água torna-se deficiente em plantas com doença murcha como resultado de uma série de eventos.

(i) Os vasos ficam completamente obstruídos por tilos e gengivas.

(ii) A resistência ao fluxo de água através dos vasos aumenta como resultado do desenvolvimento de géis vasculares, da presença de micélio e do alojamento de propágulos no lúmen dos vasos.

(iii) A resistência à transferência de água de vaso para vaso e à redistribuição de água na planta também aumenta em plantas doentes, como resultado da obstrução das membranas dos caroços por compostos de alto peso molecular, como polissacarídeos excretados pelo patógeno, o melanoide resinoso pigmentos associados ao escurecimento vascular e os produtos de clivagem parcialmente hidrolisados ​​das paredes das células por enzimas hidrolíticas do patógeno.

(iv) O fluxo de água e nutrientes pode ser prejudicado nos casos em que os tecidos vasculares são esmagados localmente devido ao crescimento do patógeno.

(v) A doença murcha pode ser induzida pela toxina murcha produzida nos vasos do xilema.

Além dos fatores acima, os glicopeptídeos produzidos por alguns patógenos se acumulam nas extremidades do sistema vascular nas margens das folhas, onde se acumulam nas membranas das células do parênquima e danificam a permeabilidade diferencial.

As folhas não sintomáticas de plantas infectadas podem ter perda de transpiração de cerca de um terço das folhas de plantas saudáveis ​​que recebem um suprimento normal de água. Os estômatos permanecem fechados. Os tecidos estão sujeitos a uma escassez cada vez maior de água.

As plantas infectadas podem ter uma taxa fotossintética mais baixa do que as plantas saudáveis. Taxas reduzidas de fotossíntese e transpiração são atribuídas ao fornecimento limitado de água. Tanto o crescimento terminal quanto o cambial são reduzidos em plantas infectadas. Novamente, as células nas quais o parasita penetra são mortas antes do que pode haver alteração da pigmentação das células e destruição do protoplasma.

Em outros, o parasita pode produzir certas substâncias que causam estrias ou manchas em certas partes do tecido do hospedeiro.

Alguns tecidos lenhosos reagem ao ataque parasitário pela secreção de goma e pelo desenvolvimento de tilos nos vasos da madeira. Nesse aspecto, as coníferas são importantes porque vários fungos e bactérias causam o escoamento de resina delas. Novamente, existem certas árvores frutíferas das quais a goma é exsudada devido a causas parasitárias e não tímidas, conhecidas como gomose.

Quando o exsudado é resina, é conhecido como resinose. Novamente, pode haver fluxo de limo quando o produto de exsudação é uma substância viscosa.


Resultados

Análise de eficiência de PCR

Oito genes de manutenção foram selecionados para análise de genes de referência comumente usados. Nomes de genes, abreviações, funções celulares, números de acesso GenBank e sequências de iniciadores estão listados na Tabela 1. Todos os iniciadores foram otimizados para eficiência da seguinte forma: Uma série de diluição de cDNA (100%, 50%, 20%, 10%, 5%, 2 % e 1%) foi desenvolvido a partir de RNA embrionário e QPCR foi realizado em cada gene usando a série de diluição como modelo. Os valores Ct foram exportados para QGene e os valores de eficiência para cada par de primer foram determinados (ver Métodos). A série de diluições foi duplicada usando cDNA preparado a partir de RNA de tecido adulto para verificar se foram obtidas eficiências de iniciador semelhantes. Usando condições QPCR otimizadas, todos os mRNAs direcionados foram detectados durante todos os estágios de desenvolvimento e em todos os tipos de tecido de ambos os sexos, mas os valores de Ct variaram, indicando que a abundância do transcrito está relacionada ao gene, estágio, tecido, sexo e tratamento (Tabelas 2 e amp3 Fig. 1).

Expressão do gene de manutenção durante o desenvolvimento, conforme medido por QPCR. Os embriões foram coletados em intervalos de tempo (2, 6, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 hpf) e agrupados (50 embriões / pool, 3 pools por ponto de tempo) para análise. Os valores Ct representam a média +/- SEM de três réplicas biológicas. Observe que o eixo y difere nos três painéis para mostrar grupos de genes com base no intervalo Ct durante o desenvolvimento: (de cima para baixo) genes altamente expressos (bactin1, elfa, 18s), genes com expressão altamente variável (tuba1, gapdh), g enes com expressão moderada (tbp, b2m, g6pd). Todos os genes mostraram diferenças significativas entre os estágios de desenvolvimento por ANOVA unilateral p & lt .05.

Níveis de expressão de genes de manutenção por sexo e tipo de tecido em peixes-zebra adultos

Para avaliar a expressão do gene doméstico por sexo e tipo de tecido, cérebro, olhos, coração, fígado, músculos, testículos e ovários foram coletados de peixes-zebra machos e fêmeas adultos reprodutivamente ativos. Os tecidos foram agrupados por sexo e tipo de tecido (3 pools por sexo / tipo de tecido, 5 peixes por pool). Os valores médios de Ct para todos os genes de manutenção nos sete tecidos são mostrados na Tabela 2. Todos os oito genes mostraram diferenças significativas em sua expressão entre os tipos de tecido quando analisados ​​separadamente em machos e fêmeas. A variação mais pronunciada (

9 Ct) para um determinado gene (gapdh) foi encontrado quando o cérebro e o músculo foram comparados em mulheres. Além disso, quando os níveis expressos de um determinado gene e tipo de tecido foram comparados em homens e mulheres, algumas diferenças significativas foram observadas. Por exemplo, a expressão de tbp e g6pd no músculo esquelético e no coração foi significativamente maior nas mulheres do que nos homens. Diferenças significativas também foram observadas em cinco dos oito genes (bactin1, gapdh, g6pd, tbp, e b2m) quando os ovários e os testículos foram comparados. Se as diferenças entre homens e mulheres na expressão do gene doméstico podem ser traduzidas em diferenças individuais dentro de cada pool de tecidos, é uma questão para estudos futuros.

Expressão do gene de manutenção durante o desenvolvimento

Para cada um dos oito genes de manutenção, a abundância de transcritos foi medida em 3 pools de embriões / larvas independentes (50 / pool) coletados em intervalos de tempo de 2 a 120 horas após a fertilização (hpf). Os níveis de expressão durante o desenvolvimento, representados como valores médios de Ct, são mostrados na Figura 1. Os genes segregados em três categorias com base na abundância de transcritos: elfa, bactin1 e 18s foram altamente expressos (Ct & lt 18), g6pd, tpb, e b2m foram expressos em um nível moderado (Ct 20-25), e tuba1 e gapdh mostrou níveis de expressão altamente variáveis ​​(Ct 16-23). Cada um dos oito genes mostrou diferenças significativas na expressão ao longo do curso do tempo de desenvolvimento, conforme determinado por ANOVA. No entanto, a magnitude da mudança ao longo do desenvolvimento variou de menos de 0,5 Ct (18s) a mais de 6 Cts (tuba1) Geralmente, a variabilidade na expressão foi maior entre 2 e 24 hpf e posteriormente estabilizada.

O efeito do tratamento com veículo / hormônio / tóxico na expressão do gene de manutenção em embriões / larvas

Para determinar se a variação na expressão do gene de manutenção é afetada pelo tratamento químico, embriões / larvas de peixe-zebra agrupados (3 pools independentes por tipo de tratamento) foram expostos entre 24-96 hpf para veículos comumente usados ​​para administração e agentes que representam desreguladores endócrinos ambientais conhecidos [11 –13]. Mostrados na Tabela 3 estão os níveis de expressão médios (valores de Ct) de cada gene em embriões tratados com veículo (DMSO ou EtOH), um agonista do receptor de estrogênio (ER) (17β-estradiol, E2), um antagonista de ER (ICI 180,172, ICI ), um agonista de receptor de andrógeno / andrógeno aromatizável (testosterona, T) e agonista de receptor de hidrocarboneto de aril (AhR) (β-naftaflavona, TCDD).Em nosso laboratório, a exposição a esses produtos químicos nas doses usadas afeta os efeitos do gene alvo mediados por ER ou AhR (respectivamente, cyp19a1b e cyp1a) sem uma resposta tóxica geral [11–13]. Todos os oito genes testados revelaram diferenças significativas nos níveis de expressão entre os grupos de tratamento. De particular interesse são as mudanças observadas nos dois veículos. Tanto o DMSO quanto o EtOH alteraram significativamente a expressão de três dos oito genes medidos. Destes, gapdh e elfa a expressão aumentou com DMSO e EtOH quando comparada aos controles não tratados, mas g6pd e 18s foram afetados diferencialmente pelo tratamento com veículo. Além disso, TCDD, um potente tóxico, suprimiu fortemente a expressão de um gene (tbp,

2 Cts), enquanto o estrogênio hormonal (E2) teve efeitos modestos em dois genes (g6pd, 18s) Curiosamente, o padrão de efeitos com o T, um andrógeno aromatizável, que regula positivamente os genes responsivos ao estrogênio nas doses usadas [11], diferia daquele do E2. Isso sugere que os efeitos T são independentes de ER. A variabilidade geral nos níveis de expressão dos oito genes após o tratamento de embriões / larvas foi menor do que a observada quando os mesmos mRNAs foram medidos em diferentes tipos de tecido de peixes adultos ou durante o curso de desenvolvimento (compare a Tabela 3 com a Tabela 2 e a Figura 1 ) Vale ressaltar aqui que todos os valores de Ct tiveram baixo SEMs, significando baixa variação biológica e técnica amostra a amostra dentro de uma determinada condição experimental.

Estabilidade de expressão de genes de manutenção

Os níveis de expressão relativa dos oito genes de manutenção foram calculados para a série de desenvolvimento, série de tratamento e painel de tecido (machos e fêmeas combinados). O software geNorm foi então usado para calcular os valores de estabilidade de expressão (M) para cada gene onde um valor M inferior corresponde a uma expressão gênica mais estável. 18s, elfa, e b2m foram encontrados para ter a expressão gênica mais estável durante o desenvolvimento (Figura 2A). Após tratamento hormonal / tóxico elfa, bactin1, e tuba1 foram os genes expressos de forma mais estável (Figura 2B). Tal como acontece com o desenvolvimento, 18s, b2m, e elfa também mostrou a expressão mais estável em todos os tipos de tecido (Figura 2C). Apesar das diferenças sexuais significativas nos níveis expressos de certos genes e tipos de tecido, a ordem de estabilidade do gene pela análise geNorm variou pouco quando machos e fêmeas foram plotados separadamente (dados não mostrados).

Estabilidade de expressão de genes de manutenção. Os resultados das análises QPCR de diferentes (A) estágios de desenvolvimento (Figura 1) (B) condições de tratamento (Tabela 3) e (C) tipos de tecido (Tabela 2, dados masculino-feminino combinados) foram usados ​​para calcular a estabilidade usando geNorm. Para obter detalhes, consulte Métodos e resultados. Os valores M relativos (eixo y) são definidos como uma medida da estabilidade da expressão gênica, com um valor M crescente correlacionado com menos estabilidade. Observe que a faixa de valores M (alto a baixo), indicando o grau de variabilidade entre os genes menos e mais estáveis, diferiu para cada uma das três condições: desenvolvimento (3,4 vezes), tratamento (3 vezes) e distribuição nos tecidos (4,5 vezes).

Efeito do uso de diferentes genes de manutenção para normalizar genes de interesse

Para testar a precisão dos resultados de QPCR após a normalização com diferentes genes de manutenção, citocromo P450 19a1b (cyp19a1b) foi selecionado porque é um gene responsivo ao estrogênio que exibe uma regulação negativa modesta da expressão constitutiva quando os embriões são tratados com o antagonista ER ICI, conforme medido por RT-PCR padrão / hibridização de transferência Southern [12]. Conforme mostrado na Figura 3, quando os níveis de expressão foram normalizados para genes de manutenção não afetados pelo tratamento ICI (bactin1, tuba1, gapdh, g6pd, elfa, consulte a Tabela 3), cyp19a1b a expressão foi regulada para baixo aproximadamente 2 vezes como esperado. O efeito modesto do tratamento com ICI sobre 18s expressão, no entanto, resultou em uma regulação negativa exagerada de cyp19a1b (

4 vezes) quando 18s foi usado para normalização. Em contraste, o ICI não teve efeito aparente sobre cyp19a1b expressão quando os dados foram normalizados para aqueles genes de manutenção regulados negativamente por ICI (tbp, b2m) A variação nos níveis de expressão devido à normalização não pode ser explicada por variações nos valores de Ct do gene alvo (ver legenda da Figura 3). Para testar ainda mais os efeitos de diferentes genes de manutenção, um segundo gene alvo, citocromo P450 1a (cyp1a), foi escolhido. cyp1a é fortemente regulado positivamente pelo TCDD agindo por meio do AhR, conforme medido por RT-PCR / transferência Southern [14–18]. Quando os níveis de expressão foram normalizados para genes de manutenção não afetados pelo tratamento com TCDD (bactin1, tuba1, gapdh, g6pd, elfa, 18s) cyp1a a expressão foi regulada positivamente de 800 a 1000 vezes como esperado. Em contraste, quando cyp1a Os níveis de mRNA foram normalizados para genes de manutenção regulados negativamente por TCDD (tbp, b2m) a regulação positiva foi muito exagerada (2.400 a 3.300 vezes).

Efeitos da normalização com diferentes genes de referência na expressão de (A) cyp19a1b e B) cyp1a em embriões de peixe-zebra após exposição a ICI 180,172 (10 μM) e TCDD (1 nM), respectivamente. Os resultados são representados como alteração de vezes (média ± SEM) em comparação com os respectivos controles tratados com DMSO. cyp19a1b (valor Ct médio: DMSO = 27,3 ± 0,07 ICI = 28,7 ± 0,02) e cyp1a (valor Ct médio: DMSO = 25,7 ± 0,05 TCDD = 15,7 ± 0,01) foram medidos por QPCR conforme descrito em Métodos. Os grupos de tratamento são aqueles descritos em Métodos e Resultados (Tabela 3 50 embriões / grupo 3 repetições biológicas).


Biologia de lagostins

A indústria da lagosta ou 'lagostim' continua a crescer em certas áreas do mundo. Este artigo analisa o ciclo de vida, as necessidades de tocas, as necessidades nutricionais e de muda de duas espécies específicas - a lagosta vermelha do pântano e a lagosta do rio branco.

Procambarus clarkii (lagosta vermelha do pântano) e P. zonangulus (lagostins do rio branco), as duas espécies de importância comercial encontradas nos tanques de lagostins da Louisiana, têm requisitos ecológicos semelhantes. Como resultado, não é incomum encontrar as duas espécies no mesmo tanque. Ambas as espécies estão associadas a ciclos naturais de inundação e secagem comuns a grande parte da Louisiana, e ambas constroem tocas, nas quais sobrevivem e se reproduzem durante períodos temporários de seca. Existem algumas diferenças entre as duas espécies, mas deve-se ter cuidado ao revisar as informações sobre a lagosta do rio branco porque as referências anteriores podem se referir a esta espécie como P. acutus acutus, ou P. zonangulus.

A lagosta vermelha do pântano produz mais ovos, porém menores, do que a lagosta do rio branco, e é capaz de desovar durante todo o ano no sul. Parece se dar melhor em águas mais ricas em nutrientes do que as do lagostim do rio branco. Lagostas de rio branco são reprodutoras sazonais, geralmente desovando apenas no outono no sul dos Estados Unidos. As taxas de alimentação foram encontradas para ser maior para a lagosta do pântano vermelho em temperaturas acima de 86 F, indicando uma possível vantagem competitiva em temperaturas mais altas. Em contraste, a lagosta do rio branco pode crescer mais rápido em temperaturas mais baixas e normalmente atinge um tamanho máximo ligeiramente maior. Normalmente, a lagosta vermelha do pântano é encontrada em maior abundância em águas com menor teor de oxigênio dissolvido (OD).

Em geral, ambas as espécies estão adaptadas às condições encontradas em tanques comerciais de lagostins e ambas respondem bem aos sistemas de produção de baixo consumo usados ​​na Louisiana. A abundância de uma espécie ou de outra pode variar entre e dentro dos tanques de cultura ao longo do tempo, mas a lagosta vermelha do pântano geralmente domina e é a espécie mais desejada no mercado. Lagostas de rio branco são mais freqüentemente encontradas em maior número em lagoas que são usadas para cultivar lagostas ano após ano.

Como essas duas espécies interagem em lagoas de lagostins não é totalmente compreendido, mas uma hipótese é que a lagosta vermelha do pântano tende a dominar em mais lagoas devido ao maior potencial reprodutivo e uma estação reprodutiva mais prolongada. Nenhuma diferença significativa na taxa de crescimento e sobrevivência entre as duas espécies foi observada em condições de cultura típicas.

Alguns pesquisadores sugerem que as datas de inundação posteriores do lago (final de outubro a novembro) podem favorecer a lagosta do rio branco por causa de sua tendência a desovar mais tarde e seus filhotes ligeiramente maiores. Esses fatores forneceriam uma vantagem sobre os filhotes de lagostins do pântano vermelho que eclodiram ao mesmo tempo. Pesquisas recentes sugerem que qualquer espécie que produza com sucesso um grande número de bebês primeiro durante os meses de outono irá predominar no lago para o resto da estação. Muita informação está faltando, no entanto, sobre as interações dessas duas espécies.

Essas duas espécies costumam ser semelhantes na aparência, especialmente em uma idade jovem. Eles podem ser facilmente identificados, no entanto, por pessoas experientes. Apesar dos esforços para excluir a lagosta do rio branco de muitas fazendas, ambas as espécies prosperam sob as práticas de cultura de rotina e frequentemente coexistem em tanques de produção. Não existe evidência de híbridos naturais entre essas duas espécies. Vários livros fornecem uma excelente visão geral da anatomia e biologia dessas e de outras espécies de lagostins.

Ciclos de vida

Com base em sua distribuição na América do Norte, o pântano vermelho e a lagosta do rio branco são classificados como espécies “temperadas”, ou seja, eles toleram as condições frias do inverno. Ambas as espécies, no entanto, possuem uma série de características que geralmente estão associadas a animais que vivem em águas quentes. Essas espécies têm vida curta (2 anos ou menos), têm alta sobrevivência juvenil e podem alternar entre formas reprodutivamente ativas e inativas. Além disso, P. clarkii é capaz de desovar o ano todo no sul dos Estados Unidos, e algumas fêmeas podem se reproduzir mais de uma vez por ano.

Essas lagostas têm ciclos de vida bem adaptados às estratégias de produção da fazenda (Figura 1). Animais maduros acasalam em águas abertas, onde o esperma é armazenado em um receptáculo especial, após o qual a fêmea se retira para uma toca para, eventualmente, desovar. A atividade de escavação pode ocorrer a qualquer momento, mas é mais prevalente no final da primavera / início do verão na Louisiana. Embora a desova possa ocorrer em águas abertas, a toca fornece proteção enquanto os ovos fertilizados ou filhotes são fixados na parte inferior da cauda de sua mãe (Figura 2). As fêmeas que carregam ovos ou filhotes são altamente suscetíveis a predadores, porque não podem usar sua resposta de fuga normal de virar a cauda.

Lagostins de todas as idades e tamanhos, maduros ou imaturos e machos ou fêmeas, cavam ou recuam para tocas para sobreviver a períodos de desidratação. Os tanques de lagostins são normalmente drenados durante os meses de verão para permitir o plantio e o crescimento da vegetação. Antes da drenagem, alguns lagostins maduros tocam perto da linha de água. Conforme o nível da água cai, tocas adicionais de lagostins aparecem mais abaixo no dique e às vezes são encontradas no fundo do tanque. No entanto, as tocas no fundo do tanque geralmente contêm uma alta porcentagem de lagostins não reprodutivos, como machos e juvenis imaturos.

O desenvolvimento ovariano (ovo) em fêmeas maduras depende da temperatura, geralmente começando antes da escavação e atingindo a conclusão dentro da toca. Os ovos em desenvolvimento dentro do ovário tornam-se arredondados, aumentam de tamanho e mudam de uma cor clara para escura à medida que amadurecem. Na maturidade, os grandes ovos pretos são eliminados entre as pernas que andam, são fertilizados externamente e, em seguida, presos aos nadadores na parte inferior da cauda com uma substância adesiva chamada glair. Embora os lagostins possam sobreviver em alta umidade dentro da toca, um pouco de água parada é necessária para uma reprodução bem-sucedida. O número de ovos postos varia com o tamanho e condição da fêmea, mas as fêmeas grandes do pântano vermelho ou da lagosta do rio branco podem ter mais de 500 ovos.

O período de incubação depende da temperatura e geralmente leva cerca de 3 semanas. Lagostins nascidos são presos aos nadadores da fêmea por meio de duas fases de muda, após as quais eles se assemelham a um lagostim adulto e começam a se alimentar. Os filhotes permanecem instintivamente com a fêmea por várias semanas após a segunda muda, embora não estejam mais presos. É fundamental que a fêmea e seus filhotes deixem a toca dentro de um tempo razoável, porque há pouca comida disponível nas tocas. Quando as condições forçam o lagostim a permanecer na toca, pode ocorrer aumento da mortalidade.

Inundações do lago ou chuvas fortes geralmente são necessárias para encorajar as fêmeas de lagostim a emergirem de suas tocas. As fêmeas emergem com seus filhotes (ou às vezes com ovos) presos às caudas (Figura 3), e os filhotes avançados são rapidamente separados de sua mãe conforme ela se move no mar aberto. Como a reprodução é um tanto sincronizada em lagostins criados em tanques, os tanques são rotineiramente inundados no outono para coincidir com o período principal de reprodução. Lagostins de rio branco são reprodutores de outono e inverno, mas a reprodução de peixes lagostins de pântano vermelho pode ocorrer a qualquer momento. O pico de reprodução da lagosta vermelha do pântano, no entanto, geralmente ocorre no outono, com pulsos menores (ou “ondas”) de filhotes entrando na população mais tarde. A reprodução estendida e o crescimento diferencial normalmente resultam em uma população de tamanhos mistos na maioria dos tanques.

Tal como acontece com todos os crustáceos, uma lagosta deve mudar ou perder seu exoesqueleto rígido para aumentar de tamanho. A muda frequente e o crescimento rápido ocorrem em tanques de produção quando as condições são adequadas. A taxa de crescimento é afetada por uma série de variáveis, incluindo temperatura da água, densidade populacional, níveis de oxigênio, qualidade e quantidade dos alimentos e, em menor grau, por influências genéticas. O tamanho da colheita é tipicamente atingido de 3 a 5 meses após a eclosão para os recrutas de outono, mas pode ser alcançado em apenas 7 a 9 semanas em condições ideais.

Quando machos e fêmeas mudam para um estágio reprodutivamente ativo, o crescimento cessa. Indivíduos sexualmente maduros exibem características distintas, incluindo coloração mais escura, garras aumentadas e estruturas sexuais endurecidas. Os machos adultos também desenvolvem ganchos proeminentes na base do terceiro e quarto par de pernas que andam. O aparecimento de lagostins maduros na população geralmente aumenta à medida que as temperaturas aumentam durante o final da primavera. As fêmeas acasalam (muitas vezes várias vezes) após a muda para uma forma madura e, em seguida, começam o processo de construção de tocas na beira da água em diques.

Ecologia de Toca

Vários estudos forneceram mais detalhes sobre tocas de lagostins, mas, em resumo, lagostas cultivadas na Louisiana cavam tocas simples (não ramificadas), quase verticais, geralmente com 40 polegadas ou menos de profundidade. As tocas servem como refúgios de predadores e fornecem ambientes úmidos ou úmidos necessários para que os lagostins sobrevivam durante os períodos de seca. Os lagostins da Louisiana evoluíram ao longo de milhões de anos para se reproduzir dentro da proteção de suas tocas. A maioria das tocas é construída à noite e pode levar vários dias para ser concluída. As tocas para lagostins são geralmente cavadas por um único indivíduo, e o diâmetro da toca é determinado pelo tamanho da lagosta. A toca se estende para baixo em uma câmara ligeiramente maior que o diâmetro do túnel.

Os níveis de água em tocas variam com as condições de umidade do solo. Água livre no fundo da toca é mais frequentemente associada com água “presa” do que o lençol freático real do solo. As paredes da toca e das câmaras terminais são amplamente trabalhadas pela lagosta, possivelmente para garantir boas vedações. A câmara terminal normalmente contém lama úmida quando a água não está presente, que serve como um umidificador. A entrada da toca concluída é eventualmente fechada com um tampão de lama, às vezes tendo uma chaminé ou pilha de solo removida durante a escavação. As entradas das tocas na beira da água são frequentemente associadas à cobertura natural, como vegetação ou detritos lenhosos. Ao longo do verão, o desgaste e a cobertura vegetal podem tornar a entrada da toca indetectável.

As tocas geralmente contêm uma única fêmea ou, às vezes, um macho e uma fêmea juntos, mas ocasionalmente podem conter lagostins adicionais. A sobrevivência e reprodução bem-sucedidas dentro da toca dependem de muitos fatores, como a severidade e duração do período de seca, características da toca (como profundidade, tipo de solo e umidade) e saúde do animal. Lagostins imaturos e lagostins forçados a cavar pela queda rápida dos níveis de água podem construir tocas rasas que não terão umidade suficiente para a sobrevivência durante longos períodos de seca ou seca. Tipos de solo com teor de argila limitado ou solo com teor de argila muito alto que racha quando seco também podem limitar a sobrevivência de lagostins enquanto em tocas.

Depois de selados, os lagostins ficam confinados à toca até que o tampão rígido que veda a entrada seja suficientemente amolecido pela umidade externa de enchentes ou chuvas. O alagamento do tanque, especialmente quando associado a chuvas intensas, facilita e estimula o surgimento de lagostins nas tocas.

Estrutura da População de Lagostins

O aparecimento de novos filhotes em um tanque é conhecido como “recrutamento”, e esses lagostins geralmente constituem a maior parte da colheita anual, mesmo quando um número significativo de lagostins juvenis remanescentes estão presentes após o alagamento. As populações de lagostins geralmente incluem (1) adultos remanescentes da temporada anterior de produção ou lotação, (2) juvenis remanescentes da temporada anterior e (3) os atuais recrutas jovens do ano (YOY).

O número de classes de idade e os números dentro das classes de idade compreendem a densidade geral de lagostins. A densidade de lagostins e a estrutura populacional têm um grande impacto nos rendimentos gerais do tanque e no tamanho dos lagostins na altura da colheita. As densidades mais altas e as estruturas populacionais mais complexas geralmente ocorrem onde a lagosta foi cultivada no mesmo local por várias temporadas consecutivas. Em novos tanques e tanques mantidos fora de produção por um ano ou mais, a densidade de lagostins é freqüentemente menor e o número de classes de idade é menor. Nessas situações, os lagostins são geralmente maiores e mais uniformes em tamanho, entretanto, os rendimentos gerais podem ser consideravelmente mais baixos.

Dinâmica populacional

Ao contrário da maioria dos empreendimentos de aquicultura, onde números e tamanhos conhecidos de juvenis são estocados, a aquicultura de lagostins na Louisiana depende do recrutamento natural (reprodução) de animais maduros (armazenados ou já presentes) para povoar o tanque. A densidade populacional depende muito da sobrevivência da cria, da reprodução bem-sucedida e da sobrevivência da prole. A densidade é influenciada principalmente por condições ambientais sobre as quais os produtores podem ter pouco ou nenhum controle. Além disso, o manejo inadequado após a inundação do outono, incluindo baixos níveis de oxigênio, abundância de predadores ou exposição a pesticidas, pode impactar negativamente as populações de lagostins e a produção subsequente, mesmo quando a sobrevivência e reprodução dos reprodutores são altas.

Por causa dessa falta de influência e controle sobre os níveis populacionais, a densidade e estrutura populacional é provavelmente o aspecto mais evasivo da produção de lagostins. Períodos prolongados de reprodução e a presença de lagostins remanescentes da temporada anterior freqüentemente resultam em vários tamanhos ou grupos de idade de lagostins presentes em um tanque a qualquer momento.Esses vários grupos de tamanho / idade são o que compõe a estrutura da população.

Embora o “recrutamento natural” na criação de lagostins tenha muitas vantagens, uma desvantagem significativa é que os produtores de lagostins têm poucos meios para controlar com precisão ou mesmo determinar a densidade populacional e a produção subsequente. Os métodos de amostragem disponíveis são brutos e atualmente incluem varreduras com rede de mergulho e uso de armadilhas de “teste”. Esses métodos são altamente variáveis ​​e sujeitos a muitas fontes de parcialidade ou erro. Os produtores geralmente não têm uma boa avaliação de suas populações até que a colheita esteja bem encaminhada no final da primavera, depois que as temperaturas do tanque aumentaram substancialmente.

Muda

Tal como acontece com todos os crustáceos, uma lagosta deve mudar ou lançar sua casca externa dura (“exoesqueleto”) para aumentar de tamanho (Figura 4), portanto, o processo de crescimento envolve a muda periódica intercalada com períodos intermediários. Aproximadamente 11 mudas são necessárias para que os lagostins atinjam a maturidade. Um ciclo de muda é reconhecido como tendo cinco estágios principais, mas deve ser entendido que o processo é realmente contínuo. A fase intermediária é o período em que o exoesqueleto é totalmente formado e endurecido. Durante esta fase, os lagostins se alimentam ativamente e aumentam suas reservas de tecido e energia. A preparação para a muda ocorre na fase de pré-muda. Isso inclui a formação de um novo exoesqueleto subjacente (macio), enquanto ocorre uma reabsorção do cálcio da casca antiga. Durante o período anterior à muda, os lagostins param de se alimentar e procuram abrigo ou cobertura.

A muda geralmente é realizada em minutos. O frágil exoesqueleto se divide entre a carapaça (cabeça) e o abdômen (cauda) na parte de trás, e a lagosta geralmente se retrai virando a cauda. Durante a fase “mole” que se segue, o exoesqueleto mole se expande para suas novas dimensões maiores. O endurecimento (calcificação) do novo exoesqueleto ocorre durante o período pós-muda, que pode ser dividido em duas fases. O endurecimento inicial ocorre quando os estoques de cálcio dentro do corpo são transportados para o novo exoesqueleto. O cálcio é armazenado no corpo tanto nos tecidos moles quanto por um curto período em duas “pedras estomacais” duras ou gastrólitos (Figura 5) localizadas na cabeça, de cada lado do estômago. Essas pedras desaparecem durante o período de endurecimento inicial após a muda. A segunda fase de endurecimento é por absorção de cálcio da água. À medida que a lagosta retoma a alimentação, ocorre um maior endurecimento da nova casca.

A muda é controlada hormonalmente, ocorrendo com mais frequência em animais mais jovens e em crescimento ativo do que em animais mais velhos. O aumento no tamanho do lagostim durante a muda e o tempo entre as mudas podem variar muito e são afetados por fatores como temperatura da água, qualidade da água, qualidade e quantidade dos alimentos, densidade populacional, níveis de oxigênio e, em menor grau, por influências genéticas . Em condições ideais, a lagosta pode aumentar até 15 por cento em comprimento e 40 por cento em peso em uma muda única.

Em tanques de cultura, a muda frequente e o crescimento rápido ocorrem durante a primavera devido ao aquecimento das águas e às fontes de alimento adequadas. O aparecimento de lagostins adultos aumenta à medida que a estação avança. Aumentos rápidos na temperatura (acima de 80 F) podem estimular o início da maturidade em tamanhos menores, especialmente sob condições de superlotação e escassez de alimentos. “Baixa estatura”, a condição pela qual os lagostins amadurecem em um tamanho indesejavelmente pequeno, é um problema em muitos tanques.

Nutrição

Os lagostins foram classificados como herbívoros (comedores de vegetação), detritívoros (consumidores de matéria orgânica em decomposição), onívoros (consumidores de matéria vegetal e animal) e, mais recentemente, carnívoros obrigatórios, o que significa que "requerem" alguma matéria animal no dieta para um crescimento e saúde ideais.

Os lagostins ingerem matéria vegetal viva e em decomposição, sementes, algas, organismos epifíticos, microorganismos e uma variedade de invertebrados maiores, como insetos e caracóis. Eles também se alimentam de peixes pequenos, quando possível. Essas fontes alimentares variam consideravelmente na quantidade e qualidade em que são encontradas no habitat aquático. Acredita-se que as plantas vivas, freqüentemente o recurso alimentar mais abundante em tanques de lagostins e habitats naturais, contribuem pouco para a nutrição direta de lagostins. As sementes amiláceas às vezes são consumidas e podem fornecer a energia necessária, mas a matéria fibrosa da planta intacta é consumida principalmente quando há escassez de outras fontes alimentares. Além de fornecer alguns nutrientes essenciais, a matéria viva das plantas fornece energia e nutrição limitadas para a lagosta em crescimento.

O material vegetal em decomposição, com seus microrganismos associados (coletivamente chamados de detritos), é consumido em um grau muito maior e tem um valor alimentar superior. A capacidade da lagosta de usar detritos como alimento básico, no entanto, parece ser muito limitada. Felizmente, em um ambiente típico de lagoa de lagostins, vários animais além da lagosta contam com os detritos ricos em micróbios como sua principal fonte de alimento. Moluscos, insetos, vermes, pequenos crustáceos e alguns pequenos vertebrados dependem dos detritos (Figura 6) e, quando consumidos por lagostins, esses animais fornecem nutrição de alta qualidade. Os cientistas perceberam que, para que os lagostins cresçam em sua taxa máxima, eles devem se alimentar em maior extensão dessas fontes de alimentos ricos em proteínas e energéticos.

Evidências suficientes foram estabelecidas para indicar que, embora os lagostins devam consumir fontes de alta proteína e alta energia para atingir o crescimento ideal, eles podem se sustentar por algum tempo comendo fontes vegetais intactas e em decomposição e até mesmo sedimentos de fundo contendo detritos orgânicos.

Alimentos suplementares não são rotineiramente fornecidos para tanques de aquicultura de lagostins. A cultura comercial de lagostins depende de um sistema autossustentável para fornecer nutrição aos lagostins, como ocorre em habitats naturais onde os lagostins são abundantes. Uma cultura de forragem vegetativa estabelecida (ou pelo menos encorajada) fornece a base de uma teia alimentar complexa (Figura 7) que, em última análise, alimenta a produção de lagostins com colheitas que normalmente variam em média de 400-600 libras por acre e muitas vezes podem exceder 1.000 libras por acre.

Fragmentos de plantas da vegetação em decomposição fornecem o “combustível” que impulsiona um sistema de produção baseado em detritos, com lagostins no topo da teia alimentar. Como resultado, o principal meio de fornecer nutrição à lagosta na aquicultura é através do estabelecimento e manejo de uma cultura de forragem. Idealmente, uma vez que os lagos sejam inundados no outono, um suprimento constante e contínuo de fragmentos de plantas alimenta a teia alimentar da qual os lagostins obtêm sua nutrição.


Assista o vídeo: #Reproduçao do peixe coliza (Agosto 2022).