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O mRNA pode ser usado pelos ribossomos mais de uma vez?

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O mRNA pode ser usado pelos ribossomos mais de uma vez? Quer dizer, o mRNA pode ser traduzido mais de uma vez? Se não, o que acontecerá com ele após a tradução?


Existem alguns casos de tradução em que posso pensar em que um mRNA é traduzido mais de uma vez: o circuito fechado modelo de tradução de mRNA, reinício de tradução e tradução por polissomos.

Modelo de malha fechada

Aqui está um artigo interessante para você começar: ncbi

Essencialmente, a teoria é que o mRNA pode formar um circuito fechado com a extremidade 3 'mantida na extremidade 5' por vários fatores. O ribossomo se monta próximo ao início, percorre o mRNA, traduzindo a sequência polipeptídica e, a seguir, se dissocia no códon STOP. Uma vez que o "fim" do mRNA está próximo ao "início" do mRNA, o ribossomo pode se recompor logo após a dissociação.

Reiniciação da tradução

Veja isso.

O ribossomo se dissocia de forma incompleta no códon STOP, a pequena subunidade continua se movendo no mRNA, então a subunidade grande se reconecta em um local de início a jusante. Isso acontece quando o mRNA tem vários ORFs.

Polissomos

(Veja o artigo da Wikipedia sobre Polissomos para mais detalhes)

Isso basicamente significa que você tem um trem de ribossomo se movendo ao longo de um mRNA. A mesma proteína está sendo traduzida várias vezes, mas por ribossomos diferentes. Uma coisa muito legal sobre isso é que ele realmente foi observado por microscopia eletrônica!
(fonte: bioninja.com.au)

Para responder a 2ª parte da sua pergunta ... wikipedia

O mRNA é degradado em um processo chamado interferência de RNA (RNAi). Também são transcritos pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que são incorporados a um complexo de ribonucleoproteína (RISC) que tem uma atividade de clivagem de mRNA. Os siRNAs são complementares a segmentos de mRNAs para dar especificidade ao RISC.


Quer saber mais sobre mRNA antes de seu COVID Jab?

por Kristina Fiore, diretora de relatórios empresariais e investigativos, MedPage Today, 3 de dezembro de 2020

Os médicos começarão a arregaçar as mangas em apenas algumas semanas para receber suas primeiras doses de vacinas COVID-19, ambas as quais usam tecnologia de mRNA para induzir uma resposta imunológica.

Para quem deseja obter mais informações sobre a história e a ciência das vacinas de mRNA e da terapêutica antes de receber a injeção, aqui está uma cartilha.

Como funciona

Biologicamente, o RNA mensageiro é transcrito do DNA e viaja para o citoplasma de uma célula, onde é traduzido pelos ribossomos em proteínas.

Para as vacinas Pfizer / BioNTech e Moderna, o mRNA sintetizado é envolto em uma nanopartícula lipídica para escapar do sistema imunológico quando injetado. Uma vez dentro da célula, os ribossomos começarão a trabalhar bombeando a proteína spike do SARS-CoV-2.

O sistema imunológico então monta uma resposta a essa proteína, conferindo imunidade ao vírus sem nunca ter sido infectado por ele.

Essencialmente, em vez de produtos farmacêuticos produzirem as proteínas por meio de um processo caro e difícil, o mRNA convoca o corpo para fazer o trabalho. A capacidade de produzir mRNA tão rapidamente é uma das razões pelas quais essas vacinas estão na frente na corrida global por uma vacina COVID-19.

Nunca foi feito antes?

Isso não é totalmente verdade. Embora uma vacina de mRNA nunca tenha estado no mercado em qualquer lugar do mundo, as vacinas de mRNA foram testadas em humanos antes, para pelo menos quatro doenças infecciosas: raiva, gripe, citomegalovírus e Zika.

Em 2017, a biotecnologia alemã CureVac publicou resultados em The Lancet para um ensaio de fase I de sua vacina anti-rábica de mRNA e, em janeiro deste ano, a empresa divulgou os resultados via comunicado à imprensa de um ensaio de fase I de sua vacina de mRNA anti-rábica de baixa dosagem.

No ano passado, pesquisadores da Moderna e da Alemanha publicaram os resultados da fase I de duas vacinas de mRNA contra a gripe. Em janeiro, a Moderna anunciou os resultados de seu estudo de fase I de uma vacina de mRNA contra o citomegalovírus e, apenas em abril passado, enquanto a pandemia se intensificava, a empresa relatou dados provisórios de sua vacina de mRNA contra o Zika.

Em um jornal em Nature Reviews Drug Discovery, Drew Weissman, MD, PhD, da Universidade da Pensilvânia na Filadélfia e um dos pioneiros da tecnologia de mRNA, e colegas escreveram que os primeiros resultados das vacinas de mRNA contra raiva e gripe "foram um tanto modestos, levando a expectativas mais cautelosas sobre a tradução de sucesso pré-clínico para a clínica. "

A equipe observou que em ambos os ensaios, a imunogenicidade foi "mais modesta em humanos do que o esperado com base em modelos animais, um fenômeno também observado com vacinas baseadas em DNA, e os efeitos colaterais não foram triviais."

Algumas indicações de imunogenicidade também podem ser obtidas nos ensaios da vacina COVID. Os resultados finais da Topline com Pfizer / BioNTech mostraram 95% de eficácia na prevenção de infecções sintomáticas em 2 meses após a segunda dose. A vacina da Moderna mostrou uma taxa de eficácia de 94,1% nos resultados finais da fase III. Ambos os produtos pareceram muito eficazes na prevenção de doenças graves, bem como casos mais moderados.

A durabilidade desses efeitos permanece uma questão em aberto. No entanto, os dados de acompanhamento de um estudo de fase I do produto Moderna, abrangendo 4 meses após a primeira dose, mostraram uma resposta persistente de anticorpos neutralizantes, embora com declínios modestos durante esse período, particularmente em participantes mais velhos.

O que sabemos sobre segurança?

Embora as vacinas contra a gripe e a raiva pareçam ser "seguras e razoavelmente bem toleradas", escreveram Weissman e colegas, os ensaios mostraram "reações moderadas e em casos raros graves no local da injeção ou reações sistêmicas".

Suas principais preocupações com a segurança, que eles disseram que deveriam ser observadas de perto em testes futuros, eram sobre a inflamação local e sistêmica, bem como manter o controle sobre o "imunógeno expresso" e sobre quaisquer anticorpos auto-reativos.

"Uma possível preocupação pode ser que algumas plataformas de vacinas baseadas em mRNA induzem respostas potentes do interferon tipo I, que têm sido associadas não apenas à inflamação, mas também potencialmente à autoimunidade", escreveram eles. "Assim, a identificação de indivíduos com risco aumentado de reações autoimunes antes da vacinação com mRNA pode permitir que precauções razoáveis ​​sejam tomadas."

Os autores também observaram que o RNA extracelular pode contribuir para o edema e citaram um estudo que mostrou que ele "promoveu a coagulação do sangue e a formação de trombos patológicos".

"A segurança, portanto, precisará de avaliação contínua, já que diferentes modalidades de mRNA e sistemas de entrega são utilizados pela primeira vez em humanos e são testados em populações maiores de pacientes", escreveram eles no artigo publicado em 2018.

Efeitos sistêmicos foram definitivamente vistos com as duas vacinas de mRNA COVID, com notícias citando os participantes como reclamando de sintomas como "gripe forte". Enquanto a Pfizer / BioNTech não relatou nenhuma preocupação séria de segurança com sua vacina COVID-19, os pacientes experimentaram fadiga de grau 3 e dor de cabeça em taxas de 3,8% e 2%, respectivamente.

A Moderna não divulgou números de eventos adversos ao anunciar os resultados finais da primeira linha, mas disse que não havia "novas preocupações sérias de segurança". Os dados provisórios do estudo de fase III da empresa, analisados ​​quando 95 infecções foram registradas, incluíram taxas de eventos adversos: fadiga (9,7%), mialgia (8,9%), artralgia (5,2%), cefaléia (4,5%), dor (4,1 %) e eritema / vermelhidão no local da injeção (2,0%).

Por que as vacinas anteriores pararam?

"Um fator importante é que não há um senso de urgência", disse Dennis Burton, PhD, da Scripps Translational Research Clinic em La Jolla, Califórnia, MedPage hoje.

O zika está relativamente contido. As vacinas contra a raiva já são suficientemente eficazes e a gripe continua sendo um alvo difícil, disse Burton.

Embora a tolerabilidade possa ter sido um problema, a segurança não era, disse ele. "Não há risco de incorporação nos cromossomos do hospedeiro, e os níveis de mRNA e proteína diminuirão e desaparecerão."

“Sabemos amplamente que a abordagem geral é bastante segura”, disse Burton, mas observou que é importante que os eventos adversos sejam monitorados e acompanhados.

Ele advertiu que apenas com base no grande número de pessoas que serão vacinadas para COVID-19, eventos ocorrerão, e provavelmente não terão relação com a vacina. Se as pessoas sentirem que as preocupações com esses eventos são tratadas de forma adequada, elas devem estar menos propensas a ter reservas sobre tomar a vacina e mais inclinadas a ajudar a atingir os níveis de imunidade de rebanho necessários para acabar com a pandemia.

“Uma das coisas que mais nos preocupam é que as pessoas não sejam vacinadas”, disse ele. "Mas os riscos desta doença serão muito maiores do que os riscos associados à vacinação."

O que mais eu preciso saber?

A introdução de mRNA sintético nas células também é uma promessa como um tipo de terapia de substituição para doenças nas quais a produção de proteínas vitais é inadequada ou defeituosa. Ele poderia, portanto, ter vantagens sobre as terapias genéticas e a substituição de proteínas: menos arriscado do que o primeiro, dosagem menos frequente do que o último e mais barato do que qualquer um.

O trabalho pré-clínico com o mRNA terapêutico remonta pelo menos a 1990, com a produção de proteínas observada em camundongos. Dois anos depois, um estudo mostrou que o mRNA injetado no hipotálamo de ratos com uma mutação genética permitiu a produção de vasopressina e reverteu seu diabetes.

Mas esses resultados iniciais não atraiu interesse substancial na terapêutica do mRNA devido a preocupações sobre a instabilidade do mRNA, alta imunogenicidade inata e entrega ineficiente, escreveram Weissman e colegas. "Em vez disso, o campo buscou abordagens terapêuticas baseadas em DNA e proteínas."

Finalmente, em 2005, Weissman e Katalin Kariko, que agora é vice-presidente sênior da BioNTech, modificaram o mRNA para que pudesse escapar da detecção imunológica e aumentar a produção de proteínas, de acordo com um artigo na ESTADO. Este é considerado um dos momentos inovadores na terapêutica de mRNA, disseram os especialistas ESTADO.

Desde então, a tecnologia tem sido usada não apenas em vacinas para doenças infecciosas, mas também como meio de acelerar o sistema imunológico para combater o câncer. O mRNA pode ter como alvo antígenos associados a tumores expressos principalmente por células cancerosas, como certos fatores de crescimento. Essas vacinas terapêuticas - em vez de profiláticas - foram testadas em uma variedade de cânceres, incluindo leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, glioblastoma, melanoma, câncer de próstata e outros.

Existem menos ensaios de terapêutica regular, mas um que atraiu alguma atenção é uma terapia de mRNA para insuficiência cardíaca que está sendo desenvolvida pela Moderna e AstraZeneca que codifica para o fator de crescimento endotelial vascular A. Estudos pré-clínicos mostraram a criação de novos vasos sanguíneos e função cardíaca melhorada, e um estudo de fase I em pacientes diabéticos publicado em Nature Communications em 2019 mostrou aumento do fluxo sanguíneo, o que poderia indicar "potencial terapêutico para angiogênese regenerativa."

Se o aparente sucesso das vacinas da Pfizer e da Moderna vai desencadear uma onda de desenvolvimento terapêutico de mRNA ainda está para ser visto, mas Burton alertou que a proteína de pico do coronavírus "parece ser um alvo particularmente fácil".

"O RNA funcionará para todas as vacinas? Não acho que possamos dizer isso ainda", disse Burton. "É um grande salto em frente. É muito rápido de fazer e tem muitas vantagens. Mas acho que o SARS-CoV-2 é um teste fácil em relação a alguns dos outros vírus com os quais temos que lidar."


Fundo

A tradução do mRNA é um processo onipresente visto em quase todos os sistemas biológicos. Nesse processo, os códons genéticos são traduzidos de mRNA para proteína por translocação de ribossomo, após a informação genética contida no DNA ser transcrita para o mRNA. O processo de tradução do mRNA envolve três atores principais: o mRNA (molde genético), o ribossomo (mecanismo de montagem) e os RNAs de transferência de aminoacil (aa-tRNAs), e é conceitualmente dividido em três estágios: iniciação, alongamento e término. Especificamente, o ribossomo primeiro se liga ao mRNA (iniciação), lê o mRNA códon por códon (da extremidade 5 'do mRNA à extremidade 3'), recruta o aa-tRNA apropriado e liga o último aminoácido ao nascente cadeia peptídica, libera o tRNA descarregado (alongamento) e, finalmente, libera a proteína completa do mRNA quando o ribossomo atinge o final do mRNA (terminação) [1]. A tradução do mRNA segue amplamente esse mesmo padrão em bactérias e eucariotos, com algumas diferenças nos mecanismos regulatórios.

Extensos estudos sobre os mecanismos de tradução do mRNA foram relatados e se baseiam em várias abordagens e ferramentas, como biologia celular experimental, bioinformática, biologia teórica e computacional e, recentemente, sistemas e biologia sintética [2–9]. No entanto, embora os mecanismos fundamentais subjacentes à tradução do mRNA sejam relativamente claros, uma série de mecanismos regulatórios detalhados só agora estão sendo descobertos, e a compreensão total dos quais exigirá uma interação entre experimentos e modelagem. Portanto, para elucidar o mecanismo e as funções da tradução do mRNA, é necessário um entendimento completo em nível de sistema, o que, consequentemente, requer modelos quantitativos bem definidos. Além disso, o entendimento obtido a partir desses modelos quantitativos fornece uma base importante para as investigações da biologia sintética [10-15].

A modelagem matemática da tradução do mRNA tem uma longa história e goza de um interesse renovado nos últimos anos com o desenvolvimento de sistemas e biologia sintética [16–28]. Os modelos para tradução de mRNA são introduzidos com diferentes formulações em vários níveis de abstração e podem ser divididos em, grosso modo, as equações diferenciais ordinárias (ODEs) baseadas e os modelos do tipo Processo de exclusão simples totalmente assimétrica (TASEP) [29-31] .

A tradução do mRNA é o resultado de uma série de transições (que podem ser conceituadas como reações), que podem ser tipicamente modeladas como um conjunto de EDOs [32-39]. Essa abordagem baseada em ODE se beneficia das extensas ferramentas de modelagem e análise disponíveis para ODEs. O modelo baseado em ODE geralmente trata cada etapa de alongamento como uma ODE (possivelmente vários ODEs, uma vez que cada etapa de alongamento é o resultado da interação de vários jogadores, incluindo o mRNA, o aa-tRNA e vários fatores de alongamento [40]), e então o O processo de tradução de proteínas é descrito de uma forma abrangente [33, 35]. No entanto, o modelo baseado em ODE não reflete algumas das características únicas da tradução do mRNA, ou seja, vários ribossomos em um mRNA não podem ocupar simultaneamente um códon. Como resultado, apesar de sua utilidade, os modelos baseados em ODE não são necessariamente a escolha padrão para modelar a tradução de mRNA, embora sejam as abordagens dominantes na modelagem de outros bioprocessos, como transcrição de genes, transdução de sinal [41-43]. No entanto, uma vez que a tradução do mRNA envolve principalmente o movimento do ribossomo ao longo do mRNA, ela pode, em muitos casos, ser estudada sem considerar as reações / subprocessos bioquímicos detalhados. Este problema de transporte simplificado pode, portanto, ser modelado com TASEP, um modelo tipicamente usado em física de não equilíbrio [17, 23, 44-48], para entender quantitativamente o transporte de partículas em uma rede unidimensional. Embora simplificados, os modelos baseados em TASEP têm sido usados ​​para obter informações de estado estacionário como a ocupação média de cada códon no mRNA, a taxa de tradução do mRNA, que são fundamentais para a compreensão da tradução do mRNA. Finalmente, embora não seja frequentemente visto, existem outras metodologias para modelar a tradução de mRNA, por exemplo, um modelo simplificado e determinístico baseado em rede de Petri que considera os eventos de iniciação, alongamento e término na tradução de mRNA como transições em uma rede de Petri cronometrada [49], e um versão simplificada do TASEP denominado "modelo de fluxo de ribossomo", onde os códons no mRNA são granulados em segmentos maiores [50, 51].

No que diz respeito a todo o processo de tradução de mRNA, a modelagem baseada em códons, ou seja, modelos que incluem a dinâmica do ribossomo em cada códon no mRNA, é necessária e desejável. Todos esses modelos, o baseado em ODE, o baseado em TASEP e o baseado em rede de Petri, podem ser usados ​​desta forma, mas com diferentes vantagens e desvantagens. Portanto, é necessário examinar todas essas metodologias de modelagem, com o objetivo de encontrar a metodologia de modelagem apropriada para responder a questões específicas relativas à tradução e regulamentação da tradução. Neste trabalho, examinamos e comparamos modelos estocásticos baseados em códons, modelos ODE e modelos de rede de Petri. Tentamos definir rigorosamente os modelos baseados em códons e os algoritmos de simulação relacionados, esclarecer diferentes regras de atualização implicitamente assumidas nesses modelos. Também propomos um novo modelo baseado em rede booleana probabilística (PBN) e comparamos todas essas metodologias. Finalmente, examinamos como esses modelos podem ser usados ​​para situações que envolvem complexidades adicionais e como várias metodologias podem nos ajudar a entender melhor o processo de tradução do mRNA. Tomada em conjunto, esta análise fornece uma plataforma de modelagem sistemática, para uso na compreensão do processo de tradução, em vários contextos.


Abordagem bioinspirada para entrega de RNA

Ao entregar fitas de material genético conhecido como RNA mensageiro (mRNA) nas células, os pesquisadores podem induzir as células a produzir qualquer proteína codificada pelo mRNA. Esta técnica possui grande potencial para administrar vacinas ou tratar doenças como o câncer, mas alcançar uma entrega eficiente de mRNA tem se mostrado um desafio.

Agora, uma equipe de engenheiros químicos do MIT, inspirada pela maneira como as células traduzem seu próprio mRNA em proteínas, projetou um sistema de entrega sintética que é quatro vezes mais eficaz do que entregar mRNA por conta própria.

"Se quisermos ser capazes de entregar mRNA, precisamos de um mecanismo para ser mais eficaz nisso, porque tudo o que foi usado até agora oferece uma fração muito pequena do que seria a eficiência ideal", diz Paula Hammond, uma David H. Koch Professor de Engenharia, chefe do Departamento de Engenharia Química do MIT e membro do Koch Institute for Integrative Cancer Research.

Hammond é o autor sênior do artigo, que aparece em Angewandte Chemie. Os principais autores do artigo são o pós-doutorando Jiahe Li e o estudante de graduação Yanpu He. Outros co-autores do artigo são Wade Wang, Connie Wu e Celestine Hong do laboratório Hammond.

Máquinas de proteína

O RNA mensageiro carrega instruções genéticas do DNA, que não pode deixar o núcleo da célula, para os ribossomos da célula, que montam proteínas com base na sequência de mRNA. O RNA mensageiro é atraente como um veículo potencial para tratar doenças ou entregar vacinas porque, depois que uma fita de mRNA é traduzida na proteína desejada, ela eventualmente se degrada.

"Isso não muda o código genético", diz Hammond. "Não há chance de que ocorra a incorporação de um gene, então o fator de segurança é muito maior."

Para que essa abordagem funcione, o mRNA precisa entrar nas células de maneira eficiente e, uma vez lá, precisa chegar aos ribossomos para ser traduzido em proteína. Em um estudo anterior, os pesquisadores do MIT descobriram que poderiam melhorar a taxa de tradução do mRNA anexando uma tampa de proteína a uma das extremidades da fita de mRNA. Esta tampa ajuda o mRNA a formar um complexo que é necessário para iniciar a tradução.

No novo estudo, os pesquisadores se concentraram na outra extremidade da molécula de mRNA. O mRNA de ocorrência natural geralmente tem uma longa "cauda poli-A", composta por uma longa sequência de repetições de adenosina, que estabiliza a molécula e a ajuda a resistir à degradação por enzimas na célula.

A equipe do MIT decidiu anexar uma proteína chamada proteína de ligação poli-A a essa cauda. Essa proteína, que é encontrada naturalmente nas células, ajuda o mRNA a se ligar aos ribossomos e iniciar o processo de tradução.

Os pesquisadores então revestiram esse complexo com um tipo de polímero conhecido como polipeptídeo, que é uma sequência de aminoácidos modificados unidos em uma cadeia. Este polipeptídeo serve como um andaime para manter a proteína de ligação poli-A e mRNA em contato próximo, e ajuda a neutralizar o mRNA carregado negativamente. Sem essa neutralização, o mRNA não seria capaz de passar pelas membranas celulares, que também têm carga negativa.

Uma vez que o mRNA revestido com polímero entra na célula, a proteína de ligação poli-A protege-o de ser quebrado e ajuda a se ligar aos ribossomos. O mRNA forma uma alça fechada de forma que um ribossomo pode circular por ela muitas vezes, produzindo muitas cópias da proteína alvo. Desta forma, o efeito do mRNA, que é um terapêutico genético muito caro, pode ser significativamente aumentado pela combinação com polipeptídeos e proteínas sintéticos muito mais baratos.

"A abordagem convencional é apenas entregar mRNA nas células", disse Li. "Mas uma vez que o mRNA chega às células, ele pode ser degradado, então formamos um complexo que é crucial para o início da tradução do mRNA."

Maior expressão de proteína

Os pesquisadores testaram esse sistema entregando mRNA que codifica o gene da luciferase, uma proteína brilhante, aos pulmões de camundongos. Eles descobriram que, com esse tipo de entrega, as células produziam quatro vezes mais proteína do que quando apenas o mRNA era empacotado com o mesmo polipeptídeo para entrega.

Uma razão pela qual esse sistema é mais eficiente, acreditam os pesquisadores, é que ele elimina a necessidade de mRNA para encontrar proteínas de ligação poli-A no ambiente de citoplasma lotado depois que o mRNA entra na célula.

"Percebemos que as células provavelmente só produzem o suficiente dessa proteína de ligação poli-A para traduzir seu próprio mRNA", diz ele. "Depois de entregar o mRNA em excesso, a célula não tem o suficiente dessa proteína auxiliar para traduzi-la. Percebemos que precisamos dar a ela mais proteína auxiliar, pré-montá-la com nossos polipeptídeos para imitar a estrutura da síntese protéica, então co -transmitir esta montagem bioinspirada na célula. "

Neste estudo, as partículas de mRNA se acumularam nos pulmões por causa da carga positiva do polipeptídeo, o que permitiu que as partículas se ligassem aos glóbulos vermelhos e pegassem uma carona até os pulmões. No entanto, os pesquisadores agora planejam explorar a modificação das partículas com polímeros que as direcionarão para outros locais do corpo, incluindo tumores.

Eles também estão trabalhando para melhorar ainda mais a estabilidade das moléculas de polipeptídeo, adicionando uma cauda hidrofóbica a uma extremidade e anexando um polímero chamado PEG. Ambas as modificações devem ajudar as moléculas a circular por mais tempo no corpo, permitindo que alcancem seus destinos pretendidos.


Mensagem em uma garrafa

Embora dezenas de ensaios estejam testando o RNA mensageiro para armar o sistema imunológico contra vírus ou câncer, apenas algumas empresas lançaram pequenos ensaios clínicos de outras terapias - como o mRNA para substituir proteínas ausentes ou defeituosas. Aqui estão alguns.

DoençaProteína codificada por mRNAVia de administraçãoEmpresa patrocinadora
Fibrose císticaCFTR, que mantém o equilíbrio de fluidos através das membranasInaladoTraduzir biografia
Insuficiência cardíacaVEGF-A, que estimula o crescimento dos vasos sanguíneosInjeção epicárdicaAstraZeneca
Deficiência de ornitina transcarbamilaseOTC, que ajuda a remover o nitrogênio do corpoIntravenosoArcturus Therapeutics
Acidemia propiônicaPropionil-CoA carboxilase, necessária para o metabolismo normalIntravenosoModerna
Amiloidose transtirretinaCas9, que corta o DNA para remover um gene defeituosoIntravenosoIntellia Therapeutics

Mas muitos outros medicamentos de mRNA precisam chegar a um local específico do corpo por meio da corrente sanguínea. Na deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), por exemplo, uma enzima ausente causa um acúmulo de amônia no sangue que pode levar a convulsões, coma e morte. Para evitar esse acúmulo, uma droga de mRNA deve atingir as células do fígado.

A Arcturus Therapeutics, empresa de medicamentos de mRNA, que visa tratar a deficiência de OTC, maximizou a quantidade de seu medicamento que acaba no fígado, em parte ajustando o tamanho e a carga elétrica de sua nanopartícula lipídica, diz o chefe da empresa Joseph Payne. O Arcturus concluiu um estudo inicial de segurança em aproximadamente 30 voluntários saudáveis ​​e, neste mês, administrou o primeiro de 12 participantes planejados com deficiência.

A empresa optou por se concentrar na deficiência de OTC em parte porque o fígado naturalmente retém e acumula partículas da corrente sanguínea - incluindo as nanopartículas terapêuticas. Outros tecidos são ainda mais difíceis de alcançar com o mRNA, diz James Dahlman, engenheiro biomédico do Instituto de Tecnologia da Geórgia. Muitas equipes estão ajustando a estrutura das nanopartículas lipídicas ou adornando-as com moléculas que as direcionam para um determinado órgão ou tipo de célula.

O laboratório de Dahlman e uma empresa que ele co-fundou, Guide Therapeutics, desenvolveram uma técnica para rastrear as trajetórias de milhares de nanopartículas quimicamente exclusivas em animais, marcando-as com "códigos de barras" de DNA. Mas descobrir a relação entre a estrutura de uma nanopartícula de lipídeo e seu destino "vai levar uma década", diz ele.

Uma segunda grande diferença entre as vacinas e a terapêutica de mRNA é que as vacinas requerem apenas uma ou algumas doses. Uma vez que o sistema imunológico é treinado para atacar a ameaça em questão, a proteína produzida a partir do mRNA se degrada e não precisa ser reposta. Na maioria das vezes, os medicamentos de mRNA que avançaram em testes clínicos até agora são aqueles "em que o efeito do medicamento dura mais do que o da droga", diz Dahlman. Isso também é verdadeiro para terapias que usam mRNA para codificar proteínas, como a enzima Cas9, que pode fatiar o genoma para fazer edições permanentes. A empresa de edição da CRISPR, Intellia Therapeutics, está promovendo uma terapia baseada em mRNA para a doença hereditária transtirretina amiloidose. A empresa administrou seu primeiro participante de um ensaio clínico no mês passado.

Mas quando doses repetidas de mRNA são necessárias para reabastecer uma proteína ao longo da vida, os efeitos colaterais - potencialmente devido ao acúmulo de nanopartículas lipídicas no corpo ou uma resposta inflamatória a RNA estranho - aumentam. As pessoas podem aceitar um ou dois dias de dor e febre depois de receber a vacina COVID-19, diz Ann Barbier, diretora médica da empresa de terapia de mRNA Translate Bio. Mas "se você experimentar isso a cada 3 semanas ou mais pelo resto de sua vida, isso é uma proposta diferente."

Para tornar as doses repetidas mais toleráveis, Translate Bio e outros estão projetando mRNA para parecer o mais natural possível para o corpo e entregando-o em nanopartículas biodegradáveis. A terapia de mRNA da Translate Bio para fibrose cística está agora em testes clínicos. Uma única dose da terapia não revelou efeitos colaterais graves. Alguns pacientes apresentaram febre, dores musculares ou dores de cabeça, que foram de curta duração e controláveis, informou a empresa. Um ensaio em andamento está testando doses múltiplas.

Melhorar a quantidade de proteína que o corpo produz a partir de uma dose de mRNA reduziria a frequência e o tamanho das doses necessárias. Uma abordagem, diz Sahay, é aumentar a capacidade das nanopartículas lipídicas de "escapar" dos sacos membranosos que as células usam para atraí-las. Dessa forma, mais da carga de mRNA das nanopartículas tem a chance de interagir com a maquinaria da célula para fazer proteínas. Sua equipe relatou em fevereiro que, em testes em células, a troca de variantes químicas naturais do colesterol em nanopartículas lipídicas os transformou em melhores artistas de escape.

A corrida por uma vacina de mRNA contra COVID-19 não resolveu os problemas de entrega e dosagem que as terapias de mRNA enfrentarão, mas pode ter suavizado seu caminho de outras maneiras. Por um lado, os produtores de vacinas mostraram que é possível produzir bilhões de nanopartículas e fitas de mRNA em curto prazo. A equipe de Sahay ainda está tentando descobrir as melhores nanopartículas de lipídios para escoltar o mRNA até os confins do corpo. “Mas no dia em que alguém descobrir isso, será transformador”, diz ele, porque as etapas para levar o mRNA à clínica “estão claramente alinhadas agora”.


Esses autores contribuíram igualmente: Matthieu Simeoni, Théo Cavinato, Daniel Rodriguez.

Afiliações

Centro de Genômica Integrativa, Universidade de Lausanne, Lausanne, Suíça

Matthieu Simeoni, Théo Cavinato, Daniel Rodriguez e David Gatfield

Você também pode pesquisar este autor no PubMed Google Scholar

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Contribuições

O primeiro rascunho foi escrito por M.S., T.C. e D.R. (Curso “Write a Review” do programa de mestrado em Ciências da Vida Molecular da Universidade de Lausanne, supervisão: D.G.). D.G. posteriormente adaptou o texto do manuscrito e as figuras. Todos os autores revisaram o manuscrito final.

Autor correspondente


MRNA não muda DNA, período

Para se tornar um médico, são necessários anos de cursos de biologia. Já se passou muito tempo desde que fiz um curso de biologia para calouros, mas juro que aprende-se sobre mRNA e DNA nos primeiros dias. E eu costumava ensinar biologia para calouros, então deixe-me ensinar tudo o que você precisa saber sobre mRNA e DNA - a menos que você queira ser um médico, então é melhor você ter aprendido muito mais do que o que estou dizendo aqui.

Como a maioria de nós já sabe, as vacinas Pfizer e Moderna Therapeutics COVID-19 são vacinas de mRNA que dependem de uma molécula de mRNA, ou RNA mensageiro, para induzir uma resposta imune. No entanto, ele não faz isso diretamente.

Vou usar o gráfico acima para nos guiar pelo processo de como o mRNA funciona nas células. Farei isso em um processo passo a passo para que todos possamos estar na mesma página.

  1. Durante o processo chamado transcrição, a RNA polimerase faz uma cópia de um gene do DNA no cromo - essa cópia é o mRNA. O processo de transcrição começa quando a célula sinaliza que precisa começar a produzir uma proteína de que o corpo necessita, digamos, insulina ou uma das milhares de enzimas ou o que for necessário.
  2. Como no DNA, a informação genética no mRNA está contida na sequência de nucleotídeos, que são organizados em códons que consistem em três ribonucleotídeos cada. Cada códon codifica um aminoácido específico, exceto os códons de parada, que terminam a síntese de proteínas.
  3. As sequências de mRNA são uma & # 8220mirror-image & # 8221 das sequências de DNA que contêm os dados sobre como produzir uma proteína.
  4. ribossomo, uma organela na célula, para tradução, onde tripletos de tRNA, que codificam para um aminoácido, se ligam ao tripleto de mRNA apropriado, adicionando um aminoácido à cadeia da proteína.
  5. Alguns vírus, como o HIV, têm uma enzima chamada & # 8220transcriptase reversa & # 8221 que pode fazer com que o mRNA faça alterações no DNA, mas seu objetivo real é fazer uma cópia de si mesmo. Também existe uma enzima chamada telomerase em humanos para adicionar um código muito específico aos cromossomos, mas ela não usa mRNA flutuando, ela usa RNA que carrega dentro de si. Nenhum deles poderia tirar mRNA de vacinas e mudar nosso DNA.

Aqui está um vídeo (geralmente não penso muito no YouTube para ciências, mas funciona para mim) que mostra como funciona a tradução e a transcrição:

Eu quero ser claro neste ponto - o mRNA não faz nada para a fita de DNA em seus genes - ele meramente espelha a sequência de DNA.

Caso você ainda queira acreditar que o mRNA nessas vacinas pode mudar magicamente o seu DNA, há outras razões pelas quais isso pode acontecer.

  1. O genoma (DNA) de sua célula está contido no núcleo da célula, que é cercado por uma membrana dupla. Essa membrana permite que moléculas grandes, como o mRNA que acabou de ler o DNA, saiam do núcleo, mas impede que moléculas grandes entrem no núcleo.
  2. Even if the mRNA molecule could affect the DNA and even if it could get into the nucleus, there are all kinds of error correction machinery in our DNA to keep out random bits of code. With trillions of cells in each human, each containing billions of DNA base pairs, there are naturally a lot of errors that could kill a human if the quality control machinery of the DNA didn’t keep close watch over errors.
  3. Similarly, this mRNA cannot get into the mitochondria (which have their own DNA) and cause damage to its DNA. Even though the mitochondrion lacks a cell nucleus, it does have its own ribosomes and genes, and they would react to the S-protein mRNA in the same ways as the cell – it would not change its DNA.

Once the mRNA has created a protein, it is then broken down by enzymes in the cell into individual nucleotides, which then move into the nucleus to be reused in a new mRNA strand. The cellular machinery of translating DNA into proteins is constantly recirculating itself.

The Pfizer and Modern mRNA strands only undergo the transcription process to produce spike proteins, that’s it. It can’t get into the cell, and mRNA just does not change the DNA.

The mRNA sequences in the Pfizer and Moderna vaccines enter the cell (in a complex manner that is just more cell biology than I think you’d want to read), and heads to the ribosomes to create the SARS-CoV-2 antigens. These antigens will depart the cell and will trigger the body’s adaptive immune system to produce antibodies effective against the actual target, in this case, the S-protein or spike on the SARS-CoV-2 virus.

One more thing – the antigens produced by these mRNA sequences are biologically inert. They will induce an immune response, but they will not cause any other biological effect including becoming pathogenic.

So, let’s summarize. The mRNA vaccines make use of the cell’s ribosome to create the S-protein of the SARS-CoV-2 virus. That antigen induces an adaptive immune system response that will “remember” that antigen allowing the immune system to quickly attack the virus if it shows up.


What takes message from DNA to the ribosomes?

The type of RNA that contains the information for making a protein is called messenger RNA (mRNA) because it carries the information, or mensagem, de DNA out of the nucleus into the cytoplasm. The mRNA interacts with a specialized complex called a ribossomo, which "reads" the sequence of mRNA bases.

Furthermore, does RNA transfer messages from DNA to ribosomes? Messages no DNA (and the mRNA) are coded such that ribossomos have to use a key to translate them. Ribossomos call upon a particular type of RNA to serve as their tool for decoding mRNA. This special tool is known as tRNA (transferência de RNA, because it's involved in the transferir of amino acids to a newly forming protein).

Similarly, you may ask, what carries the coded message to the ribosome?

A chemical called messenger RNA (mRNA) is made in the nucleus and carrega a copy of the DNA base sequence of a specific gene to the cytoplasm. Ribossomos attach to the mRNA and the instructions it carrega are used to assemble amino acids in the correct order to make a specific protein.

What is translation in DNA?

Tradução is the process that takes the information passed from DNA as messenger RNA and turns it into a series of amino acids bound together with peptide bonds. The ribosome is the site of this action, just as RNA polymerase was the site of mRNA synthesis.


Decaying RNA molecules tell a story

Once messenger RNA (mRNA) has done its job – conveying the information to produce the proteins necessary for a cell to function – it is no longer required and is degraded. Scientists have long thought that the decay started after translation was complete and that decaying RNA molecules provided little biological information.

IMAGE: V.Pelechano/EMBL – see full version below

Now a team from EMBL Heidelberg and Stanford University led by Lars Steinmetz has turned this on its head in an article published in Célula. The researchers have shown that one end of the mRNA begins to decay while the other is still serving as a template for protein production. Thus, studying the decaying mRNA also provides a snapshot of how proteins are produced.

The discovery was made almost by accident. As part of research into how DNA is transcribed into mRNA, co-researchers Vicent Pelechano and Wu Wei developed an na Vivo method to count decaying mRNA molecules in the cell. mRNA has a protective ‘cap’ that prevents it from being degraded – once that cap is removed, the decay begins. The researchers spotted a pattern in the distribution of the ‘cap-less’ RNA that they didn’t expect.

The enzyme that degrades messenger RNA follows the ribosomes and stops every three nucleotides. IMAGE: V.Pelechano/EMBL

Vicent Pelechano, from the Steinmetz group at EMBL Heidelberg, explains: “The decaying RNA was thought to be of little interest biologically, so we were really surprised to see a pattern. We looked more deeply into it because it appeared to be linked to the genetic code, but we never expected it to lead to a completely new understanding of how mRNA and ribosomes interact.”

We never expected it to lead to a completely new understanding of how mRNA and ribosomes interact.

Proteins are produced from mRNA by ribosomes – ‘molecular machines’ that pass successively along the mRNA to translate its nucleotides into amino acids. It was thought that the mRNA only started to decay once the final ribosome had left it and translation was complete. In fact, the researchers were able to determine that the protective ‘cap’ is removed and degradation begins even while ribosomes are still associated with the mRNA.

They demonstrated that the enzyme degrading mRNA follows closely behind the ribosome, pausing at set points along the mRNA, usually after each group of three nucleotides, the section of code that relates to one amino acid. The team believes that this shows the enzyme pausing while translation goes on – allowing the ribosome to do its work and move on – before starting to degrade the mRNA previously protected by the ribosome.

This novel approach also opens up new avenues to study ribosomes. “Researchers studying ribosome activity usually use drugs to stall the ribosomes in place. This can alter the way we perceive their activity. We are simply looking for the molecules remaining from mRNA decay and determining their distribution. We believe this shows a more accurate picture of what is happening to the mRNA and the ribosome than was previously possible,” explains Wu Wei of Stanford University.


Materiais e métodos

Various sources of information

TRNA copy numbers

The tRNA copy numbers of S. cerevisiae were downloaded from [40] other tRNA copy numbers were downloaded from [41].

Coding sequences

The coding sequences of the analyzed organisms were downloaded from the FTP site of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Protein abundance

Protein abundance measurements were downloaded from [42].

Gene Ontology associations

The Gene Ontology (GO) associations of S. cerevisiae genes are from [43].

Expressão genetica

mRNA levels of E. coli were downloaded from [18] mRNA levels of S. cerevisiae were downloaded from [15] mRNA levels of C. elegans come from the Gene Expression Omnibus (GEO) [44] (GDS1786).

Lists of ribosomal proteins

The lists of ribosomal proteins were downloaded from [43].

Measurements of mRNA folding

Measurements of mRNA folding in S. cerevisiae genes are from [28].

Ribosomal densities

We used two data sources of ribosomal density in S. cerevisiae. The first dataset comes from Arava et al. [13] and includes measurements of ribosome number on each mRNA molecule (without information about the per-codon density) they were used to generate Figure 2. To obtain ribosomal densities, we normalized these values by the length of the ORFs.

The second dataset [15] includes measurements of ribosomal density at a single nucleotide resolution. This dataset is noisy at the single gene level (for example, the ribosomal density along a gene may change from a positive number to zero and, again, to a positive number) but when considering large enough sets of genes, it enables a good estimation of the spatial ribosomal density trend.

Data generated in this paper

The data that were generated in this study can be downloaded from [45].

Computing folding

Folding energy was calculated using the Vienna package [46].

Computing the tRNA adaptation index

We computed the tAI similarly to the way it was computed in the work of dos Reis et al. [25]. This measure gauges the availability of tRNAs for each codon along an mRNA. As codon-anti-codon coupling is not unique due to wobble interactions, several anti-codons can recognize the same codon, with different efficiency weights (see dos Reis et al. for all the inter-codon-anti-codon relations).

Deixar n eu be the number of tRNA isoacceptors recognizing codon eu. Deixar tCGNij be the copy number of the j-th tRNA that recognizes the eu-th codon, and let S eu j be the selective constraint on the efficiency of the codon-anti-codon coupling. We define the absolute adaptiveness, C eu, for each codon eu Como:

A partir de C eu we obtain C eu, which is the relative adaptiveness value of codon eu, by normalizing the C eu values (dividing them by the maximum of all 61 C eu valores).

The final tAI of a gene g, is the following geometric mean:

Onde eu kg is the codon defined by the k-th triplet on gene g e lg is the length of the gene (excluding stop codons).

We implemented one alteration compared to the computations of dos Reis et al. we re-inferred the S eu j values (appearing in the equation above) by performing a hill-climbing optimization of the Spearman correlation between protein abundance and translation efficiency in S. cerevisiae.

To this end we used the protein abundance measurements mentioned above.

o S eu j values can be organized in a vector (S vector) as described in [25] each component of this vector is related to one wobble nucleoside-nucleoside pairing: I:U, G:U, G:C, I:C, U:A, I:A, and so on.

Computing profiles of tRNA adaptation index, folding and charge

The local folding profile of a gene was defined as the vector of the folding values assigned to the sliding windows of length 40 nucleotides, that is:

Onde FE is the folding energy.

All the genes in the genome were lined up once according to their start codon, and once according to their stop codon. The two profiles of mean folding energy were calculated as:

e Genes eu is the number of genes with at least eu + 1 40-nucleotide windows.

Local profiles of amino acid charge were computed in a similar way. First, we computed for each gene a vector of the charge assigned to the amino acids of the gene (+1 for a positive charge, -1 for a negative charge, 0 for a neutral amino acid). Next, we lined up the genes once according to their start codon, and once according to their stop codon, and computed the mean charge at each position.

The local profiles of tAI were computed in a similar way [8]. First, we computed for each gene a vector of the tAI assigned to the codons of the gene. Next, we lined up the genes once according to their start codon, and once according to their stop codon, and computed the mean tAI at each position (codon).

When we computed the reported profiles we considered all the genes (that is, we did not filter short genes) as we believe that the important feature in our context is the distance from the ATG in codons and not in percentage of the coding sequences (see also [8]). Most of the analyzed genes are longer than 200 codons in S. cerevisiae, for example, less than 20% of the genes are shorter than 200 codons (1,119 out of 5,861 a histogram of the S. cerevisiae gene lengths is shown in Figure S46 in Additional file 2).

Computing the profile of ribosomal density

The data for the ribosomal density profile were kindly supplied to us by Dr Ingolia. He sent us the data that were used for generating Figure 2d in their paper [15]. The data included read density at single nucleotide resolution as a function of position along the gene for well-expressed genes. The read density of each gene was normalized compared to itself (see details in [15]). We averaged the ribosomal density values of the nucleotides of each codon (as the data of Ingolia et al. was at the at single nucleotide resolution) in each gene to obtain a per-codon measurement of ribosomal density. The genomic ribosomal density profile was computed in a way similar to the tAI, folding energy and charge profiles (the values of each codon were averaged over all the relevant genes).

Profiles of tRNA adaptation index, folding and charge for groups of genes

Profiles of coding sequence determinants for specific gene groups (for example, ribosomal proteins and GO slim groups) were computed as reported above. In these cases, however, we only considered the genes in the group.

The tRNA adaptation index as a predictor of protein abundance

Highly expressed genes have more efficient codons to improve their translation rate, the allocation of ribosomes, and the fitness of the organism [7, 14]. Thus, it is not surprising that in many organisms measures of codon bias such as the tAI exhibit significant correlation with protein abundance [5, 14, 40, 47]. No S. cerevisiae, for example, the correlation between tAI and protein abundance is higher than 0.6 [5, 40].

Linear regression and partial correlations

Deixar X e Y denote two variables and Z = [Z1, Z2, Z3. ] denote a set of variables. The non-parametric multivariate analysis that is reported in this paper includes partial Spearman correlations of the from R(X,Y|Z) Roughly, if such a correlation is significant, it means that there is a relationship between X e Y that can not be explained by the variables in Z. Specifically, we computed the correlation between ribosomal density (X) and one of the three coding sequence determinants (Y tAI, charge, or folding energy) given the rest of the coding sequence's determinants. This analysis was performed by the commercial MATLAB software (see more details in MATLAB help. Founded in 1984, MathWorks employs 2200 people in 15 countries, with headquarters in Natick, Massachusetts, USA).

Deixar rxy denote the matrix of the correlation coefficient corresponding to the vectors x e y. The partial correlation for two variables (x e y) when controlling for a third variable (z), rxy_z, is computed according to the following formula (see, for example, [48]):

When we want to control for more than one variable we can use the formula above in a recursive way. For example, the correlation between x, y when controlling for z e C (the case that was reported in the paper) is:

In Equation 2, rxy_z, rwy_z, ryw_z, rxw_z, e ryw_z are computed using Equation 1.

o P-values are computed for linear and rank partial correlations using a Student's t distribution for a transformation of the correlation. This is exact for linear partial correlations when the variables are normal, but if this is not the case it is a large-sample approximation. We also computed an empirical P-value that was based on 100 permutations of x e y (the variables that are not controlled for). O empírico P-value is the frequency of the times that the partial correlation of the permutated vector was larger than the original one (it was significant for all variables).

The regressor mentioned in the main text is a linear regressor, where the explained variable is the ribosomal density and it is explained by the three coding sequence determinants (tAI, charge, and folding energy). As we mentioned above, the ribosomal density data are noisy thus, we utilized the smoothed version of all the profiles (five-point moving average the default parameter in MATLAB), but obtained very similar results without smoothing.

Simulation of ribosomal movement

The ribosomal movement model was based on the work of [34] (Figure 4c). According to this model, the nominal translation time of a codon is determined by the charge of the amino acid encoded by the codon (and the charge of the amino acids encoded by the neighboring codons upstream), the co-adaptation of the codon to the tRNA pool, and the strength of mRNA folding near (upstream of) the codon (see more details in the next section).

The actual translation time of a codon is also related to the potential presence of a ribosome downstream of it. If there is a proximal ribosome in front of it, the ribosome translating the codon is delayed until the ribosome downstream of it proceeds.

Other parameters of the simulations are: the minimum distance between two consecutive ribosomes (that is, the size of the ribosome) the ribosome binding time (initiation time) and the termination time (the time required for the ribosome to release the mRNA). The properties (for example, translation time) of the ribosome movement regime were computed at steady state (that is, when there was a negligible change in the translation time between consecutive ribosomes and after at least one ribosome completed the translation).

Stochastic model of translation elongation

This model is based on [36]. We model an mRNA with N codons as a chain of sites, each of which is labeled by eu. The first and last codons, eu = 1, eu = N, are associated with the start and stop codons, respectively. At any time, t, attached to the mRNA are M(t) ribosomes. Each ribosome will cover eu codons. Any codon may be covered by a single ribosome or none. To locate a ribosome, we arbitrarily assume that the codon being translated is the one in the middle of the ribosome. For example, if the first (l + 1)/2 codons are not covered, a ribosome can bind to the first codon on the mRNA strand, and then it is said to be 'on codon eu = 1'. A complete specification of the configuration of the mRNA strand is given by the codon occupation number: n eu = 1 if codon eu is being translated and n eu = 0 otherwise. Note that when n eu = 1 the (l - 1)/2 codons before and after codon eu are covered by the ribosome that is on site eu but since they are not the ones being translated the codon occupation number for them is equal to zero.

We will now specify the dynamics of this model. A free ribosome will attach to codon eu = 1 with rate λ, provided that the first (l + 1)/2 codons on the mRNA are empty. An attached ribosome located at codon eu will move to the next codon eu + 1 with rate λ eu, provided codon eu + (l + 1)/2 is not covered by another ribosome. In case eu + (l + 1)/2 > N (the ribosome is bulging out of the mRNA strand) an attached ribosome will move to the next codon with rate λ eu. The translation rates λ eu are inversely proportional to the mean translation times t eu.

In order to simulate these dynamics, we assume that the time between initiation attempts is distributed exponentially with rate λ. Similarly, the time between jump attempts from site eu para i + 1 is assumed to be exponentially distributed with rate λ eu. Note that in the case of eu = N the jump attempt is in fact a termination step. We define an 'event' as an initiation, jump attempt, or termination step. From our definition it follows that the time between events is exponentially distributed (minimum of exponentially distributed random variables) with rate:

Note that a jump attempt from codon eu can only be made if there is a ribosome translating this codon and hence the rate µ(<n eu>) depends on the set of site occupation numbers.

The probability that a specific event was an initiation attempt is given by λ/μ(<n eu>). Similarly, the probability that a specific event was a jump attempt (or termination event) from site eu to site eu + 1 is given by n eu λ eu/µ(<n eu>).

At each step of the simulation, we determine the nature of the event and the time passed till its occurrence by these rules. The set of site occupation numbers is then updated accordingly and the simulation proceeds to the next event. For example, if an initiation attempt was made, we check if the first (eu + 1)/2 codons on the mRNA are not covered. If so, we set n eu = 1, otherwise the attempt fails and n eu remains as is. If a jump attempt from codon eu to codon eu + 1 was made, we check if site eu + (eu + 1)/2 is not covered. If so, we set n eu = 0 e n eu+1 = 1, otherwise the attempt fails and n eu, n eu+1 remain as is.

Starting with an empty mRNA strand we simulated the system for 250,000 steps. The system was then simulated for an additional 1,000,000 steps where we kept track of the total number of terminations and the total time that have passed from the point this phase started. The steady state rate of protein production was determined by dividing the number of termination events by the total time that has passed. The number of steps in the second stage was taken after observing that increasing the number of steps fourfold had a negligible effect on the predicted protein production rate.

Simulation of ribosomal movement: translation time of a codon

The translation time (or rate) of a codon (or the nominal speed of its translation) is based on three features of the coding sequence. First is the co-adaptation of the codon to the tRNA pool this value was based on the tAI. Second is the charge of the amino acids corresponding to the 31 neighboring upstream codons. The exit tunnel of a ribosome has negative charge and its length is around 31 amino acids [24] thus, amino acids with positive charge should slow the translation time of a ribosome [24]. At the beginning of the gene we considered the eu < 32 amino acids before the codon. Third is the folding energy of the neighboring downstream mRNA (40 nucleotides from the start of the codon). Stronger folding should slow the ribosome [49, 50]. When the ribosome translates a codon the A site of the ribosome lies in the middle of a stretch of mRNA that is physically occupied and unwound by the ribosome however, we are interested in modeling the delay/speed of the ribosome when it is translating this codon. At this stage, the mRNA folding before the ribosome is not relevant (the ribosome already translated these codons) the mRNA folding after the ribosome is relevant as this part of the mRNA should be unfolded by the helicase before the ribosome continues and moves forward.

The non-normalized time corresponding to the adaptation to the tRNA pool of the organism (tAIeu) of codon eu is: 1/tAIeu.

The non-normalized time corresponding to the charge upstream of codon eu is the sum of 'amino acid charges' among the 32 amino acids before the codon (where a neutral amino acid adds 0 to the sum, a positively charged amino acid adds 1 to the sum, and a negatively charged amino acid adds -1 to the sum the amino acids with positive charge are Arg and His, and Lys, while the amino acids with negative charge are Asp and Glu).

The non-normalized time corresponding to the folding energy downstream of codon eu is the folding energy of the 40-nucleotides starting from the beginning of the codon (at the end of the sequence consider the 3' UTR).

The three normalized times were computed as follows: for each of the three features we divide their non-normalized value by their mean value along all the coding sequences and all windows, such that the mean of each of the normalized features will be 1.

Deixar Ntai(eu) denote the 'normalized tRNA pool adaptation time' of codon eu deixar Nch(eu) denote the 'normalized charge time' of codon eu deixar Nfe(eu) denote the 'normalized folding energy time' of codon eu.

The total time corresponding to the the eu-th codon is a 1 N t a i ( i ) ⋅ e a 2 ⋅ N c h ( i ) + a 3 ⋅ N f e ( i ) .

We checked a1, a2, a3 in the range 0[1] and chose the values that optimized the correlation between the prediction of the ribosomal movement model (with the times above) and the actual ribosomal density. The correlation was based on the smoothed version of the real and predicted profiles (five-point moving average).

We obtained similar correlations when we used charge and folding before or after the codon, probably since the charge and folding in close windows in a gene tend to be similar and thus correspond to relatively similar speeds.

The size of the ribosome

Based on previous studies [8, 15, 30, 34, 51], the footprint of the ribosome on the transcript is 10 to 20 codons. As was mentioned before, the exit channel, which is in a different compartment of the ribosome, is longer (31 codons).

Profiles of mRNA secondary structure robustness

An mRNA sequence is robust to errors (point mutations) if point mutations tend to maintain its two dimensional structure (compared to random sequences with similar features).

We computed profiles of secondary structure robustness by performing the following steps for each window of length 40 nucleotides in each mRNA sequence. First, compute the folding structure and folding energy for each of the 40 × 3 one-nucleotide point mutations of the sub-sequence. Second, compute the distance of each mutated sequence from the original one in terms of absolute change in folding energy and the number of changes in the base-pair connections required for transferring one structure to the other (see, for example, [33]) we also plotted the mean number of point mutations (errors) that do not change the mRNA structure. Third, average the distances for each window.

As a control, we generated a randomized genome maintaining the codon bias and the amino acid sequences in the original genome. We compared the distribution of robustness obtained in the original genome and the randomized one.

To control for folding energy we divided the windows into five groups of equal size each group includes windows (over all genes) with similar folding energy. We plotted the profiles of folding energy robustness for each group separately.

To manage the extensive amount of computations needed for performing so many predictions of secondary structure, we employed a cluster of eight computers (each of which had an AMD Opteron(tm) 252 2. GHz processor, two cores, and 6 GB RAM) and a six-core computer (AMD Phenom(tm) II X6 1090T 3.2 GHz processor, six cores, 16 GB RAM) for several weeks.

Profiles of tRNA adaptation index and charge robustness

tRNA adaptation index and charge robustness profiles were computed in a similar manner. In the case of the charge, we computed for each window of 13 codons the number of point mutations that change the charge of the corresponding amino acids, and the mean change in the charge due to point mutations. In the case of the tAI, we computed for each window of 13 codons the average (over all point mutations) change in the tAI score of the codon, and the number of mutations that do not change the tAI of the codon. At the next step, we plotted the corresponding genomic profiles of robustness as was described for the folding energy robustness.

Robustness profiles: control for folding, tRNA adaptation index, and charge

To make sure that the robustness profiles are not trivially a result of the fact that the folding, tAI, and charge values are more extreme at the beginning of the coding sequences, we also analyzed the robustness profiles when considering only windows in certain ranges of folding, tAI, and charge, respectively (five bins of equal size).

It is also important to note that the codons (and similarly the folding or the charge) at the beginning of the coding sequence are less optimal than those at the end of it that is, relative to the immediate context, these codons are not necessarily the universally least efficient ones. For example, in highly expressed genes, these codons can be more efficient than all the codons of lowly expressed genes (Figure 2c).

Robustness profiles: assuming different probabilities of transition and transversion errors assuming that translation errors are relatively rare in the second position of the codons

To consider the fact that transcription errors that result in transition may have higher probability than transcription errors that result in transversion, we gave higher weights to the first type of errors when we computed the robustness scores. For example, if we assume that the probability of a transition error is twice the probability of a transversion error, the weight of such an error/mutation in the folding/charge/tAI robustness score of an mRNA window is two times the weight of transversion.

Similarly, in the case of charge robustness, to consider the fact that translation errors are very rare in the second position of codons [35], the weight of such an error/mutation in the charge robustness score of a mRNA window is lower (for example, 0.1) than the weight of an error in the first/third positions of the codons.

The length of the ramps

The length of the ramp (for a profile of tAI, charge, folding energy, or robustness) was computed similarly to [8] by comparing the mean (KS test) of sliding windows of length 13 codons to the mean of the rest of the corresponding profile (we considered the first 200 codons). The region at the beginning corresponding to a set of consecutive windows with a mean value significantly lower (P ≤ 0.05) than the mean of the entire profile was defined as the length of the ramp (the length of the ramp is the number of significant consecutive windows plus 12). We allowed this region to begin in the first five codons (if there was no significant window in this region, we declared that there is no ramp).

P-values for the folding, charge, and tAI profiles and the corresponding robustness profiles

We performed two statistical tests to check if the coding sequence determinants of a certain position were significant.

In the first test we checked if the value is more extreme than in other positions. This test does not take into account constraints on amino acid sequences. Firstly, however, we believe that selection for translation efficiency can also occur at the amino acid level - that is, there are many pairs of amino acids that, when substituted, do not change the function of the protein but can improve translation (see, for example, [52–54] about various distances between amino acids). The effect on translation and the coding sequence function is determined by the position of the codon along the coding sequence. Secondly, the effect of the various features of a codon on the translation rate of the ribosome can be significant, even though these profiles are not selected for.

The first test was performed by comparing (KS test) all the values in the positions within the ramp (see the previous section) to the rest of the positions. A similar test was performed also while testing subgroups of genes (for example, ribosomal proteins and GO groups).

In the second test we checked if the value is more extreme than the randomized version of the position. The randomized version of the genome was generated by maintaining the amino acid composition of each coding sequence and the codon bias of the genome, and sampling for each gene, a randomized version under these constraints. In this case, we compared the values of the positions within the ramp of the real genome and the randomized one by a KS test.

Predicted ribosomal density versus real ribosomal density in single genes

We used the linear regressor and the model that gave the best genomic ribosomal density to predict the ribosomal density at a resolution of single codons in each of the S. cerevisiae genes. Next, we plotted the graph (histograms) of distances between the window with the highest ribosomal density, and the window with highest predicted ribosomal density. We show that the distances tend to be small. We compared the distribution of distances corresponding to the real genome to a randomized genome, where the vectors of ribosomal densities were randomly permutated and show (by KS test) that the original mean is significantly smaller than the randomized mean.

Cross-validation tests and evaluation of the ribosomal movement model and the regressor

We compared the model and regressor with all three features to models that include only some of the features (for example, only charge and tAI without folding) by performing 20 cross-validation tests. In each test the model was trained based on 50% of the data (training sets) and was implemented on the second 50% of the data (test sets). We performed correlations between the ribosomal density and the predicted ribosomal density (by the model or the regressor) for the test sets in the full model and compared them to the correlations obtained for the partial models. O empírico P-value was computed as percentage of cases where the partial model was better then the full one on the same test set. Differences (between pairs of correlations) larger than 0.4% were assumed to be significant. We also compared, in a similar manner, the absolute sum of distances between the predicted and real genomic profile of ribosomal density.

In the case of the predicted profile of ribosomal density in single genes, we divided the genes into two groups as before, inferred the parameters of the model based on one of the groups and applied it to the second group (as reported above).

Site-by-site comparisons of predicted versus real ribosomal density

We wanted to test whether there is a direct relationship between the coding sequence determinants and the ribosomal translation rate (speed). Thus, we aimed at showing a significant relationship between local density of ribosomes [15] and charge, tAI, and folding profiles in single genes. Such a task comes with several caveats: 1) as mentioned, the measurements of ribosomal density are very noisy 2) ribosomes may interact with each other (jam) 3) often, the rate-limiting step may be initiation, which varies across genes.

To overcome these problems, we searched for the window with the highest ribosomal density in each individual gene and compared its position to the position with the slowest translation rate based on the three genomic features. This relationship should hold also when initiation is rate limiting and varies among genes, or when there are interactions between ribosomes.

Randomized profiles

To show that the genomic profiles reported in this study (the three ramps at the beginning of genes and the increased robustness to transcription errors at the beginning of genes) are not due to amino acid bias, we compared the genomic profile of folding energy with a profile of folding energy observed for a randomization of the genome. The genome was randomized in the following manner. Each codon was replaced by a random codon, according to the distribution (frequency) of codons coding the same amino acid in the genome of the organism. Thus, the randomized genomes maintained both the amino acid content of each coding sequence and the codon frequencies of the original genome.

Genomic profiles based on measurements of mRNA folding

We downloaded the mRNA measurement data from [28]. These data include for each nucleotide, in thousands of S. cerevisiae transcripts, the log ratio between the probability that it is in a double-stranded conformation and the probability that it is in a single-stranded conformation (parallel analysis of RNA structure (PARS) score [28]). If this value is higher, the position is involved in a double-stranded conformation and this is related to a higher folding energy. At the first stage (Figure S2 in Additional file 2), we computed for each position the mean PARS score (over all the genes) and plotted two profiles: 1) a simple average and 2) a weighted average (in which the weight of G or C, which are involved in pairings with three hydrogen bonds, is 3, while the weight of A or T, which are involved in pairings with two hydrogen bonds, is 2). We performed a KS test and compared each position to the remaining 600 'first' positions along the genes. We found that the first three positions have a significantly low PARS score (weak mRNA folding) while the next two positions have a significantly high PARS score (strong mRNA folding).

At the second stage we plotted this profile for highly expressed genes (top 10% of the genes in terms of mRNA-levels × ribosomal density) and lowly expressed genes (bottom 10% of the genes in terms of mRNA-levels × ribosomal density) and demonstrated that the high/low PARS score reported above is stronger for highly expressed genes (Figure S2 in Additional file 2 similar results were obtained for the weighted profile).

One problem of the PARS score is that it is global and not local (like the predicted local folding energy measure reported in this study) - a nucleotide has a higher PARS score even if it is connected to another nucleotide inside or outside the 40-nucleotide window. Thus, we used the inferred folding of complete mRNA sequences of yeast based on the PARS scores that are reported in the study of Kertesz et al. [28]. We computed for each sliding window in each gene how many pairs of nucleotides where both nucleotides are within the window are connected. We plotted the mean genomic graph of these values (as we did with the predicted folding energy). The new graphs indeed look similar to the graph obtained based on predictions of mRNA folding (Figure S2 in Additional file 2).

Genomic profiles of pairs of identical slow codons

To study the distribution of pairs of identical slow codons along the coding sequences, we divided the codons into slow (the lowest 10% in terms of the tAI) and fast ones (the remaining codons). We computed the profile of the mean number of pairs of identical slow codons in each position in E. coli e S. cerevisiae. We compared this profile to those obtained under two randomization regimes: 1) when controlling for amino acid content and codon bias as mentioned above and 2) when permutating only the slow codons in each gene (that is, a control that considers the fact that there are positions, such as the ramp, with more slow codons). We also computed this profile separately for highly and lowly expressed genes in these organisms.


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