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Qual é a melhor maneira de analisar os acertos não quantitativos das especificações de massa de uma redução de imunoprecipitação?

Qual é a melhor maneira de analisar os acertos não quantitativos das especificações de massa de uma redução de imunoprecipitação?



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Estou estudando uma proteína nuclear e quero fazer uma lista de proteínas potenciais com as quais ela interage. A partir da fração nuclear de células 293T, fiz um IP (imunoprecipitação) para puxar para baixo minha proteína e enviei tudo o que puxei para uma análise de espectrometria de massa. Também fiz um IP com um anticorpo não específico como controle. Tenho uma lista enorme de resultados e não sei como priorizá-los. Posso remover manualmente os resultados que também vieram com o anticorpo não específico, obviamente, são apenas proteínas pegajosas. Procurei no Pubmed maneiras de priorizar ocorrências não quantitativas de especificações de massa, mas não tenho certeza se alguma delas funcionaria no meu caso. Todos eles exigem várias repetições de especificações de massa - posso fazer isso se precisar, mas gostaria de ver meus dados iniciais de forma mais inteligente.


Se eles estiverem disponíveis, converse com as pessoas que analisaram seus dados. Usar o conhecimento deles é inteligente.

Assumirei que duas etapas críticas foram concluídas. Primeiro, verifique se seus resultados foram pesquisados ​​corretamente. Também assumirei que as identificações de peptídeo e proteína foram filtradas para fornecer uma taxa de descoberta falsa de 1: 100 em cada nível.

Você pode remover todas as proteínas que foram identificadas em seu controle de purificação de afinidade. Outra opção é usar o Repositório de Contaminantes para Purificação de Afinidade (o CRAPome), que fornece uma estrutura formal para a remoção de proteínas contaminantes. É um bom recurso se seus dados forem compatíveis.

As proteínas restantes são o que você tem que trabalhar, esta é a

lista de proteínas potenciais com as quais [sua proteína] interage.

Priorize essas proteínas com base na biologia de seu sistema experimental. Se a lista for pequena, trabalhe na função de cada proteína e avalie como ela se encaixa na biologia que você está pesquisando.

Para avaliar as ligações funcionais potenciais entre as proteínas, você pode criar um em sílico rede. O agrupamento de Markov pode destacar a presença de grupos funcionalmente distintos de proteínas em uma rede. String, linkado acima, pode fazer isso. Medidas de centralidade podem indicar a presença de proteínas com potencial de influenciar o comportamento da rede.

Para listas maiores, você também pode avaliar a função das proteínas na lista executando uma análise de enriquecimento de anotação funcional. Existem muitas outras coisas que você poderia fazer, mas o objetivo principal é manter a biologia na vanguarda de seus esforços.

Finalmente, você menciona que as repetições são necessárias. Analisar os dados consome muito tempo. Se esta foi uma execução de teste, verifique se o teste foi bem-sucedido e execute as replicações. O tempo gasto na análise de dados incompletos pode ser gasto no preenchimento do conjunto de dados ou na garantia de que os dados corretos sejam coletados. Os dados quantitativos podem ser muito úteis e, com cuidado, as abordagens proteômicas aleatórias podem fornecer dados quantitativos, mas as pessoas que operam a máquina precisam ser consultadas quando os dados quantitativos são necessários.


Você pode procurar as proteínas mais abundantes em sua amostra. Embora, como você disse, a análise LC-MS de seu IP não seja quantitativa, você ainda pode tentar obter algumas estimativas quantitativas. Para elaborar, você pode usar, por exemplo, cobertura de sequência, não. de PSMs para cada proteína, não. de peptídeos identificados para uma proteína, parte do espectro de ID, etc, como proxies para abundância.

Existe uma correlação aproximada entre a abundância de uma proteína e todas essas quantidades. Se uma proteína é mais abundante, é mais provável que você tenha mais peptídeos identificados a partir dela, mais não. de PSMs atribuídos a ele, ele teria uma cobertura de sequência mais alta, etc. Pessoas diferentes usam coisas diferentes. Muitas vezes usei não. de PSMs normalizados pelo comprimento da proteína como uma estimativa para a abundância dessa proteína.

Como outros mencionaram, discuta com as pessoas que analisaram seus dados. Como regra geral, eu filtraria meus dados primeiro em 1% FDR no nível de PSM, depois no nível de peptídeo e, em seguida, no nível de proteína. Então, eu jogaria fora todas as proteínas que não foram identificadas por pelo menos dois peptídeos únicos. Em seguida, compararia as proteínas identificadas na lista de controle negativo e removeria as IDs comuns. Em seguida, classifique a lista restante em não. de PSM para cada proteína. Isso daria uma estimativa das proteínas mais abundantes na amostra IP. Para dar um exemplo, sua proteína isca (proteína contra a qual você fez o IP) deve ser a proteína mais abundante em sua amostra. Depois disso, as proteínas podem ser consideradas os interatores de sua isca.

Lembre-se de que esta não é uma maneira quantitativa adequada de medir as interações proteína-proteína por purificação de afinidade acoplada a LC-MS. Mas, é um começo útil. Sempre usei informações preliminares dessa análise para projetar outras melhores. Além disso, leia sobre IPs recíprocos para confirmar as interações.


Assista o vídeo: imunoprecipitado 01 (Agosto 2022).