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Devo diluir o DNA com água ou tampão de eluição?

Devo diluir o DNA com água ou tampão de eluição?



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Extraí o DNA usando um kit e a etapa final é eluída com tampão. Se eu precisar diluir minhas amostras de DNA, devo usar o mesmo tampão de eluição ou posso usar água milliq?


Eu geralmente recomendaria usar o tampão de eluição (que normalmente é o tampão Tris-EDTA) ou o tampão TE, já que o pH e as condições estabilizam o DNA por mais tempo, o que é especialmente interessante quando você deseja armazenar seu DNA.

Depende também da sua aplicação a jusante - quando eles recomendam diluir a amostra em água (ou outro tampão), eu seguiria este conselho. Na minha experiência, o tampão TE é perfeito para todas as aplicações de biologia molecular (clonagem, digestão, amplificação, PCR, etc.). O EDTA irá, obviamente, complexar cátions bivalentes, mas como a concentração no tampão é de apenas 1 mM e a solução de DNA é geralmente diluída em PCR ou digere, isso não desempenha nenhum papel nas aplicações da vida real.


Os kits Quiagen com os quais estou familiarizado afirmam explicitamente que você pode usar água em vez de tampão de eluição para a eluição. A escolha de continuar a usar tampão ou água é sua e depende do que você deseja fazer com o DNA e se o tampão interfere nas etapas posteriores. Usar o buffer é provavelmente mais seguro para armazenamento de longo prazo, mas não sei o quanto isso realmente importa (nunca tive nenhum problema em armazenar DNA na água).

Se você diluir com água, obviamente acabará com um tampão mais fraco que pode não ser capaz de manter o pH no valor especificado. Portanto, se você precisa do seu DNA no pH do tampão de eluição, não deve diluí-lo.


Apenas para adicionar às respostas acima, é melhor você não usar MQ porque se ele estiver contaminado com DNases, ele irá digerir sua construção se atingir a temperatura ambiente ou 37 oC quando você estiver derretendo a construção congelada em sua mão! O tampão TE é o tampão padrão para elusões de DNA, mas certifique-se de que sua coluna seja compatível com ele. Para experimentos baseados em transfecção, o TE funciona bem para mim!


Problemas de rendimento do Plasmid Miniprep - Baixa taxa de rendimento usando um kit Miniprep (23 / abr / 2011)

Oi,
meus colegas de laboratório e eu estamos usando o mesmo Kit (Peqlab) para nossos minipreps de DNA de plasmídeo de
células de bactérias.
Enquanto eles obtêm rendimentos & gt100 ng / l de suas bactérias, eu obtenho apenas a metade ou até pior.

Meu protocolo é baseado no manual que vem com o kit peqlab miniprep:


1) Escolha 1 colônia da placa de seleção e dilua em 10 l de H2O.
2) Use 0,5-2 l para um teste de PCR de colônia.
3) Adicione o restante a 5 ml de meio de crescimento (+ antibiótico) e incube durante a noite a 37 C.

4) Pellet Bacteria por centrifugação a 4.000 rpm por 10 min compl. remova o sobrenadante completamente
5) Ressuspender o pellet em 250 l de Solução I / RNAseA por pipetagem
6) Transfira as bactérias ressuspensas para um tubo de reação de 1,5 ml
7) Adicionar 250 l de Solução II e misturar suavemente invertendo a incubar 1 min à temperatura ambiente
8) Adicione 350 l de Solução III e misture suavemente invertendo
9) Carregue a coluna de ligação de DNA com no máx. Centrífuga de lisado de 750 l 1 min a 10.000 rpm
10) Recarregue o fluxo na mesma coluna novamente e repita a centrifugação
11) Remova o fluxo e adicione 750 l de tampão de lavagem de DNA à coluna
12) Centrifugar 1 min a 10.000 rpm
13) Remova o fluxo e adicione 750 l de tampão de lavagem de DNA à coluna
14) Centrifugar 1 min a 10.000 rpm
15) Remova o fluxo e centrifugue 1 min a 10.000 rpm para secar a coluna
16) Coloque a coluna de DNA em um novo tubo de reação de 1,5 ml e elua o DNA adicionando
70 l H2O e centrifugar 1 min a 5.000 rpm

Você tem alguma dica para mim de como posso melhorar o rendimento além de diminuir o volume de água
para eluição na etapa 16?

Ficarei muito grato por qualquer tipo de dica & # 33

Entre as etapas 8 e 9, você reduz a rotação das células e carrega apenas o lisado limpo? Isso é importante, pois, caso contrário, todos os restos de células são carregados em sua coluna. Se você girar para baixo após 8, os destroços serão deixados para trás.
5ml de cultura é muito para uma boa lise, assumindo que as células cresçam bem. Você pode estar usando muitas células para uma boa lise. Experimente 2-3 ml de células para começar.
Você pode e deve ser vigoroso na ressuspensão das células na etapa 5.
Você pode eluir duas vezes, primeiro com 40 µl de TE, depois mais 30 µl de TE. Use TE em vez de água, o que protegerá seu DNA e terá pouco efeito na digestão ou no sequenciamento a jusante. A água pura também tem pH não controlado e pode ser ácida o suficiente para não eluir o DNA de maneira eficaz.

Entre as etapas 8 e 9:
É claro que estou girando nos destroços do SDS. é um erro de digitação. Eu centrifugo por 10 min a 10.000 rpm (tentei ambos: temperatura ambiente e 4 & # 176C e não observei diferenças).
Também tentei decantar o sobrenadante ou transferi-lo cuidadosamente com uma pipeta. Acho que a decantação funciona um pouco melhor.

Para a cultura de 5 ml:
Sim, eles crescem muito bem. Talvez eu deva continuar a cultivá-los em 5 ml e, após o crescimento, separá-los em 3 tubos de reação de 1,5 ml (500 e # 181l que sobraram são usados ​​para uma cultura de glicerol).

Para a eluição:
A ideia com a TE parece convincente. Qual pH deve ter? pH 8?
O TE tem efeitos negativos nas reações de PCR ou abordagens de sequenciamento?

O EDTA quela os íons de Mg. E esta atividade poderia, em teoria, inibir reações enzimáticas a jusante. No entanto, na prática, isso realmente não ocorre, pois a quantidade de DNA usada é pequena e, portanto, apenas uma pequena quantidade de EDTA está presente. A reação de PCR geralmente tem um excesso de íons de Mg. E para fins de sequenciamento, muitas vezes você precisa diluir seu DNA, pois ele está muito concentrado. Use água para diluir uma alíquota da amostra de DNA.

Se você estiver preocupado, pode usar Tris-HCl em vez de Tris-EDTA (TE) para eluir seu DNA. Mas o EDTA impede que qualquer nuclease contaminante degrade o DNA.

não se preocupe muito. se seu colega e você estão trabalhando em plasmídeos diferentes.

Plasmídeos diferentes podem realmente diferir em seus rendimentos (embora tenham a mesma origem de replicação). A sequência da sua inserção pode, e. interfere drasticamente com a replicação do plasmídeo ou você tem atividade de promotor que leva a colisões frontais durante a transcrição e replicação, diminuindo sua frequência de replicação.

Portanto, não se preocupe muito. faça uma competição usando o mesmo plasmídeo e cepa e a mesma cultura e compare seus rendimentos. se diferirem significativamente. comece a ter noites sem dormir e tente erradicar seu erro sistêmico

Sobre a coisa do buffer TE: E quanto ao armazenamento de primers em TE? Faria sentido diluí-los em TE
em vez de água?

Qual TE pH você recomendaria para armazenamento de DNA?
Encontrei várias receitas na internet:

a)
Tris-Cl 10 mM, pH 7,5
EDTA 1 mM, pH 8


Tris-Cl 10 mM, pH 8
EDTA 1 mM, pH 8

O estoque mestre (100 µM) dos primers geralmente é feito com TE.
Uma alíquota do estoque mestre é então diluída com água para fazer a solução de primer de trabalho (10 uM)

Para DNA, TE em pH 8 é usado. Enquanto para RNA, TE com pH 7,5 é usado.
Porque? Bem, é dito que o DNA é mais solúvel em uma solução ligeiramente alcalina e o RNA mais solúvel em pH neutro.

Eu não vi a diferença, no entanto. Então, esse pedaço de "sabedoria de laboratório" é realmente verdadeiro?

E por fim. além da sugestão de phage434, se você aquecer seu TE, (

70 C) você pode eluir mais DNA da coluna.

Sempre guardo primers no TE também. A TE faz duas coisas. Primeiro, ele mantém o pH acima do neutro, o que estabiliza o DNA. pH 7,5 ou 8,0 é um tossup aqui, e é controlado pelo tris pH. O EDTA quela o magnésio e outros íons de metais pesados. O magnésio é um cofator necessário para quase todas as enzimas DNAse, de modo que mesmo se o seu DNA estiver contaminado com a ponta dos dedos, por exemplo, as enzimas serão inativas.

Agora, sobre o uso do DNA armazenado no TE. As quantidades (volume) de solução de DNA adicionadas às reações costumam ser muito pequenas (se não for, isso costuma ser um problema por si só, por outras razões). Um tampão de enzima de restrição típico em concentração 1x contém magnésio 10 mM. Se você adicionar metade do volume como uma solução contendo TE, você ajustou para 0,5 mM de EDTA, uma quantidade inconseqüente, levando a uma pequena alteração na concentração líquida de magnésio. Para primers em concentrações razoáveis, surge uma situação semelhante. Normalmente, você configura uma reação pcr com 1 µl ou menos de cada primer em uma reação de 20-50 µl e quantidades igualmente baixas de molde. Essas quantidades irão alterar muito pouco as condições de reação. Os centros de sequenciamento geralmente dizem para você não enviar amostras em TE, mas em todos os anos que as tenho enviado, sempre enviei DNA em TE e eles sempre funcionaram (bem, os que deveriam ter feito).

Sobre o pH. No que diz respeito ao DNA, não se preocupe. Para eluição de colunas, no entanto, pode haver uma dependência do pH. Aqui, veja o protocolo da coluna. Normalmente, o pH 8,0 é melhor. Esta é uma razão para usar TE (ou pelo menos tampão Tris), uma vez que a água pura geralmente tem um pH ácido por absorver CO2 do ar.

Algumas pessoas usam TE 10: 0.1, ou outras misturas, contendo menos EDTA. Eu costumava fazer isso, mas não vejo mais o ponto.

perneseblue em Dom 24 de abril 12:28:11 2011 disse:

O estoque mestre (100 µM) dos primers geralmente é feito com TE.
Uma alíquota do estoque mestre é então diluída com água para fazer a solução de primer de trabalho (10 uM)

Para DNA, TE em pH 8 é usado. Enquanto para RNA, TE com pH 7,5 é usado.
Porque? Bem, é dito que o DNA é mais solúvel em uma solução ligeiramente alcalina e o RNA mais solúvel em pH neutro.

Eu não vi a diferença, no entanto. Então, esse pedaço de "sabedoria de laboratório" é realmente verdadeiro?

E por fim. além da sugestão de phage434, se você aquecer seu TE, (

70 C) você pode eluir mais DNA da coluna.

Em nosso laboratório, todos fazem o estoque mestre (100 e # 181M) com dH2O - até onde eu sei. E desde que comecei a trabalhar lá, me disseram
para fazer isso também.
Devo mencionar que os estoques do primer master são armazenados a -70 e # 176C, então talvez (em oposição a um armazenamento de -20 e # 176C) não haja necessidade
para usar o TE & # 33?

Você recomendaria fazer meu estoque de diluição (5 & # 181M) com TE do estoque mestre (por exemplo, 950 & # 181l TE + 50 & # 181l primer) ou o
concentração de TE muito alta tem efeitos negativos nas reações de pcr e sequenciamento?

EDITAR:
Acabei de saber na página da web do nosso serviço de sequenciamento que não há como usar o TE como tampão de diluição para que as sondas de DNA sejam sequenciadas.
Isso restringiria minha escolha ao tampão Tris-HCl, mas melhor do que água pura de qualquer maneira.

EDIT2:
Se estou planejando usar Tris-HCl como tampão de eluição e armazenamento, que concentração deveria ter? 10 mM ou algo assim?

Eu não recomendaria usar TE para diluir o primer de estoque para fazer as soluções de primer de trabalho. O TE em tal situação seria de pouca utilidade para manter seus primers de estoque seguros e abre uma pequena chance de que o EDTA poderia inibir as reações de PCR a jusante.

O objetivo do EDTA em TE é inibir a atividade da nuclease quando a solução estoque foi descongelada. Portanto, manter o estoque de primer 100uM a -80 C não invalida a necessidade de usar o TE. Mais sobre o Tris em TE ajuda a manter o pH. A água tende a ser ácida devido ao dióxido de carbono atmosférico.


Diluição do primer. . água ou tampão? - (01 / jun / 2007)

No momento, estou usando tampão de PCR 10X contendo MgCl2. Não usei esse tampão para diluir meus primers, mas água. Para evitar cálculos desnecessários (para Mg e outros) na preparação do mix principal. Meu amigo não está feliz com isso. é claro que meus primers estão funcionando bem.

Sem água sem vida ... a água é sua melhor amiga, cristalina como a água. deixe a água correr .. sem problemas (contanto que seja miliq)

No momento, estou usando tampão de PCR 10X contendo MgCl2. Não usei esse tampão para diluir meus primers, mas água. Para evitar cálculos desnecessários (para Mg e outros) na preparação do mix principal. Meu amigo não está feliz com isso. é claro que meus primers estão funcionando bem.

Eu concordo. Não há absolutamente nenhum problema em diluir seus primers em água, nunca ouvi falar de ninguém diluindo-os em tampão.

Diluo meus primers em tampão Tris 10mM, pH8 (alguns usam 7,5). Na verdade, é apenas água tamponada a um certo pH. Isso deve evitar a degradação do DNA em pHs mais baixos.
Eluímos todos os nossos DNAs em água tamponada.

usamos milliq para diluir o primer. se você for sensível, então você pode usar milliq apenas de uma garrafa autoclavada (claro, após o resfriamento)

Eu uso o TE. O EDTA impede que a maioria das enzimas do DNA sejam ativas, tornando o DNA muito mais estável. As pequenas quantidades de EDTA adicionadas a uma reação de PCR com a porcentagem muito pequena da mistura proveniente dos primers é desprezível: TE tem 1 mM de EDTA e (a 30 pmol / ul) será um máximo (com ambos os primers) de 3 % do volume de PCR. Isso significa que ele irá quelar 0,03 mM de Mg ++ da reação, de tipicamente 1,5-2 mM de Mg ++, uma quantidade totalmente desprezível.

usamos água millipore para fazer soluções de primer. Eles são bastante estáveis. Em meu antigo laboratório, usamos TE. Então, os dois funcionam lindamente.

Água sem Nuclease usada que vem no Kit de Purificação de DNA. Isso é de alguma forma diferente do MQ?

O kit de água pode ser sua melhor aposta, já que esse material é QC & # 39d antes de embalar com os kits. MilliQ ou água nanopura também podem ser bons, mas eu sou um fã de autoclavagem, já que você nunca sabe onde seu vidro esteve. Eu geralmente uso o TE também como seguro extra contra degradação / contaminação.

Eu usei água e TE. A princípio, fiquei preocupado com o fato de o EDTA quelar o Mg ++ e reduzir a atividade do Taq, mas na verdade funciona bem. Provavelmente a concentração de EDTA não é alta o suficiente para isso, mas ainda protege meus primers. Então, eu só uso o TE de agora em diante.


Purificação de DNA genômico usando os kits de fluxo Illustra ™ GenomicPrep Midi

Illustra ™ genomicPrep Midi Flow Kits da Cytiva são projetados para extração e purificação de alto rendimento de DNA genômico de tecido animal e linhagens de células de mamíferos em cultura (kit de tecido e células amp) e sangue / frações de sangue (kit de sangue). Todo o procedimento, incluindo lise, purificação e dessalinização, pode ser concluído usando um método baseado em gravidade ou baseado em rotação. O DNA genômico altamente puro pode ser obtido com o protocolo de rotação em apenas 3 horas para o kit de células e tecidos e em apenas 2 horas com o kit de sangue. O DNA genômico purificado tem alto peso molecular, qualidade e pureza e, portanto, é compatível com a maioria das técnicas de biologia molecular, como amplificação por PCR, digestão com enzimas de restrição e sequenciamento de DNA.

Os kits utilizam um processo simples e eficiente, empregando um procedimento de lise simples (7), purificação usando cromatografia em coluna de troca aniônica com uma coluna Illustra ™ Fast Flow Genomic e um processo de dessalinização sem problemas usando uma coluna de dessalinização illustra ™ NAP ™ -25 . As colunas illustra ™ Fast Flow Genomic, usadas para a etapa de purificação, contêm um meio de cromatografia de troca aniônica com excelentes características de fluxo, estabilidade química e de pH excepcionais e alta capacidade para biomoléculas. O DNA genômico, mas não as impurezas potenciais, liga-se ao meio de troca aniônica em altas concentrações de sal. O DNA é subsequentemente eluído da coluna em um tampão contendo concentrações de sal mais altas. As colunas illustra ™ Fast Flow Genomic são descartáveis, de uso único e robustas para protocolos de fluxo por gravidade ou centrifugação. Eles são fornecidos pré-equilibrados e possuem excelentes características de fluxo, resultando em redução do tempo de operação e tempo total do processo. O tampão usado para pré-equilíbrio foi otimizado para evitar que a maioria das impurezas se liguem ao meio, levando a maior pureza e rendimento de DNA genômico. Uma etapa de dessalinização com base em colunas illustra ™ NAP-25 é fornecida no kit para evitar a necessidade de precipitação de isopropanol.

Células illustra ™ e tecido amp genomicPrep Midi Flow Kit foi otimizado para a purificação de DNA genômico de até 200 mg de tecido animal ou até 2 x 10 7 células de mamíferos em cultura. O rendimento típico é de 0,75 a 1,5 μg de DNA por miligrama de tecido.

O kit Illustra ™ blood genomicPrep Midi Flow foi desenvolvido para a purificação de DNA genômico de 1 a 8 mL de sangue. O rendimento típico de 5 mL de sangue humano é de 80 a 125 μg.

Segue-se um protocolo geral para purificação de DNA genômico usando os kits de fluxo Illustra ™ genomicPrep Midi.

Materiais

Colunas de purificação illustra ™ e colunas de dessalinização, tampões, Proteinase K liofilizada e adaptadores (para centrifugação) são fornecidos com cada kit

Opcional para protocolo de gravidade: reservatório de tampão LabMate ™

Necessário para o protocolo de rotação: Centrífuga equipada com rotor oscilante e baldes para 50 mL

Opcional para a etapa de concentração final: Isopropanol

Para tecidos e células

A solução PBS de Dulbecco é necessária para a homogeneização do tecido ou ressuspensão celular

Banho-maria ou bloco de aquecimento para incubação a 60 ° C

Para isolar DNA genômico de altas densidades de células: filtro Steriflip ™ 0,2 μm (Millipore, SCGP 00525) ou equivalente (requer uma fonte de vácuo)

Homogeneizador recomendado para purificação de DNA genômico de tecidos animais: Homogeneizador portátil movido a motor (Kimble, parte no. 749540 ou equivalente) com sonda (parte no. 749520-0090)

Preparação antecipada

Dissolva a Proteinase K em água.

Use água para diluir o tampão de eluição fornecido para a etapa de dessalinização.

Para amostras de tecido: Homogeneizar completamente.

Para sangue: Pré-encher os tampões de lise e a água livre de DNase.

Prepare PBS: Veja a receita em Preparação Avançada para Mini Spin Kits, acima.

Protocolo

Observação: Colunas e buffers NÃO são transferíveis entre os kits Cytiva na linha de produtos illustra ™. Certifique-se de usar as colunas e buffers corretos para sua purificação.

Nota: Este procedimento pode ser realizado por fluxo de gravidade ou centrifugação. O procedimento de fluxo por gravidade demorará um pouco mais, mas aumentará o rendimento.

uma. Homogeneizar tecido animal

Homogeneizar 100 a 200 mg de tecido em PBS.

b. Ressuspender células de mamíferos

Enxaguar até 2 × 10 7 células com PBS e, em seguida, ressuspender em tampão TE (fornecido).

c. Isolar glóbulos brancos

Adicionar tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar brevemente em temperatura ambiente.

Centrifugue para sedimentar o WBC. RBC são seletivamente lisados ​​por pressão osmótica.

2. Lise as células / prepare a coluna Illustra ™ Fast Flow Genomic

Adicione tampão de lise de glóbulos brancos e Proteinase K para lisar as células e digerir proteínas. Incubar brevemente em temperatura ambiente. Durante a incubação, equilibre a coluna de troca aniônica. WBC são lisados ​​por detergente.

b. Lise as células do tecido ou células em cultura

Adicione o tampão de lise e a Proteinase K. O tampão de lise abre as células e a Proteinase K digere as proteínas. Incubar por 1 a 1,5 h com calor. Adicione RNase A e incube brevemente. Diluir as amostras de tecido com tampão de alto teor de sal. Amostras de cultura de células de alta densidade exigirão filtração. Durante a etapa RNase, equilibre a coluna de troca aniônica. As células são lisadas pelo detergente.

Adicione a amostra à coluna de troca aniônica. O DNA genômico se liga ao meio de troca aniônica em condições de alto teor de sal, enquanto outros contaminantes não. Adicione tampão de carregamento adicional para completar o carregamento da amostra e para lavar os contaminantes.

4. Eluir DNA genômico / preparar coluna de dessalinização illustra ™ NAP-25

Adicionar tampão de alta força iônica para eluir o DNA genômico do meio de troca aniônica. Equilibre a coluna de dessalinização.

O equilíbrio da coluna pode ser convenientemente realizado usando reservatório tampão LabMate PD-10. Se o reservatório tampão for mantido apenas para equilíbrio da coluna de dessalinização, o acessório LabMate é reutilizável.

É fundamental equilibrar a coluna NAP-25 porque estabilizadores de absorção de UV são usados ​​no empacotamento da coluna.

Carregar DNA genômico eluído na coluna de dessalinização preparada.

6. Eluir DNA genômico pronto para uso

O DNA genômico é eluído em um tampão de baixa força iônica. Se DNA altamente concentrado for necessário, uma precipitação de isopropanol opcional pode ser realizada.

Para armazenamento de curto prazo, coloque o DNA genômico a 4 ° C. Para armazenamento de longo prazo, alíquotar a amostra e armazenar a -20 ° C. Não submeta as amostras a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.


Purificação de DNA de plasmídeo

A consideração primária para a purificação do plasmídeo é a separação do DNA do plasmídeo do DNA cromossômico e do RNA celular da bactéria hospedeira. Vários métodos foram desenvolvidos para gerar um lisado limpo que não apenas remova proteínas e lipídios, mas também remova eficientemente o DNA cromossômico contaminante, deixando o DNA de plasmídeo livre em solução. Os métodos para a preparação de lisados ​​clarificados que enriquecem para DNA de plasmídeo incluem SDS-desnaturação alcalina (22 & ndash23), precipitação de sal-SDS (24) e ebulição rápida (25).

O método de desnaturação alcalina SDS, que é usado em todos os sistemas de isolamento de plasmídeo Promega, é um procedimento popular para purificar DNA de plasmídeo devido à sua versatilidade e consistência geral. Esta técnica explora a diferença nas características de desnaturação e renaturação de DNA de plasmídeo circular covalentemente fechado e fragmentos de DNA cromossômico. Em condições alcalinas (em pH 11), tanto o plasmídeo quanto o DNA cromossômico são desnaturados com eficiência. A neutralização rápida com um tampão de alto teor de sal, como acetato de potássio, na presença de SDS tem dois efeitos que contribuem para a eficácia geral do método.

Em primeiro lugar, a neutralização rápida faz com que o DNA cromossômico pareie de uma maneira intratramas, formando um agregado insolúvel que precipita da solução. A natureza covalentemente fechada do DNA circular do plasmídeo promove a re-hibridização entre cadeias, permitindo que o plasmídeo permaneça em solução. Em segundo lugar, o sal de potássio do SDS é insolúvel, então a proteína e o detergente precipitam e agregam, o que auxilia no aprisionamento do DNA cromossômico de alto peso molecular. A separação do material solúvel e insolúvel é realizada por um método de limpeza (por exemplo, filtração, limpeza magnética ou centrifugação). O DNA de plasmídeo solúvel está pronto para ser purificado posteriormente. Existem vários métodos disponíveis para purificar o DNA de plasmídeo a partir do lisado limpo. Esses incluem:

  • plasmídeo de ligação à sílica na presença de altas concentrações de sais caotrópicos (2 & ndash4)
  • precipitação diferencial de DNA de plasmídeo a partir de soluções aquosas de sal caotrópico / etanol (26 & ndash28)
  • cromatografia de troca iônica sobre membranas de celulose modificada por DEAE (29)
  • precipitação com polietilenoglicol (30 & ndash31) extração orgânica usando fenol (32)

Considerações gerais para purificação de DNA de plasmídeo

Condições de crescimento e cultura bacteriana

O isolamento bem-sucedido de DNA de plasmídeo de qualidade começa com a preparação da cultura. Vários fatores podem influenciar o crescimento das células bacterianas. O crescimento bacteriano em cultura líquida ocorre em três fases: 1) uma fase de latência curta na qual a bactéria se aclimata ao meio e começa a se dividir 2) uma fase logarítmica, caracterizada pelo crescimento exponencial em que a maioria das cepas de E. coli irá dividir a cada 20 & ndash30 minutos e 3) uma fase estacionária na qual o crescimento diminui e eventualmente para em resposta à falta de nutrientes no meio.

Nenhum aumento líquido na biomassa ocorrerá na fase estacionária, mas a replicação do plasmídeo continuará por várias horas após atingir a fase estacionária. A maioria das cepas de E. coli atingirá uma concentração de 1,0 & ndash4,0 & vezes 10 9 células / ml de cultura nesta fase, dependendo do meio de cultura e das condições de aeração. Dependendo do tamanho da inoculação e do tamanho da cultura, a fase estacionária será alcançada em 6 & ndash8 horas

Aeração e temperatura são de importância crítica. O volume da cultura deve ser menor ou igual a 1/4 do volume do recipiente (por exemplo, meio de 250ml em um frasco de 1 litro) usando 1/10 do volume do recipiente (por exemplo, meio de 100ml em um frasco de 1.000ml) produz resultados ideais . O tubo ou frasco de cultura deve ser colocado em agitador orbital (aproximadamente 250rpm) para garantir aeração adequada (33). Frascos confusos podem aumentar a aeração e, portanto, os rendimentos de DNA de plasmídeo. Uma vez que a maioria das cepas de E. coli crescer melhor a 37 & degC, esta temperatura de incubação é recomendada, a menos que a cepa de interesse exija diferentes condições para um crescimento ideal.

Diferentes meios de cultura também terão um efeito profundo no crescimento de diferentes cepas bacterianas. Os sistemas de purificação de DNA de plasmídeo Promega são apropriados para culturas bacterianas cultivadas em meio 1X Luria-Bertani (LB). No entanto, o uso do meio LB-Miller contendo mais NaCl produzirá rendimentos significativamente maiores e é altamente recomendado. Meios mais ricos, como 2X YT, CIRCLEGROW & reg ou Terrific Broth, podem ser usados ​​para aumentar os rendimentos de plasmídeo aumentando a biomassa para um determinado volume de cultura.

Mantenha a biomassa em uma faixa aceitável para o sistema de isolamento de plasmídeo usado, pois a sobrecarga pode resultar em pureza e rendimento pobres do DNA de plasmídeo (consulte Biomassa processada para obter mais informações). O tempo de incubação da cultura afeta o rendimento e a qualidade do DNA de plasmídeo isolado. As culturas bacterianas cultivadas até uma densidade insuficiente produzirão quantidades relativamente baixas de DNA. Culturas superdimensionadas podem resultar em rendimentos abaixo do ideal e contaminação excessiva de DNA cromossômico devido à autólise de células bacterianas após terem atingido a fase estacionária. Não recomendamos o uso de culturas cultivadas por mais de 18 & ndash20 horas.

Seleção Antibiótica

A maioria dos plasmídeos carrega um gene marcador para uma resistência específica a antibióticos. Ao suplementar o meio de crescimento com o antibiótico de escolha, apenas as células contendo o plasmídeo de interesse irão se propagar. Adicionar antibiótico à concentração necessária ajudará a maximizar os rendimentos de plasmídeo. Observe que adicionar muito antibiótico pode inibir o crescimento e muito pouco pode fazer com que uma população mista de bactérias cresça & mdashboth com e sem o plasmídeo de interesse. Para obter mais informações sobre as faixas ideais de antibióticos para uso em cultura, bem como os mecanismos de ação e resistência aos antibióticos, consulte a Tabela 5 (34).

Tabela 5. Modo de ação do antibiótico e mecanismo de resistência.

Antibiótico Modo de ação Mecanismo de Resistência Trabalho Conc. Solução de estoque
Ampicilina (Amp) Um derivado da penicilina que mata células em crescimento interferindo na síntese da parede celular bacteriana. O gene de resistência (bla) especifica uma enzima periplasmática, β-lactamase, que cliva o anel β-lactama do antibiótico. 50-125µg / ml 50mg / ml em água
Cloranfenicol (Cm) Agente bacteriostático que interfere na síntese de proteínas bacterianas ao se ligar à subunidade 50S dos ribossomos e prevenir a formação de ligações peptídicas. O gene de resistência (gato) especifica uma acetiltransferase que acetila e, portanto, inativa o antibiótico. 20-170µg / ml 34mg / ml em etanol
Higromicina (Hygro) Inibidor da síntese de proteínas que interfere na translocação do ribossomo 80S e causa tradução incorreta. O gene de resistência (hph) especifica uma fosfotransferase que catalisa a fosforilação do grupo 4-hidroxila no anel de ciclitol (hiosamina), produzindo assim 7'-O-fosforil-higromicina B, que carece de atividade biológica in vivo e in vitro. 20–200µg / ml 100mg / ml em água
Canamicina (Kan) Agente bactericida que se liga aos ribossomos 70S e causa leitura incorreta do RNA mensageiro. O gene de resistência (kan) especifica uma enzima (aminoglicosídeo fosfotransferase) que modifica o antibiótico e impede sua interação com os ribossomos. 30µg / ml 50mg / m em água
Neomicina (Neo) Agente bactericida que bloqueia a síntese de proteínas ao se ligar à subunidade ribossômica 70S procariótica. Expressão do gene bacteriano APH (aminoglicosídeo fosfotransferase) (derivado de Tn5). 50µg / ml 25mg / ml em água
Tetraciclina (Tet) Agente bacteriostático sensível à luz que impede a síntese de proteínas bacterianas ao se ligar à subunidade 30S dos ribossomos. O gene de resistência (tet) especifica uma proteína que modifica a membrana bacteriana e impede o transporte do antibiótico para a célula. 10µg / ml em cultura líquida 12,5µg / ml em placas 12,5mg / ml em etanol

Procedimentos de Inoculação Recomendados

1–100ml de cultura

Escolha uma colônia isolada de uma placa recentemente semeada (com menos de 5 dias) e inocule meio LB contendo o (s) antibiótico (s) necessário (s). A incubação com agitação por 8–16 horas a 37 ° C antes da colheita geralmente resulta em rendimentos máximos de um plasmídeo de alto número de cópias. Para obter um rendimento altamente reprodutível, determine a densidade celular alcançada em um experimento típico e faça as culturas crescerem até essa densidade em cada experimento subsequente. Normalmente, após a incubação durante a noite, a absorvância de uma diluição de dez vezes da cultura em um comprimento de onda de 600 nm (A600) com um comprimento de caminho de 1 cm deve variar de 0,10–0,35.

100-1000ml de cultura

Usando uma colônia de uma placa recentemente semeada (com menos de 5 dias), inocule 5–50ml de meio LB contendo o (s) antibiótico (s) necessário (s). Cultive esta cultura inicial de 8 horas até durante a noite a 37 ° C. No dia seguinte, use esta cultura para inocular o frasco de cultura maior contendo meio suplementado com antibiótico, diluindo a cultura inicial entre 100 a 500 vezes (por exemplo, adicionando 10 mL de cultura durante a noite a 1 litro de meio). Incubar esta cultura secundária por 12–16 horas antes da colheita das células. O A600 de uma diluição de dez vezes da cultura deve ser 0,10–0,35. Tal como acontece com culturas menores, para alcançar um rendimento altamente reprodutível, determine a densidade celular usada em um experimento típico e faça as culturas crescerem até essa densidade em cada experimento subsequente.

Ao colher bactérias, siga as condições descritas no protocolo Wizard® Plus SV Miniprep DNA Purification System ou PureYield ™ Plasmid Midiprep System. Se o tempo ou velocidade de centrifugação recomendados for excedido, as células peletizadas podem ser mais difíceis de ressuspender. Tempo ou velocidade de centrifugação insuficiente pode resultar na coleta incompleta de células e perda do material inicial. Consulte um manual de instruções da centrífuga para a conversão de rpm para g-força. Uma vez que as bactérias são peletizadas, este é um bom ponto de parada no processo de purificação. Armazenar o pellet a –20 ° C resulta em pouca perda de DNA de plasmídeo e pode aumentar a lise.

Fatores que afetam a qualidade e o rendimento do DNA de plasmídeo

Seleção de cepas bacterianas

A escolha da cepa bacteriana hospedeira pode ter um impacto significativo na qualidade e no rendimento do DNA usando qualquer método de purificação. Recomendamos o uso de cepas hospedeiras, como DH5α ™, JM109 (Cat. # L2005) e XL1-Blue, que contêm mutações no endA gene. E. coli cepas que são listadas como endA1 contém essas mutações.

o endA O gene codifica uma proteína periplasmática de 12kDa chamada endonuclease I. Esta enzima é uma DNase de fita dupla que pode copurificar-se com o DNA do plasmídeo, causando assim degradação potencial. O RNA atua como um inibidor competitivo e altera a especificidade da endonuclease daquela de uma enzima nucleolítica de fita dupla que produz oligonucleotídeos de sete bases para uma nickase que cliva em média uma vez por substrato (35-36). A função da endonuclease I não é totalmente compreendida, e as cepas que apresentam fimAs mutações A1 não têm fenótipo óbvio além da estabilidade melhorada e rendimento do plasmídeo obtido a partir delas.

A expressão da endonuclease I foi caracterizada e foi considerada dependente da fase de crescimento bacteriano (37). Neste estudo, os níveis de endonuclease I foram encontrados para ser mais de 300 vezes maior durante a fase exponencial em comparação com a fase estacionária. Além disso, as composições de mídia que encorajaram o crescimento rápido (por exemplo, altos níveis de glicose e adição de aminoácidos) resultaram em altos níveis de endonuclease I.

Strains that contain the wildtype endonuclease A (endA) gene can yield high-quality, undegraded plasmid DNA if special precautions are used to reduce the probability of nuclease contamination and plasmid degradation (37). Promega has performed a thorough investigation of methods at different points in the purification process to ensure the isolation of high-quality DNA from EndA + (wildtype) bacterial strains. These include: 1) inclusion of an alkaline protease treatment step that degrades nucleases in the Wizard® Mais SV Minipreps DNA Purification System 2) optimization of culture conditions to limit in vivo expression during bacterial growth 3) heat inactivation during and after purification 4) optimization of protocol conditions to limit binding of the nuclease to the resin and 5) post-purification methods to remove endonuclease. These methods and results are summarized in Schoenfeld et al. 1995 (38) and the Wizard® Plus SV Plasmid DNA Purification System Technical Bulletin. Information on genetic markers in bacterial strains can also be found in Ausubel et al. 1989 (33) and Sambrook et al. 1989 (39).

Plasmid Copy Number

One of the most critical factors affecting the yield of plasmid from a given system is the copy number of the plasmid. Copy number is determined primarily by the region of DNA surrounding and including the origin of replication in the plasmid. This area, known as the replicon, controls replication of plasmid DNA by bacterial enzyme complexes. Plasmids derived from pBR322 (Cat.# D1511) contain the ColE1 origin of replication from pMB1. This origin of replication is tightly controlled, resulting in approximately 25 copies of the plasmid per bacterial cell (low copy number). Plasmids derived from pUC contain a mutated version of the ColE1 origin of replication, which results in reduced replication control and approximately 200–700 plasmid copies per cell (high copy number).

Some plasmids contain the p15A origin of replication, which is considered a low-copy-number origin. The presence of the p15A origin of replication allows for replication of that particular plasmid in conjunction with a plasmid containing the ColE1 origin of replication. A compatibility group is defined as a set of plasmids whose members are unable to coexist in the same bacterial cell. They are incompatible because they cannot be distinguished from one another by the bacterial cell at a stage that is essential for plasmid maintenance. The introduction of a new origin, in the form of a second plasmid of the same compatibility group, mimics the result of replication of the resident plasmid. Thus, any further replication is prevented until after the two plasmids have been segregated to different cells to create the correct prereplication copy number (40). Most plasmids provided by Promega, including the pGEM® Vectors, are considered to be high-copy-number. The only exception is the pALTER®-MAX Vectors.

Some DNA sequences, when inserted into a particular vector, can lower the copy number of the plasmid. Furthermore, large DNA inserts can also reduce plasmid copy number. In many cases, the exact copy number of a particular construct will not be known. However, many of these plasmids are derived from a small number of commonly used parent constructs.

Appropriate Sample Size and Throughput

Depending on the volume of the bacterial culture, there are different isolation systems for your needs. For small-volume bacterial cultures of 0.6–3ml, use a system like the PureYield ™ Plasmid Miniprep System (Cat.# A1223, A1222), which gives a plasmid DNA yield of 1.5–7.5μg with an A260/UMA280 ≥1.8 from a 0.6ml overnight bacterial culture with a total biomass (O.D.600 of culture × volume of culture in μl) of 1.3–8.

Figure 16. The Vac-Man® 96 Vacuum Manifold. This 96-well vacuum manifold is used for processing SV 96 plates for plasmid, genomic and PCR product purification.

For larger cultures with volumes ranging from 50–100ml, the PureYield™ Plasmid Midiprep System (Cat.# A2492, A2495, A2496) is a good choice. With this system, a 50ml culture of a high-copy-number plasmid with a total biomass of 100–200 O.D.600 units will yield 100–200µg of plasmid. The PureYield™ Plasmid Maxiprep System (Cat.# A2392, A2393) can isolate plasmid from 100–250ml of culture with yields up to 1mg of plasmid DNA with an A260/A280 >1.7 from 250ml of overnight bacterial culture, transformed with a high-copy-number plasmid.

For high-throughput processing, systems based on a 96-well format can be performed manually with a vacuum manifold (e.g., Vac-Man® 96 Vacuum Manifold Figure 16) using silica membrane technology such as the Wizard® SV 96 Plasmid DNA Purification System (Cat.# A2250, A2255, A2258). Alternatively, an automated liquid-handling workstation can process multiwell plates with MagneSil® PMPs and a 96-well magnet (e.g., MagnaBot® 96 Magnetic Separation Device Figure 17) using the Wizard® MagneSil® Plasmid Purification System (Cat.# A1630, A1631, A1635).

Figure 17. The MagnaBot® 96 Magnetic Separation Device. This 96-well magnet is used for capturing MagneSil® PMPs for DNA purification.

Yields for these systems using high-copy-number plasmid range from 3&ndash5µg for the Wizard® SV 96 Plasmid DNA Purification System and up to 6µg for the Wizard® MagneSil® Plasmid Purification System. Smaller plasmid amounts are helpful for assessing the success of a cloning experiment by PCR or restriction digestion or for use in a coupled transcription/translation system like the TNT® Quick Coupled Transcription/Translation System (Cat.# L1170, L2080).

Biomass Processed

Optical density (O.D.) is the measure of how much light is blocked by the biomass of the bacterial culture in a path length of 1cm. The density of the culture is measured at a wavelength of 600nm and can have a great effect on plasmid isolation success. For example, the Wizard® SV 96 Plasmid Purification System has a maximum biomass recommendation of 4.0 O.D.600 to avoid clogging of the Wizard® SV 96 Lysate Clearing Plate (Cat.# A2241, A2248), so calculating the O.D. of the culture is necessary.

O.D./ml culture = 600nm absorbance reading × dilution factor

For O.D. measurement, a 1:10 dilution is typically used (e.g., 0.1ml culture in 0.9ml culture medium) to keep the reading in the range of 0.1&ndash1.0, where the spectrophotometer is most accurate. For the example above, if the 1:10 dilution reading is 0.15, meaning that each milliliter of culture is 1.5 O.D., no more than 2.67ml culture can be processed (4 O.D. divided by 1.5 O.D./ml = 2.67ml). Exceeding the recommendations of the plasmid purification system may cause clogging or contamination of the system.

Plasmid Purification Method and Transfection

Many plasmid isolation systems indicate they are transfection-quality (e.g., the PureYield&trade Plasmid Systems or the Wizard MagneSil Tfx&trade System, Cat.# A2380). This may be important, as some cultured cells are sensitive to the amount of endotoxin and other contaminants present in the plasmid preparation. Endotoxin is a lipopolysaccharide cell wall component of the outer membrane of Gram-negative bacteria (i.e., all E. coli strains) that can copurify with the plasmid DNA regardless of the purification system used. The amount of this molecule varies by bacterial strain, growth conditions and isolation method. In the PureYield&trade Plasmid Systems, there is an Endotoxin Removal Wash solution that reduces the amount of endotoxin, proteins and other contaminants eluted with the plasmid DNA. For many common cell lines, like 293 and HeLa, the amount of endotoxin present for routine transfections has a minimal effect on the efficiency of transfection (41).

Many factors influence transfection efficiency and/or cellular death including the type and amount of transfection reagent, cell confluency, DNA amount and incubation time with the reagent:DNA complex. Each of these factors will need to be optimized for each cell line-plasmid combination transfected in order to minimize cell death and maximize transfection efficiency. In our experience, transfection experiments with HeLa and NIH/3T3 cells demonstrated that there was little DNA preparation difference with four different plasmid isolation systems used (based on silica membrane, anion exchange and silica resin) when comparing efficiencies using the same transfection reagent. However, the transfection reagent used for DNA uptake had a significant effect on transfection efficiency and cell death. For general considerations for optimization, consult our Transfection guide.

Silica Column-Based Systems

Promega products like the Wizard® Mais SV Minipreps DNA Purification System (Cat.# A1330, A1460, A1465) and the PureYield&trade Plasmid Systems combine the benefits of alkaline lysis with the rapid and easy purification by silica. This is done by using a silica-based membrane in a column format to bind the plasmid DNA contained in the cleared alkaline lysates. Purification is based on selective adsorption of DNA to the silica membrane in the presence of high concentrations of chaotropic salts, washes to efficiently remove contaminants, and elution of the DNA with low-salt solutions such as TE buffer or water.

Purified plasmid DNA is used in many applications from preparing vectors for cloning to generating templates for transcription or coupled transcription/translation reactions. The silica-based purification systems from Promega minimize the amount of salts and other impurities carried over during isolation, which can negatively affect downstream applications, lower yield or prevent enzyme systems from synthesizing the product of interest.

PureYield&trade Plasmid Systems

The PureYield&trade Plasmid Systems isolates high-quality plasmid DNA for use in eukaryotic transfection and in vitro expression experiments. The unique reagents, proprietary matrix and silica membrane-based design of the PureYield&trade Systems greatly reduces the amount of time spent on purification compared to silica resin or other membrane-column methods. While the unique Endotoxin Removal Wash removes protein, RNA and endotoxin contaminants from the bound DNA, the Column Wash Solution followed by membrane drying eliminates salts and alcohols from the plasmid prep, allowing the purified plasmid to be used for highly sensitive applications such as transfection, in vitro transcription and coupled in vitro transcription/translation. An additional benefit is that the same degree of purification can be obtained even with low-copy-number plasmids. Although the system works best for plasmids less than 10kb, plasmids as large as 18kb have been purified.

The unique combination of reagents in the PureYield&trade Plasmid Miniprep System purifies plasmid either directly from 0.6ml of bacterial culture or cell pellets from up to 3ml of cell culture (Figure 18). A typical overnight culture is grown in LB medium for 16&ndash18 hours. If the cell pellet method is chosen, cells are harvested by centrifugation, then resuspended in 600&mul of TE buffer or water. Purifying DNA directly from bacterial culture takes less than 10 minutes with elution volumes as low as 30&mul, resulting in more concentrated plasmid DNA. The low elution volume is possible because the column design retains virtually no buffer. A transfection comparison of plasmid isolated using the PureYield&trade Plasmid Miniprep System in various cell lines can be found in Figure 19.

Figure 18. The PureYield™ Plasmid Miniprep System yields transfection-quality DNA in approximately 10 minutes.

To isolate larger quantities of high-quality plasmid DNA, use the PureYield™ Plasmid Midiprep System. This plasmid midiprep system is designed to purify 100–200µg of plasmid DNA with an A260/A280 >1.7 from a 50ml overnight culture of bacteria in as little as 30 minutes, if the culture is grown with a high-copy-number plasmid, reaching a total optical density (O.D.600 of culture × volume of culture) of 100–200. Larger volumes up to 250ml can be processed, but require greater volumes of solutions than that supplied with the PureYield™ Plasmid Midiprep System.

Figure 19. Plasmid DNA prepared using the PureYield™ Plasmid Miniprep System consistently works well in transfection experiments. The pGL4.13[luc2/SV40] Vector (Cat.# E6681) was prepared using a competing system or the PureYield™ Plasmid Miniprep System. Five different commonly used mammalian cell lines were transfected with the plasmid, and transfection efficiency was assessed by measuring the luciferase activity using the ONE-Glo™ Luciferase Assay System (Cat.# E6110 n = 6).

The PureYield&trade Plasmid Midiprep System is designed for purification by vacuum using a manifold such as the Vac-Man® Laboratory Vacuum Manifold (Cat.# A7231), but there are alternative protocols that use all centrifugation or both vacuum and centrifugation. All protocols generate high-quality purified plasmid DNA. A swinging-bucket tabletop centrifuge or the Eluator&trade Vacuum Elution Device (Cat.# A1071) is required for the final elution step regardless of the protocol chosen.

For a larger plasmid isolation capacity, the PureYield&trade Plasmid Maxiprep System is able to purify up to 1mg of plasmid DNA with an A260/A280 >1.7 from 250ml of overnight bacterial culture, transformed with a high-copy-number plasmid in approximately 60 minutes. As with the midiprep system, the protocol requires a vacuum pump and manifold (e.g., the Vac-Man® Laboratory Vacuum Manifold, 20-sample), a centrifuge with a fixed-angle rotor for lysate clearing and either a tabletop centrifuge with a swinging bucket rotor or the Eluator&trade Vacuum Elution Device for the final elution step.

Wizard® SV Column-Based Systems

High-quality, purified plasmids are used for automated fluorescent DNA sequencing as well as for other standard molecular biology techniques including restriction enzyme digestion and PCR. Whether you are isolating a few samples or a 96-well plate, there is a silica membrane-based system available.

For manual purification, the Wizard® Mais SV Minipreps DNA Purification System provides a simple and reliable method for rapid isolation of plasmid DNA using a column-based silica membrane (see Figure 20 for overview of method). The entire miniprep procedure can be completed in 30 minutes or less, depending on the number of samples processed. The plasmid DNA from 1&ndash10ml of overnight E. coli culture can be purified by using either a vacuum manifold like the Vac-Man® Laboratory Vacuum Manifold (process up to 20 samples) or a microcentrifuge (number of samples processed depends on rotor size).

This system can be used to isolate any plasmid hosted in E. coli but works most efficiently when the plasmid is less than 20,000bp in size. The yield of plasmid will vary depending on a number of factors, including the volume of bacterial culture, plasmid copy number, type of culture medium and the bacterial strain used as discussed in Factors that Affect Plasmid DNA Quality and Yield. The DNA binding capacity of the SV membrane is up to 20µg of high-quality plasmid DNA. An alkaline protease treatment step in the isolation procedure improves plasmid quality by digesting proteins like endonuclease I.

Figure 20. Overview of the Wizard® Mais SV Minipreps DNA Purification System centrifugation protocol.

To process more samples at once, consider using the 96-well format of the Wizard® SV 96 and SV 9600 Plasmid DNA Purification Systems. These high-throughput systems provide a simple and reliable method for the rapid isolation of plasmid DNA using a silica-membrane 96-well plate. A single plate can be processed in 60 minutes or less. The Wizard® SV 96 and SV 9600 Systems are designed for use either in a manual format or with automated instruments.

To use the Wizard® SV 96 and SV 9600 Systems, a vacuum manifold (e.g., Vac-Man® 96 Vacuum Manifold) and a vacuum pump capable of generating 15&ndash20 inches of mercury or equivalent with a vacuum trap is needed for sample processing. Figure 14 shows the Vac-Man® 96 Manifold set up for purification.

Magnetic-Based

For automated, high-throughput plasmid purification, use our MagneSil® paramagnetic particle (PMP)-based systems that yield purified plasmid, which can be used directly for automated fluorescent DNA sequencing, as well as for other standard molecular biology techniques including restriction enzyme digestion and PCR.

Ideal for use with automated platforms, the silica-coated MagneSil® PMP systems are also easily scalable for larger volumes or multiwell format. For plasmid miniprep purification, the MagneSil® PMPs are used for both lysate clearing and DNA binding, eliminating the need for centrifugation or vacuum filtration, as the binding of nucleic acids occurs in solution. The particles are also completely resuspended during the wash steps of a purification protocol, enhancing the removal of impurities from the DNA.

The Wizard® MagneSil® Plasmid DNA Purification System provides a simple and reliable method for the rapid isolation of plasmid DNA in a multiwell format. The purification procedure uses MagneSil® PMPs for lysate clearing as well as DNA capture, circumventing the need for centrifugation or vacuum filtration. The MagnaBot® 96 Magnetic Separation Device is needed for plasmid purification. The protocol also requires a multiwell plate shaker. This protocol has been optimized using the Micro Mix 5 shaker on the Beckman Coulter Biomek® 2000.

The Wizard MagneSil Tfx&trade System provides a simple and reliable method for the rapid isolation of transfection-quality plasmid DNA in a multi-well format. DNA purified with using this system is greatly reduced in chemical contaminants as well as RNA, protein, and endotoxin, providing high-quality plasmid DNA suitable for transfection, as well as for other standard molecular biology techniques. Like the Wizard® MagneSil® Plasmid DNA Purification System, the Wizard MagneSil Tfx&trade System uses MagneSil® PMPs for lysate clearing as well as DNA capture. In addition, a proprietary paramagnetic endotoxin removal resin reduces the level of endotoxin present in the purified plasmid DNA.

By avoiding the need for centrifugation or vacuum filtration, DNA purification with the Wizard MagneSil Tfx&trade System can be completely automated, requiring the MagnaBot® 96 Magnetic Separation Device and Heat Transfer Block (Cat.# Z3271) for the protocol. An automated method for the Wizard MagneSil Tfx&trade System has been developed for the Biomek® FX robotic workstation. The procedure requires no manual intervention and takes approximately 45 minutes to process a single 96-well plate. This automated protocol also can be adapted to other robotic workstations.

Plasmid Purification Kit Comparison

Compare plasmid DNA prep kits to find the purification solution that is right for you.


Washing the Immunoprecipitate

After immunoprecipitation, the antibodies, beads, and protein A or G often have biomolecules associated with their surfaces that are not related to antigen recognition. It is therefore necessary to perform a series of wash steps with ChIP-specific buffers to remove nonspecific chromatin, protein, and nucleic acids from your immunoprecipitate, because these nonspecific components can significantly increase background signals, produce high variability, and contribute to failure of the ChIP assay. In some cases, multiple buffers (for example, high salt, low salt, lithium chloride, and stringent TE wash), or buffers of increasing stringency, are used to reduce binding of nonspecific molecules.

Other protocols involve simpler buffer systems. Regardless of the wash methods you use, you should use consistent wash conditions: maintain consistent buffer temperatures, wash incubation times, and rotation speeds of any apparatus used for washing. In certain cases, background signals may be reduced by increasing the number of washes, although significant improvement of ChIP signals is ultimately determined by the quality of your ChIP antibody and the nature of your ChIP target.


How to prepare 1X TE buffer

  • Our stock solution is 10X which means the total concentration of the stock solution is 10 times more than the working solution.
  • Hence for preparation of 1X TE buffer, we have to take 1 ml of stock buffer and add 9ml of D/W.
  • This will make a 1X working solution from a 10X stock solution.
  • 10mM Tris HCL and 1mM EDTA will make directly the 1X of working solution.
  • In order to achieve a good quality of results please autoclave the TE buffer solution before use.

Alternatively, the DNA can also be dissolved in water. However, the chance of acid hydrolysis is high in water (because water is slightly acidic) which can be prevented by storing DNA into the TE buffer.

So the TE buffer is the best nucleic acid storing solution apart from all other solutions.

Some of the interesting articles:


Conclusões

We developed a protocol to assess the adsorption and elution of DNA from silica particles while emulating POC DNA extraction conditions for samples containing ≤ 1 μg DNA. Controlling for presence of a chaotrope, DNA adsorption increased with increasing acidity of the aqueous adsorption solution. Adsorption was further enhanced by adding 5 M GuSCN to the adsorption solution. Elutions exceeded 30% DNA recovery only when DNA was adsorbed at pH 5.2 with 5 M GuSCN for inputs of ≥ 100 ng net DNA. Adsorption at pH 3 resulted in DNA-silica-chaotrope complex that was too strong for buffer EB to disrupt effectively, while adsorption at pH 8 was not strong enough for DNA to adsorb sufficiently. Due to the poor recover of DNA with buffer EB at pH 3, we attempted to disrupt DNA-silica-chaotrope complex by varying the eluting solution. Hot formamide and 1 M NaOH resulted in increased recovery of 27.5% and 71.9% respectively, leading to the conclusion that the interaction was dominated by hydrophobic interactions and hydrogen bonding. However, neither of these buffers is practical for POC use. The optimal adsorption condition for POC use studied here was achieved using pH 3 with 5 M GuSCN resulting in up to 99.998% DNA adsorbed, while the optimal DNA recovery with buffer EB was 53.5% DNA using pH 5.2 with 5 M GuSCN. As our knowledge of these interactions improve, so will the range of clinical applications for this technology.


DNA pellets not dissolving and stuck to sides of the tube after ethanol precip??

So after doing some spin column extractions on old tissues that were never stored properly, I found that a lot of my extracts had really low concentrations with the Qubit and decided to do an ethanol precip (3x 100% EtOH + 0.1x 3M NaAC, freeze overnight at -20 or less time in -80, spin, wash with 1 mL 70% EtOH, spin, aspirate EtOH, dry, and then rehydrate in nuclease free water) to see if I could raise it enough for NextGen sequencing.

It looks like in some tubes, there is a visible DNA pellet, and in some tubes, there are tiny white splotches all over the side of the tube, esp under the hinge, which I always point out of the centrifuge. The problem here is that the DNA won't dissolve in nuclease free water! I've tried Qubiting just the liquid water, and it does have a DNA concentration, but I've also tried taking the 2 uL from right next to the pellet (sometimes even sucking up a little bit of the pellet) and when I do, there's a significantly higher concentration. The data shows I'm losing a lot of DNA when I do this (more than weɽ normally expect, I think) so I think a lot of my DNA is sequestered in those damn pellets. How do I get it back.


Resumo

A rectrospective study was conducted on the effect of the long term storage of 122 DNA samples resuspended in water, one of the elution media still suggested by well established protocols. These DNA samples come from four different kinds of forensically relevant samples (saliva swabs, FTA card bloodstains, nails and II° World War bones) extracted in 2008–2018 and stored at – 20 °C (n = 113 of groups #1-#5) and at +4 °C (n = 9 of the group #6), respectively. At the time of the present study (2019), quantitative PCR (qPCR) was employed as tool for assessing the degradation of the samples. The employment of the Human Quantifiler Kit showed that the median loss of DNA ranged from 17.8% to 66.6% in groups #1-#5 while it was 85.0% in group #6. However, it is likely that these values represent an underestimation due to the shortness of the qPCR probe (62 bp). Noteworthy, the DNA loss was statistically significant in each of the six groups (p values ≤ 0.0167). Thus, in agreement with the data on spontaneous DNA decay, no forensic DNA sample should be stored in water for long term periods. In conclusion, the results of this technical note warn against the use of water for this purpose.


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