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DNA polimerase eucariótica na cadeia principal e retardadora

DNA polimerase eucariótica na cadeia principal e retardadora



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Livros diferentes afirmam especificações diferentes em que DNA polimerase eucariótica atua na fita principal e qual DNA polimerase atua na fita retardada.

TL, DR: Qual é a realidade? e se houver múltiplas possibilidades, então qual é aplicável para qual organismo (como mamífero humano, fungo de levedura, Arabidopsis planta etc.)?

Informações muito variadas, como,

De acordo com o livro The Cell de G.M. Cooper (NCBI), no sistema eucariótico de mamíferos, A DNA polimerase δ atua tanto na fita principal quanto na tardia.

De acordo com o livro Molecular biology de R. F. Weaver, ed-5; DNA pol- δ funciona na fita retardada e pol ε funciona na fita retardada e DNA pol ε trabalham na fita principal.

Fundamentos de biologia molecular, Lizabeth Allison (Semantic Scholar) diz outra coisa, diz que pol ε funciona na fita retardada.

O artigo de Stillman B., DNA polimerases na forquilha de replicação em eucariotos. (NCBI) (NCBI-PMC) (FIGURA) diz que no modelo viral SV40 a δ polimerase atua em ambas as fitas, mas no cromossomo celular, δ atua no lagging e & epsilon na fita principal.

Agora, qual é a verdade? se todas forem verdadeiras, elas se aplicam a organismos diferentes?


  • Durante a iniciação, as proteínas se ligam à origem da replicação enquanto a helicase desenrola a hélice do DNA e duas forquilhas de replicação são formadas na origem da replicação.
  • Durante o alongamento, uma sequência de iniciador é adicionada com nucleotídeos de RNA complementares, que são então substituídos por nucleotídeos de DNA.
  • Durante o alongamento, o fio dianteiro é feito continuamente, enquanto o fio retardado é feito em pedaços chamados fragmentos de Okazaki.
  • Durante a terminação, os primers são removidos e substituídos por novos nucleotídeos de DNA e o esqueleto é selado por DNA ligase.
  • origem de replicação: uma sequência particular em um genoma em que a replicação é iniciada
  • fio condutor: a fita modelo da dupla hélice de DNA que é orientada de modo que a bifurcação de replicação se mova ao longo dela na direção 3ª a 5ª
  • fio retardado: a fita da dupla hélice do DNA modelo que é orientada de modo que a bifurcação de replicação se mova ao longo dela de maneira 5ª a 3ª

Como os genomas eucarióticos são bastante complexos, a replicação do DNA é um processo muito complicado que envolve várias enzimas e outras proteínas. Ocorre em três estágios principais: iniciação, alongamento e término.


Organização de polimerases de DNA nuclear eucariótico para replicação: interações específicas com proteínas acessórias organizam Pols α, δ e ϵ no replissomo para replicação de DNA de fita principal e fita retardada

Estudos bioquímicos e de microscopia crioeletrônica acabam de ser publicados revelando interações entre proteínas do replissomo de levedura que são importantes para a síntese altamente coordenada das duas fitas de DNA do genoma nuclear. Esses estudos revelam as principais interações importantes para organizar as DNA polimerases α, δ e ϵ para a replicação da fita principal e posterior. A helicase CMG (Mcm2-7, Cdc45, GINS) é central para esta rede de interação. Estes são apenas os exemplos mais recentes de elegantes estudos realizados no passado recente que levam a uma compreensão muito melhor de como a forquilha de replicação eucariótica alcança uma replicação eficiente de DNA que é precisa o suficiente para prevenir doenças, mas permite a evolução.

Palavras-chave: DNA polimerases replicação de DNA microscopia crioeletrônica iniciação de replissomo de replicação.

Funcionários do governo dos Estados Unidos contribuíram com este artigo e seu trabalho é de domínio público nos Estados Unidos.


Biologia 171

Ao final desta seção, você será capaz de fazer o seguinte:

  • Discuta as semelhanças e diferenças entre a replicação do DNA em eucariotos e procariotos
  • Declare o papel da telomerase na replicação do DNA

Os genomas eucarióticos são muito mais complexos e maiores em tamanho do que os genomas procarióticos. Os eucariotos também têm vários cromossomos lineares diferentes. O genoma humano tem 3 bilhões de pares de bases por conjunto haplóide de cromossomos e 6 bilhões de pares de bases são replicados durante a fase S do ciclo celular. Existem múltiplas origens de replicação em cada cromossomo eucariótico, os humanos podem ter até 100.000 origens de replicação em todo o genoma. A taxa de replicação é de aproximadamente 100 nucleotídeos por segundo, muito mais lenta do que a replicação procariótica. Na levedura, que é um eucarioto, sequências especiais conhecidas como sequências de replicação autônoma (ARS) são encontradas nos cromossomos. Estes são equivalentes à origem de replicação em E. coli.

O número de DNA polimerases em eucariotos é muito maior do que em procariotos: 14 são conhecidos, dos quais cinco são conhecidos por terem papéis principais durante a replicação e foram bem estudados. Eles são conhecidos como pol α, pol β, pol γ, pol δ, e pol ε.

As etapas essenciais de replicação são as mesmas dos procariotos. Antes que a replicação possa começar, o DNA deve ser disponibilizado como um modelo. O DNA eucariótico é ligado a proteínas básicas conhecidas como histonas para formar estruturas chamadas nucleossomos. As histonas devem ser removidas e substituídas durante o processo de replicação, o que ajuda a explicar a taxa de replicação mais baixa em eucariotos. A cromatina (o complexo entre DNA e proteínas) pode sofrer algumas modificações químicas, de modo que o DNA pode ser capaz de deslizar para fora das proteínas ou ser acessível às enzimas do mecanismo de replicação do DNA. Na origem da replicação, um complexo de pré-replicação é feito com outras proteínas iniciadoras. Helicase e outras proteínas são então recrutadas para iniciar o processo de replicação ((Figura)).

Diferença entre replicação procariótica e eucariótica
Propriedade Procariontes Eucariotos
Origem de replicação Solteiro Múltiplo
Taxa de replicação 1000 nucleotídeos / s 50 a 100 nucleotídeos / s
Tipos de DNA polimerase 5 14
Telomerase Não presente Presente
Remoção de primer de RNA DNA pol I RNase H
Alongamento do fio DNA pol III Pol α, pol δ, pol ε
Grampo deslizante Grampo deslizante PCNA

Uma helicase usando a energia da hidrólise do ATP abre a hélice do DNA. Bifurcações de replicação são formadas em cada origem de replicação conforme o DNA se desenrola. A abertura da dupla hélice causa enrolamento excessivo, ou superenrolamento, no DNA antes da bifurcação de replicação. Estes são resolvidos com a ação de topoisomerases. Os primers são formados pela enzima primase e, usando o primer, o DNA pol pode iniciar a síntese. Três principais DNA polimerases estão então envolvidas: α, δ e ε. O DNA pol α adiciona um fragmento de DNA curto (20 a 30 nucleotídeos) ao primer de RNA em ambas as fitas e, em seguida, transfere-se para uma segunda polimerase. Enquanto a fita principal é continuamente sintetizada pela enzima pol δ, a fita retardada é sintetizada por pol ε. Uma proteína de grampo deslizante conhecida como PCNA (antígeno nuclear de célula em proliferação) mantém o DNA pol no lugar para que ele não deslize para fora do DNA. À medida que pol δ corre para o RNA do primer na fita retardada, ele o desloca do molde de DNA. O primer deslocado de RNA é então removido por RNase H (AKA flap endonuclease) e substituído por nucleotídeos de DNA. Os fragmentos de Okazaki na fita retardada são unidos após a substituição dos primers de RNA por DNA. As lacunas que permanecem são seladas pela DNA ligase, que forma a ligação fosfodiéster.

Replicação de telômero

Ao contrário dos cromossomos procarióticos, os cromossomos eucarióticos são lineares. Como você aprendeu, a enzima DNA pol pode adicionar nucleotídeos apenas na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Na fita principal, a síntese continua até que o final do cromossomo seja alcançado. Na fita retardada, o DNA é sintetizado em trechos curtos, cada um dos quais é iniciado por um primer separado. Quando a bifurcação de replicação atinge o final do cromossomo linear, não há como substituir o primer na extremidade 5 'da fita retardada. O DNA nas extremidades do cromossomo, portanto, permanece desemparelhado e, ao longo do tempo, essas extremidades são chamadas de telômeros, pode ficar progressivamente mais curto à medida que as células continuam a se dividir.

Os telômeros compreendem sequências repetitivas que não codificam para nenhum gene em particular. Em humanos, uma sequência de seis pares de bases, TTAGGG, é repetida de 100 a 1000 vezes nas regiões dos telômeros. De certa forma, esses telômeros protegem os genes de serem excluídos conforme as células continuam a se dividir. Os telômeros são adicionados às extremidades dos cromossomos por uma enzima separada, a telomerase ((Figura)), cuja descoberta ajudou na compreensão de como essas extremidades cromossômicas repetitivas são mantidas. A enzima telomerase contém uma parte catalítica e um modelo de RNA embutido. Ele se liga ao final do cromossomo e os nucleotídeos de DNA complementares ao modelo de RNA são adicionados na extremidade 3 e # 8242 da fita de DNA. Uma vez que a extremidade 3 & # 8242 do modelo de fita retardada é suficientemente alongada, a DNA polimerase pode adicionar os nucleotídeos complementares às extremidades dos cromossomos. Assim, as extremidades dos cromossomos são replicadas.


A telomerase é normalmente ativa em células germinativas e células-tronco adultas. Não é ativo em células somáticas adultas. Por sua descoberta da telomerase e sua ação, Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider e Jack W. Szostak ((Figura)) receberam o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 2009.


Telomerase e envelhecimento

As células que sofrem divisão celular continuam a ter seus telômeros encurtados porque a maioria das células somáticas não produz telomerase. Isso significa essencialmente que o encurtamento do telômero está associado ao envelhecimento. Com o advento da medicina moderna, cuidados preventivos de saúde e estilos de vida mais saudáveis, a expectativa de vida humana aumentou e há uma demanda crescente para que as pessoas pareçam mais jovens e tenham uma melhor qualidade de vida à medida que envelhecem.

Em 2010, os cientistas descobriram que a telomerase pode reverter algumas condições relacionadas à idade em ratos. Isso pode ter potencial na medicina regenerativa. 1 Camundongos com deficiência de telomerase foram usados ​​nesses estudos, esses camundongos apresentam atrofia do tecido, depleção de células-tronco, falha do sistema de órgãos e respostas prejudicadas à lesão do tecido. A reativação da telomerase nesses camundongos causou extensão dos telômeros, reduziu o dano ao DNA, reverteu a neurodegeneração e melhorou a função dos testículos, baço e intestinos. Assim, a reativação dos telômeros pode ter potencial para o tratamento de doenças relacionadas à idade em humanos.

O câncer é caracterizado pela divisão celular descontrolada de células anormais. As células acumulam mutações, proliferam incontrolavelmente e podem migrar para diferentes partes do corpo por meio de um processo chamado metástase. Os cientistas observaram que as células cancerosas têm telômeros consideravelmente encurtados e que a telomerase está ativa nessas células. Curiosamente, somente depois que os telômeros foram encurtados nas células cancerosas é que a telomerase se tornou ativa. Se a ação da telomerase nessas células pode ser inibida por drogas durante a terapia do câncer, então as células cancerosas poderiam ser potencialmente impedidas de divisão posterior.

Resumo da Seção

A replicação em eucariotos começa em várias origens de replicação. O mecanismo é bastante semelhante ao dos procariontes. Um primer é necessário para iniciar a síntese, que é então estendida pela DNA polimerase à medida que adiciona nucleotídeos um a um à cadeia crescente. O filamento principal é sintetizado continuamente, enquanto o filamento posterior é sintetizado em trechos curtos chamados fragmentos de Okazaki. Os primers de RNA são substituídos por nucleotídeos de DNA, os fragmentos de DNA Okazaki são ligados em uma fita contínua pela DNA ligase. As extremidades dos cromossomos representam um problema, pois o RNA primer nas extremidades 5 'do DNA não pode ser substituído por DNA, e o cromossomo é progressivamente encurtado. A telomerase, uma enzima com um molde de RNA embutido, estende as extremidades copiando o molde de RNA e estendendo uma fita do cromossomo. A DNA polimerase pode então preencher a fita complementar de DNA usando as enzimas de replicação regulares. Dessa forma, as extremidades dos cromossomos são protegidas.

Resposta livre

Como os cromossomos lineares em eucariotos garantem que suas extremidades sejam replicadas completamente?

A telomerase tem um modelo de RNA embutido que estende a extremidade 3 e # 8242, então o primer é sintetizado e estendido. Assim, os fins são protegidos.

Notas de rodapé

    Jaskelioff et al., "A reativação da telomerase reverte a degeneração do tecido em ratos idosos deficientes em telomerase", Natureza 469 (2011): 102-7.

Glossário


Diferenças entre vertente principal e posterior

Qual é a diferença entre fio condutor e fio retardado? A enzima DNA polimerase sintetiza uma nova fita em peça contínua na direção 5 & # 8242-3 & # 8242 e é chamada de fita principal, requer apenas um primer para iniciar o crescimento e a enzima DNA ligase não é necessária e se formou continuamente como um único fragmento. No entanto, a enzima DNA polimerase sintetiza uma nova fita em peça descontínua na direção 5 & # 8242-3 & # 8242 e é chamada de fita retardada, no início é formada na forma de um pequeno fragmento chamado fragmentos de okazaki, cada fragmento requer primer de RNA separado para iniciar e exigir a enzima DNA ligase para unir todos os fragmentos.

Diferenças entre vertente principal e atrasada

Agora, explicamos resumidamente a diferença entre a vertente principal e posterior em seguir direto ao ponto: -

Cordão principal: -
1) é formado continuamente na direção 5 & # 8242-3 & # 8242 em um único fragmento

2) requer apenas um primer para iniciar o crescimento

3) A enzima DNA ligase não é necessária para esta fita

4) a direção de crescimento da fita principal é 5 & # 8242-3 & # 8242.

Fio retardado: -
1) no início é formado na forma de um pequeno fragmento denominado fragmentos de okazaki

2) cada fragmento requer primer de RNA separado para iniciar

3) é necessária a enzima DNA ligase para unir fragmentos de DNA

4) da fita completa é 3 & # 8242-5 & # 8242 na direção, porém para o fragmento okazaki é na direção 5 & # 8242- 3 & # 8242.


4. REPLICAÇÃO DE STRAND LÍDER

4.1. O CMG DNA Helicase

Nos últimos anos, os estudos bioquímicos da replicação do DNA têm mostrado grande progresso. De fato, em 2015, a reconstituição completa da iniciação e alongamento da replicação do DNA foi relatada com proteínas purificadas de levedura (5). Nesta seção, vamos nos concentrar na função da replicase de fita principal que consiste na helicase CMG e Pol & # x003b5. A iniciação da replicação do DNA está associada ao rearranjo da helicase central Mcm2-7 de uma forma inativa que circunda o dsDNA para a de uma helicase ativa, que circunda o ssDNA e desenrola o dsDNA parental usando a energia da hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) (Figura 1) . Várias linhas de evidência apóiam a localização do núcleo MCM em torno da fita principal. O complexo CMG está associado à cadeia principal Pol & # x003b5, tornando plausível sua associação com a fita principal (13, 14). CMG é uma helicase 3 & # x02032-5 & # x02032 em substratos de DNA modelo (20), assim como a helicase de arquea MCM homóloga (68, 69). Essa direcionalidade colocaria o complexo na fita principal ao se mover na direção da bifurcação. Além disso, os bloqueios de estrada da fita atrasada, mas não os bloqueios de estrada da fita principal, são contornados pela helicase CMG, sugerindo uma forte associação com a fita principal (70).

Embora as estruturas de raios-X e crio & # x02013 microscopia eletrônica (crio-EM) estejam disponíveis para cada um dos três subconjuntos do CMG por algum tempo (ver referências em 71, 72), dois novos estudos empolgantes produziram crio- Estruturas EM do complexo CMG. Ambos os estudos revelam um arranjo geral semelhante dos três subconjuntos & # x02014Mcm2-7, Cdc45 e GINS & # x02014, fornecendo novas informações sobre a organização da replicase de fita principal. A estrutura do CMG de levedura foi obtida sem DNA com resolução de 3,7 & # x020134,8 & # x000c5 (73). Esses dados crio-EM são consistentes com a presença de dois conformadores diferentes, uma forma compacta e uma forma estendida. A conversão da forma estendida para a forma compacta após a ligação de ATP é proposta para ser associada ao movimento dos seis domínios AAA + do núcleo Mcm2-7, embora a hidrólise do ATP reverta esse movimento, permitindo que a helicase CMG se mova ao longo do ssDNA em uma lagarta movimento. Uma segunda estrutura crio-EM, do Drosófila Complexo CMG, foi obtido na presença de uma molécula parcialmente dsDNA que mimetiza uma forquilha de replicação estável (74). Novamente, dois conformadores principais foram obtidos, uma forma compacta com resolução de 7,4 & # x000c5 e uma forma relaxada com resolução de 9,8 & # x000c5. Na forma compacta, a porção ssDNA do DNA pode ser visualizada para passar pelo anel Mcm2-7, apoiando as conclusões de estudos anteriores de que o CMG circunda a fita principal. A segunda estrutura relaxada não tem densidade de DNA no núcleo e mostra uma lacuna entre as subunidades Mcm2 e Mcm5. Curiosamente, tanto o carregamento inicial do complexo MCM em torno do dsDNA quanto a conversão subsequente para aquela de uma helicase ativa em torno do ssDNA são propostas para serem mediadas por uma abertura entre as subunidades Mcm2 e Mcm5 (75, 76). A forma compacta de CMG predomina na presença de adenosina não hidrolisável 5 & # x02032-& # x003b3-tio-trifosfato (ATP& # x003b3S), enquanto a forma relaxada predomina na presença de ATP. A última forma provavelmente representa uma estrutura na qual o ATP foi hidrolisado, apoiando um modelo no qual a hidrólise do ATP converteria a forma compacta em uma forma relaxada. Curiosamente, essa mudança conformacional está associada apenas com o movimento mínimo de alongamento do CMG, que foi observado com o CMG de levedura e formou a base para um modelo de lagarta para a ação da helicase (73). Essas novas estruturas do complexo CMG são apenas o começo de uma nova direção para a biofísica dos estudos de replicação do DNA auxiliados por estudos crio-EM.

4.2. DNA polimerase & # x003b5 e Replicação de DNA de cadeia principal

As três DNA polimerases replicativas, & # x003b1, & # x003b4, e & # x003b5, são membros da família B de polimerases de DNA. Uma revisão completa dessas enzimas está fora do escopo desta revisão, e o leitor pode consultar revisões abrangentes recentes que discutem a estrutura e a função de Pol & # x003b1, Pol & # x003b4 e Pol & # x003b5 e suas relações evolutivas (77, 78). Outra revisão recente descreve a consequência das mutações da polimerase replicativa na disposição do câncer em humanos (79). Nesta seção, consideramos brevemente as propriedades que predispõem essas polimerases a replicar as duas fitas do genoma nuclear (Figura 3).

Replicases de DNA eucariótico. DNA polimerase & # x003b1 (Pol & # x003b1, vermelho ) e Pol & # x003b5 ( verde) contém quatro subunidades e Saccharomyces cerevisiae Pol & # x003b4 (azul) contém três subunidades, enquanto Pol & # x003b4and humana Schizosaccharomyces pombe Pol & # x003b4 tem uma pequena quarta subunidade adicional (não mostrada). Os aglomerados de enxofre demonstrados [4Fe & # x020134S] & # x02013 são indicados com grandes bolas laranja e átomos de zinco ligados com pequenas bolas cinza. Propriedades catalíticas e interações de proteína e # x02013proteína são listadas. Observe que Pol & # x003b4 tem uma alta fidelidade para incompatibilidades de base & # x02013base, mas baixa fidelidade para deleções de nucleotídeo único em sequências repetitivas. Abreviaturas: GINS, Sld5, Psf1, Psf2 e complexo Psf3 n.d., PCNA não determinado, antígeno nuclear de proliferação celular.

As propriedades de Pol & # x003b5 são diferenciados daqueles de Pol & # x003b1 e Pol & # x003b4 de várias maneiras. Pol & # x003b5 tem uma subunidade de alto peso molecular cujo domínio N-terminal codifica a polimerização de DNA e 3 & # x02032-atividade exonucleolítica e um domínio C-terminal (CTD) homólogo, mas cataliticamente inativo, que é necessário para a montagem replissoma e ativação de checkpoint (55 & # x0201359, 80, 81). A forma holoenzima de Pol & # x003b5 também contém uma subunidade Dpb2 não catalítica que é essencial e as subunidades Dpb3 e Dpb4 que não são essenciais (82). A presença de um pequeno domínio na subunidade catalítica permite que Pol & # x003b5 para circundar o dsDNA nascente (83), que é provavelmente responsável pela alta processabilidade intrínseca desta enzima. Esta alta processabilidade é aumentada ainda mais pelas subunidades Dpb3 e Dpb4 não essenciais e por meio de interações com o clamp de replicação PCNA. Em contraste, a muito baixa processabilidade intrínseca da síntese de DNA por Pol & # x003b4 é amplamente aumentada por PCNA, de modo que na presença de PCNA ambos Pol & # x003b5 e Pol & # x003b4 têm processividades comparáveis ​​(84).

A capacidade de síntese por deslocamento da fita pela DNA polimerase da fita retardada é essencial para a maturação eficiente dos fragmentos de Okazaki na fita retardada. Comparado com Pol & # x003b4, Pol & # x003b5 não realiza síntese de deslocamento de fita eficiente (85). Em grande medida, isso é uma consequência de sua atividade 3 & # x02032-exonuclease muito ativa, uma vez que a síntese por deslocamento de fita é observada na enzima exonuclease defeituosa (86). A atividade intrínseca 3 & # x02032-exonuclease de Pol & # x003b5 revisa seus próprios erros de replicação (87), e faz isso tão eficientemente que Pol & # x003b5 sintetiza DNA com mais precisão do que Pol & # x003b4 com proficiência em revisão e muito mais precisão do que Pol & # x003b1 com deficiência em revisão. Felizmente, essa fidelidade mais baixa na fita em atraso é contrabalançada por um reparo de incompatibilidade mais ativo nessa fita (64). Assim, a falta de capacidade de deslocamento dos fios faz com que Pol & # x003b5 menos adequado para servir como a replicase de fita retardada. Em contraste, suas interações com vários componentes do complexo CMG causam seu direcionamento exclusivo para a fita principal da bifurcação de replicação (Figura 3). Estudos bioquímicos e genéticos anteriores estabeleceram uma interação essencial entre a subunidade Dpb2 de Pol & # x003b5 e a subunidade Psf1 de GINS (14). Um estudo crio-EM de baixa resolução da helicase CMG em um complexo com Pol & # x003b5 é consistente com essas interações, e essa estrutura revelou interações adicionais entre Mcm5 e a metade C-terminal de Pol2 (88). O significado funcional dessas interações com Pol & # x003b5 é apoiado por estudos bioquímicos recentes por O & # x02019Donnell e colaboradores (89, 90). A helicase CMG, pré-carregada na fita principal de um garfo de replicação do modelo, recrutou Pol & # x003b5 para a fita principal em preferência a Pol & # x003b4 e de uma maneira que era dependente de Pol & # x003b5& # x02019s Subunidade Dpb2. Além disso, mesmo quando Pol & # x003b4 estava pré-vinculado à vertente principal, Pol & # x003b5 prontamente deslocado se complexos CMG estivessem presentes.

A estrutura crio-EM do CMG & # x02013Pol & # x003b5 complexo não só revelou sua arquitetura geral e interações de proteínas, mas também sugeriu um caminho para o segmento do ssDNA principal através do complexo CMG e Pol & # x003b5 (88) (Figura 4). Em estudos bioquímicos anteriores no Xenopus extrato de ovo & # x02013 baseado no sistema de replicação de DNA, a forquilha de replicação foi deixada correr em um cross-link interstrand precisamente posicionado (91). Paralisação transitória da replicação da fita principal foi observada

40 nt antes da ligação cruzada, seguido por um estol mais pronunciado em uma posição

20 nt antes do cross-link. o

20-nt stall é consistente com o comprimento do DNA ocluído pelo hexâmero Mcm2-7 (74), enquanto o

O estol de 40 nt é proposto para representar o rosqueamento adicional do filamento principal através de Cdc45 e GINS antes de entrar no Pol & # x003b5 site ativo (88). Estas considerações bioquímicas e estruturais sugerem que o fio condutor preferencialmente passa por todo o complexo CMG antes de se ligar a Pol & # x003b5, mas pode ter a flexibilidade de se liberar prontamente de Cdc45 & # x02013GINS, talvez para permitir uma resposta mais flexível aos desafios na replicação do DNA da fita principal (Figura 4).

Estrutura e interações completas. Dois modelos para o caminho percorrido pela fita principal antes da entrada na DNA polimerase & # x003b5 (Pol & # x003b5) sítio catalítico. Qualquer (uma)

Comprimentos de 20 nt de DNA de fita simples estão obstruídos. A proposta foi feita para que essas duas formas também possam se interconverter. A fita atrasada é mostrada em loop de modo que Pol & # x003b1 e Pol & # x003b5 mover na mesma direção enquanto segurado em um complexo por Ctf4. Abreviaturas: GINS, Sld5, Psf1, Psf2 e complexo Psf3 Mcm2-7, complexo de helicase PCNA, antígeno nuclear de proliferação celular RPA, proteína de replicação A.


Polimerases de DNA

As enzimas que catalisam a síntese de DNA em um modelo de DNA são Polimerases de DNA. Eles desempenham duas funções primárias na célula: a síntese de DNA durante a replicação do genoma e a re-síntese do DNA ausente após o dano da recombinação e após a excisão do primer da fita retardada.

Tanto em procariotos quanto em eucariotos, DNA polimerases especializadas são dedicadas a funções de replicação e reparo, sendo as primeiras às vezes denominadas Réplicas de DNA. Todas as polimerases de DNA possuem um 5 & ​​# 8242- & gt3 & # 8242 polimerase atividade. e pirofosforólise atividade, que juntos facilita a síntese de DNA.


Mecanismo de montagem da polimerase assimétrica na forquilha de replicação eucariótica

Os eucariotos usam polimerases distintas para a replicação das fitas principais e posteriores, mas como eles direcionam suas respectivas fitas é incerto. Nós reconstituímos as forquilhas de replicação de Saccharomyces cerevisiae e descobrimos que a helicase CMG seleciona a polimerase (Pol) ɛ para a exclusão de Pol δ na fita principal. Mesmo que Pol δ se reúna na fita principal, Pol ɛ rapidamente a substitui. Pol δ-PCNA é distributivo com CMG, em contraste com sua alta estabilidade em ssDNA preparado. Conseqüentemente, o CMG não estabilizará Pol δ, deixando a fita principal acessível para Pol ɛ e estabilizando Pol ɛ. A comparação de Pol ɛ e Pol δ em um modelo de DNA de fita retardada revela o oposto. Pol δ domina o excesso de Pol ɛ no ssDNA iniciado com PCNA. Assim, PCNA favorece fortemente Pol δ em relação a Pol ɛ na fita atrasada, mas CMG se sobrepõe e inverte esse equilíbrio em favor de Pol ɛ na fita principal.

Declaração de conflito de interesse

INTERESSES FINANCEIROS CONCORRENTES

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Bonecos

Reconstituição de um novo fio condutor ...

Reconstituição de um replissome de fita principal com CMG, Pol ε, RFC, PCNA e RPA.…

Comparação de Pol ε e Pol δ na replicação da fita principal com CMG. Tempo…

CMG seleciona Pol ε de uma mistura de Pol ε e Pol δ.…

Pol ε funciona de forma estável com ...

Pol ε funciona de forma estável com CMG, enquanto Pol δ não. ( uma…

Pol ε e Pol δ associam-se rapidamente a um modelo preparado com PCNA. ( uma…

Pol δ é dominante sobre Pol ε em um template de modelo de cadeia retardada. (…

Esquema de montagem de polimerase assimétrica ...

Esquema de montagem de polimerase assimétrica em uma forquilha de replicação. ( uma ) CMG ...


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A replicação do DNA foi estudada em uma ampla variedade de espécies. Para nossos propósitos, vamos nos concentrar em temas comuns dos mecanismos de replicação encontrados tanto em procariotos quanto em eucariotos. Esta seção examinará DNA polimerases eucarióticas e proteínas acessórias, enfatizando propriedades que são comuns àquelas vistas em enzimas bacterianas.

Cinco DNA polimerases, chamadas a, d, b, e e g, foram isoladas de células eucarióticas. Seguindo o paradigma estabelecido para estudar a replicação em bactérias, os pesquisadores buscaram determinar quais proteínas estão envolvidas em uma função particular usando tanto a análise genética quanto a caracterização bioquímica. Embora nenhum rastreio genético para funções de replicação de DNA possa ser feito em mamíferos, uma quantidade substancial foi aprendida estudando a replicação em vitro de DNA contendo origens virais de replicação, como aquelas encontradas no vírus simian 40 (SV40) ou vírus do papiloma bovino. Esses vírus de mamíferos têm pequenos cromossomos (cerca de 5 a 7 kb) e podem ser replicados completamente em sistemas livres de células. O uso de sistemas livres de células competentes para a replicação permitiu uma análise detalhada das proteínas necessárias para esse processo. A capacidade de interferir com a atividade de proteínas designadas em um sistema livre de células, e. ao adicionar anticorpos que os inativam ou inibidores para bloquear sua atividade, fornece os meios para testar se aquela proteína é necessária para a replicação do DNA. Na verdade, esta interferência com uma proteína no vitroimita a informação obtida a partir dos fenótipos de mutações de perda de função nos genes que codificam a proteína de interesse. Além disso, as proteínas purificadas podem ser combinadas para reconstituir as atividades necessárias para a síntese completa do molde de DNA viral. O sucesso em tal reconstituição indica que os componentes principais foram identificados. Além disso, proteínas homólogas às identificadas em células de mamíferos foram encontradas em leveduras, e a mutação desses genes fornece informações adicionais sobre a função biológica das enzimas. Os resultados desses tipos de estudos são apresentados nesta seção.

A principal polimerase para a replicação do DNA nuclear é DNA polimerase d (Figura 5.27). É necessário para a síntese da fita principal e da fita final, pelo menos na reconstituição no vitrosistemas de replicação. Possui duas subunidades, uma polimerase (125 kDa) e outra subunidade (48 kDa). Catalisa a síntese de DNA com alta fidelidade e contém a atividade de exonuclease 3 'a 5' esperada para revisão. Possui alta processividade quando associado a um análogo da pinça deslizante bacteriana (b2), denominado PCNA.

Figura 5.27. DNA polimerases eucarióticas e proteínas de replicação na forquilha de replicação. A principal DNA polimerase replicativa nos núcleos é a DNA polimerase d. RFA é o equivalente funcional do SSB bacteriano, esta proteína de ligação de fita simples reveste o DNA de fita simples. Uma helicase catalisa a separação das duas fitas parentais. A DNA polimerase a (mostrada como um círculo ao redor do novo primer) contém uma primase que faz pequenos trechos de RNA e DNA que servem como primers para a síntese de DNA.

PCNA, ou antígeno nuclear de proliferação celular, foi inicialmente identificado como um antígeno que aparece apenas em células em replicação e apenas em determinados momentos do ciclo celular (como a fase S). Esta proteína trimérica tem uma estrutura em anel semelhante à da braçadeira deslizante b2 de E. coliDNA polimerase III (Figura 5.28), apesar da ausência de similaridade de sequência significativa nas proteínas. A ligação do PCNA confere alta processabilidade à polimerase d. Assim, o PCNA é estrutural e funcionalmente análogo ao E. coli subunidade b. Cada subunidade do PCNA trimérico se dobra em dois domínios, para um total de seis domínios no anel. Cada subunidade do dimérico E. coli A subunidade b dobra-se em três domínios, novamente formando seis domínios no anel. Assim, a braçadeira deslizante tem uma estrutura muito semelhante em bactérias e mamíferos.

Figura 5.28. Estruturas semelhantes de fatores de processabilidade para a replicação do DNA. A proteína de mamífero, PCNA (topo), é um trímero, cada monômero do qual tem dois domínios semelhantes. O trímero forma um círculo que envolve o DNA, servindo assim como uma pinça deslizante. A subunidade b da DNA polimerase III de E. coli é um dímero (parte inferior), cada monômero do qual tem três domínios semelhantes. Esses domínios têm uma estrutura muito semelhante à do PCNA, apesar de apresentarem similaridade de sequência limitada. Assim, as pinças deslizantes funcionalmente análogas em eucariotos e procariontes têm estruturas semelhantes.

As junções template-primer são reconhecidas pela multissubunidade fator de replicação C, ou RFC. Como o complexo g em E. coli, esta enzima é uma ATPase e ajuda a carregar o fator de processabilidade PCNA. Assim, o RFC desempenha uma função semelhante ao complexo bacteriano g.

Uma das primeiras polimerases eucarióticas a ser isolada foi DNA polimerase uma, que agora é reconhecido como um catalisador da síntese de primer. Esta enzima contém quatro subunidades polipeptídicas, uma com atividade de polimerase (170 kDa), duas que compreendem uma atividade primase (50 e 60 kDa) e outra subunidade de função (atualmente) indeterminada (70 kDa). A DNA polimerase a tem baixa processabilidade, mas alta fidelidade. Esta alta fidelidade é surpreendente porque nenhuma exonuclease 3 'a 5' está associada à enzima. A polimerase a, possivelmente com primases adicionais, catalisa a síntese de segmentos curtos de DNA e RNA que servem como iniciadores para as polimerases replicativas.

DNA polimerase e está relacionado à polimerase d, e pode desempenhar um papel na síntese da fita retardada. Também depende do PCNA, na Vivo. No entanto, nenhum requisito foi identificado para ele em sistemas de replicação viral em vitro.

O composto afidicolina bloqueia o crescimento de células de mamíferos. Ele faz isso evitando a replicação do DNA, e os alvos dessa droga são as DNA polimerases aed (assim como e). O fato de que a inibição dessas DNA polimerases com afidicolina também interrompe a replicação do DNA em células de mamíferos argumenta que, de fato, a e d são responsáveis ​​pela replicação do DNA nuclear em células eucarióticas. This conclusion is strongly supported by the phenotype of conditional loss-of-function mutations in the genes encoding the homologs to these polymerases in yeast. Such mutants do not grow at the restrictive temperature, indicating that d and a are the replicative polymerases. The biochemical evidence implicates polymerase a in primer formation, and d appears to be the major polymerases used to synthesize the new strands of DNA.


DNA Replication: Eukaryotic Elongation and Termination.

We discussed about the Initiation in the Eukaryotic cells in the last post. In the present post, let’s look into the Alongamento e a Terminação in Eukaryotic DNA Replication.

During Initiation, a repertoire of proteins bind and unwind the DNA at the origem. To this protein complex the polimerases are loaded. The polymerases work together with other proteins for the elongation of the daughter strands.

(Just for info: Read more about the eukaryotic origins in the paper titled ‘Making Sense of Eukaryotic DNA Replication Origins‘.)

Elongation:

The first polymerase to initiate the DNA synthesis is the DNA polymerase α, which exists in the form of DNA polymerase α-primase complex. The primase subunit synthesizes the RNA primers (around 7-12 nucleotides) which are then transferred to the polymerase domain and extended with DNA bases (around 20-25 nucleotides). Replication factor C (RFC) initiates a reaction called polymerase switching. The DNA strands are then extended by other polymerases namely the DNA polymerase δ e DNA polymerase ε.

Leading strand synthesis:

Fig 1: Synthesis of leading or continuous strand.

As DNA pol α completes synthesizing RNA primer and adding DNA bases, the RFC causes dissociation of DNA pol α and assembles proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the region of the primer terminus. PCNA is a DNA clamp for DNA polymerases.

Pol ε has been reported as the main leading strand synthesis polymerase (in Saccharomyces cerevisiae) In the leading strand as the replication is continuous and the primer is synthesized only once and the extension is carried out (fig 1).

Lagging strand synthesis:

Fig 2: Synthesis of lagging or discontinuous strand with series of Okazaki fragments.

Polymerases δ is the major polymerase in lagging-strand synthesis. The replication in the lagging strands is discontinuous and takes place with formation of several Okazaki fragments (fig 2).

Okazaki fragments (fig 3) generated in eukaryotes during lagging-strand synthesis are around 200 bases (prokaryotes, around 2000 bases) long. As several Okazaki fragments are made, Polymerase switching during synthesis of Okazaki fragments is of higher importance.

Hence an Okazaki fragment is made up of RNA nucleotides (7-10 nucleotides), then around 10-20 nucleotides of DNA bases are added by the DNA pol α. Following which, the RFC causes polymerase switching and the deoxyribonucleotides are added by DNA pol δ held by the PCNA, the sliding braçadeira (see the figure below). DNA pol δ dissociates after the synthesis of the entire DNA stretch, as it approaches the previous RNA primer.

(Just for info: Know more about PCNA)

The proteins involved in the replication, especially PCNA (Boehm et al., 2016).

RNA primers are removed by RNase H1, such that one ribonucleotide remains still attached to the DNA (3′ end) part of the Okazaki fragment. This left out ribonucleotide is then removed by flap endonuclease 1 (FEN 1). Polymerase δ then fills the gaps formed between Okazaki fragments following the primer removal. o nick formed between the Okazaki fragment and the lagging strand are filled in by DNA ligase I, hence forming single lagging strand.

Fig 4: Removal of RNA primer and linking of individual Okazaki fragments.

Nucleosome Assembly:

During elongation, there is continuous disassembly as reassembly of the nucleosome packaging along the DNA, too. As we know, one of the feature of the eukaryotic DNA is that it is packaged in form of highly compact structures called the Cromossomos. It involves winding of the negatively charged DNA around the basic proteins called histonas to form structures called nucleossomos (fig below). Each nucleosome is composed of 8 histona proteins, two each of H2A, H2B, H3 and H4. Histone H1 forms the linker between two nucleosomes.

The nucleosomes.

During replication, two nucleosomes in front of the replication fork, that is unreplicated DNA, becomes destabilized. Hence the replication fork movement causes DNA packaging to disorganise to allow the replication proteins to interact with the DNA.

No replicated portion, the leading and lagging strands were nucleosome-free till about 225 bp and 285 bp, respectively. Following this region, the DNA was packaged with histone octomer but some lacked histone H1. After around 450 bp to 650bp from the replication fork, complete nucleosomes with H1 were detected in the daughter strands. Hence there is stepwise assembly of daughter strands into complete nucleosome.

The parental nucleosomes disassociate and randomly bind the daughter DNA strands, such that each strands has metade do parental nucleosomes. The remaining nucleosome components required for packaging the two daughter strands, are synthesized de novo and assembled onto the daughter strands.

Termination:

Following the successful elongation, the replication has to be terminated to give two separate copies of the DNA.

Involving two adjacent replication forks:

As the eukaryotic cell have a large number of origens, the termination involves merging of two adjacent replication forks. This includes four different steps:

– Dissolution:

The DNA stretch between the two adjacent forks (fig 5.a) is unwound (fig 5.b) and the approaching CMGs pass each other (fig 5.c). The last Okazaki fragment is processed by DNA pol δ and FEN1 (fig 5.d).

o gaps in the daughter strands (as in normal Okazaki fragments) are filled in and two oppositely approaching synthesized strands are ligated.

– Dissociation of replisome:

The replisome complex dismantles after the convergence of the two replication fork. This process involves termination-specific polyubiquitylation of Mcm7 and the p97/VCP/Cdc48 segregase (fig 5.e).

– Decatenation:

If there are any intertwinings in the daughter DNA strands or catenanes, they are removed utilising topoisomerase II segregating the two strands.

Fig 5: Termination involves merging of the two neighbouring forks (Dewar & Walter, 2017).

Involving the ends of the Chromosomes:

As is known the DNA in eukaryotic chromosomes is a linear molecule, the termination in eukaryotic DNA also involve completing replication at the termina of chromosomes known as Telomeres (fig 6).

Fig 6: Telomeres form protective end of eukaryotic linear DNA (Aulinas, 2013).

During the synthesis of Okazaki fragments, Primer de RNA fornecer 3′-OH group for 5′ to 3′ replication. On the removal of RNA primer, from the fio retardado no chromosome end, the end remains unreplicated and the newly synthesized strand is shortened (fig 7).

Fig 7: Shortening of the chromosome ends.

This shortening of the chromosome is prevented by the presence of special repeats of sequences called telômeros (and telomere-associated proteins) at the ends of DNA in chromosomes contain. Por ex. human Chromosomes are protected by telomeres having repeated sequences of (TTAGGG)n of about 15–20 kb at birth. These structures protect the ends of chromosomes from being mistakenly considered as DNA double strand breaks (DSB).

In normal somatic cells, the telomeric region of eukaryotic chromosomes are shortened with each round of DNA replication. After certain number of DNA replications, and hence cell divisions, the telomeres are shortened to an extent that it leads to replicative cell senescence ou apoptose.

(Just for info: Please read about the Nobel prize given to a work on telomeres.)

No entanto, em linha germinativa e cancer cells, an enzyme called telomerase, extends the ends of the chromosomes, especially the 5′ end of the lagging strands. The ability to maintain the length of the telomeres, make these cells imortal.

Telomerase is a transcriptase reversa which has a RNA modelo, conhecido como template-encoding RNA molecule (TER) for extension of the telomeric DNA (fig 8). O básico proteína component of telomerase is known as TERT (TElomerase Reverse Transcriptase).

In humans, the RNA template has the sequence AUCCCAAUC. The newly synthesized telomeric DNA repeats are added to the overhanging single-stranded 3′ end of the DNA (fig 8).

Fig 8: Synthesis of telomeric DNA repeats by Telomerase (Verhoeven et al, 2014).

(Just for info: visit to watch the animation on action of Telomerase and much more.)

After strand extension on the 3′ end by the telomerase is completed, DNA pol α and DNA ligase complete the DNA strand synthesis.

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Read more posts by The Biotech Notes:

Bambara et al. (1997) Enzymes and Reactions at the Eukaryotic DNA Replication Fork. J Biol Chem. 272(8):4647-50.

Abmayr and Workman (2012) Holding on through DNA Replication: Histone Modification or Modifier? Célula. 150(5):875-7.

Verhoeven et al (2014). Cellular aging in depression: Permanent imprint or reversible process?: An overview of the current evidence, mechanistic pathways, and targets for interventions. BioEssays 36(10):968-78.

Bailey et al (2015) Termination of DNA replication forks: “Breaking up is hard to do”.Nucleus 6 (3):187-196.

Dewar & Walter (2017) Mechanisms of DNA replication termination. Nature Reviews Molecular Cell Biology 18:507–516.

Aulinas (2013) Telomeres, aging and Cushing’s syndrome: Are they related? Endocrinology and Nutrition (English Edition) 60(6): 329-335.

Boehm et al. (2016) The Many Roles of PCNA in Eukaryotic DNA Replication. Enzymes 39:231-54.