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13,48: Resposta inflamatória e leucócitos - Biologia

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O que acontece quando um inimigo passa pela primeira linha de defesa?

Para que esse running back passe pela primeira linha de defesa, geralmente deve haver um buraco ou quebra na linha. Ele então corre para a secundária, ou segunda linha de defesa. Sempre que a pele é rompida, é possível que os patógenos entrem facilmente em seu corpo. Eles passam da primeira linha de defesa e correm para a segunda linha de defesa.

A segunda linha de defesa

Se você tiver um corte na mão, a fissura na pele fornece uma maneira de os patógenos entrarem em seu corpo. Suponha que as bactérias entrem pelo corte e infectem a ferida. Essas bactérias, então, encontrariam a segunda linha de defesa do corpo.

Resposta Inflamatória

O corte em sua mão pode ficar vermelho, quente e inchado. Estes são sinais de umresposta inflamatória. Esta é a primeira reação do corpo a danos ou infecções nos tecidos. Conforme explicado em Figura abaixo, a resposta é desencadeada por produtos químicos chamados citocinas ehistaminas, que são liberados quando o tecido é ferido ou infectado. Os produtos químicos se comunicam com outras células e coordenam a resposta inflamatória. Você pode ver uma animação da resposta inflamatória neste link: http: //www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/inflammatory.html.

Este desenho mostra o que acontece durante a resposta inflamatória. Por que as mudanças nos capilares são importantes para esta resposta?

Leucócitos

Os produtos químicos que desencadeiam uma resposta inflamatória atraem leucócitos para o local da lesão ou infecção. Leucócitos são glóbulos brancos. Seu papel é combater infecções e se livrar dos detritos. Os leucócitos podem responder com uma defesa inespecífica ou específica.

  • UMA defesa não específica é o mesmo, independentemente do tipo de patógeno envolvido. Um exemplo de defesa não específica é fagocitose. Este é o processo pelo qual os leucócitos envolvem e decompõem patógenos e resíduos. É ilustrado em Figura abaixo. A primeira linha de defesa do sistema imunológico também é uma defesa inespecífica.
  • UMA defesa específica é feito sob medida para um patógeno específico. Os leucócitos envolvidos nesse tipo de defesa fazem parte da resposta imune e são descritos em outros conceitos.

Nesta imagem, os leucócitos (brancos) estão atacando os patógenos (em forma de estrela).

Resumo

  • A segunda linha de defesa ataca os patógenos que conseguem entrar no corpo.
  • A segunda linha de defesa inclui a resposta inflamatória e a fagocitose por leucócitos inespecíficos.

Análise

  1. O que é uma defesa inespecífica?
  2. Qual é a segunda vida de defesa do corpo? Quando isso entra em vigor?
  3. Identifique as funções dos leucócitos não específicos na segunda linha de defesa do corpo.
  4. Jera cortou o dedo. No dia seguinte, a pele ao redor do corte ficou vermelha e quente. Por que esses sinais de infecção?

Atividade sérica da DPPIV e sua expressão em linfócitos em pacientes com melanoma e em pessoas com vitiligo

A dipeptidil peptidase IV, uma serina protease multifuncional, está implicada na regulação da transformação maligna, promoção e progressão adicional do câncer, exercendo atividades supressoras de tumor ou mesmo completamente opostas - promoção de tumor.

O objetivo da presente pesquisa foi determinar a atividade sérica da DPPIV, bem como as porcentagens de linfócitos CD26 +, leucócitos CD26 + totais e a intensidade média de fluorescência da expressão de CD26 em linfócitos em pacientes com melanoma, pessoas com vitiligo e em controles saudáveis.

Métodos

A atividade da DPPIV no soro foi determinada por teste colorimétrico. A expressão de DPPIV (como CD26) em glóbulos brancos periféricos imunocompetentes foi feita usando análise de citometria de fluxo.

Resultados

Os dados do nosso estudo mostram, pela primeira vez, uma diminuição estatisticamente significativa: na atividade sérica da DPPIV, na porcentagem de leucócitos totais CD26 + e na porcentagem de linfócitos em pacientes com melanoma em comparação com pessoas saudáveis ​​de controle. Além disso, a atividade sérica da DPPIV significativamente mais baixa foi encontrada no grupo de pacientes com melanoma em relação às pessoas com vitiligo.

Conclusão

Este estudo indica a necessidade de explorar a causa e a importância dos distúrbios na atividade sérica da DPPIV e na expressão do CD26 em células imunocompetentes em complexos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e progressão do melanoma.


1. Introdução

Os linfonodos (LNs) são pequenos órgãos em forma de feijão encontrados ao longo dos vasos linfáticos que drenam o parênquima de órgãos não linfóides. Como outros órgãos linfoides secundários (SLOs), os LNs têm uma arquitetura linfoide característica, com domínios de células B e T segregados organizados por tipos de células estromais distintos [1, 2]. Essa estrutura facilita o encontro de linfócitos raros e específicos do antígeno com células dendríticas portadoras de antígeno (DCs) e, portanto, suporta as respostas imunes primárias [3, 4]. A formação de LN ocorre durante a embriogênese tardia de acordo com um programa de desenvolvimento que ocorre independentemente do antígeno ou inflamação [5]. No entanto, os linfócitos também podem encontrar antígenos fora dos LNs, como mostrado em répteis e pássaros (espécies que não têm LN), e em ratos experimentais que não têm SLOs [6]. Nestes casos, as células T e B agregam-se no parênquima de órgãos não linfóides periféricos e até formam domínios de células B e T distintos semelhantes aos dos SLOs convencionais. Como esses agregados linfoides não ocorrem como parte de um programa de desenvolvimento e são formados apenas após a inflamação local, eles são denominados órgãos linfoides terciários (TLO) [7, 8].

Três tipos de TLOs são encontrados no pulmão: focos inflamatórios nodulares (NIF), compostos por aglomerados de células mieloides e granulomas de células T CD8 + [9], como aqueles formados durante Mycobacterium tuberculosis infecção, caracterizada por um núcleo central de macrófagos infectados rodeados por células B e células T [10] e tecido linfóide associado ao brônquio induzível (iBALT), que mais se assemelha à arquitetura de SLOs convencionais e é encontrado no espaço perivascular em torno de sangue grande vasos e ao longo das vias aéreas do pulmão [7, 11]. A formação de IBALT ocorre em resposta a várias condições inflamatórias, usando uma variedade de vias moleculares. Neste capítulo, vamos resumir o entendimento atual das etapas que levam ao desenvolvimento de iBALT e revisar brevemente o impacto de iBALT nas respostas imunes pulmonares contra infecções microbianas, alérgenos e autoantígenos.


Resultados

PDCs humanos expressam mRNA para receptores de adenosina

O padrão de expressão dos 4 subtipos de receptor de adenosina, denotado A1, UMA2a, UMA2b, e A3, em PDCs humanos foi avaliada por RT-PCR. Ex vivo, PDCs expressaram mRNA para A1 mas não para A2b ou A3 receptores (Figura 1). UMA2a a expressão do mRNA do receptor foi observada em níveis baixos em alguns doadores e estava ausente em outros. A estimulação noturna com IL-3 e CD40L induzida pela regulação negativa de A1 e regulação superior de A2a mRNA do receptor (Figura 1). Conforme observado com PDCs imaturos, nenhum A2b ou A3 o mRNA do receptor foi detectado em PDCs maduros. Este padrão diferia das DCs derivadas de monócitos imaturos (MoDCs), que expressavam altos níveis de A1 e A3 mRNA do receptor e níveis baixos de ambos A2a e A2b mRNA (dados não mostrados).

Expressão do receptor de adenosina de PDCs humanos. O RNA mensageiro foi extraído de PDCs altamente purificados (pureza superior a 96%) imediatamente após o isolamento ou após cultura durante a noite na presença de IL-3 e CD40L. Perfis de A1, UMA2a, UMA2b, e A3 a expressão do receptor foi gerada por RT-PCR. Além do produto esperado de 278 bp para o A1 receptor, um segundo transcrito de 483 bp foi amplificado (setas), que continha o A esperado1 sequência do receptor com uma inserção de 205 pb pertencente ao íntron entre os exões 5 e 6. Uma experiência representativa de 6 é mostrada.

Expressão do receptor de adenosina de PDCs humanos. O RNA mensageiro foi extraído de PDCs altamente purificados (pureza superior a 96%) imediatamente após o isolamento ou após cultura durante a noite na presença de IL-3 e CD40L. Perfis de A1, UMA2a, UMA2b, e A3 a expressão do receptor foi gerada por RT-PCR. Além do produto esperado de 278 bp para o A1 receptor, um segundo transcrito de 483 bp foi amplificado (setas), que continha o A esperado1 sequência do receptor com uma inserção de 205 pb pertencente ao íntron entre os exões 5 e 6. Uma experiência representativa de 6 é mostrada.

Em PDCs, a reação de PCR para o A1 receptor amplificou um segundo transcrito, que era maior do que o produto esperado de 278 pares de bases (pb) e que também foi regulado para baixo após a maturação. O sequenciamento de DNA revelou que este produto de 483 pb continha o A esperado1 sequência do receptor com uma inserção de 205 pb, correspondendo à região 3 'do íntron localizado entre os exons 5 e 6 do A1 gene. Esses nucleotídeos foram provavelmente incorporados ao transcrito devido a um local de splicing a montante alternativo. No entanto, é improvável que o novo transcrito codifique para um receptor de adenosina funcional, porque a mudança de quadro causada pela inserção gera uma proteína que é truncada após a hélice III, afetando o sítio de ligação de adenosina previsto (resíduos nas hélices III e VII) como bem como o local de ligação da proteína G. 31

PDCs mobilizam cálcio intracelular em resposta à adenosina via A1 receptores

O A1 e A3 receptores sinalizam através da fosfolipase C e, conseqüentemente, mobilizam cálcio dos estoques intracelulares. Para avaliar a função do receptor de adenosina em PDCs, estudamos a sinalização do cálcio em resposta à adenosina e a agonistas específicos do receptor de adenosina. A adenosina induziu fortes transientes de cálcio em PDCs imaturos (Figura 2A). As respostas foram observadas em concentrações tão baixas quanto 0,1 a 1,0 μM e foram máximas em 10 μM. Os agonistas específicos do subtipo do receptor revelaram que a sinalização do cálcio foi mediada pelo A1 receptor, porque os transientes de cálcio foram observados apenas em resposta ao A1 agonista do receptor CHA, mas não para DPMA ou IB-MECA, agonistas de A2a e A3 receptores, respectivamente (Figura 2B). A sensibilidade dos PDCs à adenosina foi regulada durante a maturação. Em PDCs maturados com CD40L (24 horas), a sinalização de cálcio em resposta à adenosina diminuiu significativamente, correlacionando-se com a regulação negativa de A1 expressão de mRNA do receptor mostrada na Figura 1. Após 48 horas de ativação, os transientes de cálcio não foram mais induzidos (Figura 2B). Forte sinalização de cálcio foi observada em resposta a CCL19 (MIP-3β), mas não a CXCL12 (SDF-1α) em PDCs maturados em CD40L (dados não mostrados).

Sinalização de cálcio de PDCs em resposta à adenosina e agonistas específicos do receptor de adenosina. Transientes de cálcio em PDCs cultivados durante a noite com IL-3 (AB) ou IL-3 mais CD40L por 48 horas (B) em resposta à adenosina ou aos agonistas específicos do receptor de adenosina, CHA, DPMA e IB-MECA (cada 1 μM), foi analisado por citometria de fluxo. Após estabelecer uma linha de base por 10 segundos, os reagentes foram adicionados nas concentrações indicadas. Dados representativos de 4 experimentos diferentes são mostrados.

Sinalização de cálcio de PDCs em resposta à adenosina e agonistas específicos do receptor de adenosina. Transientes de cálcio em PDCs cultivados durante a noite com IL-3 (AB) ou IL-3 mais CD40L por 48 horas (B) em resposta à adenosina ou aos agonistas específicos do receptor de adenosina, CHA, DPMA e IB-MECA (cada 1 μM), foi analisado por citometria de fluxo. Após estabelecer uma linha de base por 10 segundos, os reagentes foram adicionados nas concentrações indicadas. Dados representativos de 4 experimentos diferentes são mostrados.

A adenosina induz quimiotaxia de PDCs imaturos

Como a capacidade dos PDCs de migrar em resposta às quimiocinas inflamatórias é baixa, estávamos interessados ​​em saber se a adenosina pode induzir a quimiotaxia dos PDCs, como foi relatado anteriormente para outros leucócitos. 32-34 Em um ensaio de quimiotaxia Transwell padrão, descobrimos que os PDCs isolados recentemente migram em direção aos gradientes de adenosina de uma maneira dependente da concentração (Figura 3A). A migração para a adenosina foi observada em concentrações fisiologicamente relevantes de 0,1 a 1,0 μM, com migração máxima entre 1,0 e 10 μM (7,5% a 14,5% do total de PDCs). A resposta quimiotática à adenosina aumentou após um período de repouso noturno na presença de IL-3 para alguns doadores, provavelmente refletindo diferenças individuais na taxa de recuperação do estresse celular induzido pelo procedimento de isolamento (Figura 3B). Em contraste, a capacidade dos PDCs de migrar em direção ao CXCL12, que era em magnitude comparável à adenosina, diminuiu após a cultura durante a noite. Além disso, os PDCs cultivados com IL-3 mostraram uma forte resposta migratória ao CCL21 (Figura 3C), correlacionando-se com a regulação negativa de CXCR4 e a regulação positiva da expressão de CCR7, conforme avaliado por análise FACS (dados não mostrados). Um padrão de migração distinto foi observado para PDCs maturados com CD40L por 48 horas. PDCs maturados com CD40L migraram com eficiência em resposta ao CCL21 (dados não mostrados), mas não mais para a adenosina (Figura 3D).

Migração de PDCs para adenosina ou quimiocinas. (A) Curva dose-resposta para a migração de PDCs recentemente isolados em direção à adenosina. A média ± SEM de 7 experimentos, cada um realizado em duplicata, são mostrados. (B) Curva de dose-resposta para a migração de PDCs cultivados durante a noite na presença de IL-3 em direção à adenosina. A média ± SEM de 3 experimentos, cada um realizado em duplicata, são mostrados. (C) Resposta migratória de PDCs para adenosina, CXCL12 (SDF-1α) ou CCL21 (6Ckine) após o isolamento (ex vivo) e após 1 dia de cultura com IL-3. Média ± SEM de 4 a 6 experimentos independentes, cada um realizado em duplicata, são mostrados. (D) PDCs foram cultivados durante a noite na presença de IL-3 ou por 48 horas na presença de IL-3 e trímero de CD40L antes da avaliação de sua resposta migratória à adenosina. A média ± SEM de duplicatas é mostrada.

Migração de PDCs para adenosina ou quimiocinas. (A) Curva dose-resposta para a migração de PDCs recentemente isolados em direção à adenosina. A média ± SEM de 7 experimentos, cada um realizado em duplicata, são mostrados. (B) Curva de dose-resposta para a migração de PDCs cultivados durante a noite na presença de IL-3 em direção à adenosina. A média ± SEM de 3 experimentos, cada um realizado em duplicata, são mostrados. (C) Resposta migratória de PDCs para adenosina, CXCL12 (SDF-1α) ou CCL21 (6Ckine) após o isolamento (ex vivo) e após 1 dia de cultura com IL-3. A média ± SEM de 4 a 6 experimentos independentes, cada um realizado em duplicata, são mostrados. (D) PDCs foram cultivados durante a noite na presença de IL-3 ou por 48 horas na presença de IL-3 e trímero CD40L antes da avaliação de sua resposta migratória à adenosina. A média ± SEM de duplicatas é mostrada.

A migração de PDCs em direção à adenosina é mediada pelo A1 receptor

Regulação negativa de A1 receptores combinados com uma perda na função migratória em PDCs maturados em CD40L nos levaram a especular que A1 receptores medeiam a quimiotaxia para adenosina. Para testar essa hipótese, foi estudada a influência de agonistas e antagonistas seletivos do receptor de adenosina na migração do PDC. Como esperado, o A1 agonista do receptor, CHA (1 μM), fortemente induziu quimiotaxia de PDCs, enquanto o A2a e A3 os agonistas do receptor DPMA e IB-MECA foram ambos ineficazes (Figura 4A). A este respeito, nenhuma diferença foi observada entre os PDCs recém-isolados e cultivados com IL-3 (dados não mostrados). Além disso, o A1 o antagonista do receptor DPCPX aboliu a migração de PDCs em direção à adenosina. CSC e MRS 1220, antagonistas de A2a e A3 receptores, foram ineficazes (Figura 4B).

A quimiotaxia de PDCs em resposta à adenosina é mediada pelo A1 receptor. (A) Migração de PDCs cultivados durante a noite na presença de IL-3 em resposta a 1 μM do A1, UMA2a ou A3 agonistas do receptor CHA, DPMA ou IB-MECA, respectivamente. (B) Migração de PDCs em direção a 100 μM de adenosina na ausência ou presença de 10 μM de A1,UMA2a, orA3 antagonistas do receptor DPCPX, CSC ou MRS 1220, respectivamente. Os dados representam a média ± SEM de 3 a 4 experiências diferentes. *P & lt .05.

A quimiotaxia de PDCs em resposta à adenosina é mediada pelo A1 receptor. (A) Migração de PDCs cultivados durante a noite na presença de IL-3 em resposta a 1 μM do A1, UMA2a ou A3 agonistas do receptor CHA, DPMA ou IB-MECA, respectivamente. (B) Migração de PDCs em direção a 100 μM de adenosina na ausência ou presença de 10 μM de A1,UMA2a, orA3 antagonistas do receptor DPCPX, CSC ou MRS 1220, respectivamente. Os dados representam a média ± SEM de 3 a 4 experiências diferentes. *P & lt .05.

A adenosina aumenta o cAMP citosólico e inibe a produção de citocinas em PDCs maduros

UMA2a os receptores são acoplados positivamente à adenilato ciclase e estimulam a formação do segundo mensageiro cAMP. Para avaliar a função de A2a receptores em PDCs, analisamos os níveis de cAMP citosólico em resposta à adenosina em PDCs recentemente isolados e após a ativação com CD40L. Para aumentar a sensibilidade do ensaio de cAMP em números baixos de células, os PDCs foram incubados com rolipram, um inibidor da enzima de degradação de cAMP fosfodiesterase (PDE) tipo IV. Em comparação com PDCs imaturos, a adenosina aumentou significativamente os níveis de cAMP em PDCs ativados por CD40L (4,4 vezes ± 1,4 vezes versus aumento de 1,8 vezes ± 0,5 vezes, n = 4, P = 0,01) (Figura 5). Esses achados são consistentes com o funcional A2a expressão do receptor em PDCs maduros.

A adenosina aumenta os níveis de cAMP citosólico em PDCs maduros. PDCs isolados de fresco ou PDCs ativados por trímero de CD40L (24 horas) foram incubados com 100 μM de adenosina na presença de rolipram. Após 30 minutos, os níveis de cAMP foram medidos em lisados ​​celulares por imunoensaio enzimático (EIA). Os dados são expressos como aumento n vezes dos níveis de cAMP e representam a média ± SEM de 4 dadores diferentes. *P & lt .05.

A adenosina aumenta os níveis de cAMP citosólico em PDCs maduros. PDCs isolados de fresco ou PDCs ativados por trímero de CD40L (24 horas) foram incubados com 100 μM de adenosina na presença de rolipram. Após 30 minutos, os níveis de cAMP foram medidos em lisados ​​celulares por imunoensaio enzimático (EIA). Os dados são expressos como aumento n vezes dos níveis de cAMP e representam a média ± SEM de 4 dadores diferentes. *P & lt .05.

Becaue A2a a sinalização do receptor foi previamente ligada a propriedades antiinflamatórias, investigamos se a adenosina tem um impacto na produção de citocinas de PDCs em resposta ao CpG ODN. O protocolo de estimulação utilizado em nosso estudo foi previamente relatado por Krug et al. PDCs foram ativados com ODN 2006 em combinação com células BKH transfectadas com CD40L, um protocolo de estimulação induzindo IFN-α, IL-6, bem como IL-12, que é máximo após um período de pré-cultivo de 60 horas com IL-3. 13 PDCs estimulados com CpG ODN 2006 e CD40L produziram grandes quantidades de IFN-α e IL-6. A adenosina (até 100 μM) não teve influência significativa na produção de IFN-α (Figura 6A) ou IL-6 (Figura 6B) por PDCs imaturos. Para estudar o efeito da adenosina na produção de citocinas por células maduras, os PDCs foram cultivados por 60 horas com IL-3, o que resultou na regulação negativa de A1 e regulação superior de A2a receptores (dados não mostrados). Em PDCs maduros, a adenosina inibiu significativamente a produção de IFN-α e IL-6 em resposta a CpG e CD40L (Figura 6A-B). Além disso, a cultura com IL-3 induziu em PDCs a produção de grandes quantidades de IL-12 em resposta a CpG ODN 2006 e CD40L, conforme relatado anteriormente por Krug et al. 13 A adenosina também suprimiu significativamente a produção de IL-12p40 e IL-12p70 sob essas condições (Figura 6C-D), destacando o papel potencial da adenosina na modulação da produção de citocinas por PDCs maduros. Nenhum efeito da adenosina na viabilidade do PDC foi observado para concentrações de até 250 μM, descartando potenciais efeitos tóxicos da adenosina. Além disso, a adenosina não induziu a maturação de PDCs, conforme avaliado pela regulação positiva da expressão de superfície do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e MHC classe II, bem como as moléculas coestimulatórias CD80 e CD86 (Figura 7).

A adenosina regula a produção de citocinas de PDCs maduros. PDCs (2,5 × 10 5 células por mililitro) foram ativados com CpG ODN 2006 e células BHK transfectadas com CD40L na presença ou ausência de 100 μM de adenosina, diretamente ex vivo ou após cultura com IL-3 por 60 horas. Os sobrenadantes foram colhidos após 48 horas, e as concentrações de IFN-α (A), IL-6 (B), IL-12p40 (C) e IL-12p70 (D) foram medidas por ELISA. Os dados representam a média ± SEM de 3 doadores diferentes. *P & lt .05.

A adenosina regula a produção de citocinas de PDCs maduros. PDCs (2,5 × 10 5 células por mililitro) foram ativados com CpG ODN 2006 e células BHK transfectadas com CD40L na presença ou ausência de 100 μM de adenosina, diretamente ex vivo ou após cultura com IL-3 por 60 horas. Os sobrenadantes foram colhidos após 48 horas, e as concentrações de IFN-α (A), IL-6 (B), IL-12p40 (C) e IL-12p70 (D) foram medidas por ELISA. Os dados representam a média ± SEM de 3 dadores diferentes. *P & lt .05.

Expressão de marcador de superfície de PDCs em resposta à adenosina. Os PDCs foram cultivados com IL-3 por 48 horas na ausência ou presença de 100 μM de adenosina. A expressão de superfície de HLA-ABC, HLA-DR, CD80 e CD86 foi avaliada por citometria de fluxo. Um experimento representativo de 3 é mostrado.

Expressão de marcador de superfície de PDCs em resposta à adenosina. Os PDCs foram cultivados com IL-3 por 48 horas na ausência ou presença de 100 μM de adenosina. A expressão de superfície de HLA-ABC, HLA-DR, CD80 e CD86 foi avaliada por citometria de fluxo. Um experimento representativo de 3 é mostrado.


Migração DC

A migração de DC da pele é uma das primeiras etapas na fase de iniciação de uma resposta imune (Fig. 2). O contacto da pele com antigénios é conhecido por estimular várias citocinas epidérmicas, e. IL-6, TNF-α, GM-CSF e CXCL2 / CXCL3 (proteína inflamatória de macrófagos-2, MIP-2) 19, entre os quais IL-1β e TNF-α são essenciais na migração de DC 20, 21.

Migração de células dendríticas. O contato da pele com um hapteno desencadeia a migração de células dendríticas através dos vasos linfáticos aferentes para os linfonodos de drenagem da pele. A produção de citocinas - particularmente TNF-α, IL-1α e IL-1β - facilita a migração de células de Langerhans (LC) para fora da epiderme. Em um estágio posterior, a interação CCR7-CCL21 desempenha um papel fundamental na migração de LC para as áreas de células T dos nódulos linfáticos. DC, IL de células dentríticas, interleucina MMP, metaloproteinases de matriz TNF-α, fator de necrose tumoral-α.

Desemaranhamento da pele DC

A sinalização de citocinas resulta na expressão alterada de moléculas de adesão, o que facilita a migração das DC para fora da epiderme. A mobilização de CD está associada à perda de CD324 (E-caderina), causada pela produção de TNF-α, IL-1β ou IL-1α 21, 22. Em resumo, é proposto que IL-1β derivada de LC desempenha duas funções. Em primeiro lugar, a IL-1β derivada de DC ativa as DC em uma alça autócrina através do receptor 1 de IL-1 (IL-1RI). Em segundo lugar, a IL-1β também estimula os queratinócitos epidérmicos (KCs) a secretar TNF-α, que atua de forma parácrina para facilitar a migração das DC através do TNF-RII 23. Se a disponibilidade de qualquer uma dessas citocinas estiver comprometida, a migração do alérgeno-LC e a mobilização de CD nos linfonodos de drenagem e o desenvolvimento de sensibilização por contato são parcialmente inibidos 24, 25.

Simultaneamente, a produção de enzimas que degradam a membrana basal da epiderme, como as metaloproteinases da matriz (MMPs), é regulada positivamente no LC 26 ativado. A MMP-2, MMP-3 e MMP-9 foram descritas para facilitar a passagem de LC através da membrana basal. Posteriormente, as MMPs também são essenciais para a migração de LC e DDC através da matriz do tecido dérmico, por clivagem do colágeno tipo IV 27. A atividade de MMP-2 e MMP-9 está sob o controle de inibidores da proteinase de ocorrência natural, como a metaloproteinase do inibidor de tecido (TIMP) -1 e TIMP-2, respectivamente. Vários estudos demonstraram que os inibidores de MMPs impediram a emigração de LC da epiderme e o acúmulo de DC para o linfonodo aferente em resposta à aplicação epicutânea de sensibilizantes, como níquel, oxazolona (OXA) e dinitroclorobenzeno (DNCB) 27- 29 Esses achados sugerem que o desenvolvimento de hipersensibilidade de contato pode ser evitado pela inibição da atividade de MMP. No entanto, o desenvolvimento de hipersensibilidade de contato não foi prejudicado em camundongos com deficiência de MMP-9, embora a migração de LC tenha sido dramaticamente inibida nesses camundongos com deficiência de gene 27. Aparentemente, os poucos DDC e LC que ainda migram na ausência de MMP-9 induzem hipersensibilidade de contato com sucesso. Além disso, a hipersensibilidade de contato pode ser induzida pela difusão livre do alérgeno de contato nos linfonodos aferentes, onde pode ser apresentado por CDs locais 30.

Enquanto isso, a expressão diferencial de moléculas de adesão é induzida para mediar as interações com a matriz extracelular, células epidérmicas e dérmicas. Entre os eventos mais importantes está a expressão reduzida de CD324, que permite ao LC se dissociar dos KCs circundantes 31. Papéis adicionais são pensados ​​para CD54 (molécula de adesão intracelular, ICAM-1) e antígeno-1 associado à função linfocitária porque o bloqueio dessas moléculas de adesão inibiu a migração de DC epidérmicas para os linfonodos regionais. A expressão regulada positivamente de integrina α6 e integrina β1 compreende antígeno 6 muito tardio que confere atividade de ligação à laminina LC e, assim, a capacidade de interagir com a membrana basal. Outra molécula de adesão, a molécula de adesão juncional 1 (JAM-1), é expressa por DC e, portanto, afeta a migração de DC 32, 33. A ausência de JAM-1 facilita o tráfico de DC para os nódulos linfáticos 34. Combinados, esses eventos resultam no desemaranhamento de LC dos KCs circundantes, permitindo assim a migração de LC.

Quimiocinas e receptores de quimiocinas

A migração de LC também está associada à expressão de receptores de quimiocinas na superfície das células. O iDC expressa receptores de quimiocinas, e estes podem guiá-los para locais inflamatórios onde ocorre a amostragem de antígeno. Após a amostragem do antígeno, as DCs se diferenciam rapidamente em um fenótipo maduro. Este processo de maturação está associado a uma mudança no perfil do receptor de quimiocinas. Os receptores de quimiocinas de homing da pele são regulados negativamente (CCR1, CCR2, CCR5 e CCR6), enquanto os receptores envolvidos no direcionamento ao linfonodo local são regulados positivamente (CCR4, CXCR4 e CCR7) 35. É importante ressaltar que a mobilização de DC da periferia para os nódulos linfáticos aferentes é regulada pelo receptor de quimiocina "porteiro" CCR7 9, 36. Ambas as vênulas linfáticas e endoteliais altas produzem CCL21, um importante ligante CCR7 37, 38. Residir DC nas áreas paracorticais dos linfonodos produzem CCL19, um segundo ligante do CCR7. Ao lado de LC contendo antígeno, também as células T virgens expressam CCR7. Isso orquestra o encontro de DC e células T virgens nas áreas dos linfonodos paracorticais.

Os mediadores lipídicos, leucotrienos cisteínicos (cysLTs) e prostaglandina E2 (PGE2), todos produzidos em locais de inflamação, também são necessários para a migração de LC 39, 40. Esses mediadores lipídicos promovem, pela regulação positiva de CCR7, quimiotaxia de DC ideal para a quimiocina CCL19, mas não para CCL21. Além disso, a proteína-1 de resistência a múltiplas drogas do transportador cysLT e o transportador de lipídios p-glicoproteína (multirresistência a drogas, MDR-1) também são expressas por CD e são necessárias para sua entrada em vasos linfáticos aferentes 41, 42.

Regulação negativa da migração DC

Em camundongos, independentemente da natureza do estímulo (por exemplo, contato da pele com alérgenos, patógenos ou trauma), apenas até 30% das CL epidérmicas deixam o tecido 43, 44. Possivelmente, esses LC residenciais têm a função de resguardar a pele para exposições subsequentes. A retenção de LC pode ser causada pelo rápido início da produção de reguladores negativos da migração de LC, como IL-4 derivado da epiderme, IL-10 e TGF-β1. A primeira citocina inibe a migração de LC humana por meio da regulação negativa da expressão de TNF-RII 44. As duas últimas citocinas induzem a expressão de CCR6, facilitando também a retenção de CL na epiderme 8. Durante a inflamação cutânea, a IL-10 fornece contrapeso homeostático para IL-1β e TNF-α 19. TGF-β1 inibe a migração de DC por meio da inibição da expressão de CCR7 e da regulação positiva da expressão de CD324 45.

Diferenças na migração LC e DDC

Em camundongos, LC e DDC mostram diferentes capacidades migratórias após exposição epicutânea a sensibilizadores de antígeno. Estudos em camundongos mostraram que após a exposição da pele ao corante fluorescente tetrametil rodamina isotiocianato, a migração de DDC precedeu claramente a migração de LC 46. Isso pode ser devido ao fato de que os CL demoram mais para atingir os linfonodos aferentes porque eles precisam primeiro se desprender dos KCs vizinhos. Curiosamente, dentro da zona de células T, as DDC estão localizadas no paracórtex externo logo abaixo dos folículos de células B, enquanto as LC estão localizadas no paracórtex interno rico em células T 46. Essas descobertas sugerem que DDC está envolvido na iniciação de células B, enquanto LC está envolvido na ativação de células T. A capacidade de migração diferencial e destino de linfonodo entre LC e DDC pode resultar de uma quimiocina distinta ou expressão do receptor mediador de lipídios no LC e DDC 47. Recentemente, foi sugerido que a expressão do CCR7 desempenha um papel importante nessa controvérsia. Em vitro DDC gerado adquire uma baixa expressão de CCR7, enquanto LC adquire um alto nível de expressão de CCR7 48. Este achado pode explicar a migração de LC, e não DDC, para zonas de células T dentro do linfonodo.


Agradecimentos

Os autores desejam agradecer à Dra. Ann Word pelas discussões úteis e pela leitura crítica do manuscrito. Os autores agradecem ao Dr. Borna Mehrad por fornecer o anticorpo RB6-8C5 e pelas discussões úteis durante o curso deste trabalho. Agradecemos à Dra. Judith Head por fornecer consultoria técnica para imuno-histoquímica e pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também ao Dr. David Russell pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a excelente assistência técnica de John Shelton e Kelly Straach.


5 Conclusão e perspectiva

Esta revisão destacou alguns exemplos recentes de complexos de metais de transição que foram investigados quanto à atividade antiinflamatória ou anti-autoimune. Uma estratégia comum que tem sido empregada é a coordenação de compostos antiinflamatórios ou outras moléculas bioativas a íons metálicos, resultando em maior atividade. Por exemplo, as atividades antiinflamatórias de complexos metálicos 32–35 de um derivado de 1,2-diidroquinazolinona foram superiores aos do ligante livre. 46 Isso foi atribuído à maior lipofilicidade dos complexos metálicos em comparação com o ligante livre, melhorando potencialmente a capacidade dos complexos de atravessar as membranas celulares e entrar nas células. No caso do AINE aceclofenaco 9, a complexação com zinco gerou um complexo zinco-aceclofenaco que induziu menos úlceras estomacais em ratos, embora tenha atividade antiinflamatória comparável à do fármaco original. 29 Os autores postularam que o grupo carboxila ulcerogênico do aceclofenaco poderia ser efetivamente mascarado por sua coordenação com o zinco, resultando em efeitos colaterais adversos menos graves no estômago.

A segunda estratégia utiliza complexos metálicos com ligantes lábeis que podem coordenar diretamente com biomoléculas. Trávníček e colegas de trabalho demonstraram que os complexos de ouro (I) 41 carregando ligantes substituídos de 6-benzilaminopurina e trifenilfosfina exibiram atividade antiinflamatória mais forte in vitro e in vivo para auranofina em doses equitóxicas. 63 Curiosamente, análogos contendo um grupo 2-cloro na porção adenina eram inativos in vivo, indicando que pequenas alterações na estrutura desses complexos de ouro (I) podem ter um efeito significativo em suas propriedades antiinflamatórias. 65 A terceira abordagem descrita nesta revisão envolve complexos de metal cineticamente inertes que têm como alvo biomoléculas específicas de uma forma não covalente. Por exemplo, o complexo ciclometalado de Ir (III) [Ir (ppy)2(biq)] PF6 desenvolvido por Leung, Ma e colegas de trabalho representou o primeiro inibidor de TNF-α à base de metal 48. 77 Alternativamente, a porfirina Mn, a poliamina cíclica e os derivados de salen são capazes de catalisar reações redox que eliminam as espécies reativas e suprimem o estresse oxidativo e a inflamação.

Um aspecto importante que deve ser considerado criticamente no projeto e desenvolvimento de complexos metálicos como agentes antiinflamatórios é sua toxicidade. Os efeitos colaterais adversos notáveis ​​dos medicamentos de ouro incluem úlceras orais, alteração do paladar, erupções cutâneas, pigmentação da pele, anemia (trombocitopenia) ou toxicidade renal (proteinúria, nefropatia). Além disso, também foram relatados efeitos tóxicos no cérebro. Por outro lado, os compostos de platina têm sido associados a nefrotoxicidade, neurotoxicidade, cardiotoxicidade e mielossupressão, 115 e seu uso no corpo também pode levar ao desenvolvimento de quimiorresistência por meio de múltiplos mecanismos. 116 Como o uso de complexos metálicos como agentes antiinflamatórios ainda é um tema relativamente novo e emergente, estudos extensos sobre a toxicidade dos compostos descritos nesta revisão foram realizados com pouca frequência. No entanto, como a toxicidade freqüentemente representa um dos limites mais comuns para o uso de complexos metálicos na medicina, a avaliação da toxicidade é uma etapa essencial necessária para determinar a potencial aplicação farmacológica desses complexos metálicos como agentes antiinflamatórios.

Em relação ao futuro, acreditamos que uma maior elucidação do mecanismo preciso de ação da atividade antiinflamatória dos complexos de metais bioativos é necessária a fim de facilitar o projeto racional de análogos de complexos metálicos que poderiam apresentar potência ou seletividade melhorada, ao mesmo tempo em que minimizam a toxicidade. Em particular, as potenciais transformações químicas ou reações dos complexos metálicos in vivo devem ser mais completamente caracterizadas. Além disso, acreditamos que a aplicação de complexos de metal cineticamente inertes para direcionar especificamente as biomoléculas nas células merece uma investigação mais aprofundada. Os membros das vias inflamatórias ou imunológicas celulares interagem uns com os outros por meio de interfaces proteína-proteína que são tipicamente grandes e amorfas. Essas interações proteína-proteína podem ser potencialmente direcionadas por complexos de metal cineticamente inertes que possuem ligantes de forma adequada e hidrofobicidade para se ligarem à interface proteína-proteína. Finalmente, os avanços na biologia molecular e na interactômica podem apresentar novos alvos para o desenvolvimento de novos complexos de metais antiinflamatórios ou anti-autoimunes. Dada a diversidade de estudos promissores destacados nesta revisão, prevemos que é apenas uma questão de tempo antes que os próximos complexos de metais de transição sejam aprovados na clínica para o tratamento de doenças inflamatórias ou autoimunes.


Parte 2: Um Papel para a Proteína Reorganizadora de Actina Drebrin na Função de Mastócitos

00: 00: 08.02 Olá.
00: 00: 09.12 Sou Avery August,
00: 00: 10.24 Estou na Cornell University,
00: 00: 12.02 e na segunda parte desta palestra
00: 00: 13,27 Vou falar um pouco sobre
00: 00: 15.19 alguns de nossos estudos de pesquisa
00: 00: 16,27 tentando entender a base molecular
00: 00: 18,23 para a resposta alérgica em mastócitos.
00: 00: 23.04 Então, aqui está um resumo
00: 00: 25.10 de como ocorre a resposta alérgica.
00: 00: 29.02 Você tem um alérgeno,
00: 00: 30.02 gera uma resposta IgE,
00: 00: 32.16 que IgE então reveste mastócitos e basófilos
00: 00: 36.20 para que a segunda vez que você se exponha a um alérgeno,
00: 00: 39.01 os mastócitos desgranulam
00: 00: 41.11 e você obtém estes sintomas
00: 00: 43,18 de uma resposta alérgica.
00: 00: 45.29 Portanto, estamos muito interessados ​​em tentar entender
00: 00: 48.13 a base molecular para esta resposta de degranulação,
00: 00: 50.21 porque gostaríamos de entender
00: 00: 52,26 como direcionar melhor este processo
00: 00: 55.10 para evitar a degranulação
00: 00: 57,27 e o desenvolvimento desses sintomas.
00: 01: 00.29 Então, como eu disse na primeira parte da minha palestra,
00: 01: 04.24 bloqueando mastócitos
00: 01: 06.20 e bloqueando a degranulação dos mastócitos
00: 01: 08.08 pode reduzir a liberação dos componentes,
00: 01: 10,28 e reduzindo a liberação desses componentes,
00: 01: 12,25, na verdade, reduzimos os sintomas.
00: 01: 14,28 Mas qual é a base molecular para isso?
00: 01: 17.10 Como eu disse a vocês, a droga Chromolyn
00: 01: 19,26 é capaz de fazer isso,
00: 01: 21,10, mas não entendemos muito bem como o Chromolyn funciona,
00: 01: 23,26 e também o Chromolyn tem efeitos colaterais.
00: 01: 26,22 Então, o que sabemos é que
00: 01: 29.13 o mastócito tem um receptor para IgE,
00: 01: 32.00 e que os receptores para IgE
00: 01: 34.00 é na verdade muito semelhante aos receptores
00: 01: 36.14 que são encontrados nas células T, como o receptor de células T,
00: 01: 38,22 ou nas células B, o receptor de células B.
00: 01: 40.25 E todos esses receptores,
00: 01: 42.13 o que eles têm em comum,
00: 01: 44.03 são caudas citoplasmáticas
00: 01: 45,23 que têm os chamados motivos ITAM,
00: 01: 47.11 e estes motivos ITAM
00: 01: 49.10 interagir com famílias de quinases
00: 01: 52.10 que levam a uma via de sinalização intracelular
00: 01: 54.08 que eventualmente leva à degranulação
00: 01: 56,12 e liberação de histamina,
00: 01: 58.03 como discuti na parte um,
00: 01: 59,24, bem como a produção de citocinas.
00: 02: 01.25 E então o que nos interessa é
00: 02: 05.14 tentando entender como esses caminhos
00: 02: 07.14 realmente levam a esses efeitos diferentes.
00: 02: 10.01 Então, o que sabemos é que
00: 02: 13.00 o receptor FC para IgE
00: 02: 14,16 desencadeia um aumento no cálcio intracelular,
00: 02: 16.14 e esse aumento no cálcio intracelular
00: 02: 18.10 é muito importante
00: 02: 20.09 para desgranulação e produção de citocinas,
00: 02: 23,08 e um dos compostos
00: 02: 26.02 que foi descoberto que pode realmente
00: 02: 28,24 inibir essa liberação de cálcio é
00: 02: 30.27 uma molécula que foi relatada pela primeira vez por outros laboratórios da Abbott
00: 02: 33.02 como imunossupressor.
00: 02: 34.27 E aquela molécula, que chamarei de BTP abreviadamente,
00: 02: 38.12 é realmente muito interessante,
00: 02: 40,27 porque realmente pode inibir
00: 02: 42,27 sinalização de cálcio nas células.
00: 02: 45.14 E por isso estávamos muito interessados ​​em tentar compreender
00: 02: 47,27 se este composto específico
00: 02: 50.05 também inibiria a resposta dos mastócitos in vivo.
00: 02: 53.13 Então, para fazer isso, o que fizemos
00: 02: 56.20 é que pegamos camundongos e os injetamos com IgE
00: 03: 00.25 que era específico para uma molécula
00: 03: 03.19 chamado DNP-BSA.
00: 03: 06.07 E quando injetamos aquele IgE,
00: 03: 08.17 que o IgE agora vai circular dentro do camundongo,
00: 03: 11.04 revestirá os mastócitos e basófilos,
00: 03: 13,27 e agora quando injetamos o mouse
00: 03: 16.06 com o alérgeno,
00: 03: 19.00 dentro de três minutos,
00: 03: 20.13 podemos determinar se os mastócitos irão liberar histamina,
00: 03: 23.16 que podemos então analisar.
00: 03: 25.07 Também determinamos se o BTP
00: 03: 27.04 bloquearia esse efeito.
00: 03: 29.00 E então o que descobrimos foi que
00: 03: 31,22 quando injetamos BTP em camundongos
00: 03: 33,26 uma hora antes de lhes darmos o alérgeno,
00: 03: 35.28 poderíamos obter uma redução na liberação de histamina,
00: 03: 38,24 indicando que o BTP realmente bloqueia
00: 03: 41.12 a liberação de histamina desses mastócitos.
00: 03: 43.27 A outra coisa que queríamos fazer
00: 03: 45,21 é determinar se este efeito de mastócitos
00: 03: 48,23 levaria a diferenças de temperatura.
00: 03: 52.04 Uma das coisas que acontecem
00: 03: 54.02 quando você expõe camundongos a IgE e o alérgeno
00: 03: 57,22 é que eles realmente perdem a temperatura corporal,
00: 04: 00.04 e podemos medir a temperatura corporal
00: 04: 01,28 medindo a temperatura ao longo do tempo
00: 04: 04.16 na presença ou ausência do BTP.
00: 04: 08.10 E então nessa experiência o que fizemos.
00: 04: 10.26 injetamos os camundongos com IgE e,
00: 04: 14,16 uma hora antes de lhes darmos o alérgeno,
00: 04: 16.16 demos o BTP
00: 04: 18,02 e medimos a quantidade de.
00: 04: 20.04 as mudanças de temperatura ocorridas.
00: 04: 22.12 O que você pode ver aqui
00: 04: 24.12 é uma diferença na temperatura corporal nestes ratos,
00: 04: 26.25 e você pode ver que os ratos que receberam o veículo
00: 04: 29.02 realmente perdeu a temperatura corporal,
00: 04: 31.13 enquanto os camundongos que receberam BTP
00: 04: 33.20 não perdeu a temperatura corporal.
00: 04: 35.16 E então o que aquele experimento nos indicou
00: 04: 38.04 foi que o BTP foi capaz de inibir
00: 04: 40.04 liberação de histamina nos mastócitos,
00: 04: 41.23 mas também os efeitos da degranulação dos mastócitos,
00: 04: 44,10 ou seja, perda de temperatura.
00: 04: 47,01 Então, BTP, então,
00: 04: 49,05 pode inibir a degranulação dos mastócitos
00: 04: 51,29 e pode inibir a liberação
00: 04: 54.11 do conteúdo dos grânulos dos mastócitos,
00: 04: 57,17 então queríamos descobrir se o BTP
00: 04: 59,26 pode afetar os mastócitos diretamente.
00: 05: 01.13 E assim, felizmente, podemos gerar mastócitos de forma muito simples
00: 05: 03.28 tirando medula óssea de camundongos,
00: 05: 05.24 cultivando-os na presença de citocinas,
00: 05: 08.00 interleucina-3,
00: 05: 09.18 e fator de células-tronco,
00: 05: 11.06 e 4-6 semanas depois
00: 05: 12.20 temos uma população composta em grande parte por mastócitos,
00: 05: 14,18 quase 100% de mastócitos.
00: 05: 16.10 Podemos então pegar esses mastócitos e analisá-los.
00: 05: 19.00 E a maneira como fizemos isso é
00: 05: 21.00 pegamos os mastócitos,
00: 05: 22.16 nós os incubamos com IgE durante a noite,
00: 05: 24.20, armando-os,
00: 05: 26.12 e então podemos adicionar o antígeno,
00: 05: 28.04 e ao longo do tempo podemos analisar esses mastócitos.
00: 05: 30.23 E assim fizemos isso,
00: 05: 32.12 e o que descobrimos foi que
00: 05: 34.21 em mastócitos que acabaram de ser tratados com veículo
00: 05: 36.26 temos uma boa degranulação,
00: 05: 39.13 Considerando que os mastócitos que eram
00: 05: 41.11 tratado apenas com BTP
00: 05: 43.07 e desencadeado com IgE.
00: 05: 45.04 não temos mais degranulação,
00: 05: 46,27 indicando que BTP
00: 05: 49.01 realmente inibe a degranulação dos mastócitos,
00: 05: 52.00 impedindo-os de liberar seus conteúdos,
00: 05: 54.09 incluindo histamina, heparina e TNF.
00: 05: 57,27 Então, a próxima coisa que queríamos descobrir é
00: 06: 00.03 qual é o alvo do BTP.
00: 06: 01.29 E então colaboramos com alguns químicos,
00: 06: 06.16 Blake Peterson e sua aluna Laurie Mottram,
00: 06: 09.20 e eles sintetizaram para nós
00: 06: 11.26 o BTP acoplado a um ligante e biotina.
00: 06: 15.13 E o que poderíamos fazer então
00: 06: 17.12 é tomar essa ligação BTP-biotina
00: 06: 19.18 e acoplar a uma conta
00: 06: 21.13 e determinar, usando técnicas bioquímicas padrão,
00: 06: 24.18 quais proteínas realmente interagiriam
00: 06: 26,28 com a porção BTP.
00: 06: 29.00 E então esse experimento é mostrado aqui.
00: 06: 31.09 Você pode ver que assumiríamos as contas de controle
00: 06: 34.16 e cubra-os apenas com o ligante e biotina,
00: 06: 37.18 ou contas que têm o BTP.
00: 06: 41.05 Passaríamos um extrato de proteína sobre essas contas,
00: 06: 44.09 lavaríamos todo o material estranho,
00: 06: 47.00 e então analisaríamos as proteínas
00: 06: 50.03 que realmente interagiu especificamente com as contas
00: 06: 52,06 em géis SDS-PAGE
00: 06: 54,04 por espectrometria de massa
00: 06: 56.06 para identificar proteínas associadas a BTP.
00: 06: 58.19 E então fizemos aquele experimento
00: 07: 00.09 usando lisados ​​de células,
00: 07: 03.05 e o que descobrimos foi que
00: 07: 05.15 uma proteína proeminente que foi purificada
00: 07: 07.09 nestas contas BTP
00: 07: 08.22 era uma proteína chamada drebrin.
00: 07: 10.12 E então drebrin é na verdade
00: 07: 12,24 uma proteína de ligação à actina,
00: 07: 14.12 e pode realmente interagir com a actina
00: 07: 16.25 e leva à polimerização da actina
00: 07: 20.04 quando você coloca nas células.
00: 07: 22,24 Também descobrimos que
00: 07: 25.03 quando você muta dois resíduos
00: 07: 27.14 dentro do domínio de ligação à actina de drebrin,
00: 07: 29.28 poderíamos abolir a ligação do BTP ao drebrin,
00: 07: 32.26 indicando que o BTP interagiu
00: 07: 35.02 diretamente com drebrin
00: 07: 36,21 e não de forma indireta.
00: 07: 38.08 E esses resíduos são mostrados aqui em vermelho.
00: 07: 39,24 Se transformarmos a lisina 270 e a lisina 271
00: 07: 42,17 para metioninas,
00: 07: 44.11 abolimos completamente a ligação do BTP ao drebrin,
00: 07: 47.04 ao passo que se mutássemos arginina em metionina,
00: 07: 50.17 ou glutamina para leucina,
00: 07: 52.23 mantivemos a interação,
00: 07: 54.25 indicando que essa interação é específica.
00: 07: 57.18 Para que pudéssemos mostrar, então,
00: 07: 59.18 que o BTP interage com esta proteína drebrina de ligação à actina,
00: 08: 03.07 e a drebrin é uma proteína reguladora da actina.
00: 08: 06.05 Então, isso introduziu uma área totalmente nova
00: 08: 10.03 que poderíamos explorar
00: 08: 11,27 para tentar determinar
00: 08: 13.18 qual foi a base molecular para esta resposta do receptor Fc.
00: 08: 17.24 Então, novamente, aqui está o caminho que mostrei a você,
00: 08: 19.20 e o que mostramos é que
00: 08: 22.04 cálcio, mostrado em vermelho,
00: 08: 24.02 é realmente inibido pelo BTP.
00: 08: 25.11 Eu também acabei de mostrar a vocês aquele drebrin
00: 08: 27.16 foi identificada como uma proteína que interage com BTP.
00: 08: 31,22 E então a questão era,
00: 08: 33.14 onde o drebrin se enquadra neste caminho
00: 08: 36.25 que é acionado pelo receptor FC?
00: 08: 39.13 E então fizemos alguns experimentos
00: 08: 40,28 para tentar determinar
00: 08: 42.28 se drebrin seria capaz
00: 08: 45.05 para afetar a ativação do
00: 08: 47.12 uma série dessas diferentes vias.
00: 08: 48.25 Então, para fazer isso,
00: 08: 50.10, na verdade, geramos camundongos nocaute drebrin,
00: 08: 52.06 e fizemos isso através da aquisição de células-tronco embrionárias,
00: 08: 54.24 que tinha uma cassete
00: 08: 57.26 que foi preso dentro do gene para drebrin,
00: 09: 00.06 que resultou nas células
00: 09: 02.25 não sendo capaz de fazer a proteína.
00: 09: 05.04 Geramos ratos a partir dessas células-tronco embrionárias
00: 09: 07.16 e então examinamos os cérebros desses ratos,
00: 09: 09.23 que também expressa drebrin,
00: 09: 11,21 para a expressão de drebrin.
00: 09: 12,24 E você pode ver, aqui,
00: 09: 14.12 neste western blot
00: 09: 16.17 que os cérebros do tipo selvagem
00: 09: 18.12 expressa drebrin de comprimento total,
00: 09: 19.26 enquanto os cérebros dos camundongos com deficiência de drebrin
00: 09: 22.06 não tinha nenhum drebrin.
00: 09: 24.16 Em seguida, continuamos a caracterizar esses ratos
00: 09: 27,24 para determinar se seus mastócitos
00: 09: 29,24 estavam funcionais.
00: 09: 31.03 E o que você pode ver aqui
00: 09: 33.12 é a pele do tipo selvagem de camundongos com deficiência de drebrin,
00: 09: 37.14 corado com azul de toluidina,
00: 09: 39.11 e nas setas pretas
00: 09: 41.08 você pode ver onde os mastócitos são encontrados na pele,
00: 09: 43.00 e você pode ver que o desenvolvimento de mastócitos
00: 09: 44,18 estava perfeitamente bem na ausência de drebrin
00: 09: 47,01 nestes ratos.
00: 09: 48.24 Também olhamos imagens de micrografia eletrônica
00: 09: 52,16 e você pode ver, novamente,
00: 09: 54.03 que a ultraestrutura desses mastócitos
00: 09: 55,26 estava perfeitamente bem,
00: 09: 57.16 se drebrin estava lá ou não.
00: 09: 59.20 Portanto, estávamos bastante confiantes de que, na ausência de drebrin,
00: 10: 01.10 pelo menos in vivo,
00: 10: 03.02 mastócitos foram capazes de se desenvolver
00: 10: 04.27 e eles foram encontrados no lugar certo.
00: 10: 07.02 Então, a próxima coisa que decidimos fazer
00: 10: 09.05 é perguntar se esses mastócitos
00: 10: 11.11 foram funcionais in vivo nesta análise,
00: 10: 14.21 que mostrei antes.
00: 10: 16,27 E aqui, o que fizemos de novo.
00: 10: 19.00 armamos os mastócitos in vivo
00: 10: 21.14 com IgE por injeção de IgE,
00: 10: 23,22 e então, no dia seguinte,
00: 10: 26.18 nós os desafiamos com o alérgeno
00: 10: 27,27 e três minutos depois
00: 10: 29.25 recolhemos estes ratos
00: 10: 31,18 e determinou se havia histamina.
00: 10: 32,28 E novamente, o que você vê aqui
00: 10: 35.15 é que os camundongos do tipo selvagem geraram uma grande quantidade de histamina
00: 10: 37.00 quando lhes demos o alérgeno mais IgE,
00: 10: 39.18 enquanto os camundongos com deficiência de drebrin
00: 10: 41.18 teve uma resposta de histamina muito reduzida
00h10: 44,20 nas mesmas condições.
00: 10: 46.03 Então, esses experimentos nos indicaram
00: 10: 48.19 que drebrin era muito importante para a liberação de histamina
00: 10: 51.04 de mastócitos in vivo
00: 10: 52.16 quando os ativamos com IgE.
00: 10: 55.10 O segundo experimento que fizemos
00: 10: 57.06 foi o experimento sobre o qual falei antes, que é,
00: 11: 00.13 esses camundongos com deficiência de drebrina realmente perdem a temperatura corporal
00: 11: 03.20 quando injetamos o alérgeno?
00: 11: 05.14 E então fizemos a mesma experiência.
00: 11: 06.22 Armamos os mastócitos in vivo com IgE,
00: 11: 09.24 demos a eles o alérgeno,
00: 11: 11.04 e então monitoramos a temperatura
00: 11: 12,24 por até 60 minutos depois
00: 11: 14,28 para determinar se eles perdem a temperatura corporal.
00: 11: 17.05 E o que você pode ver aqui é que
00: 11: 22.16 os camundongos do tipo selvagem que receberam veículo.
00: 11: 24.06 eles perderam a temperatura corporal,
00: 11: 27.01 na ausência de drebrin,
00: 11: 29.08 eles não perderam mais a temperatura corporal,
00: 11: 32.00 e camundongos do tipo selvagem que são tratados com BTP
00: 11: 34.02 também não perdeu mais a temperatura corporal.
00: 11: 36.10 Então, tanto no nocaute,
00: 11: 38,02, bem como o composto,
00: 11: 39.14 obtivemos o mesmo resultado.
00: 11: 40.22 Ou seja, anafilaxia sistêmica passiva
00: 11: 43,18 foi realmente reduzido
00: 11: 46,02 em resposta ao alérgeno
00: 11: 48.09 quando inibimos com BTP
00: 11: 49,26 ou quando eliminamos o gene drebrin.
00: 11: 53.25 Então, a próxima coisa que queríamos fazer,
00: 11: 55,27 é olhar para os mastócitos individuais
00: 11: 58.01 e pergunte se vimos o mesmo resultado.
00: 11: 59.11 Então, novamente, pegamos medula óssea de camundongos,
00: 12: 01.26, neste caso, camundongos do tipo selvagem ou com deficiência de drebrin,
00: 12: 04.02 cultivou-os na cultura por seis semanas,
00: 12: 06.24 e, em seguida, nós os revestimos com IgE durante a noite
00: 12: 08.20 e, em seguida, os desencadeou com alérgeno
00: 12: 10.18 para determinar se eles responderiam.
00: 12: 13,22 E então, novamente,
00: 12: 16.04 estamos olhando para a ativação de mastócitos
00: 12: 18,23 pelo receptor de IgE,
00: 12: 20,22 e primeiro vamos olhar para as respostas de cálcio
00: 12: 22.12 para ver se o cálcio foi afetado
00: 12: 24.10 na ausência de drebrin,
00: 12: 26.12 e esse experimento é mostrado aqui.
00: 12: 29.00 Pegamos os mastócitos e os carregamos
00: 12: 30,27 com um corante sensível ao cálcio,
00: 12: 33.03, então os revestimos com IgE,
00: 12: 35.00 e, em seguida, acione-os com o antígeno,
00: 12: 37.14 e você pode ver que as células do tipo selvagem,
00: 12: 39.14 em cinza claro,
00: 12: 41.16 aumenta o cálcio e esse cálcio permanece alto por muito tempo,
00: 12: 44,23 enquanto na ausência de drebrin
00: 12: 46.26 esses mastócitos aumentam o cálcio inicialmente,
00: 12: 49,24 mas o cálcio não fica alto,
00: 12: 51.20 começa a diminuir com o tempo.
00: 12: 54.01 E no gráfico inferior
00: 12: 55.29 você pode ver a inclinação dessa degradação do cálcio
00: 12: 58.05 é uma inclinação negativa
00: 13: 00.13 na ausência de drebrin nestes mastócitos,
00: 13: 02.10 ao passo que é uma inclinação positiva nas células do tipo selvagem,
00: 13: 04.29 indicando que, na ausência de drebrin
00: 13: 06.27 o que estamos realmente afetando
00: 13: 08.28 é a liberação prolongada de cálcio
00: 13: 10,26 que vemos que é necessário
00: 13: 12,26 para que esses mastócitos se degranulem e liberem seu conteúdo.
00: 13: 16.20 Então, degranulação de mastócitos, então,
00: 13: 20.08 requer a ativação de drebrin,
00: 13: 22,26 a ativação do receptor FC,
00: 13: 25.04 e lança estes conteúdos:
00: 13: 26.16 histamina, heparina e outras citocinas.
00: 13: 29.11 E então perguntamos se poderíamos
00: 13: 32,27 veja redução na degranulação
00: 13: 34.17 na ausência de drebrin nestes mastócitos.
00: 13: 36,22 Então, esse experimento é mostrado aqui.
00: 13: 39.04 Podemos estimular esses mastócitos,
00: 13: 41.04 ou mastócitos de tipo selvagem
00: 13: 42.16 ou mastócitos deficientes em drebrina,
00: 13: 44.02 com IgE e o alérgeno,
00: 13: 46,10 e de uma maneira dependente da concentração
00: 13: 48.08 você obtém um aumento na degranulação,
00: 13: 50,26 conforme medido pela liberação de β-hexosaminase.
00: 13: 54.02 Então, em mastócitos de tipo selvagem
00: 13: 55.22 você obtém um aumento na liberação de β-hexosaminase,
00: 13: 58.14 e quando drebrin está faltando,
00: 14: 01.05 você pode ver aqui que os mastócitos
00: 14: 04.06 desgranula muito menos em comparação com o tipo selvagem.
00: 14: 07.06 Portanto, a ausência de drebrin, então,
00: 14: 09.07 afeta a degranulação dos mastócitos in vitro,
00: 14: 10,26 além de reduções no cálcio intracelular ao longo do tempo.
00: 14: 16.00 E quanto às citocinas?
00: 14: 17.26 Então, eu disse a você na primeira parte da minha palestra
00: 14: 20.08 que a ativação de mastócitos com alérgeno
00: 14: 22.18 não apenas libera histaminas,
00: 14: 24.10, mas também libera citocinas,
00: 14: 26.08 e essas citocinas podem ter efeitos importantes
00: 14: 28.02 no sistema imunológico,
00: 14: 29.10, portanto, fizemos um experimento semelhante
00: 14: 31.09 onde tiramos mastócitos
00: 14: 33,27 e os estimulou
00: 14: 35.25 e perguntou se drebrin, ou a ausência de drebrin,
00: 14: 37,28 afetaria a liberação de citocinas.
00: 14: 41.12 E a liberação de citocinas.
00: 14: 43.12 algumas dessas citocinas são dependentes de cálcio
00: 14: 44.21 e algumas das citocinas não são dependentes de cálcio,
00: 14: 46.28 então olhamos para dois padrões diferentes de citocinas:
00: 14: 49.00 citocinas dependentes de cálcio
00: 14: 50.11 e citocinas independentes de cálcio.
00: 14: 53.04 E esse experimento é mostrado aqui.
00: 14: 55.04 Nos dois primeiros gráficos estão as citocinas dependentes de cálcio,
00: 14: 57,19 interleucina-2 e GM-CSF,
00: 15: 00.23 e você pode ver aqui, nos círculos preenchidos,
00: 15: 03.29 células do tipo selvagem produzem IL-2 e GM-CSF
00: 15: 08.04 perfeitamente bem,
00: 15: 09.16 mas nos mastócitos sem drebrin,
00: 15: 11.14 você pode ver que eles agora não
00: 15: 13.20 liberam as citocinas dependentes de cálcio.
00: 15: 16.02 Por outro lado, se olharmos para IL-6, no gráfico inferior,
00: 15: 19.04 que não é uma citocina dependente de cálcio,
00: 15: 21.18 você pode ver que há muito pouca diferença
00: 15: 23.03 entre as células do tipo selvagem e as células deficientes em drebrina
00: 15: 24,26 na produção de citocinas.
00: 15: 27.02 Então, esses experimentos mostram que
00: 15: 29.08 drebrin desempenha um papel fundamental
00: 15: 30.24 na regulação da sinalização de cálcio que leva à degranulação,
00: 15: 34.17, mas também sinalização de cálcio
00: 15: 36.12 levando à produção de citocinas
00: 15: 38,24 e apenas essas citocinas
00: 15: 40.10 que são dependentes de cálcio
00: 15: 41,17 são afetados pela ausência de drebrin.
00: 15: 43.24 A outra coisa que queríamos descobrir
00: 15: 48.04 é onde neste caminho
00: 15: 50.00 o drebrin mente.
00: 15: 51.02 E então fizemos uma série de experimentos
00: 15: 52.19 onde examinamos o
00: 15: 54.17 ativação das quinases Src, Syk e Tec,
00: 15: 56.18 e não houve diferença.
00: 15: 58.05 Perguntamos se a ativação PLC-gama
00: 16: 00.21 foi afetado pela ausência de drebrin,
00: 16: 02.29 e não houve diferença.
00: 16: 04.14 E então o que podemos concluir, então,
00: 16: 06.12 foi que drebrin desempenha um papel
00: 16: 08.18 em um caminho paralelo ou diferente
00: 16: 10.13 que não está a montante do PLC-gama,
00: 16: 12,25, mas na verdade ainda afeta o cálcio
00: 16: 14,24 de uma maneira
00: 16: 16.22 que não entendemos muito bem.
00: 16: 19.06 Agora, uma das coisas que eu falei para vocês
00: 16: 22.01 foi que a ativação do drebrin
00: 16: 23.16 é importante para a polimerização de actina,
00: 16: 28.03 e por isso queríamos descobrir
00: 16: 29.20 se drebrin afetaria a actina
00: 16: 32,22 nessas células.
00: 16: 33,24 Agora, a actina é muito importante
00: 16: 35.10 para a estrutura da célula,
00: 16: 38.01, mas também se mostrou importante
00: 16: 40.18 para desgranulação
00: 16: 42.20 e o movimento dos grânulos dentro das células,
00: 16: 44.24 e então a ideia de que drebrin desempenha um papel
00: 16: 47.03 não apenas na regulação da sinalização de cálcio
00: 16: 49.05, mas também na regulação do citoesqueleto de actina
00: 16: 52.07 nos levou a olhar para a actina
00: 16: 54,07 nessas células.
00: 16: 55.22 Então, fizemos alguns experimentos muito simples
00: 16: 57.20 para determinar isso.
00: 16: 59.00 Primeiro, pegamos o tipo selvagem
00: 17: 01.09 ou mastócitos deficientes em drebrina
00: 17: 02.25 e os corou com faloidina,
00: 17: 04.24 que mancha a actina F, ou filamentosa.
00: 17: 09.16 E você pode ver, de forma mais aparente,
00: 17: 11,20 é que as células do tipo selvagem
00: 17: 13,24 realmente tem uma boa actina
00: 17: 16.04 em torno do perímetro da célula,
00: 17: 18.11 mas se olharmos para as células deficientes de drebrin
00: 17: 20.19 você pode ver que eles têm mais actina
00: 17: 22.04 e a actina é realmente distribuída
00: 17: 24.16 não apenas no perímetro da célula,
00: 17: 26,14, mas começa a se estender dentro da célula.
00: 17: 28.04 Então, queríamos quantificar um pouco mais,
00: 17: 30.23 e então fizemos citometria de fluxo
00: 17: 32.14 com essas células
00: 17: 34.01 usando faloidina marcada,
00: 17: 36.01 e você pode ver aqui
00: 17: 38.07 que os mastócitos do tipo selvagem, em sólidos,
00: 17: 41.01 tem menos actina se você olhar
00: 17: 43,23 na intensidade média de fluorescência
00: 17: 45.14 do que os mastócitos que não têm drebrin.
00: 17: 50.13 Então, na ausência de drebrin,
00: 17: 51.27 esses mastócitos, na verdade, têm F-actina aumentada,
00: 17: 54.11 que pode estar afetando a resposta.
00: 17: 57.15 Então, queríamos explorar isso um pouco mais
00: 17: 59.01 e pergunte, o que acontece com a F-actina
00: 18: 01.11 quando essas células são realmente estimuladas?
00: 18: 04.06 E então o que fizemos foi pegar esses mastócitos
00: 18: 06.23 e os estimulou da mesma forma que
00: 18: 08.17 nós os estimulamos antes,
00: 18: 09,23 com IgE e alérgeno,
00: 18: 11.03 e olhamos para F-actina ao longo do tempo
00: 18: 13,07 nessas células.
00: 18: 15.00 E este é um slide um pouco complicado
00: 18: 17.11 e eu o explicarei lentamente.
00: 18: 19,07 À direita você pode ver que os mastócitos do tipo selvagem
00: 18: 22.12 começam com actina no tempo zero,
00: 18: 23.25 a maior parte da actina está na borda da célula.
00: 18: 26,14 no perímetro da cela.
00: 18: 28.05 Dois minutos após a ativação,
00: 18: 29.18 você pode ver que a F-actina
00: 18: 31.04 começa a se mover dentro da célula,
00: 18: 33.20 com o aumento do sinal
00: 18: 36,14 em 2 minutos, 5 minutos e 10 minutos,
00: 18: 38,26 e, em seguida, por 30 minutos, na parte inferior,
00: 18: 40.29 a célula é muito semelhante a uma célula
00: 18: 43.03 que não foi ativado.
00: 18: 44,13 Então, em células de tipo selvagem,
00: 18: 45.29 há um aumento na F-actina
00: 18: 47,23 que é reorganizado
00: 18: 50.03 longe do perímetro da célula
00: 18: 52.15 em direção ao meio da célula
00: 18: 54,03 e depois volta
00: 18: 56.01 para o perímetro da cela.
00: 18: 58.04 Se olharmos para os mastócitos deficientes de drebrin,
00: 19: 00.04 você pode ver que no momento 0,
00: 19: 02.09 a actina é distribuída por toda a célula,
00: 19: 04.07 não apenas no perímetro,
00: 19: 06.07 e esse padrão não muda muito
00: 19: 08.27 à medida que estimulamos as células ao longo do tempo.
00: 19: 11.15 Portanto, alterações induzidas pelo receptor de IgE FC
00: 19: 15.05 são diferentes entre as células do tipo selvagem
00: 19: 18.20 e as células deficientes em drebrin,
00: 19: 20,19 no espaço e no tempo.
00: 19: 23.17 E podemos quantificar isso
00: 19: 25,03 comparando a diferença
00: 19: 26,27 entre as células deficientes em drebrina
00: 19: 28.07 e as células de tipo selvagem em cada ponto de tempo,
00: 19: 31.04 estatisticamente, e você pode ver isso aqui.
00: 19: 33.14 no eixo y no gráfico à esquerda,
00: 19: 37.05 que no momento 0,
00: 19: 40.03 há uma grande diferença na localização da F-actina nessas células,
00: 19: 42,27 e isso muda conforme a célula é ativada,
00: 19: 45.19, mas em todos os casos há uma diferença estatisticamente significativa
00: 19: 49,03 na localização da actina
00: 19: 51,09 nas células do tipo selvagem
00: 19: 53.01 em comparação com as células deficientes em drebrina.
00: 19: 56.09 Então, quais são esses experimentos
00: 19: 58,29 indicado para nós
00: 20: 00.18 foi que o drebrin estava regulando
00: 20: 02.18 a superestrutura da F-actina nestes mastócitos.
00: 20: 05.11 Então, fizemos a pergunta,
00: 20: 07.28 podemos relaxar a superestrutura F-actina
00: 20: 10.10 nestas células deficientes em drebrina
00: 20: 12,20 e resgate a função
00: 20: 14,19 na ausência de drebrin?
00: 20: 15,29 Então, usamos um composto
00: 20: 17,26 chamada latrunculin B.
00: 20: 18.29 O que a latrunculina B faz
00: 20: 20.19 é que se liga à F-actina
00: 20: 22.14 e aumenta sua mobilidade,
00: 20: 24.11 ou reduz a quantidade de F-actina nas células.
00: 20: 27.15 E o que eu mostro aqui na [esquerda]
00: 20: 30.20 são gráficos de citometria de fluxo
00: 20: 32.06 de mastócitos deficientes em drebrina
00: 20: 33,27 tratados com latrunculin B,
00: 20: 35.07 e você pode ver aqui,
00: 20: 36,22 na tabela da [direita],
00: 20: 38.00 conforme aumentamos a quantidade de latrunculin B,
00: 20: 39,27 reduzimos a quantidade de F-actina
00: 20: 42,29 nessas células.
00: 20: 44.07 Então, podemos usar latrunculin B
00: 20: 45.19 para ajustar a quantidade de F-actina nessas células,
00: 20: 47,22 e agora podemos fazer a pergunta,
00: 20: 49.15 se reduzirmos a quantidade de F-actina nessas células deficientes de drebrina,
00: 20: 52.25 podemos resgatar a desgranulação?
00: 20: 55.20 E esse experimento é mostrado aqui.
00: 20: 57.25 Então, aqui nos círculos pretos
00: 21: 00.02 são mastócitos de tipo selvagem
00: 21: 02.14 que estimulamos com IgE e antígeno,
00: 21: 05.07 de uma forma dependente da concentração,
00: 21: 07.01 e temos um aumento na degranulação
00: 21: 09.00 durante esse período de tempo.
00: 21: 11,12 Na ausência de drebrin,
00: 21: 13.01 nos círculos abertos,
00: 21: 14.08 você pode ver que os mastócitos deficientes em drebrin
00: 21: 18.19 na verdade degranulam muito menos.
00: 21: 22.18 No entanto, quando tratamos esses mastócitos deficientes em drebrin
00: 21: 25,13 com 0,5 ou 1 [micromolar] latrunculina B,
00: 21: 28.17 podemos resgatar parcialmente a degranulação,
00: 21: 30,26 indicando que permitir F-actina
00: 21: 32.11 para ser mais fluido nessas células
00: 21: 34.13 permite que essas células agora
00: 21: 37.07 ser capaz de degranular.
00: 21: 39.17 Então, podemos resumir, então,
00: 21: 41,05, colocando drebrin neste caminho,
00: 21: 44,11 de certa forma
00: 21: 46.13 que o receptor FC desencadeia a ativação
00: 21: 48.02 dessas tirosina quinases,
00: 21: 49,22 que leva à ativação
00: 21: 51.06 de uma série de caminhos diferentes,
00: 21: 53,02 incluindo drebrin,
00: 21: 54.15 e o que drebrin faz
00: 21: 56.01 é controlar a quantidade de F-actina nessas células,
00: 21: 57,23 para controlar a sinalização de cálcio
00: 21: 59,22 e / ou desgranulação dessas células
00: 22: 02.14 para que possam divulgar seu conteúdo,
00: 22: 04.15 produzem citocinas,
00: 22: 06.11 e participar na resposta alérgica.
00: 22: 09.09 E então, com isso,
00: 22: 10.15 Gostaria de agradecer às pessoas que fizeram o trabalho no laboratório.
00: 22: 12.13 A maior parte deste trabalho foi feito
00: 22: 14,27 pelas pessoas mostradas em vermelho.
00: 22: 16.25 Mankit Law foi a principal pessoa
00: 22: 19.19 que dirigiu a maior parte da obra,
00: 22: 21.03 com a ajuda de vários pós-doutorandos
00: 22: 22.25 e alunos de pós-graduação no laboratório.
00: 22: 24.17 Colaboramos com Laurie Mottram e Blake Peterson,
00: 22: 27.05 junto com Tomo Shirao e Hiro Yamazaki
00: 22: 29,29 na Gunma University.

  • Parte 1: Alergias e o sistema imunológico

Discussão

Os resultados apresentados demonstram uma relação entre o perfil de populações de células progenitoras pulmonares putativas e doenças pulmonares crônicas. Foram identificadas relações específicas entre o aumento de progenitores semelhantes aos epiteliais CCSP + e a fibrose cística e entre o aumento dos fibrócitos circulantes e doenças fibróticas, como fibrose pulmonar e bronquiolite obliterante. Além disso, os resultados sugerem o envolvimento de mediadores quimiotáticos chave, incluindo SDF-1, SCGF-β e MCP-1 no recrutamento ou manutenção dessas populações de células nos grupos de doenças específicos estudados.

Em nossa publicação anterior [8], relatamos que a medula óssea murina contém uma população de células que expressam CCSP em sua superfície. Isso foi confirmado por PCR em populações classificadas por FACS, western blotting e com o uso de camundongos nocaute CCSP. Essa população demonstrou uma maior propensão para expressar um fenótipo epitelial pulmonar em nível de gene e proteína e foi preferencialmente retida no pulmão lesado, em comparação com outras células da medula óssea e contribuiu para o revestimento epitelial após o transplante de medula óssea. Como resultado dessas propriedades, denominamos essas células de células progenitoras semelhantes a epiteliais. Também relatamos que a medula humana contém uma população semelhante por citometria de fluxo. Aqui, confirmamos que a medula óssea humana e o sangue periférico contêm tais células usando sondas de PCR específicas baseadas em Taqman. Digno de nota, a quantidade de mRNA de CCSP é aproximadamente 60 vezes menor do que os tecidos brônquicos, mas muitas vezes maior do que outros tipos de células da medula óssea.

A avaliação de populações de células progenitoras de fibroblastos e semelhantes a epiteliais em pacientes com doença pulmonar crônica em estágio terminal não foi relatada anteriormente. Nossa hipótese é que, ao estudar essas doenças variáveis, a medição de duas populações de células com funções potencialmente contraditórias forneceria um entendimento mais completo. Na verdade, existem diferenças significativas nessas populações de células quando comparadas entre as doenças subjacentes. Especificamente, as células CCSP + na medula óssea e no sangue periférico aumentaram em pacientes com FC, onde o dano epitelial das pequenas vias aéreas e lesão podem ser um estímulo predominante e persistente. Reconhecendo as diferenças entre lesão pulmonar aguda e crônica, e entre estudos em camundongos e humanos, essas descobertas apóiam nossas observações originais em camundongos, onde essas células aumentaram após uma lesão das vias aéreas induzida por naftaleno específico do epitélio. Especulamos que isso pode ser atribuído a um esforço sustentado, mas não resolvido, para reparar o epitélio danificado de FC, levando a um ambiente inflamatório persistente, resultando em um sinal de recrutamento perpétuo para a medula óssea e acúmulo da população progenitora semelhante a epitelial CCSP +. Foi relatado anteriormente que o epitélio brônquico de pacientes com FC é mais proliferativo do que as vias aéreas sem FC [12]. Os xenoenxertos humanizados das vias aéreas, em que as células derivadas de FC retratam um maior potencial proliferativo, foram posteriormente caracterizados por remodelamento, diferenciação retardada e respostas pró-inflamatórias alteradas [13].

A observação de que os fibrócitos circulantes estão aumentados nas doenças fibróticas está de acordo com as evidências anteriores [10, 14]. Também documentamos que os pacientes com BO são um subconjunto particularmente notável em termos de número muito alto de fibrócitos [11]. Isso apóia a hipótese de que os fibrócitos circulantes podem contribuir para a população de fibroblastos do pulmão, seja por meio da ativação parácrina de fibroblastos endógenos ou por enxerto e contribuição direta para a deposição e remodelação da matriz. A medição das populações de progenitores epiteliais e mesenquimais identificou mudanças nesses números de células que correspondem às mudanças na patologia pulmonar epitelial ou mesenquimal subjacente. Especificamente, progenitores semelhantes a epiteliais aumentados foram identificados na FC, onde o epitélio é hiperplásico, enquanto os progenitores mesenquimais foram aumentados na doença caracterizada por fibroproliferação. Embora muitos mecanismos comuns existam em pacientes com doença pulmonar em estágio terminal, a biologia única da FC versus doença pulmonar fibrótica pode ser mais bem descrita por essas novas diferenças no número de células progenitoras, abrindo novos caminhos de investigação.

É importante ressaltar que não foram encontradas correlações entre a idade do paciente, sexo ou IMC, sugerindo que esses parâmetros demográficos não parecem influenciar as mudanças observadas nos perfis celulares. No entanto, foi identificada uma correlação entre a proporção de CCSP + BMCs e PBMCs, sugerindo uma relação entre o número de células da medula óssea em reserva e o número que pode sair e trafegar através do sangue periférico. Verificou-se que o SCGF-β se correlaciona significativamente com o número de ambas as populações de células CCSP +. É possível que o SCGF-β possa atuar como um mitógeno endógeno para os progenitores do tipo epitelial, conforme descrito para as células hematopoiéticas CD34 + [15], embora a fonte direta desse fator não tenha sido determinada neste estudo. Nenhuma correlação foi identificada entre as populações de células CCSP + e a proporção de fibrócitos circulantes. Isso sugere que mecanismos distintos podem ser responsáveis ​​pelo recrutamento de cada população e argumenta contra uma alteração generalizada na mobilização ou tráfico de células derivadas da medula.

Este estudo tem várias limitações, sendo a mais importante o desenho transversal. Estudos futuros serão necessários para obter dados de pacientes em vários pontos durante o desenvolvimento de sua doença pulmonar. No entanto, é duvidoso que a amostragem da medula óssea seja possível em um estudo de acompanhamento longitudinal. Nesses pacientes, todos com doença pulmonar em estágio final grave aguardando transplante de pulmão, não houve relação significativa entre células CCSP + BMCs / PBMCs ou CD45 + Collagen-1 + e razão FEV1 / FVC em pacientes com FC ou DPOC ou com a% prevista FVC para pacientes com fibrose pulmonar. Isso não exclui a possibilidade de que essas populações de células contribuam para a patologia da doença pulmonar, e análises adicionais em pacientes em estágios muito anteriores da doença pulmonar serão importantes prioridades futuras. Além disso, muitos outros parâmetros clínicos importantes influenciam a função pulmonar e essas variáveis ​​de confusão podem ter obscurecido qualquer relação entre o número de células e a função pulmonar. Outra limitação é o uso de doadores de pulmão como grupo controle. Embora não seja ideal, já que este grupo pode muito bem ter dano agudo ou crônico ao pulmão, ele representou a única opção para análise da medula óssea, já que a colheita do esterno de controles verdadeiramente normais não seria ética.

Em um esforço para compreender os mecanismos responsáveis ​​por diferentes perfis de células progenitoras entre doenças pulmonares, as principais quimiocinas e receptores foram analisados. Foi relatado que os fibrócitos expressam vários receptores importantes de quimiocinas, incluindo CXCR4 [9], CCR2 [16] e CCR7 [17]. Quando CCSP + BMCs e PBMCs foram analisados ​​para um painel de receptores semelhantes, a expressão de CCR2, CCR4, CXCR3 e CXCR4 foi identificada. Espera-se que algumas vias sejam redundantes e algumas citocinas tenham a capacidade de ativar ambas as populações de células. Esta é talvez uma evidência da origem da medula óssea de ambas as populações.

Estudos de migração para CCSP + foram realizados para investigar o em vitro resposta a várias quimiocinas. A migração não foi analisada para fibrócitos, como foi relatado anteriormente [9, 18]. Aqui, descobrimos que o Fator Derivado do Estroma (SDF-1) foi um estímulo de migração importante para células CCSP +, como também foi relatado para fibrócitos. Foi relatado anteriormente que anticorpos neutralizantes contra SDF-1 podem atenuar os efeitos fibróticos da lesão pulmonar induzida por bleomicina em camundongos [9]. A expressão pulmonar de SDF-1 também foi relatada no contexto de lesão pulmonar e recrutamento de células derivadas da medula óssea [19]. O SCGF-β também induziu a migração de CCSP + PBMCs e BMCs em pacientes com doença pulmonar em estágio terminal. Isto suporta a correlação observada entre esta citocina plasmática e o número de células CCSP + medidas. A expressão dos transcritos de SCGF-β está supostamente restrita às células da linhagem mieloide [20], que pode incluir macrófagos pulmonares residentes. A expressão de CCR2 por ambas as populações de células, bem como o aumento dos ligantes IP-10 e MCP-1 na fibrose pulmonar, destaca ainda mais o papel da inflamação em muitas doenças pulmonares em estágio terminal. A concentração plasmática de MCP-1 mostrou ainda estar correlacionada ao número de fibrócitos circulantes, identificando novamente um papel para o recrutamento de células progenitoras mediado por CCR2, que pode ser aumentado no paciente fibrótico.

Curiosamente, MIF foi encontrado para ser especificamente aumentado em pacientes com FC, talvez sugerindo um papel único para CD74 ou CXCR4 no mecanismo de recrutamento de células CCSP +. Foi relatado que MIF pode atuar como um ligante para CXCR4 e induzir a migração de monócitos e células T, talvez sugerindo um novo mecanismo de tráfego de células progenitoras semelhantes a epiteliais [21, 22]. MIF é um mediador inflamatório pleiotrópico com funções semelhantes às das quimiocinas que podem direcionar a migração de leucócitos para locais inflamatórios [21].MIF também foi mostrado para ser produzido por células epiteliais [23] e macrófagos alveolares ativados [24], sugerindo um mecanismo potencial pelo qual o epitélio de FC danificado recruta células CCSP + circulantes. Aumentar o recrutamento de CCSP + usando MIF pode não ser uma opção terapêutica viável, pois o MIF atua em vários tipos de células e pode exacerbar as respostas inflamatórias.


Materiais e métodos

Animais.

Camundongos C57BL / 6, CX3CR1 gfp / + (9) e CD11b-DTR (fornecido por J.S. Duffield, Harvard Medical School, Boston, MA) (47) foram criados e usados ​​de acordo com a legislação francesa. Os experimentos foram conduzidos com 4–8 semanas de idade.

Lesão muscular e preparação muscular.

10 μl de notexina (25 μg / ml em PBS Latoxan) foram injetados no TA. Para a análise histológica, os músculos foram preparados conforme descrito anteriormente (27). A análise quantitativa da regeneração muscular foi realizada em toda a área lesada: aproximadamente sete campos (20 × PL Flustar Carl Zeiss MicroImaging, Inc. objetiva) foram analisados ​​em cada camundongo, representando 300-400 fibras por camundongo. O diâmetro da miofibra foi avaliado após a imunomarcação do colágeno IV (consulte Immunolabeling) em aproximadamente sete campos (objetivo de 20 ×) em cada camundongo. O pequeno diâmetro de apenas miofibras nucleadas centralmente foi avaliado no músculo de regeneração tardia (área não hachurada na Fig. 8 B) com o software Axiovision 4.6 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.), representando 250–350 fibras por camundongo. Em camundongos injetados com PBS, o fascículo puncionado foi omitido da análise.

Isolamento de MOs / MPs do músculo.

A fáscia do TA foi removida. Os músculos foram dissociados em DMEM contendo colagenase B 0,2% (Roche Diagnostics GmbH) e tripsina-EDTA 0,2% a 37 ° C por 45 min duas vezes, filtrados e contados. As células CD45 + foram isoladas usando classificação magnética (Miltenyi Biotec) e coradas com anticorpo anti-Gr1 conjugado com PE ou PC5 (que reage com Ly-6C e Ly-6G, mas apenas Ly-6C é expresso por MOs eBioscience). As células foram classificadas usando um classificador de células (Epics Elite Beckman Coulter). Foram utilizadas populações apresentando pureza & gt90%. Em algumas experiências, foram usados ​​anticorpos CD11c, I-A b (BD Biosciences) e F4 / 80 (AbD Serotec) conjugados com PE. A análise foi realizada com citômetro (FACSCalibur BD Biosciences).

Rotulagem de MOs de sangue.

A rotulagem de MOs circulantes foi realizada exatamente como descrito anteriormente (15) com microesferas simples (Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres 0,5μm, 2,5% sólidos PolySciences, Inc.) e clo-lip, que foram preparadas conforme descrito anteriormente (79). O clodronato foi um presente da Roche Diagnostics GmbH.

Esgotamento de MOs circulantes e i.m. MPs.

12 ng / g DT foi i.v. injetado em camundongos CD11b-DTR. O sangue foi colhido retroorbitalmente em vários momentos após a injeção, e as células foram marcadas com anticorpos anti-CD11b, anti-Gr1 e F4 / 80 e analisadas por citometria de fluxo. Por causa das altas variações interindividuais (3-12% de PBMCs), o número de MOs circulantes em camundongos de controle foi normalizado para 5% de PBMCs para cada série (média calculada com & gt25 camundongos). Para esgotar os MOs / MPs infiltrados, 25 ng / g DT em & lt10 μl foi i.m. injetado nos dias 5 e 6 após a lesão. Os controles incluíram injeção de PBS.

Immunolabeling.

As lâminas de músculo foram incubadas com anticorpo anticolágeno IV (1:50 Chemicon International, Inc.) revelado com anticorpo anti-coelho conjugado com Cy5. As células selecionadas de camundongo foram centrifugadas em lâminas e marcadas com 1 μg / ml de anticorpo anti-Ki67 (Abcam plc), revelado com anticorpo anti-coelho conjugado com FITC. As mpcs humanas cultivadas foram incubadas com 60 μg / ml de anticorpo antidesmina (Abcam plc), revelado por um anticorpo anti-coelho conjugado com Cy3, e com 10 μg / ml de anticorpo antimiogenina (BD Biosciences), revelado por um anti-camundongo biotinilado (Vector Laboratórios) e por diclorotriazilaminofluoresceína-estreptavidina (Beckman Coulter). Os controles incluíram incubação com IgGs de coelho inteiro ou camundongo. Outros anticorpos secundários e IgGs foram obtidos de Jackson ImmunoResearch Laboratories.

RT-PCR.

O RNA total foi preparado a partir de células selecionadas usando o mini kit RNeasy (QIAGEN). 0,5 μg de RNA total foi transcrito reversamente usando a transcriptase reversa Superscript II e amplificado com uma Taq DNA polimerase de platina (Invitrogen) e os seguintes primers específicos (sentido e anti-sentido, respectivamente): β2 microglobulina, 5′-CAGTTCCACCCGCCTCAC-3 ′ e 5 ′ -CACATGTCTCGATCCCAG-3 ′ TNF-α, 5′-TTCCAGATTCTTCCCTGAGGT-3 ′ e 5′-TAAGCAAAAGAGGAGGCAACA-3 ′ IL-1β, 5′-TGACGTTCCCATTAGACAACTG-3 ′ e 5′-CCGTACCTA, 5′-CCGTACCTA GAGACGGAATACAGGGCTTTC-3 'e 5'-TCTCTGTGGAGCTGAAGCAAT-3' IL-10, 5'-ACCAGCTGGACAACATACTGC-3 'e 5'-TCACTCTTCACCTGCTCCACT-3' SLPI, 5'-CCTTAAGCTTGAGAAGCCACA-3 'e 5'-AGCACTTGTATTTGCCGTCAC e PPAR-γ, 5′-AAGAGCTGACCCAATGGTTG-3 ′ e 5′-GGATCCGGCAGTTAAGATCA-3 ′. A amplificação foi realizada a 94 ° C, 60 ° C e 72 ° C durante 1 min para cada etapa durante 30 ciclos. 10 μl de produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2% contendo brometo de etídio para visualização. A quantificação foi realizada por meio do software Image (Scion).

Cultura mpc humana.

Os componentes do meio de cultura foram adquiridos da Invitrogen. As mpcs humanas foram cultivadas a partir de amostras musculares no momento da cirurgia corretiva, em conformidade com a legislação francesa (Code de la Santé Publique, livre II), conforme descrito anteriormente (26).

Cultura de células MP humanas.

Os MPs foram diferenciados dos MOs isolados de sangue humano, conforme descrito anteriormente (26). Os MPs diferenciados foram posteriormente cultivados em meio RPMI 1640 contendo 15% de FBS ou meio RPMI 1640 avançado contendo 0,5% de FBS (suplementado com 1% de piruvato de sódio, 10 mM de Hepes, 50 μM de β-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos não essenciais, 100 × 1 % vitaminas). Os MPs foram tratados, ou não, por 48 h com 1 μg / ml de LPS (Sigma-Aldrich) e 10 ng / ml de IFN-γ (PeproTech), ou 10 ng / ml de IL-4 (PeproTech) ou 80 ng / ml DEX (Sigma-Aldrich) e IL-10 10 ng / ml (PeproTech).

Fagocitose.

necrose mpc foi induzida por H2O tratamento durante 1 h a 37 ° C. 100% das células eram positivas para iodeto de propídio. Os mpcs necróticos foram semeados em MPs (cinco mpcs mortos para um MP) durante 3 h a 37 ° C. As culturas de MP foram lavadas três vezes para remover o material não digerido e posteriormente cultivadas em meio suplementado de RPMI 1640 avançado sem soro ao longo de 24 h para fazer meio condicionado. Em alguns experimentos, as células foram tratadas, conforme descrito anteriormente, com 10 μg / ml de colchicina (Sigma-Aldrich) (40), 1 μg / ml de citocalasina D (Sigma-Aldrich) (41) ou 40 μg / ml de anexina V recombinante (BD Biosciences) (42). A fagocitose foi quantificada nas mesmas condições após a incubação com microesferas fluorescentes (conforme descrito em Marcação de MOs sanguíneos). O número de células LX + foi quantificado em microscópio invertido e expresso como porcentagem do total de células.

Co-culturas.

Os mpcs foram semeados em culturas de MP previamente preparadas (proporção de MP / mpc de 3: 1) em meio suplementado de RPMI 1640 avançado, exceto em alguns experimentos em que MPs e mpcs foram semeados juntos antes de o tratamento de MP ser aplicado, conforme descrito na cultura de células de MP humano.

Comportamento mpc.

o crescimento do mpc foi avaliado conforme descrito anteriormente (26). A proliferação de mpc foi estimada pela incorporação de BrdU (Roche Diagnostics GmbH). A diferenciação de mpc foi avaliada pela contagem do número de células miogenina + entre células desmina +. A fusão mpc foi estimada contando o número de núcleos por miotubo.

Análise estatística.

Todos os experimentos foram realizados usando pelo menos três culturas ou animais diferentes em experimentos independentes. Os estudantes t teste foi usado para análises estatísticas. P & lt 0,05 foi considerado significativo.


Assista o vídeo: THE INFLAMMATORY RESPONSE (Agosto 2022).