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Alguém pode me vincular a recursos sobre a eficiência da ligadura de ponta adesiva?

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Eu realmente gostaria de saber se a ligadura da extremidade pegajosa poderia ser realizada com eficiência muito alta e quais fatores influenciam isso. No entanto, não consigo encontrar nenhum artigo sobre o assunto, embora tenha certeza de que existem. Eu esperava que alguém soubesse de alguma literatura.


O melhor recurso para solucionar problemas de ligações que encontrei (e uso com frequência) é esta página NEB. Isso pressupõe que você já tenha consultado as instruções fornecidas com a enzima que está usando. No meu caso é T4 Ligase, novamente da NEB. É útil verificar as perguntas frequentes e as referências listadas nessa página. Além disso, você pode usar a ferramenta Calculadora Molar na configuração de Ligadura (veja mais no primeiro link).

Boa sorte com alta eficiência!


Para medir a frequência de indels no local da ligação, você pode usar um vetor com um local de restrição exclusivo no gene lacZ. Com um ensaio colorimétrico, você pode contar o número de cfu branco. A ligação perfeita in-frame produz cfu azul


Promega Connections

Um dos métodos mais fáceis para clonar fragmentos de DNA de extremidades cegas, incluindo produtos de PCR, é a clonagem de vetor T, como com pGEM®-T ou pGEM®-T Easy Vector Systems. Este método tira vantagem da saliência "A" adicionada por uma enzima de PCR como Taq DNA Polimerase. Os vetores T são plasmídeos linearizados que foram tratados para adicionar saliências 3 ′ T para coincidir com as saliências A da inserção. A inserção é ligada diretamente ao vetor de plasmídeo de cauda T com T4 DNA ligase. A inserção pode então ser facilmente transferida do vetor T para outros plasmídeos usando os locais de restrição presentes na região de clonagem múltipla do vetor T.

Revisão de polimerases como Pfu não adicione saliências “A” para que os produtos de PCR gerados com essas polimerases tenham extremidades cegas. Em um blog anterior, discutimos um método simples para adicionar uma cauda A a qualquer fragmento de DNA de extremidade cega para permitir a clonagem do vetor T. A seguir, pensamos na próxima etapa: Ligadura.

Preparação de Ligadura

Você embotou sua inserção de DNA de interesse (de PCR, digestão com enzimas de restrição ou mesmo DNA genômico cortado e embotado), certificou-se de que o fragmento tem cauda A e está pronto para clonar em um vetor T (por exemplo, pGEM ® -T Vector fácil). A próxima etapa é tão simples quanto misturar alguns microlitros de seu produto purificado com o vetor de clonagem na presença de DNA ligase, tampão e ATP.

Estime a concentração do DNA inserido preparado pelo método espectrofotométrico ou compare a intensidade da coloração do seu produto de PCR com o padrão de peso molecular do DNA de tamanho semelhante e concentração conhecida em um gel de agarose. Se a concentração de DNA do vetor for desconhecida, estime a concentração do vetor pelo mesmo método que você escolheu para a inserção.

É uma boa ideia configurar várias proporções de vetor: inserir DNA para determinar a proporção ideal para um determinado vetor e inserir. Lembre-se de que a relação vetor: inserto mudará dependendo do tamanho do inserto. Na maioria dos casos, uma proporção molar de 1: 1 ou 1: 3 de vetor: inserção funciona bem, mas você pode querer considerar 1: 5, 5: 1 e até mesmo uma proporção de 10: 1.

A equação para o cálculo da quantidade de inserto necessária em uma razão molar específica de vetor: inserto é:
[(ng do vetor × kb tamanho da inserção) ÷ kb tamanho do vetor] × (quantidade molar da inserção ÷ quantidade molar do vetor) = ng da inserção

Exemplo:
Quanto DNA de inserção de 500 bp precisa ser adicionado a 100 ng de vetor de 3,0 kb em uma reação de ligação para uma proporção desejada de vetor: inserção de 1: 3?
Resposta: [(vetor de 100 ng × inserção de 0,5 kb) ÷ vetor de 3,0 kb] × (3 ÷ 1) = inserção de 50 ng

Se a matemática parecer intimidante, não se preocupe. Nossas calculadoras BioMath estão aqui para ajudar!

Se você estiver interessado em mais detalhes sobre como configurar uma ligadura, dê uma olhada neste vídeo útil:

Dicas para clonagem de vetores T

Aqui estão algumas coisas para lembrar enquanto você trabalha:

  1. Nucleases podem degradar as saliências T no vetor. Certifique-se de usar água esterilizada e sem nuclease em suas reações de ligadura.
  2. Use células competentes de alta eficiência (≥1 × 10 8 cfu / μg DNA) para as transformações. A ligação de fragmentos com uma saliência de base única pode ser ineficiente, por isso é essencial usar células com uma alta eficiência de transformação para obter um número razoável de colônias.
  3. Limite a exposição do seu produto de PCR à luz ultravioleta de ondas curtas para evitar a formação de dímeros de pirimidina. Use uma placa de vidro entre o gel e a fonte de UV. Se possível, visualize apenas o produto de PCR com uma fonte de UV de onda longa ou use algo como Diamond® Nucleic Acid Dye que permite visualizar seu DNA sem o uso de UV.

Para obter mais informações sobre clonagem, consulte nosso Guia de tecnologia de subclonagem.

Você é um estudante ou um cientista em início de carreira em busca de solução de problemas e recursos de instruções? Ou você supervisiona os membros do laboratório de nível básico? Confira nosso Centro de Recursos do Aluno para mais artigos, vídeos e ferramentas úteis!


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Resultados e discussões

Visão geral do método de clonagem AFEAP

O mecanismo de clonagem AFEAP para a montagem de fragmentos múltiplos é mostrado na Fig. 1a. A clonagem AFEAP requer duas rodadas de PCRs para gerar a sequência adaptadora saliente nas extremidades 5 'de cada molécula de DNA que pode se associar para ligar segmentos de DNA. Todos os cortes entre dois fragmentos adjacentes são unidos pela T4 DNA ligase sem a introdução de quaisquer sequências de cicatriz. O ponto crucial para uma clonagem AFEAP bem-sucedida é atribuir uma região "saliente". Como mostrado nas Fig. 1a e b, a saliência pode ser uma sequência curta no terminal 5 'dos ​​locais de junção. A clonagem AFEAP requer dois conjuntos de primers (Fig. 1b). Os primers do primeiro conjunto são primers padrão direto e reverso que flanqueiam a região saliente atribuída. Os primers do segundo conjunto são projetados com sequência adicional de saliência em suas extremidades 5 'que serão incorporadas ao produto de PCR. Em detalhes, a montagem de fragmentos de DNA com clonagem de AFEAP em plasmídeo circular requer quatro etapas (Fig. 1a): (i) Na primeira rodada de PCR, várias PCRs são realizadas em paralelo com os primers diretos e reversos do primeiro conjunto, ou seja, Fw1-1 e Rv1-1, Fw2-1 e Rv2-1, Fw3-1 e Rv3-1, ..., e Fwn-1 e Rvn-1, para produzir fragmentos de DNA de fita dupla, ou seja, dsDNA 1, dsDNA 2, dsDNA 3,…, dsDNA n (ii) Na PCR de segunda rodada, dois PCRs de iniciador único são executados em paralelo com cada um dos iniciadores direto e reverso do segundo conjunto, ou seja, Fw1–2 ou Rv1– 2, Fw2–2 ou Rv2–2, Fw3–2 ou Rv3–2,…, ou Fwn-2 ou Rvn-2, usando cada produto de DNA gerado no PCR de primeira rodada como modelo. Os PCRs de segunda rodada rendem vários pares de produtos de DNA de fita simples complementares que contêm as regiões salientes desejadas em suas extremidades 5 ′, ou seja, ssDNA1a / ssDNA 1b, ssDNA 2a / ssDNA 2b, ssDNA 3a / ssDNA 3b, ... ou ssDNA na / ssDNA nb (iii) os produtos complementares de DNA de fita simples gerados na etapa 2 recozem para formar fragmentos de DNA de fita dupla com saliência 5 ′ desemparelhada (iv) Esses fragmentos de DNA de fita dupla são subsequentemente montados "lado a lado" . Os cortes nos DNAs de várias partes recozidos são selados por ligase para formar o plasmídeo transformável. Os vetores reconstituídos são transformados em competentes E.coli as células e os locais de união podem ser confirmados por sequenciamento de DNA.

Clonagem AFEAP. uma Os detalhes esquemáticos mostram o fluxograma da montagem de vários fragmentos com clonagem AFEAP. A primeira PCR produz fragmentos de DNA lineares (etapa 1) e é seguida por uma segunda PCR assimétrica (um primer) (etapa 2) e anelamento subsequente (etapa 3) que insere saliências sobrepostas na extremidade 5 'de cada fragmento de DNA. Esses fragmentos de DNA de fita dupla são posteriormente montados "de mãos dadas" (etapa 4). Os cortes nos DNAs de várias partes recozidos são selados por DNA ligase para formar o plasmídeo transformável (etapa 4), seguido por transformação bacteriana para produzir os plasmídeos desejados, que é confirmada por sequenciamento de DNA (etapa 4). b Uma clonagem AFEAP típica mostrando a região de saliência e os dois conjuntos de iniciadores de dois fragmentos adjacentes. Fw: primer direto, Rv: primer reverso, OH: região saliente, ssDNA: DNA de fita simples

Determinação de parâmetros para montagem efetiva

Para determinar as condições ideais para clonagem AFEAP, avaliamos os efeitos de cinco fatores-chave, como comprimento da saliência, tamanho dos fragmentos de DNA, saliência projetada como extremidade 5 'de G / C ou A / T, tratamento com ligase e condições de transformação, que tínhamos a hipótese de ser importante para a clonagem AFEAP. Um conjunto de fragmentos de DNA com tamanhos variados (Fig. 2a) foi utilizado para avaliar o sistema de reação e sua eficiência de montagem. Os primers projetados para montar as extremidades 3 ′ e 5 ′ de DNAs lineares para formar o círculo foram listados no arquivo adicional 2: Tabela S2. Os produtos de PCR foram submetidos ao protocolo de clonagem AFEAP como mencionado acima (Fig. 1a). A eficiência de montagem da clonagem AFEAP foi caracterizada como unidades formadoras de colônia (CFUs) por micrograma de DNA ligado após a transformação e a porcentagem de clones contendo os vetores desejados em relação ao total de vetores sequenciados foi calculada como fidelidade. Os locais de união de cada montagem foram confirmados por sequenciamento de DNA (arquivo adicional 3: Figura S1).

Determinação de parâmetros para uma montagem efetiva. uma Flowsheet da montagem das extremidades 3 ′ e 5 ′ do fragmento linear de DNA para formar o círculo. Os efeitos do comprimento da saliência na eficiência de montagem foram caracterizados como unidades formadoras de colônias (CFUs) por micrograma de DNA ligado (b) e porcentagem de colônias corretas (fidelidade) (c). d Efeitos da projeção projetada como 5 ′ final de G / C ou A / T. As CFUs relativas produzidas da saliência projetada como extremidade 5 ′ de G ou C são apresentadas como porcentagens das CFUs da projeção projetada como extremidade 5 ′ de A ou T no mesmo tamanho de construção. e Efeitos do tratado com ligase. As CFUs relativas produzidas de ligase tratada são apresentadas como percentagens das CFUs de nenhuma ligase tratada com o mesmo tamanho de construção. f Efeitos das condições de transformação

Primeiro testamos os efeitos do comprimento da saliência. O comprimento das saliências do DNA testado varia de 0 a 20 bp. O comprimento da saliência mostrou efeitos marcantes na eficiência de montagem (Fig. 2b e c). Uma saliência, que é inferior a 2 nucleotídeos nos produtos de PCR, é insuficiente para a montagem, resultando assim em clones positivos baixos. A partir da saliência de 4 nucleotídeos em diante, um aumento acentuado da eficiência da clonagem AFEAP é observado até 10 bp, com o pico de eficiência em 9.000 CFUs e 98% das colônias corretas. A partir da saliência de 10 nucleotídeos, as saliências mais longas usadas diminuem ligeiramente a eficiência. Como resultado, a saliência de 5–8 nucleotídeos é, portanto, adequada para clonagem AFEAP com alta eficiência e baixo custo. E então investigamos os efeitos do tamanho dos fragmentos de DNA. Cinco pontos de tamanho diferentes, ou seja, 5,5, 8,0, 15, 20 e 30 kb foram testados. O CFU diminuiu significativamente com fragmentos de tamanho de DNA mais longos (Fig. 2b), enquanto a fidelidade não mudou significativamente dentro do comprimento da faixa de projeção testada (Fig. 2c). Além disso, avaliamos os efeitos das saliências projetadas como 5 ′ final de G / C ou A / T. A eficiência de montagem de fragmentos de DNA, especificamente para aqueles de fragmentos de DNA mais longos, está se beneficiando da extremidade 5 'da saliência como um G ou C (Fig. 2d). Além disso, testamos os efeitos do tratamento com ligase. Como mostrado na Fig. 2e, a eficiência de montagem para fragmentos de tamanhos diferentes aumentou significativamente quando tratados com ligase. Por último, avaliamos os efeitos das condições de transformação, como eletroporação ou transformação química, na eficiência da montagem. A eletroporação deu maior eficiência, mas menor fidelidade (Fig. 2f).

As condições ideais para a montagem de DNA eficaz com clonagem AFEAP foram resumidas e listadas na Tabela 1.

Montagem de vários fragmentos

Após desenvolver e otimizar o método de clonagem AFEAP, sua eficiência e precisão na montagem de múltiplos fragmentos foram avaliadas. Testamos os efeitos do número do fragmento de DNA, tamanho final do plasmídeo, a razão molar entre fragmentos de DNA mais longos e mais curtos e as condições de transformação.

Para avaliar os efeitos do número de fragmentos na eficiência, construímos um pET22b-FLAG-T4 L-GGSGGvinculador-MCM6 construção em tandem, que codifica a lisozima T4 (T4 L) [20] e a proteína MCM6 fundida por um ligante peptídico, a partir de um número variável de fragmentos de DNA (8,0 kb, Fig. 3a). Os produtos de PCR foram submetidos ao protocolo de clonagem AFEAP como mencionado acima (Fig. 1a). Os locais de junção de cada montagem foram confirmados por sequenciamento de DNA (arquivo adicional 4: Figura S2). Avaliamos primeiro os efeitos da razão molar entre os fragmentos de DNA mais longos e mais curtos. Foi demonstrado que a razão molar é crítica para a obtenção de maior eficiência de montagem. Ao aumentar a razão molar de fragmentos de DNA mais curtos para mais longos de 1: 6 para 20: 1, a eficiência de montagem aumentou 6 vezes (Fig. 3b). Mas da proporção de 10: 1 em diante, a eficiência de montagem aumentou ligeiramente. Em comparação, a fidelidade de montagem não variou significativamente para todas as condições testadas (Fig. 3b). Como resultado, a razão molar foi determinada como 10: 1 para alta eficiência e baixo custo. E então testamos os efeitos do número do fragmento de DNA. Como esperávamos, a eficiência de montagem AFEAP mostrou um sólido negativo com o aumento do número de fragmentos de DNA para montagem (Fig. 3c). O CFU por μg de DNA caiu para cerca de 100 ao montar 13 fragmentos (Fig. 3c). Em contraste, a fidelidade caiu ligeiramente, mas permaneceu & gt76% mesmo para a montagem de 13 fragmentos. Em comparação com o método de Gibson comumente usado, o método de clonagem AFEAP apresentou maior eficiência de montagem (Fig. 3c), demonstrando o bom desempenho desta nova abordagem. Além disso, avaliamos os efeitos das condições de transformação na eficiência de montagem de múltiplos fragmentos com o método AFEAP. A eletroporação deu maior eficiência, mas menor fidelidade, o que é semelhante ao mencionado acima (Fig. 3d).

Eficiência de montagem de múltiplos fragmentos de DNA com clonagem AFEAP. uma Os detalhes esquemáticos mostram o mecanismo de caracterização do número de fragmentos. A sequência de DNA que codifica as proteínas T4 L e MCM6 é dividida em vários fragmentos, conforme mostrado por setas de duas pontas. O número de fragmentos para cada montagem é mostrado à esquerda das setas de duas pontas e os locais de junção para a montagem são indicados abaixo das linhas tracejadas. T4 L: lisozima T4. V: vetor (backbone). b Efeitos da razão molar entre fragmentos de DNA mais longos e mais curtos. c CFU e fidelidade em função do número do fragmento. d Efeitos das condições de transformação

Em seguida, avaliamos os efeitos do tamanho final do plasmídeo. Reunimos quatro plasmídeos diferentes de tamanhos crescentes, mantendo o número de fragmentos em seis (Fig. 4a). Os quatro plasmídeos escolhidos foram um plasmídeo pET22b de 11,5 kb abrigando um cluster de gene biossintético de avermectina (GenBank: AB032524.1) [21], um pET22b de 19,6 kb abrigando um cluster de gene de cosmomicina (GenBank: DQ280500.1) [22], um pET22b de 28 kb hospedando o cluster de gene biossintético de enterocina (GenBank: AF254925.1) [23], e um plasmídeo pET22b de 35,6 kb que abriga o cluster de gene de biossíntese de aureotina aurABCDEFGHI (GenBank: AJ575648.1) [24]. Os locais de junção de cada montagem foram confirmados por sequenciamento de DNA (arquivo adicional 5: Figura S3). Como mostrado na Fig. 4b, a eficiência de montagem mostrou uma correlação negativa com o tamanho do plasmídeo montado. Ao montar o plasmídeo de tamanho 8 kb, mais de 1490 CFUs / μg de DNA ligado foram gerados com uma precisão de 92%. Em contraste, a eficiência de montagem diminuiu para 1402, 1329, 1206 e 921 CFUs / μg quando plasmídeos de 11,5, 19,6, 28 e 35,6 kb foram montados, respectivamente. Mesmo assim, a acurácia ainda é superior a 82% na montagem do plasmídeo de 35,6 kb, o que confirma a alta capacidade desse método de montagem independente da sequência.

Efeitos do tamanho do plasmídeo na eficiência de montagem. uma Os clusters de genes escolhidos de 6 kb, 14,1 kb, 22,5 kb e 29,1 kb usados ​​para a caracterização do tamanho da construção. b Eficiência em função do tamanho da construção

Construção de plasmídeo maior

Como a clonagem AFEAP mostra a capacidade de montagem de fragmentos grandes, testamos a viabilidade da clonagem AFEAP para construir um cromossomo artificial bacteriano (BAC), que contém a inserção de sequência de DNA de 200 kb. Consequentemente, procedemos à montagem do cluster de biossíntese de salinomicina (200 kb GenBank: HE586118.1) [25] a partir do Streptomyces albus subsp. albus (ATCC ® 55,161 ™) no vetor pCC1BAC ™ (Epicenter ®) entre o local BamH I (353–358) e o local Hind III (383–388) para formar um BAC. Como DNA polimerases regulares só podem amplificar até 40 kb com alta fidelidade, planejamos dividir essa sequência de DNA de 200 kb em 8 sequências curtas consecutivas, que são então montadas em BAC com clonagem de AFEAP. A Figura 5a mostra a estratégia para construir BAC com o método de clonagem AFEAP. O procedimento de clonagem detalhado pode ser encontrado no arquivo Adicional 6: Informações de Suporte. A Figura 5b mostra os produtos de DNA resultantes por clonagem AFEAP avaliados por eletroforese em gel de agarose a 1%, e as 8 partes consecutivas de DNA e o esqueleto do vetor linear foram unidos um ao outro e deslocados para um peso molecular mais alto (Fig. 5b, pista 11). A presença de nove sítios de junção foi confirmada por sequenciamento de DNA (Fig. 5b). 34 ± 13 UFC / μg foram obtidos na transformação com uma precisão de 46,7 ± 4,7%. Estes resultados demonstram que a clonagem AFEAP pode ser uma ferramenta poderosa de montagem de DNA para fragmentos múltiplos, especialmente para DNA grande de até 200 kb.

Construção de plasmídeo maior. uma Diagrama esquemático da montagem de BAC de 200 kb com método de clonagem AFEAP. (b, painel superior) A eletroforese de agarose mostra a amplificação de PCR usando os primers listados no arquivo adicional 2: Tabela S2. Pista 1: escada de DNA de 1 kb Pista 2–9: produtos de PCR de PCRs de primeira rodada Pista 10: Recozimento de produtos de PCR de PCRs de segunda rodada antes da ligação Pista 11: após a ligação. As amostras de DNA foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1%. (b, abaixo do painel) Validação de sequenciamento dos locais de junção de re-junção. As regiões salientes são marcadas por caixas vermelhas


Teste rápido de urina

O que é um teste rápido de urina?

Um teste de urina & # x000a0rapid é a maneira mais rápida de testar a urina. Isso envolve a imersão de uma tira de teste com pequenos campos coloridos quadrados na amostra de urina por alguns segundos. Depois disso, você tem que esperar um pouco para que o resultado apareça. Dependendo da concentração da substância específica que você está testando, os campos da tira de teste mudam de cor. Em seguida, as cores resultantes dos campos são comparadas com uma tabela de cores. A tabela de cores pode ser encontrada na embalagem do teste de urina. Mostra quais cores indicam valores normais e anormais.

Em um teste rápido de urina, uma tira de teste é mergulhada na urina e então comparada com os campos coloridos na embalagem.

Os testes rápidos de urina geralmente são feitos como parte dos exames de rotina & # x02013, por exemplo, no consultório de um médico de família, durante as consultas pré-natais, ao ser admitido no hospital ou antes da cirurgia. Eles também são usados ​​em pessoas com sintomas agudos, como dor na parte inferior do abdome, dor de estômago ou nas costas, dor ao urinar com frequência ou sangue na urina. Algumas pessoas com diabetes usam este teste para verificar seus níveis de açúcar.

Os testes rápidos de urina podem ser feitos em consultórios médicos, no hospital ou em casa. As tiras-teste estão disponíveis sem receita na farmácia ou na Internet. Mas eles não se destinam a fins de autodiagnóstico e devem ser usados ​​em consulta com um médico. & # X000a0

Que substâncias um teste rápido de urina pode detectar? & # X000a0

Muitas substâncias são geralmente encontradas apenas em certas quantidades na urina, portanto, níveis mais altos ou mais baixos indicam um desvio da norma.


Resultados

A fusão de FnCas12a e 5′-3 ′ ssDNA exonuclease pode aumentar a eficiência de edição em células HEK293T

O Cas12a gera extremidades DSB escalonadas, que podem ser facilmente combinadas pelo emparelhamento de bases Watson-Crick e, portanto, favorecem o caminho de reparo NHEJ preciso que não contribui para a eficiência geral de edição (Fig. 1A). Para aumentar a eficiência de edição de genes de FnCas12a, assumimos que enviesar a via de reparo DSB em NHEJ impreciso fundindo uma exonuclease de ssDNA com FnCas12a que degradará as extremidades pegajosas perfeitamente compatíveis (Fig. 1A). Para testar nossa hipótese, selecionamos seis candidatos a exonuclease ssDNA, incluindo Artemis de humano, RecJ e polA-exo de Escherichia colie exonuclease do fago T5, fago T7 e fago λ. Cada um deles foi fundido ao terminal N ou C de FnCas12a como fusões candidatas para testes de comparação da eficiência de edição (Fig. 1B). O ensaio T7E1 mostrou que T5 EXO teve o efeito mais significativo na melhoria da eficiência indel de FnCas12a, aumentando em 216% no terminal N de FnCas12a e 141% no terminal C de FnCas12a (Fig. 1C). Embora FnCas12a-Artemis e ecRecJ-FnCas12a tenham mostrado eficiência indel ligeiramente maior do que FnCas12a, o restante dos candidatos não melhorou a eficiência de edição de FnCas12a. Considerando que T5 EXO-FnCas12a fundido com N-terminal exibiu maior eficiência indel e um tamanho menor do que todas as outras fusões candidatas, nós o escolhemos para testes de edição de genoma subsequentes, e doravante nos referiremos a ele como TEXT.

FIGO. 1. Edição de genes mediada por FnCas12a, EXO-FnCas12a e FnCas12a-EXO em células HEK293T. (UMA) Ilustração do sistema FnCas12a e EXO-FnCas12a / FnCas12a-EXO e vias de reparo de DNA correspondentes. O FnCas12a gera extremidades pegajosas totalmente compatíveis, que são reparadas principalmente pela via de junção de extremidade não homóloga precisa (NHEJ) e, portanto, não contribuem para a eficiência de inserção e exclusão (indel). O FnCas12a fundido com exonuclease pode degradar a saliência do DNA de fita simples após a clivagem e pode influenciar a via de reparo celular principalmente em NHEJ impreciso, o que resultará no aumento da eficiência indel. (B) Ilustração esquemática do cassete de expressão FnCas12a / EXO-FnCas12a / FnCas12a-EXO. (C) Frequências indel relativas induzidas por FnCas12a, EXO-FnCas12a e FnCas12a-EXO. A eficiência da edição de genes foi analisada usando o ensaio T7E1. (Imagens de gel são mostradas na Figura Suplementar S1.) Imagens coloridas estão disponíveis online.

Edição do genoma de TEXTO em vários locais de diferentes linhas de células

Para traçar o perfil do sistema TEXT ainda mais, projetamos crRNAs FnCas12a para alvejar três loci - DNMT1, CCR5 e GAPDH - em diferentes linhas de células, incluindo células HEK293T, células Hela e células B3 epiteliais de lente humana (HLEB3). Em comparação com FnCas12a no locus DNMT1, o sistema TEXT melhorou a eficiência de edição de genes em até 172% em células Hela e 330% em células HLEB3 (Fig. 2A). No locus CCR5, TEXT mostrou eficiência de edição duas a três vezes maior do que FnCas12a em todas as três linhas de células (Fig. 2B). Notavelmente, no locus GAPDH, FnCas12a mostrou apenas cerca de 0,3% de eficiência de edição em células HEK293T e níveis indetectáveis ​​de edição em células Hela e HLEB3, enquanto TEXT melhorou drasticamente a eficiência de edição de genes, com um aumento de 10 vezes nas células HEK293T e com eficiência de edição em células Hela e HLEB3 (Fig. 2C). Estes resultados indicam que o sistema TEXT pode geralmente aumentar a eficiência de edição de genes de FnCas12a em células humanas, variando de 2 a 10 vezes mais eficiência em nossos testes, e pode editar significativamente os locus que anteriormente não podiam ser editados por FnCas12a.

FIGO. 2. Comparação da eficiência de edição de genes do sistema FnCas12a e do sistema TEXT nas linhas celulares HEK293T, Hela e HLEB3. (UMA) Eficiência de edição de genes do sistema FnCas12a e do sistema TEXT para o ser humano DNMT1 gene em células Hela e HLEB3. (B) Eficiência de edição de genes do sistema FnCas12a e do sistema TEXT para o ser humano CCR5 gene em células HEK293T, Hela e HLEB3. (C) Eficiência de edição de genes do sistema FnCas12a e do sistema TEXT para humanos GAPDH gene em células HEK293T, Hela e HLEB3. A porcentagem de Indel em cada locus foi determinada usando o ensaio T7E1 e é expressa como a média ± desvio padrão de três réplicas biológicas (*p & lt 0,05 **p & lt 0,01 ***p & lt 0,001 bicaudal t-teste). (As imagens do gel são mostradas nas Figuras Suplementares S2 – S4). Imagens coloridas estão disponíveis online.

Comprimento variável do espaçador de crRNA para otimizar a eficiência de edição de TEXTO

A região espaçadora de crRNA usa pareamento de base Watson-Crick para localizar o complexo Cas12a-crRNA ou sistema TEXT em loci genômicos específicos. Foi relatado que otimizando o comprimento do espaçador de crRNA variando de 18 a 23 nt, a eficiência de corte de CRISPR-Cas12a pode ser aumentada. Normalmente, 21 nt pode atingir maior eficiência de edição do que outros comprimentos ao usar FnCas12a. 16 De forma semelhante, a fim de investigar o comprimento do espaçador ideal de crRNA para edição de genes mediada por TEXT em células humanas, construímos uma série de crRNAs com diferentes comprimentos de espaçador variando de 18 a 23 nt, e testamos a eficiência de edição de gene de TEXT no locus DNMT1. Consistente com um relatório anterior, 16 descobrimos que crRNA com um comprimento de espaçador de 20–21 nt pode permitir maior eficiência de edição de genes ao usar FnCas12a (Fig. 3B), enquanto o sistema TEXT requer um comprimento de espaçador de 21–23 nt para atingir o corte máximo eficiência (Fig. 3B). Além disso, é importante notar que quando o comprimento do espaçador do crRNA era de 18 nt, a eficiência de edição do FnCas12a diminuiu drasticamente para 1,2%. No entanto, o sistema TEXT manteve mais de 10% de eficiência de edição. No geral, esses resultados confirmaram que o sistema TEXT é compatível com uma ampla gama de comprimentos de guia.

FIGO. 3. Diferentes comprimentos de espaçadores de crRNA resultam em padrões de clivagem distintos e eficiência de edição de genes. (UMA) Padrão de clivagem de FnCas12a sob diferentes comprimentos de espaçador crRNA (18-23 nt). Com um espaçador de 18 nt (crRNA-18 nt), os locais de clivagem do FnCas12a ocorreram principalmente após a 13ª e 14ª bases na fita não-alvo e a partir das 22ª bases na fita alvo. Com um espaçador de 19 nt, os locais de clivagem do FnCas12a ocorreram principalmente após a 14ª, 13ª e 17ª bases na fita não-alvo e a partir da 22ª bases na fita-alvo. Com um espaçador de 20 nt, os locais de clivagem do FnCas12a ocorreram principalmente após a 18ª, 17ª e 16ª bases na fita não-alvo e a partir das 18ª e 19ª bases na fita alvo. Com um espaçador de 21–22 nt, os locais de clivagem do FnCas12a ocorreram principalmente após as 18ª bases na fita não-alvo e a partir da 21ª e 22ª bases na fita alvo. Com um espaçador de 23 nt, os locais de clivagem do FnCas12a ocorreram principalmente após a 18ª base na fita não-alvo e a partir da 20ª, 21ª e 22ª bases na fita alvo. Os locais de clivagem são indicados por setas vermelhas. (B) Eficiência de edição de genes do sistema FnCas12a e do sistema TEXT para o locus DNMT1 humano com diferentes comprimentos de espaçador de crRNA em células HEK293T. As imagens de gel são mostradas na Figura Suplementar S5. (C) Aumento da eficiência de edição do sistema TEXT em comparação com FnCas12a em diferentes comprimentos de espaçador. A proporção foi determinada pela fórmula UMA/B, Onde UMA e B representam a eficiência de edição de genes de TEXT e FnCas12a, respectivamente. (D) A proporção relativa de deleções para inserções induzidas por FnCas12a ou o sistema TEXT com comprimentos espaçadores de 18-23 nt de crRNA. (E) As proporções relativas de exclusões de tamanhos diferentes entre as deleções totais que foram induzidas por FnCas12a ou o sistema TEXT com comprimentos espaçadores de 18-23 nt de crRNA. (F) Razão do tamanho das deleções (1–30 nt) induzida pelo sistema TEXT com um espaçador de 18 nt de crRNA. (Imagens de gel são mostradas na Figura Suplementar S5. Razão do tamanho das deleções (1–30 nt) induzida por FnCas12a e o sistema TEXT com outros comprimentos espaçadores de crRNA são mostrados nas Figuras Suplementares S6 e S7). Imagens coloridas estão disponíveis online.

TEXT melhora a edição de genes sob diferentes comprimentos de crRNA

Anteriormente, acreditava-se que o Cas12a cortaria o DNA na 18ª base a jusante do local PAM na fita não-alvo e na 23ª base na fita alvo. 9 No entanto, recentemente, foi relatado que os locais de clivagem FnCas12a estão localizados após a 13ª, 14ª, 18ª e 19ª bases na fita não alvo e da 21ª a 24ª bases na fita alvo, 29 o que apóia o esquema de que FnCas12a tem um padrão de clivagem diferente ao usar diferentes comprimentos de espaçador de crRNA (Fig. 3A). Quando o comprimento do espaçador de crRNA é 18 nt, o que normalmente direciona Cas12a para gerar extremidade pegajosa de 8–9 nt, a eficiência de edição de genes do sistema TEXT é 11 vezes maior do que FnCas12a (Fig. 3A e C). Quando o comprimento do espaçador é 19 nt, o que direciona Cas12a para gerar uma extremidade pegajosa de 5–9 nt, TEXT pode aumentar a eficiência de edição de FnCas12a em cinco vezes (Fig. 3A e C). Quando o comprimento do espaçador é de 20-23 bp, com extremidade pegajosa de 3-5 nt, a eficiência de edição de genes de TEXT é cerca de duas vezes maior do que FnCas12a (Fig. 3A e C).

Análise de sequenciamento profundo de padrões indel TEXT

Além disso, analisamos o padrão indel de TEXT e FnCas12a com diferentes comprimentos de espaçador de crRNA por sequenciamento profundo (Fig. 3D-F). Em geral, TEXT induziu uma maior eficiência indel do que FnCas12a (Fig. 3B e C). Além disso, a razão entre a frequência de exclusão e a frequência de inserção (del / in) é significativamente maior em TEXT do que em FnCas12a (Fig. 3D). Ao usar o espaçador crRNA de 18 nt, o TEXT aumentou o del / in de FnCas12a de 20,17 para 92,86, enquanto só aumentou de 56,78 para 80,84 ao usar o espaçador crRNA de 23 nt (Fig. 3D). Em seguida, medimos os comprimentos das deleções geradas por TEXT e FnCas12a. Ao usar FnCas12a, sob diferentes comprimentos de espaçador de crRNA de 18 a 23 nt, a proporção de tamanhos de deleção & lt3 bp e & lt6 bp são cerca de 20% e 30-40%, respectivamente, enquanto ao usar TEXT, os tamanhos de deleção que são & lt3 bp e & lt6 bp representam 10% e 20%, respectivamente (Fig. 3E). É importante notar que quando o comprimento do espaçador é 18 nt, o tamanho de deleção que é & lt6 bp é 42,6% por FnCas12a e 14,3% por TEXTO (Fig. 3E). Além disso, analisamos o padrão de deleção e descobrimos que a proporção de deleção de 8–9 nt de TEXT é de até 41,2% com um crRNA de comprimento de espaçador de 18 nt, enquanto que de FnCas12a é de 9,8% (Fig. 3F). Em seguida, para entender melhor o papel de T5-EXO na edição de TEXTO, analisamos os dados de sequenciamento de próxima geração para gerar um padrão de indels detalhado de TEXTO, no qual a maioria dos alelos de exclusão não contém a sequência das saliências 5 ′ (arquivo suplementar S5). Os resultados confirmam ainda que o sistema TEXT melhora a eficiência de edição de genes de FnCas12a ao ressecar a saliência de fita única 5 'nas extremidades de DSB. Coletivamente, o sistema TEXT aumentou substancialmente a frequência de deleção e o tamanho de deleção no locus alvo.

TEXT realiza edição eficiente no alvo com o mínimo de efeitos fora do alvo

A caracterização adicional do sistema TEXT mostrou atividades de edição substanciais em células humanas. Comparamos a eficiência de edição de FnCas12a, TEXT, LbCas12a e AsCas12a, com NTTV PAMs em células humanas. Em todos os casos, observamos maior eficiência de edição alcançada por TEXT do que por FnCas12, LbCas12a e AsCas12a (Fig. 4A). Em particular, o TEXT mostrou atividades de edição robustas em vários locais de destino endógenos com ATTV e GTTV PAMs em comparação com AsCas12a e LbCas12a (Fig. 4A). Estes resultados confirmam que o TEXT reconhece o TTV PAM, o que ajudará a direcionar os sites genômicos que não são acessíveis para LbCas12a e AsCas12a. Em seguida, determinamos os efeitos fora do alvo de TEXT em comparação com FnCas12a, LbCas12a e AsCas12a. Usamos ferramentas de previsão CRISPR RGEN para gerar um conjunto de locais fora do alvo potenciais e descobrimos que apenas um local fora do alvo tinha eficiência detectável por TEXT e outros ortólogos Cas12a, enquanto a maioria dos locais fora do alvo previstos mostraram efeitos fora do alvo indetectáveis ​​(Fig . 4B). Os resultados indicaram que o sistema TEXT não aumenta significativamente os efeitos fora do alvo ao aumentar a eficiência da edição no alvo.

FIGO. 4. Comparação das eficiências de edição e efeitos fora do alvo entre os ortólogos TEXT e Cas12a em uma ampla gama de alvos endógenos. (UMA) Comparação da eficiência indel de TEXT, FnCas12a, LbCas12a e AsCas12a em vários locais do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) em células HEK293T. Quatro tipos de PAM (ATTV, CTTV, GTTV e TTTV) foram analisados, nos quais três a quatro locais diferentes foram selecionados para representar cada tipo de PAM. A eficiência de Indel foi detectada pelo ensaio T7E1. (B) Perfil fora do alvo de TEXT, FnCas12a, LbCas12a e AsCas12a em loci selecionados em células HEK293T. (Locais fora do alvo e seus primers de amplificação estão listados no Arquivo Suplementar S4. As imagens de gel são mostradas nas Figuras Suplementares S8 – S15). Imagens coloridas estão disponíveis online.


Aqui estão algumas questões a serem consideradas ao selecionar um método de controle de natalidade:

  • O método evita bem a gravidez? Para saber se um método funciona bem, observe o número de gestações em 100 mulheres que usaram esse método durante um período de 1 ano.
  • Quais são seus sentimentos sobre engravidar? Uma gravidez não planejada criaria sofrimento ou angústia para uma mulher ou seu parceiro? Ou uma gravidez seria bem-vinda se ocorresse antes do planejado?
  • Quanto custa um método de controle de natalidade? O seu plano de seguro paga por isso?
  • Quais são os riscos para a saúde? Converse sobre esses riscos com seu médico antes de acreditar no que ouve de outras pessoas.
  • O seu parceiro está disposto a aceitar e usar um determinado método de controle de natalidade?
  • Você quer um método que só precise usar quando fizer sexo? Ou você quer algo que esteja no lugar e sempre funcionando?
  • A prevenção de infecções transmitidas por contato sexual é importante? Muitos métodos não o protegem contra infecções sexualmente transmissíveis (DSTs). Os preservativos são a melhor escolha para prevenir DSTs. Eles funcionam melhor quando combinados com espermicidas.
  • Disponibilidade: o método pode ser usado sem receita, uma visita do provedor ou, no caso de menores, com consentimento dos pais?

MÉTODOS DE BARREIRA DE CONTROLE DE NASCIMENTO

  • Um preservativo é uma bainha fina de látex ou poliuretano. O preservativo masculino é colocado em torno do pênis ereto. O preservativo feminino é colocado dentro da vagina antes da relação sexual.
  • Um preservativo deve ser usado em todos os momentos durante a relação sexual para evitar a gravidez.
  • Os preservativos podem ser comprados na maioria das farmácias e supermercados. Algumas clínicas de planejamento familiar oferecem preservativos gratuitos. Você não precisa de receita para obter preservativos.

DIAFRAGMA E TAMPA CERVICAL:

  • Um diafragma é um copo de borracha flexível que é preenchido com creme ou geleia espermicida.
  • É colocado na vagina sobre o colo do útero antes da relação sexual, para evitar que os espermatozoides cheguem ao útero.
  • Deve ser deixado no local por 6 a 8 horas após a relação sexual.
  • Os diafragmas devem ser prescritos pelo profissional de saúde da mulher. O provedor determinará o tipo e tamanho corretos de diafragma para a mulher.
  • Cerca de 5 a 20 gravidezes ocorrem ao longo de 1 ano em 100 mulheres que usam este método, dependendo do uso adequado.
  • Um dispositivo semelhante, menor, é denominado capuz cervical.
  • Os riscos incluem irritação e reações alérgicas ao diafragma ou espermicida e aumento da frequência de infecção do trato urinário e infecção vaginal por fungos. Em casos raros, a síndrome do choque tóxico pode se desenvolver em mulheres que deixam o diafragma por muito tempo. Um capuz cervical pode causar um teste de Papanicolau anormal.
  • As esponjas anticoncepcionais vaginais são moles e contêm uma substância química que mata ou "desativa" os espermatozoides.
  • A esponja é umedecida e inserida na vagina para cobrir o colo do útero antes da relação sexual.
  • A esponja vaginal pode ser comprada na sua farmácia sem receita médica.

MÉTODOS HORMONAIS DE CONTROLE DE NASCIMENTO

Alguns métodos de controle de natalidade usam hormônios. Eles terão um estrogênio e uma progesterona, ou apenas uma progesterona. Você precisa de uma receita para a maioria dos métodos hormonais de controle de natalidade.

  • Ambos os hormônios impedem o ovário de uma mulher de liberar um óvulo durante seu ciclo. Eles fazem isso afetando os níveis de outros hormônios que o corpo produz.
  • Os progestágenos ajudam a evitar que os espermatozoides cheguem ao óvulo, tornando o muco ao redor do colo do útero espesso e pegajoso.

Os tipos de métodos hormonais de controle da natalidade incluem:

    : Estes podem conter estrogênio e progesterona, ou apenas progesterona. : Estas são pequenas hastes implantadas sob a pele. Eles liberam uma dose contínua de hormônio para prevenir a ovulação. , como Depo-Provera, que são administrados nos músculos da parte superior do braço ou das nádegas uma vez a cada 3 meses.
  • O adesivo de pele, como Ortho Evra, é colocado no ombro, nas nádegas ou em outro local do corpo. Ele libera uma dose contínua de hormônios.
  • O anel vaginal, como o NuvaRing, é um anel flexível com cerca de 5 centímetros de largura.É colocado na vagina. Ele libera os hormônios progesterona e estrogênio. : Este medicamento pode ser comprado sem receita na sua farmácia.
  • O DIU é um pequeno dispositivo de plástico ou cobre colocado dentro do útero da mulher pelo seu provedor. Alguns DIUs liberam pequenas quantidades de progesterona. O DIU pode ser deixado no local por 3 a 10 anos, dependendo do dispositivo usado.
  • Os DIUs podem ser colocados quase a qualquer hora.
  • Os DIUs são seguros e funcionam bem. Menos de 1 em cada 100 mulheres por ano engravidará usando um DIU.
  • Os DIUs que liberam progesterona podem ser usados ​​no tratamento de sangramento menstrual intenso e na redução das cólicas. Eles também podem fazer com que os períodos parem completamente.

MÉTODOS PERMANENTES DE CONTROLE DE NASCIMENTO

Esses métodos são melhores para homens, mulheres e casais que têm certeza de que não desejam ter filhos no futuro. Eles incluem vasectomia e laqueadura tubária. Esses procedimentos às vezes podem ser revertidos se uma gravidez for desejada em um momento posterior. No entanto, a taxa de sucesso para reversão não é alta.


O que esperar após a ablação cardíaca

Como é a recuperação?

Depende do tipo de procedimento que você tem:

Ablação por cateter. Você pode precisar passar uma noite no hospital, mas a maioria das pessoas pode ir para casa no mesmo dia. Nesse caso, você vai descansar em uma sala de recuperação por algumas horas enquanto uma enfermeira observa de perto sua frequência cardíaca e pressão arterial. Você precisa ficar deitado e imóvel para evitar sangramento de onde sua pele foi cortada. Planeje que alguém o leve para casa.

O médico irá prescrever um medicamento para prevenir a formação de coágulos sanguíneos e outro para prevenir a AFib. Você provavelmente vai tomá-los por 2 meses. Um banho está bom quando você estiver em casa, mas mantenha a água do lado mais frio. Não tome banho, nade ou mergulhe por 5 dias ou até que os cortes tenham cicatrizado.

Contínuo

  • Não levante mais de 10 libras.
  • Pule as atividades que o fazem empurrar ou puxar coisas pesadas, como limpar a grama ou cortar a grama.
  • Se você ficar cansado, pare e descanse.
  • Não faça exercícios. Você pode voltar ao normal na segunda semana.

Contínuo

Procedimento de labirinto. Você provavelmente ficará no hospital cerca de uma semana. Você passará os primeiros dias em uma unidade de terapia intensiva (UTI) e depois se mudará para um quarto normal antes de ir para casa. A recuperação completa leva cerca de 6 a 8 semanas, mas você deve ser capaz de retornar às atividades normais em 2 ou 3 semanas. Você deve começar a se sentir melhor em cerca de 4 semanas. Você provavelmente vai tomar um anticoagulante por cerca de 3 meses.

Mini labirinto. Você ficará na UTI por algumas horas a um dia. Você provavelmente ficará de 2 a 4 dias, no total.

Abrir-coração Labirinto. Esta é uma grande cirurgia. Você vai passar um ou dois dias na UTI e pode ficar no hospital por até uma semana. No início, você se sentirá muito cansado e com algumas dores no peito. Você provavelmente pode voltar a trabalhar em cerca de 3 meses, mas pode levar 6 meses para voltar ao normal. Quando estiver em casa:

  • Você pode precisar de alguém para levá-lo por um tempo. O médico avisará quando você puder dirigir novamente.
  • Você provavelmente precisará de ajuda em casa.
  • Você precisará voltar em cerca de 10 dias para retirar os pontos.
  • Não levante nada pesado por várias semanas.

Contínuo

Procedimento convergente. Isso geralmente requer uma internação hospitalar de 2 a 3 dias. A recuperação é semelhante à ablação por cateter.

Vida após ablação cardíaca

A ablação por cateter pode não curar seu AFib, mas geralmente irá aliviar seus sintomas. Você ainda pode ter episódios de AFib durante os primeiros 3 meses porque leva muito tempo para as cicatrizes se formarem.

Se você tem AFib há muito tempo, provavelmente precisará de outro tratamento para manter o batimento cardíaco regular. Você também pode precisar de medicamentos para controlar o ritmo cardíaco por alguns meses após o procedimento.

Contínuo

A maioria das pessoas que se submetem ao procedimento do labirinto obtém um alívio duradouro de seus sintomas. E muitos não precisam tomar remédio para ritmo cardíaco depois.

Seu médico pode recomendar mudanças no estilo de vida para manter seu coração saudável, incluindo:

  • Faça uma boa dieta com menos sal e álcool.
  • Parar de fumar.
  • Mantenha um peso saudável.
  • Obtenha mais atividade física.
  • Tente controlar o estresse e as emoções fortes.

Fontes

Pare o Afib.org: “Procedimento do labirinto: (Ablação cirúrgica),” “O que esperar após a ablação cardíaca”, “O que esperar após um procedimento do labirinto”, “O que esperar após a cirurgia do mini labirinto.”

Keck School of Medicine da USC: “Robotic-Assisted Maze Surgery”.

Frankel Cardiovascular Center, Michigan Medicine: “Frequently Asked Questions: Catheter Ablation.”

Instituto Inova Heart and Vascular: “Frequently Asked Questions.”

Johns Hopkins Medicine: “Atrial Fibrillation Surgery.”

Lahey Hospital & Medical Center: “Procedimento convergente”.

Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue: “Ablação por Cateter.”

American Heart Association: “O que é Fibrilação Atrial (AFib ou AF)?” “Procedimentos não cirúrgicos para fibrilação atrial (AFib ou AF)”, “Diretrizes de tratamento de fibrilação atrial (AFib ou AF)”, “Por que a fibrilação atrial (AF ou AFib) é importante”, “Ablação para arritmias”, “Procedimentos cirúrgicos para Fibrilação atrial (AFib ou AF). ”

Cleveland Clinic: “Surgical Procedures for Atrial Fibrillation (MAZE),” “After Catheter Ablation,” “Heart Surgery for Atrial Fibrillation (MAZE): After the Procedure.”

Heart Rhythm Society: “Sintomas de Fibrilação Atrial (AFib),” “Tipos de Ablações”.

Universidade de Southern California Keck School of Medicine: “MAZE Procedure for Treatment of Atrial Fibrillation.”

Verma, A. Circulação, publicado em agosto de 2005.

Mayo Clinic: “Fibrilação atrial: sintomas”, “ablação de fibrilação atrial”, “ablação cardíaca”.


Fundo

Long INterspersed Element-1 (LINE-1, L1) é um dos DNAs móveis mais abundantes em humanos. Com cerca de 500.000 cópias, as sequências LINE-1 compreendem cerca de 17% do nosso DNA [1]. Embora a maioria deles exista em um estado invariante (fixo) e não esteja mais ativo, cerca de 500 inserções do Homo sapiens sequências L1 específicas (L1Hs) são mais variáveis ​​e derivam de algumas L1Hs "quentes" que permanecem transcricionalmente e transposicionalmente ativas [2,3,4,5,6,7]. A atividade do LINE-1 resulta em inserções de elementos transponíveis que são uma fonte significativa de variação estrutural em nossos genomas [8,9,10,11]. Eles são responsáveis ​​por novos eventos de inserção L1 da linha germinativa, bem como pela retrotransposição de outras sequências de DNA móvel, incluindo Alu Elementos Intercalados Curtos (SINEs) [12,13,14,15] e SVA (SINE / VNTR /Alu) retrotransposons [16]. Além disso, o LINE-1 pode se propagar em tecidos somáticos, e inserções adquiridas somaticamente são freqüentemente encontradas em cânceres humanos [17,18,19,20,21,22,23].

As caracterizações de sequências de elementos transponíveis permanecem incompletas em parte porque sua natureza altamente repetitiva apresenta desafios técnicos. O uso dessas repetições de alto número de cópias como sondas ou sequências de iniciadores pode criar sinais ou produtos em ensaios baseados em hibridização e amplificações de PCR que não correspondem a loci genômicos discretos. Além disso, tanto a ausência de muitas variantes de inserção comuns do conjunto do genoma de referência quanto a presença de centenas de milhares de sequências semelhantes em conjunto complicam a capacidade de mapeamento de leitura de sequenciamento. Detectar inserções que ocorrem como alelos de baixa frequência em uma amostra mista apresenta um desafio adicional, como ocorre com inserções adquiridas somaticamente. No entanto, vários estudos recentes descrevem estratégias para mapear esses elementos e destacam a atividade contínua do LINE-1 em humanos hoje. Esses métodos incluem o enriquecimento baseado em hibridização [24,25,26,27,28,29] amplificação por PCR seletiva [6, 17, 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39] e adaptado análises de leituras de sequenciamento do genoma inteiro [10, 11, 18, 19, 40, 41].

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para amplificar e sequenciar loci de inserção de retrotransposon humano LINE-1 desenvolvido nos laboratórios Burns e Boeke, Transposon Insertion Profiling by sequencing (TIPseq) [22, 23, 42,43,44]. Este método usa vectorette PCR mediada por ligação [45] para amplificar seletivamente regiões de DNA genômico diretamente 3 ′ de elementos L1Hs. Isto é seguido pela preparação da biblioteca e sequenciação profunda Illumina (ver Fig. 1a). TIPseq localiza inserções L1Hs fixas, polimórficas e somáticas com precisão de par de bases e determina a orientação da inserção (isto é, se está na fita mais (+) ou menos (-) em relação ao genoma de referência). Ele detecta, embora não faça distinção entre, inserções de comprimento total e 5 ′ truncadas de até 150 bp. O TIPseq é altamente preciso na identificação de inserções somáticas L1 em ​​tecidos tumorais versus tecidos normais correspondentes e permite que a cobertura de sequenciamento seja direcionada de forma eficiente para os locais de inserção do LINE-1, portanto, é uma maneira econômica de processar amostras para essa finalidade. Usamos o TIPseq para demonstrar a retrotransposição do LINE-1 em cânceres de pâncreas [22] e de ovário [23] e para mostrar que inserções adquiridas somaticamente não são comuns em glioblastomas [44]. Junto com o pipeline computacional baseado em aprendizado de máquina desenvolvido no Laboratório Fenyӧ para o processamento de dados TIPseq, TIPseqHunter [23], este protocolo permite aos pesquisadores mapear os locais de inserção do LINE-1 em amostras de DNA genômico humano e comparar os locais de inserção entre as amostras.

Etapas do protocolo TIPseq. uma As etapas no TIPseq são mostradas de cima para baixo em um fluxograma vertical. Estes incluem (i.) Anelamento de adaptador de vectorette, (ii.) Digestão de DNA genômico (gDNA), (iii.) Ligação de adaptador de vectorette, (iv.) PCR touchdown de vectorette, (v.) Corte de amplicon de PCR, (vi.) Sequenciamento preparação da biblioteca, (vii.) sequenciamento Illumina e (viii.) análise de dados. As primeiras sete dessas etapas são mostradas adjacentes às representações esquemáticas em parte b., Para a direita. b O recozimento do adaptador Vectorette é mostrado primeiro. Sequências incompatíveis dentro dos oligonucleotídeos vectorette hibridizados são ilustrados em vermelho e azul e criam uma estrutura duplex com emparelhamento de base imperfeito. A saliência da extremidade pegajosa em uma fita do vetorete (aqui, uma saliência de 5 ′ na fita inferior) é desenhada em cinza. Esta saliência no vetorete recozido complementa as extremidades coesivas deixadas pela digestão de DNA genômico, e as ligações de digestão e vetorete são mostradas nas duas etapas subsequentes. A caixa preta dentro do fragmento de gDNA ilustra um elemento LINE-1 de interesse (ou seja, um L1Hs específico da espécie). A maioria dos fragmentos de gDNA não terá um elemento de interesse transponível e, portanto, não pode ser amplificado de forma eficiente pela PCR do vetor. Na PCR vectorette, o iniciador L1Hs começa a síntese da primeira cadeia (1) e estende esta cadeia através da sequência vectorette ligada. O primer reverso complementa esta cópia da primeira fita do vetor (2) e os dois primers participam da amplificação exponencial (3) desses fragmentos em ciclos subsequentes. c Os amplicons são cortados e as etapas convencionais de preparação da biblioteca de sequenciamento Illumina completam o protocolo. As leituras de sequenciamento em pares são necessárias para realizar a análise de dados com o TIPseqHunter. d Um diagrama de empilhamento de leitura demonstra como há cobertura profunda da extremidade 3 ′ dos elementos L1Hs. Para elementos na fita mais (+) em relação ao genoma de referência, as sequências amplificadas estão a jusante do local de inserção (isto é, cobrindo coordenadas genômicas ascendendo a partir da inserção do transposon). Para inserções de cadeia negativa (-), as sequências são recuperadas na direção oposta


Armas Químicas e Biológicas: Uso na Guerra, Impacto na Sociedade e no Meio Ambiente

Desde o final da Segunda Guerra Mundial, houve uma série de tratados lidando com as limitações, reduções e eliminação das chamadas armas de destruição em massa e / ou seus sistemas de transporte (geralmente chamados de sistemas de entrega). Alguns dos tratados são bilaterais, outros multilaterais ou, em casos raros, universais. No presente trabalho serão discutidas apenas as armas químicas e biológicas, com ênfase na Convenção para Eliminá-las (CBWC).

O termo & # 8220Armas de destruição em massa& # 8221 (WMD), usado para abranger armas nucleares (NW), biológicas (BW) e químicas (CW), é enganoso, politicamente perigoso e não pode ser justificado em termos de eficiência militar. Isso foi apontado anteriormente pelo autor [1] e discutido em detalhes consideráveis ​​na ref. [2]. Considerando que a proteção com vários graus de eficiência é possível contra armas químicas e biológicas, por mais inconveniente que seja para as forças militares no campo de batalha e para os civis em casa, não é de forma alguma viável contra armas nucleares. As armas químicas demonstraram ser amplamente ineficazes na guerra; as armas biológicas nunca foram implantadas em escala significativa. Ambos os tipos devem ser melhor designados como armas de terror contra civis e armas de intimidação para soldados. Os requisitos de seu sistema de transporte diferem enormemente daqueles para ogivas nucleares. Eles são capazes de causar ansiedade, pânico e psicose consideráveis ​​sem fronteiras em grande parte da população. O armazenamento de armas biológicas não é possível em uma escala de tempo longa [3, 4]. Somente as armas nucleares são completamente indiscriminadas por seu poder explosivo, radiação de calor e radioatividade, e somente elas deveriam, portanto, ser chamadas de armas de destruição em massa.

No entanto, se quisermos manter o termo & # 8220Armas de destruição em massa (ADM)& # 8220, é uma visão defensável para excluir armas químicas e biológicas, mas juntos com armas nucleares todos aqueles que realmente mataram milhões de pessoas em guerras civis desde a Segunda Guerra Mundial. Estes são principalmente rifles de assalto, como AK47s, pistolas, e minas terrestres, em menor grau morteiros, bombas de fragmentação e granadas de mão.

Este artigo fornece no Capítulo 2 uma visão geral da história da guerra química, aborda no Capítulo 3 o inventário de armas químicas, discute no Capítulo 4 a eliminação de armas químicas e possíveis problemas resultantes para o meio ambiente (CW), analisa no Capítulo 5 alguns armas químicas não letais e armas químicas que podem estar no limite dos explosivos convencionais e descrevem no Capítulo 6 algumas das velhas e novas armas biológicas (BW). O Capítulo 7 avalia e compara o uso de armas biológicas e químicas por terroristas e militares em combate. O status atual e os procedimentos de verificação para a Convenção de Armas Químicas e Biológicas (CBWC) são abordados nas conclusões do Capítulo 8.

2. Guerra Química, Sua História [5]

Os gregos usaram misturas de enxofre com resina de piche para a produção de vapores sufocantes em 431 aC, durante a Guerra de Tróia. As tentativas de controlar as armas químicas datam de um acordo franco-alemão de 1675 assinado em Estrasburgo. Então veio a Convenção de Bruxelas em 1874 para proibir o uso de veneno ou armas envenenadas. Durante o Primeiro Apelo de Paz de Haia em 1899, a Convenção de Haia elaborou o acordo de Bruxelas ao proibir o uso de projéteis que difundissem gases asfixiantes ou deletérios & # 8221 (Leis e costumes de guerras em terra) Esta Convenção foi reforçada durante a segunda conferência de Haia em 1907, mas as proibições foram amplamente ignoradas durante a Primeira Guerra Mundial. Na batalha de Ypres / Bélgica, botijões de gás cloro foram explodidos em abril de 1915 pela Alemanha, que matou 5.000 soldados franceses e feriu 15.000 . Fritz Haber, ganhador do Prêmio Nobel em 1919 pela invenção da fixação de amônio, convenceu o Kaiser alemão a usar gás cloro para encerrar a guerra rapidamente. A história nos ensinou um resultado diferente. Durante a Primeira Guerra Mundial, todas as partes usaram cerca de 124.000 toneladas de produtos químicos na guerra. O gás mostarda & # 8211 & # 8220 o rei dos gases de batalha & # 8221 & # 8211 então usado em ambos os lados em 1917 matou 91.000 e feriu 1,2 milhão, respondendo por 80% das vítimas químicas (morte ou ferimentos). As armas químicas causaram cerca de 3 por cento das estimadas 15 milhões de vítimas na Frente Ocidental [3, 6]. Para colocar esses números em perspectiva, a perda total de vidas Aliadas foi de ³ 5 milhões, dos Poderes Centrais 3,4 milhões e o total de todos os soldados feridos foi de 21 milhões. Apesar de seu uso intensivo, o gás foi um fracasso militar na Primeira Guerra Mundial. O aspecto desumano e o sofrimento logo foram reconhecidos e o ano de 1922 viu o estabelecimento do Tratado de Washington, assinado pelos Estados Unidos, Japão, França, Itália e Grã-Bretanha. Em 1925, o Protocolo de Genebra para o Proibição do uso em guerra de gases asfixiantes, venenosos ou outros e Métodos bacteriológicos de guerra foi assinado e tem sido a pedra angular do controle de armas químicas e biológicas desde então. O Protocolo de Genebra não proibia o armazenamento ou a pesquisa de armas químicas.

Apesar das convenções que proíbem as armas químicas, os italianos as usaram durante a guerra de 1935-36 na Etiópia, os japoneses na China durante a Segunda Guerra Mundial (1938-42), e foram usadas também no Iêmen (1966-67). Vários novos produtos químicos foram desenvolvidos para uso em armas. Sarin, Soman e VX seguiram Tabun, o primeiro gás nervoso, descoberto em 1936.

Durante a Guerra do Vietnã (1961-1973), os Estados Unidos foram acusados ​​de usar agentes lacrimogêneos e altas doses de herbicidas (desfolhantes) da mesma maneira que armas químicas. Algumas organizações internacionais consideram Napalm, seu nome comercial, uma arma química, outras a colocam em pé de igualdade com os lança-chamas e, conseqüentemente, não se enquadra em nenhum dos artigos do CWC.

Saddam Hussein usou armas químicas contra civis iraquianos e também contra soldados iranianos entre 1980 e 1988. Estima-se que dos cerca de 27.000 iranianos expostos ao gás mostarda iraquiano naquela guerra até março de 1987, apenas 265 morreram. Durante toda a guerra, as armas químicas iraquianas mataram 5.000 iranianos. Isso constituiu menos de um por cento dos 600.000 iranianos que morreram por todas as causas durante a guerra [6].

A Convenção sobre a Proibição do Desenvolvimento, Produção, Armazenamento e Uso de Armas Químicas e sobre Sua Destruição (CWC) [7], entrou em vigor em 1997 após o depósito de 65 documentos de ratificação, e foi assinado em maio de 1999 por 122 estados-partes. Existem 46 signatários não ratificantes e 22 não-Estados Partes [8, 9].

3. O Inventário de Armas Químicas

As armas químicas foram produzidas durante o século XX por muitos países e em grandes quantidades. Eles ainda são mantidos nos arsenais militares como armas do mesmo tipo ou de resposta flexível. Munições velhas são parcialmente descartadas de forma ambientalmente irresponsável.

3.1 Valor militar das armas químicas

Por sua natureza, as armas químicas têm um alcance relativamente limitado: elas criam problemas de segurança regionais, e não globais, e diminuem o ritmo das operações. Nisso, são militarmente mais semelhantes às armas convencionais do que às armas nucleares ou biológicas.

Mesmo o uso extensivo de armas químicas não teve impacto decisivo no resultado das guerras, teve apenas sucesso local e tornou as guerras desconfortáveis, sem propósito. Por essa e outras razões, é difícil entender por que eles estão por aí. No entanto, eles foram produzidos em enormes quantidades e a humanidade tem que lidar com sua eliminação muito custosa.

Os cientistas devem ser responsabilizados por sua invenção, produção, uso e também pela eliminação de armas químicas? Certamente não inteiramente, já que militares e políticos exigiam sua produção. No entanto, precisamos da ajuda de cientistas para a difícil tarefa de neutralizá-los ou eliminá-los.

3.2 Classificação de armas químicas

As munições binárias contêm duas substâncias químicas não letais separadas que reagem para produzir uma substância química letal quando misturadas durante a entrega no campo de batalha. As armas unitárias, que representam a maior quantidade do estoque, contêm um único produto químico letal nas munições. Outros agentes unitários são armazenados em contêineres a granel. As características dos agentes de guerra química e resíduos de armamento tóxico são descritos em detalhes na ref. [10]. O leitor deve consultar este artigo, que resume as características químicas e físicas dos agentes de bolhas, sangue, sufocamento, nervos, controle de distúrbios e vômitos, bem como seus efeitos no corpo humano.

A maneira mais fácil & # 8211 digamos mais barata & # 8211 de eliminar (?) as armas químicas após a Segunda Guerra Mundial pareceram despejá-los no oceano [11]. Houve a preocupação de que, após a derrota em 1945, os alemães pudessem ser tentados a usar parte de seu arsenal, que totalizava 296.103 toneladas. Portanto, as armas foram capturadas e jogadas no mar. Existem mais de 100 descargas marítimas de armas químicas ocorridas de 1945 a 1970 em todos os oceanos, exceto no Ártico. 46.000 toneladas foram despejadas nas áreas do Báltico conhecidas como Gotland Deep, Bornholm Deep e Little Belt. De acordo com O Comitê Continental de Dumping o total foi compartilhado por 93.995 toneladas dos Estados Unidos, 9.250 toneladas da França, 122.508 toneladas da Grã-Bretanha e 70.500 toneladas da Rússia.

Os EUA despejaram armas químicas alemãs na região escandinava, totalizando entre 30.000 e 40.000 toneladas, nove navios no Estreito de Skagerrak e mais dois no Mar do Norte, a profundidades de 650 a 1.180 metros.

Só os russos despejaram 30.000 toneladas em uma área de 2.000 quilômetros quadrados perto das ilhas Gotland e Bornholm.

Entre 1945 e 1949, os britânicos despejaram 34 carregamentos de navios transportando 127.000 toneladas de produtos químicos (contendo 40.000 toneladas de gás mostarda) e armas convencionais na trincheira norueguesa a 700 metros de profundidade.

As armas químicas no fundo do Mar Báltico (a profundidade média do Mar Báltico é de 51 metros) e no Mar do Norte representam um perigo grave para a vida aquática. Os projéteis das granadas são corroídos e, com o tempo, começam a vazar. A corrosão dessas armas já está tão avançada que a identificação dos antigos proprietários é virtualmente impossível. Consequentemente, ninguém pode ser responsabilizado hoje em dia pela eliminação final.

Os Estados Unidos são responsáveis ​​por 60 despejos no mar, totalizando cerca de 100.000 toneladas (equivalente a 39 vagões de carga cheios), de armas químicas cheias de materiais tóxicos no Golfo do México, na costa de Nova Jersey, Califórnia, Flórida e Carolina do Sul, e perto da Índia, Itália, Noruega, Dinamarca, Japão e Austrália.

Alguns dos números acima parecem não ser totalmente coerentes e não somam bem ao total, demonstrando, entre outras coisas, que nenhuma contabilidade cuidadosa foi feita durante essas ações inadmissíveis.

Durante a década de 1950, os Estados Unidos conduziram um ambicioso programa de gás nervoso, fabricando o que acabaria por totalizar 400.000 foguetes M-55, cada um dos quais era capaz de entregar uma carga útil de 5 kg de Sarin [11, 12]. Muitos desses foguetes tinham defeitos de fabricação, o propelente quebrando de uma maneira que poderia levar à ignição automática. Por esta razão, em 1967 e 1968, 51.180 foguetes de gás nervoso foram lançados a 240 km da costa do Estado de Nova York em profundidades de 1 & # 8217950 a 2.190 metros, e na costa da Flórida.

O CWC não cobre armas químicas despejadas no mar na verdade, ele faz uma exceção clara para eles (CWC, Artigo III, § 2). O CWC não fornece a base legal para cobrir armas químicas que foram descartadas antes de 1985. Elas continuam sendo uma bomba-relógio incontrolável.

3.4 O arsenal existente

O arsenal de armas químicas deve ser subdividido em duas categorias: (i) O & # 8220stockpile & # 8221 de agentes unitários de guerra química (CW) e munições, compreendendo o material dentro de armas e produtos químicos em armazenamento a granel, e (ii) # 8220não-estoque & # 8221 material, incluindo material químico enterrado, armas químicas binárias, armas químicas recuperadas, antigas instalações para produção de armas químicas e outros materiais diversos de guerra química.

3.4.1 O estoque de agentes de guerra química unitários e munições

o Defence euinteligência UMAgency (DIA) nos relatórios dos EUA [13, 14]:

Egito: Primeiro país no Oriente Médio a obter treinamento, doutrinação e material em armas químicas. Ele empregou fosgênio e agente de mostarda contra as forças realistas iemenitas em meados da década de 1960, e alguns relatórios afirmam que também usava um agente nervoso organofosforado.
Israel: Desenvolveu seu próprio programa de armas ofensivas. O estudo DIA de 1990 relata que Israel mantém uma instalação de testes de guerra química. Reportagens de jornais sugerem que a instalação fica no deserto de Negev.
Síria: Começou a desenvolver armas químicas na década de 1970. Recebeu armas químicas do Egito na década de 1970, e a produção indígena começou na década de 1980. Ele teria dois meios de entrega: uma bomba aérea de 500 quilos e ogivas químicas para mísseis Scud-B. Dois depósitos de armazenamento de munições químicas, em Khna Abu Shamat e Furqlus. O Centro D & # 8217Etude et Recherche Scientifique, perto de Damasco, foi o principal centro de pesquisa. Está construindo uma nova fábrica de armas químicas perto da cidade de Aleppo.
Irã: Iniciou um programa químico e de guerra em resposta ao uso de gás mostarda no Iraque contra as tropas iranianas. No final da guerra, os militares puderam plantar mostarda e fosgênio. Tinha projéteis de artilharia e bombas cheias de agentes químicos. Estava desenvolvendo mísseis balísticos. Tem uma ogiva de agente químico para seus mísseis superfície-superfície.
Iraque: Usou armas químicas repetidamente durante a guerra Iraque-Irã. Mais tarde, atacou os aldeões curdos no norte do Iraque com mostarda e gás nervoso. Desde o fim da Guerra do Golfo, a ONU destruiu mais de 480,0000 litros de agentes químicos do Iraque e 1,8 milhões de litros de precursores químicos.
Líbia: Obteve seus primeiros agentes químicos do Irã, usando-os contra o Chade em 1987. Abriu sua própria unidade de produção em Rabta em 1988. Pode ter produzido até 100 toneladas de bolhas e agentes nervosos antes de um incêndio estourar em 1990. Está construindo um segundo instalação em um local subterrâneo em Tarhunah.
Arábia Saudita: Pode ter limitado a capacidade de guerra química em parte porque adquiriu 50 mísseis balísticos CSS-2 da China. Acredita-se que esses mísseis altamente imprecisos sejam adequados apenas para o lançamento de agentes químicos.
Iugoslávia: A ex-Iugoslávia tem capacidade de produção CW. Produziu e transformou Sarin, mostarda de enxofre, BZ (um incapacitante psicoquímico) e irritantes CS e CN. Os bósnios produziram armas químicas rudimentares durante a guerra de 1992-1995.
Romênia: Possui instalações de pesquisa e produção e estoques de armas químicas e instalações de armazenamento. Tem um grande programa de guerra química e desenvolveu um método mais barato para sintetizar Sarin.
Checoslováquia: Capacidades químicas da planta piloto que provavelmente incluíam Sarin, Soman e possivelmente VX.
França: Possui estoque de armas químicas, incluindo bombas de aerossol.
Bulgária: Possui estoque de munições químicas de origem soviética.

Possui o segundo maior arsenal de armas químicas do mundo, consistindo em

31.000 toneladas de produtos químicos e 3,6 milhões de granadas [15]. As armas químicas contêm cerca de 12.000 toneladas de agentes e 19.000 toneladas estão armazenadas a granel. Os detalhes sobre a composição e localização são fornecidos na Tabela 1.

Uma estimativa do estoque russo em 1993 coloca-o em

40.000 toneladas de agente, das quais um quarto é da safra anterior à Segunda Guerra Mundial. Uma porção maior parece estar no armazenamento a granel [16]. Da quantidade oficialmente declarada, 30.000 toneladas são agentes orgânicos fosfóricos (Sarin, Soman, VX), as 10.000 toneladas restantes são compostas por 7.000 toneladas de lewisita (em contêineres?), 1.500 toneladas de mistura de gás mostarda e Lewisita (GB, GD, VX), e 1.500 toneladas de gás mostarda. Números ligeiramente diferentes sobre a composição do arsenal são dados na ref. [17]. Alguns analistas independentes acreditam que as 40.000 toneladas formalmente declaradas pela Rússia são apenas uma fração de um total de 100.000 a 200.000 toneladas, o resto das quais provavelmente foram eliminadas de alguma maneira [18].

Locais do Estoque Unitário de Químicos dos EUA
Local Agente Agente Toneladas Porcentagem de estoque
Anniston Army Depot (ADAD), Anniston, AL GB, HD, HT, VX 2,253.63 7.4
Aberdeen Proving Ground (APG), Edgewood, MD HD 1,624.87 5.3
Blue Grass Army Depot (BGAD), Richmont, KY GB, HD, VX 523.41 1.7
Ilha Johnston (JI), Oceano Pacífico GB, HD, VX 1,134.17 3.7
Newport Chemical Activity (NECA), Newport, IN VX 1,269.33 4.2
Pine Bluff Arsenal (PBA), Pine Bluff, AR GB, HD, HT, VX 3,849.71 12.6
Pueblo Depot Activity (PUDA), Pueblo, CO HD, HT 2,611.05 8.5
Tooele Army Depot (TEAD), Tooele, UT H, HD, HT, GA, GB, L, TGA, TGB, VX 13,616.00 44.5
Umatilla Depot Activity (UMDA), Herminston, OR GB, HD, VX 3,717.38 12.2
Total 30,599.55 100.0

Agentes de gases nervosos não persistentes: Tabun (GA) e Sarin (GB) e seus produtos espessados ​​(TGA e TGB) Agentes de mostarda (H, HD e HT) Lewisite (L) Agente de nervo persistente (VX)

Agentes do Estoque Unitário de Químicos dos EUA
Agente Local Agente Toneladas Porcentagem de estoque Total
GA TEAD 1.41 0.005 1.41
GB UM ANÚNCIO 436.51
BGAD 305.64
JI 617.48
PBA 483.69
TEAD 6,045.26
UMDA 1,041.01 29.1 8,902.59
H TEAD 319.77 1.5 319.77
HD UM ANÚNCIO 456.08
APG 1,624.87
BGAD 90.63
JI 164.86
PBA 94.20
PUDA 2,551.94
TEAD 5,694.64
UMDA 2,339.52 42.5 13,016.74
HT UM ANÚNCIO 532.30
PBA 3,124.55
PUDA 59.11
TEAD 181.51 12.7 3,897.47
eu TEAD 12.96 0.004 12.96
TGA TEAD 0.64 0.002 0.64
TGB TEAD 3.48 0.01 3.48
VX UM ANÚNCIO 828.74
BGAD 127.15
JI 351.83
NECA 1,269.33
PBA 147.27
TEAD 1,356.33
UMDA 363.86 14.5 4,444.51
TOTAL 100.0 30,599.55

Estoque de produtos químicos binários dos EUA
Local Tipo Preenchimento Componente Total de toneladas
APG QL 0.73
DF 0.57 1.30
PBA QL 48.21
DF 126.51 174.72
TEAD OPA 33.58 33.58
UMDA OPA 470.59 470.59
TOTAL 680.19

Difluoreto metilfosfônico (DF) Álcool isopropílico e isopropilamina (OPA) Etil 2-diisoprpilaminoetil metilfosfonita (QL)

Tabelas 1. Estoque de produtos químicos binários e unitários dos EUA

As tabelas acima fornecem a localização dos nove depósitos e a variedade de armas químicas armazenadas, o que é um indicativo da complexidade para sua eliminação ou problemas de transporte.

As localizações das armas químicas soviéticas estão espalhadas por grandes partes da Europa Ocidental e parte asiática da Rússia em sete locais (Tabela 2 [18]). Cerca de 80% são transformados em armas e consistem principalmente de agentes nervosos organofosforados. O restante do material é armazenado a granel em dois locais & # 8211 Kambarka e Gornyi.

Local % de estoque Agentes
Kambarka 15.9 Lisita
Gorny 2.9 Mostarda
Lewite
Kizner 14.2 Vx
Sarin
Tão homem
Lisita
Maradykovsky 17.4 Vx
Sarin
Tão homem
Mix M / L
Pochep 18.8 VX
Sarin
Tão homem
Leonidovka 17.2 VX
Sarin
Tão homem
Shchuchye 13.6 VX
Sarin
Tão homem
Fosgênio

Tabela 2. Locais de armazenamento de armas químicas da Rússia e # 8217s [18]

3.4.2 O material não armazenado

Os dados sobre materiais não armazenados são escassos. Algumas estimativas estão disponíveis para os EUA [12]. Todo o material recuperado nos EUA até agora contém apenas centenas de toneladas de agente e poderia, em teoria, ser colocado em um único prédio de armazenamento de 8 por 25 metros [12]. Uma quantia considerável de dinheiro será necessária para a destruição de todas as antigas instalações de produção de armas químicas construídas ou usadas após 1º de janeiro de 1946.

As armas químicas abandonadas representam um risco à segurança. Entre 1985 e 1995, pescadores holandeses relataram mais de 350 casos em que armas químicas, despejadas no Mar Báltico, foram capturadas em redes de pesca, algumas resultando em graves queimaduras.

Na China, durante a Segunda Guerra Mundial, os japoneses deixaram 678.729 armas químicas. Negociações recentes resultaram no acordo do Japão & # 8217 para coletar e destruir essas armas.

Os agentes mais persistentes & # 8211 mostardas e lewisite & # 8211 podem permanecer perigosos por décadas. Mesmo depois que a lewisita se decompõe, os compostos de arsênio resultantes podem permanecer no solo e contaminar as águas subterrâneas [19].

A recuperação de munições da Primeira Guerra Mundial ainda continua. As coletas anuais da França chegam a cerca de 30-50 toneladas ao longo da velha linha de frente, e da Bélgica a 17 toneladas (cerca de 1.500 itens) [20].

4. Eliminação de armas químicas

O CWC não apenas proíbe o uso, produção, aquisição e transferência de armas químicas, mas também exige que os Estados-Partes destruam suas armas e instalações de produção existentes. Para os EUA, o prazo é 29 de abril de 2007. O CWC proíbe o descarte por despejo em um corpo de água, sepultamento em terra ou queima a céu aberto, e exige que a tecnologia escolhida destrua o agente químico de maneira irreversível que também protege a segurança dos humanos e do meio ambiente.

4.1 Programa, custos e status da destruição do arsenal ativo existente

Uma vez que o peso de uma arma química típica é cerca de dez vezes o do agente que contém, e outras nações podem ter até 10-15 por cento do estoque combinado da Rússia e dos Estados Unidos, a massa do material a ser destruído chega a aproximadamente 500.000 toneladas e # 8211 quase 100.000 caminhões de material.

Em geral, a parte de ignição da munição deve ser removida ou desativada antes da destruição. Em seguida, começa a parte principal da eliminação da arma. Os Estados Unidos escolhem a incineração em alta temperatura e a neutralização química como sua técnica de destruição preferida, que deve destruir os produtos químicos junto com o invólucro de metal. O custo deste procedimento pode ultrapassar o custo de destruição do agente muitas vezes & # 8211 em alguns casos em 10-20 vezes.

O processo de eliminação é lento e tedioso, com custos crescentes com o passar do tempo. Um acordo bilateral US & # 8211 da URSS em junho de 1990 para destruir pelo menos 50% de seus estoques até 1999 e não reter mais do que 5.000 toneladas do agente até 2002 está há muito desatualizado [21].

Desde 1985, a estimativa de custo do Exército dos EUA & # 8217s para o programa de eliminação de estoque aumentou das estimativas em 1985 de $ 1,7 bilhões para $ 15,7 bilhões a partir de hoje, e sua data de conclusão projetada caiu de 1994 para 2007 [16, 12]. No final de 1999, cerca de 22% de seus produtos químicos haviam sido incinerados [8, 9].

A destruição do arsenal russo enfrenta desafios financeiros e técnicos [17] e está seriamente atrasada. O primeiro prazo imposto pela destruição de 1% dos estoques pela CWC & # 8211 até 29 de abril de 2000 & # 8211 já foi perdido. De acordo com o programa revisado aprovado pelo governo russo em julho, esse marco não será alcançado até 2003, enquanto todo o processo de destruição está programado para durar até 2012. A Rússia não quer copiar a comprovada tecnologia de incineração americana. Seu próprio programa de neutralização-bituminização não foi desenvolvido além da bancada do laboratório e, portanto, destruiu apenas alguns milhares de armas [22]. A ideia da incineração de seu arsenal de armas químicas por explosão nuclear é estudada nos antigos laboratórios de armas da Rússia e # 8217 [23]. Este procedimento, mesmo que seja viável no subsolo, não é compatível com o Tratado de Proibição de Testes Abrangentes (CTBT) e encontrará também sérias resistências por parte dos ambientalistas.

A maioria das estimativas para os custos da Rússia & # 8217s estão na faixa de US $ 6 bilhões a US $ 8 bilhões [18].

4.2 As armas abandonadas

As armas químicas são enterradas em terra, despejadas no mar e simplesmente perdidas em muitos lugares do nosso globo [20]. Encontrar, coletar e destruí-los pode ser tão difícil, perigoso e demorado quanto as minas terrestres.

o programa de eliminação de estoque não armazenado está atualmente projetado para custar $ 15,1 bilhões & # 8211 quase o custo do programa de eliminação de estoque & # 8211 e levará até 2033 para ser concluído [12]. Nesse caso, o principal fator de custo decorre das dificuldades de detecção de armas químicas espalhadas, devido à contabilidade insuficiente, à necessidade de projetar e construir novos sistemas móveis de eliminação e, por último, não menos importante, da superação da oposição pública à destruição ou ao transporte de CW letal no vizinhança dos habitats. As disposições do CWC não se aplicam a armas enterradas em seu território antes de 1º de janeiro de 1977.

4.4 Uma comparação de agentes de armas químicas com outros resíduos

Nossa civilização produz uma grande variedade de produtos residuais, com diferentes graus de perigo para o meio ambiente e as pessoas. Eles variam de lixo doméstico, lixo eletrônico da era da informação, a lixo tóxico de fábricas de produtos químicos, subprodutos da indústria de mineração, carvão e queima de petróleo e, por último, não menos importante, aos de uso militar e civil da energia nuclear. Entre esses resíduos está um risco ambiental amplamente desconhecido devido às cem a duzentas toneladas de mercúrio, que foram despejadas na natureza durante a fabricação de armas nucleares nos Estados Unidos (principalmente em Oak Ridge, também em Hanford / Washington ) Seu impacto na cadeia alimentar pode se tornar catastrófico em nível regional [24]. Mesmo o propelente de armas mais amplamente utilizado, o Trinitrotoluol ou TNT, é uma ameaça ao meio ambiente devido à sua persistência e capacidade de entrar facilmente nas águas subterrâneas.

UMA estimativa crua A importância dos resíduos de armas químicas em relação à produção de outros resíduos humanos pode ser feita a partir de dados da produção anual de resíduos em quilogramas por habitante na França:

Desperdício Kg / pessoa / ano
Doméstico (lixo de cozinha, sucata doméstica diversa) 360
Agricultura (plástico, sucata agrícola) 7,300
Resíduos industriais (resíduos de metal, ferro, não ferro, pós, resíduos de tecnologia) 3,000
deles classificado como lixo tóxico 100
Lixo hospitalar 15
Resíduos nucleares (embalados) 1.2
Desperdício total 10,776

Tabela 2 Produção anual de resíduos em quilogramas por pessoa na França [25]

E assumindo que a produção de resíduos por pessoa na França (população de 58 milhões) e nos Estados Unidos (população de 267 milhões) é comparável (provavelmente uma subestimação dos números dos EUA), o total de resíduos dessas categorias pode ser estimado para os EUA em toneladas por ano:

Desperdício Toneladas / ano
Doméstico 100· 10 6
Agricultura 2·10 9
Resíduos industriais 800·10 6
disso lixo tóxico 30·10 6
Lixo nuclear 320·10 0
Desperdício de armas químicas 500·10 0
Desperdício total 3·10 9

Tabela 3 Estimativa bruta da produção anual de resíduos nos EUA

Presume-se que as 30.000 toneladas de material de armas químicas dos EUA foram acumuladas ao longo

60 anos, ou seja, em média 500 toneladas produzidas por ano. O de cima estimativa da ordem de magnitudemostra que os resíduos de armas nucleares e químicas estão na mesma parte da bola, mas são cem mil vezes menores do que os outros resíduos tóxicos / perigosos. Devido à complexidade dos itens tóxicos, uma comparação qualitativa dos perigos presentes e futuros para a humanidade e o meio ambiente, tomando os aspectos quantitativos em consideração podem e não devem ser considerados, pois podem levar a conclusões erradas.

5. Armas químicas não letais

Todas as armas são feitas de elementos químicos, seja o casco de metal de uma granada, às vezes feita de urânio empobrecido, o agente explosivo para impulsioná-la ou o material inserido em seu invólucro. Os perigos do combustível de foguete altamente tóxico e volátil nos sistemas de lançamento de ogivas nucleares na Rússia podem ser muito altos [26]. Por esta simples razão, é difícil chegar a uma definição abrangente para armas químicas.

Os produtos químicos ainda são matéria de armas se usados ​​em concentrações muito baixas? O último ponto pode ser ilustrado pelo uso duplo de Zyklon B (ou Cyclon B em inglês), que é usado como fumigante para fins de controle de pragas e vermes. Foi aplicado em baixa concentração de uma forma benéfica no campo de concentração nazista de Dachau, enquanto utilizado em alta concentração nas câmaras de gás de Auschwitz, levou a um dos atos mais criminosos cometidos no século XX [27].

Dezenas de tecnologias estão sendo estudadas ou desenvolvidas sob a rubrica elástica de & # 8220 armas não letais & # 8221 [28]. Eles incluem infra-som, supercáusicos, irritantes como gás lacrimogêneo e todos aqueles que podem ser direcionados a alvos não humanos & # 8211, como inibidores de combustão, produtos químicos que podem imobilizar máquinas ou destruir pneus de aviões. O texto do CWC nem sempre dá uma resposta ou definição inequívoca do que é um agente de arma química. Poderia ser questionado se os seguintes agentes se enquadram na categoria de armas químicas, alguns deles antigos como a guerra [10], como (i) Agentes Militares de Fumaça, (ii) Incendiários produzindo incêndios e queimaduras na pele? Onde pertencem os usados ​​recentemente ou desenvolvidos recentemente, como (iii) Espuma pegajosa, super lubrificantes (& # 8220slickums e stickums & # 8221), ou (iv) Raios laser químicos pulsados? Um caso especial leva (v) Munição de urânio empobrecido, que pode ser considerada uma arma biológica ou radiológica.

O preâmbulo do Convenção sobre Proibições ou Restrições ao Uso de Certas Armas Convencionais que Podem ser Consideradas Excessivamente Prejudiciais ou de Efeitos Indiscriminados (CCW), e menos formalmente referido como o & # 8220 Convenção de Armas Desumanas & # 8221, manifestou o desejo de alterações [30]. Entre elas estava a eliminação das armas a laser, que agora são proibidas pela Protocolo IV, que foi adotada pela Conferência dos Estados Partes na Convenção e entrou em vigor em 30 de julho de 1998 [28, 29].

Outras armas estão sendo negociadas, como submunições em forma de pequenas bombas montadas em grupos e lançadas por aeronaves ou por artilharia, foguetes ou mísseis guiados, estar equipadas com dispositivos que as tornem inofensivas se não explodirem. Um cilindro pode conter 50 pequenas bombas, ou 600, ou até 4.700, dependendo do modelo, e pode cobrir uma área de terreno de 100 a 250 metros de diâmetro. As bombas, quando equipadas com fusíveis de ação retardada, são armas eficazes de negação de área. Normalmente, cerca de 30% não explodem e permanecem como minas, como muitas no Kosovo após a guerra de 1999.

Urânio empobrecido (DU) [31], que chamou muita atenção do público na última década, é um subproduto do enriquecimento de urânio natural & # 8211 aumentando a proporção do átomo U235 que é a única forma de urânio que pode sustentar uma reação e é usado em reatores nucleares ou armas nucleares. O restante urânio empobrecido praticamente não tem valor comercial. O Departamento de Energia dos EUA (DoE) tem um estoque de 560.000 toneladas métricas, com uso civil muito limitado como matéria corante em cerâmica ou como constituinte de liga de aço [32]. O urânio empobrecido é quimicamente tóxico como outros metais pesados, como o chumbo, mas pode produzir efeitos adversos à saúde, sendo um emissor de partículas alfa com meia-vida radioativa de 4,5 bilhões de anos.

Na década de 1950 & # 8217, os Estados Unidos ficaram interessados ​​em usar urânio metálico empobrecido em armas porque ele é extremamente denso, pirofórico, barato e disponível em grandes quantidades. Os penetradores de energia cinética não explodem, eles se fragmentam e queimam a armadura devido à natureza pirofórica do urânio metálico e às temperaturas extremas de flash geradas no impacto. Eles contaminam as áreas com poeira radioativa e tóxica extremamente fina. Isso, por sua vez, pode causar danos aos rins, cânceres no pulmão e nos ossos, doença respiratória não maligna, distúrbios de pele, distúrbios neurocognitivos, danos cromossômicos e defeitos congênitos [33]. As armas com urânio empobrecido estão se proliferando e provavelmente se tornarão comumente usadas na guerra terrestre. Os Estados Unidos, Reino Unido, França, Rússia, Grécia, Turquia, Israel, Arábia Saudita, Kuwait, Bahrein, Egito, Tailândia, Taiwan e Paquistão possuem ou fabricam armas de urânio empobrecido. Muitos países da OTAN podem seguir o mesmo caminho. Essas armas foram usadas em grandes quantidades, primeiro na Guerra do Golfo de 1991 [33, 34], e depois novamente durante a Guerra do Kosovo em 1999 [35]. Pode-se perguntar se o DU é principalmente um produto químico ou uma arma radiológica? Não se deve esperar uma resposta imediata antes que o material classificado seja disponibilizado e a razão médica para a Síndrome da Guerra do Golfe seja identificada, que aparece em milhares de soldados americanos. Parece que o efeito do radioativo por inalação de pequenas doses terá apenas um pequeno impacto no risco de morrer de câncer, enquanto o efeito do metal pesado parece dominar [36]. Seja como for, o urânio empobrecido é perigoso, mas empalidece em comparação com os outros efeitos diretos e indiretos da guerra.

Devido às suas propriedades de duplo uso, algumas armas químicas podem ser mascaradas como pesticidas, fertilizantes, corantes, herbicidas ou desfolhantes. Entre 1962 e 1971, mais de 72 milhões de herbicidas foram distribuídos no Vietnã do Sul [37], dos quais mais de 44 milhões de litros foram desfolhantes agente laranja, contendo cerca de 170 kg de dioxina. Cientistas americanos desenvolveram um meio de engrossar a gasolina com o sabão de alumínio dos ácidos naftênico e palmítico em um xarope pegajoso que se estende dos projetores e queima mais lentamente, mas a uma temperatura mais alta. Esta mistura, conhecida como Napalm, também pode ser usado em aeronaves ou ogivas lançadas por mísseis contra alvos militares ou civis. Uma pequena carga altamente explosiva espalha o líquido em chamas, que gruda no que atinge até que se queime. Napalm ainda é apenas um herbicida, mesmo quando usado em uma quantidade muito grande, e então acidentalmente afetando humanos?

O fósforo branco é usado como um reservatório e preenchimento de granadas em combinação com uma pequena carga altamente explosiva. É um incendiário e o mais conhecido produtor de fumaça branca viva. Pequenos pedaços queimam ainda mais intensamente do que Napalm quando atingem o pessoal.

Os herbicidas não são abrangidos pela Convenção, mas são proibidos pela Proibição de uso militar ou qualquer outro uso hostil de técnicas de modificação ambiental (ENMOD), adotado pela Assembleia Geral da ONU em 10 de dezembro de 1976 e entrou em vigor em 5 de outubro de 1978 [38].

A fim de coibir a produção de armas químicas, exige a sua identificação, por ex. por oligoelementos na munição!

6. Antigas e novas armas biológicas

O uso de agentes biológicos como arma sempre teve uma opinião mundial ainda mais adversa do que a guerra química. Uma monografia do SIPRI descreve, entre outros tópicos, a visão mutante dos agentes de guerra biológica e de toxinas, a nova geração de armas biológicas, a mudança do status das armas de toxinas, uma nova geração de vacinas contra armas biológicas e de toxinas e as implicações do BWC [39 ]

Alegações de que agentes biológicos foram usados ​​como armas de guerra podem ser encontradas em registros escritos e nas obras de arte de muitas civilizações antigas [40]. Já em 300 aC, os gregos poluíram os poços e os suprimentos de água potável de seus inimigos com cadáveres de animais. Mais tarde, os romanos e os persas usaram as mesmas táticas. Em 1155, em uma batalha em Tortona, Itália, Barbarossa ampliou o escopo da guerra biológica, usando os corpos de soldados mortos e também de animais para poluir poços. Em 1863, durante a Guerra Civil dos Estados Unidos, o General Johnson usou corpos de ovelhas e porcos para poluir a água potável em Vicksburg. O uso de catapultas como armas estava bem estabelecido no período medieval, e projetar sobre as paredes os cadáveres de pessoas mortas por doenças era uma estratégia eficaz para sitiar exércitos. Em 1763, a história da guerra biológica deu uma guinada significativa do uso bruto de cadáveres doentes para a introdução de uma doença específica, a varíola (& # 8220Morte negra & # 8221), como uma arma nas Guerras Indígenas da América do Norte. Essa técnica continuou com cadáveres infectados com cólera ou tifo. Em 1915, durante a Primeira Guerra Mundial, a Alemanha foi acusada de usar cólera na Itália e praga em São Petersburgo. Há evidências de que a Alemanha usou mormo e antraz para infectar cavalos (1914) e gado, respectivamente, em Bucareste em 1916, e empregou táticas semelhantes para infectar 4.500 mulas na Mesopotâmia no ano seguinte.

O período 1940 & # 8211 1969 pode ser considerado a idade de ouro da pesquisa e desenvolvimento da guerra biológica. Especialmente a década de 1940 foi o período mais abrangente de pesquisa e desenvolvimento da guerra biológica.

Os Estados Unidos assinaram o Protocolo de Genebra, mas o Senado votou apenas em 1974. Informações detalhadas sobre a história do Programa de guerra biológica ofensiva dos EUA entre 1941 e 1973 pode ser encontrado na ref. [41].

Foi relatado recentemente que os Estados Unidos testaram uma bomba germinativa projetada pela União Soviética e montaram uma fábrica de germes no deserto de Nevada a partir de materiais disponíveis comercialmente, em particular para produzir uma variante potencialmente mais potente da bactéria que causa o antraz, uma doença mortal ideal para germes guerra [42]. É discutível se tal pesquisa é consistente com o tratado que proíbe armas biológicas.

A ex-União Soviética tinha um importante programa de armas biológicas, que pode ter se estendido até o período após sua dissolução [43].

Por uma década após 1972, havia esperança de que o problema da Guerra Biológica seria erradicado. No entanto, as últimas duas décadas produziram indícios de que cerca de oito nações em desenvolvimento, além da China e Israel, iniciaram programas de desenvolvimento de armas biológicas em vários graus.

Agentes de guerra biológica (BW), ou armas biológicas, são & # 8216organismos vivos, qualquer que seja sua natureza, ou material infeccioso derivado deles, que se destinam a causar doenças ou morte no homem, animal e plantas, e que dependem para seus efeitos de sua capacidade de se multiplicar na pessoa, o animal, ou planta atacada & # 8217. Os agentes de BW, no entanto, podem ser usados ​​não apenas em guerras, mas também por terroristas. Deve-se, portanto, referir-se a organismos vivos & # 8216usado para fins hostis & # 8217.

o Biológico Cáguias Convention (BWC) proíbe que bactérias como a salmonela sejam usadas contra soldados. Isso permitiria bactérias que comem petróleo ou borracha para a destruição de equipamentos para fins pacíficos, mas proíbe seu uso para aplicações hostis.

6.2 Agentes de guerra tóxicos e outros agentes de guerra química

As toxinas são substâncias tóxicas geralmente produzidas por organismos vivos. Agentes de guerra de toxinas (TW), ou armas tóxicas, são toxinas usadas para propósitos hostis. Agentes TW são inequivocamente tipos de agentes de guerra química (CW). Agentes CW, ou armas químicas, são substâncias químicas gasosas, líquidas ou sólidas, que são usadas com propósitos hostis para causar doenças ou morte em humanos, animais ou plantas e que dependem de sua toxicidade direta para seu efeito primário.

Os agentes TW, como todos os outros agentes CW, são inanimados e incapazes de se multiplicar. Eles são agentes CW independentemente de serem produzidos por um organismo vivo ou por síntese química ou mesmo se eles são responsáveis ​​pela qualificação desse organismo como um agente BW.

No entanto, os agentes TW são freqüentemente considerados erroneamente como armas biológicas, e as definições de guerra biológica (BW) ocasionalmente incluem agentes TW. Novos agentes de armas químicas, que são 5 a 10 vezes mais perigosos do que VX, o gás tóxico mais perigoso conhecido hoje.

O controle bem-sucedido de armas biológicas é uma tarefa assustadora [44]. Garantir a segurança contra armas biológicas e tóxicas é uma questão mais complexa do que proibir totalmente armas químicas ou nucleares. Isso se deve ao caráter das tecnologias relevantes. Mais do que isso, a biotecnologia é de dupla utilização, ou seja, a mesma tecnologia pode ser usada para fins civis e militares de defesa permitidos, bem como para fins ofensivos ou terroristas proibidos.

6.3 Guerra Biológica contra Culturas

Desencadear intencionalmente organismos que matam as safras de alimentos de um inimigo é uma arma potencialmente devastadora de guerra e terrorismo [45]. Todas as principais safras de alimentos vêm em uma série de variedades, cada uma geralmente adequada a condições específicas de clima e solo. Essas variedades têm sensibilidades variadas a doenças específicas. Os patógenos das culturas, por sua vez, vêm em diferentes linhagens ou raças e podem ser direcionados de forma eficiente contra essas marcas de culturas. Dessa forma, pode ser possível atacar o estoque de alimentos do inimigo, mas evitando danos ao próprio. No entanto, tal estratégia pode não funcionar para países vizinhos, onde as condições agrícolas são semelhantes às do agressor. A disseminação desses organismos representa o risco de uma epidemia mundial, e o uso dessas armas pode muito bem ser contraproducente. Qualquer guerra desse tipo seria dirigida principalmente contra a população civil. Devido aos atrasos envolvidos, isso não afetaria imediatamente o resultado de uma guerra.

No entanto, muitos países desenvolveram substâncias anticrop no século XX.

O Iraque fabricou a partir dos anos 70 o fungo da obscenidade do trigo, visando as plantas de trigo no Irã. O programa de armas biológicas da França no final da década de 1930 incluía o trabalho com dois assassinos de batata. Durante a Segunda Guerra Mundial, os britânicos se concentraram em vários herbicidas. A Alemanha investigou durante o mesmo período doenças como a requeima da batata e ferrugem do trigo que infecta as folhas, bem como pragas de insetos, como o besouro do Colorado. O programa de armas biológicas do Japão na Segunda Guerra Mundial não é muito conhecido, mas contém patógenos e herbicidas químicos. Os esforços americanos foram substanciais. Eles se concentraram em produtos que atacavam as safras de soja, beterraba sacarina, batata-doce e algodão, destinadas a destruir o trigo no oeste da União Soviética, e o arroz na Ásia, principalmente na China. Entre 1951 e 1969, os EUA armazenaram mais de 30.000 kg do fungo que causa a ferrugem do trigo, uma quantidade provavelmente suficiente para infectar todas as plantas de trigo do planeta [45]. De acordo com outra fonte [46], 36.000 kg de ferrugem do colmo do trigo e uma quantidade adicional de ferrugem do colmo do centeio, apenas 900 kg de brusone foram produzidos e armazenados. Os EUA, usando a & # 8220bomba de penas & # 8221 e balões flutuantes, desenvolveram sistemas de distribuição e transporte engenhosos.

7. ADM: Guerra, Terrorismo, Perspectiva Comparada

O conceito de armas de destruição em massa (ADM) deve ser revisitado, conforme apontado na Introdução deste artigo. A eficiência física e o efeito psicológico dessas armas podem diferir consideravelmente quando são usadas na guerra por soldados ou em tempos de paz por terroristas. Os países industrializados podem desenvolver tecnologias confiáveis ​​e sofisticadas, que podem não estar disponíveis para pequenos grupos.

7.1 Armas na Guerra

A eficiência das armas na guerra está intimamente relacionada com o parâmetro de tempo:

  • Número de baixas inimigas em um determinado período,
  • Número de armas utilizadas para obter o resultado desejado,
  • Prazo de entrega das armas,
  • Possibilidade de armazenamento por longos períodos,
  • Infraestrutura afetada por seu uso,
  • Evitar impacto negativo sobre as próprias tropas e população civil,
  • Termine uma guerra rapidamente,
  • Nenhuma defesa eficiente contra armas de curto ou longo prazo.

Evidentemente, as armas nucleares são & # 8220superior & # 8221 a quaisquer outras armas em todos esses pontos. Uma categoria de arma específica é útil em conflitos entre países e / ou na guerra civil? Pode servir como um impedimento? Seu uso tem efeitos de longo prazo na área de cultivo?

A eficiência das armas químicas e biológicas depende muito de sua dispersão, das condições climáticas, determinando a exposição e letalidade para os combatentes. Um agente presuntivo não deve ser apenas altamente tóxico, mas também & # 8216 adequadamente altamente tóxico & # 8217, para que não seja muito difícil de manusear pelo usuário. Deve ser possível armazenar a substância em recipientes por longos períodos sem degradação e sem corroer o material de embalagem. Esse agente deve ser relativamente resistente à água atmosférica e ao oxigênio, para que não perca seu efeito quando disperso. Ele também deve suportar as forças de cisalhamento criadas pela explosão e pelo calor quando é disperso. O transporte desses agentes por mísseis de longo alcance e distribuição eficiente enfrentará enormes dificuldades, causando sua decomposição, principalmente devido ao desenvolvimento de calor da ogiva na reentrada na atmosfera. Alguns países desenvolvidos já podem ser capazes de superar esses obstáculos [47].

Encontrar uma resposta para essas perguntas pode ser facilitado pela avaliação de guerras anteriores.

Na Primeira Guerra Mundial, uma média de uma tonelada de agente era necessário matar apenas um soldado. As armas químicas causaram 5% das vítimas. O uso de armas químicas não acabou com a guerra rapidamente, como havia sido previsto. Durante a guerra entre o Iraque e o Irã até março de 1997, 27.000 iranianos foram expostos a granadas químicas, apenas 265 morreram. Durante toda a guerra entre esses dois países, armas químicas mataram 5.000, de um total de 600.000 por todas as causas, ou seja,menos de 1 por cento [6].

A eficiência das armas químicas / biológicas em guerras futuras é difícil de prever. As estimativas cobrem uma ampla gama, conforme mostrado abaixo.

Em condições ideais, 1 tonelada de Sarin lançada de um avião poderia produzir de 3.000 a 8.000 mortes; no entanto, em condições de brisa, apenas 300 a 800 [6]. Para obter um efeito sensato, é necessário que os aviões voem a altitudes muito baixas (menos de 100 metros) e, conseqüentemente, a zona de letalidade que poderia ser coberta permanece pequena. Além disso, as partículas do agente maiores que 10 micrômetros não atingem a região alveolar não ciliada nos pulmões, e aquelas com um tamanho de cerca de 1 micrômetro são exaladas. O tamanho ideal é algo entre 10 a 5 micrômetros, que não pode ser obtido facilmente. A luz solar mata ou desnatura a maioria dos agentes biológicos. A eficiência do antraz pode cair por um fator de mil quando o agente é usado durante um dia ensolarado. Portanto, os agentes devem ser pulverizados durante a noite.

As armas químicas dependem mais do que qualquer outro armamento de fatores atmosféricos e topográficos, enquanto a temperatura, o clima e o terreno são fatores importantes na determinação da persistência de um determinado agente químico. Ataques químicos podem contaminar uma área por várias horas a vários dias. Peso por peso, as armas biológicas são centenas a milhares de vezes mais potentes do que a arma química mais letal [47. 48]. O tempo de contaminação varia entre várias horas e várias semanas.

Uma ogiva de míssil Scud cheia de botulinum poderia contaminar uma área de 3.600 quilômetros quadrados, ou 16 vezes maior do que a mesma ogiva cheia com o agente nervoso Sarin [49].

Um estudo das Nações Unidas [50] comparou os resultados hipotéticos de um ataque realizado por um bombardeiro estratégico usando armas nucleares, químicas ou biológicas. Uma bomba nuclear de um megaton, o estudo descobriu, pode matar 90 por cento das pessoas desprotegidas em uma área de 300 quilômetros quadrados. Uma arma química de 15 toneladas pode matar 50% das pessoas em uma área de 60 quilômetros quadrados. Mas uma arma biológica de 10 toneladas pode matar 25% das pessoas e deixar 50% doentes, em uma área de 100.000 quilômetros quadrados.

Se um míssil balístico atingir uma cidade lançando 30 quilos de esporos de antraz em uma ogiva unitária contra uma cidade sem nenhuma medida de defesa civil, isso pode resultar em níveis de dosagem inalatória letal em uma área de cerca de 5 a 25 quilômetros quadrados. Sem tratamento, a maior parte da população infectada morreria em uma ou duas semanas. Para densidades populacionais urbanas típicas, isso poderia resultar na morte de dezenas de milhares ou mesmo centenas de milhares de pessoas [51].

Foram feitas observações exageradas, contraproducentes, essencialmente incorretas e até perigosas de um alto funcionário dos Estados Unidos. Ele afirmou que cerca de 2,5 quilos de antraz, se lançado no ar sobre Washington, DC, mataria metade de sua população, ou seja, 300.000 pessoas (TV, novembro de 1997). Em março de 1988, quatro dos especialistas mais qualificados em antraz servindo no governo dos Estados Unidos publicaram um artigo no Arquivos de medicina interna que usava uma estimativa diferente: 50 quilos de antraz liberados sobre uma cidade de 500.000 pessoas poderiam matar até 95.000 pessoas, e possivelmente menos, dependendo das condições atmosféricas urbanas. A primeira estimativa foi aproximadamente 100 vezes maior [46, 52].

Essas eficiências acima pressupõem, entretanto, que os agentes químicos e biológicos podem se espalhar por uma grande superfície e atingir o nível do solo, enquanto as armas nucleares podem ser explodidas em qualquer altitude predeterminada e no nível do solo com a eficiência desejada.

7.2 Armas para terroristas

Há um medo amplamente injustificado do público em relação a ataques terroristas com agentes químicos ou biológicos, seu impacto na vida diária, sua frequência e número de pessoas possivelmente afetadas.

Entre 1960 e 1980, ocorreram 40.000 incidentes de terrorismo internacional (de acordo com a CIA), mas apenas 22 deles foram realizados com agentes químicos ou biológicos, apresentando uma proporção ínfima de 1 / 2.000. De 1900 até hoje ocorreram 71 atos terroristas em todo o mundo envolvendo o uso de agentes biológicos ou químicos, resultando em 123 vítimas fatais, entre as quais apenas uma era americana, atingida por uma bala com cianeto. Esses atos produziram 3.774 lesões não fatais (784 americanos, 751 deles por intoxicação alimentar por salmonela por uma seita religiosa baseada em Oregan). Durante as primeiras nove décadas do século 20, houve 70 ataques biológicos (18 por terroristas), causando 9 mortes [6].

A seita Aum-Shinrikyo no Japão tinha cerca de US $ 1 bilhão (outra fonte dá US $ 1,2 a 1,6 bilhão) à sua disposição para o desenvolvimento de armas químicas e biológicas.

  • Aum tinha equipamento adequado (ainda mais do que o necessário).
  • Aum havia usado empresas de fachada comercial para comprar o equipamento.
  • Aum pode ter gasto cerca de US $ 10 milhões em seu esforço para produzir agentes biológicos.
  • Vários dos indivíduos tinham pós-graduação.
  • Aum reuniu uma biblioteca de pesquisa.
  • Aum teve tempo suficiente & # 8211 quatro anos & # 8211 para suas tentativas.
  • Aum tentou adquirir expertise na Rússia e obter ou comprar cepas de doenças no Japão.

No entanto, Aum não conseguiu produzir nenhum dos dois agentes biológicos, Clostridium botulinum, para obter toxina botulínica, e antraz, e também não conseguiu dispersá-los. Apesar de seus esforços, gasta R $ 10 milhões no desenvolvimento de agentes biológicos. Aum pulverizou toxina botulínica sobre Tóquio várias vezes em 1990 e conduziu atividades semelhantes com esporos de antraz em 1993, mas sem nenhum efeito conhecido. Na verdade, a seita havia usado uma cepa de vacina contra antraz relativamente inofensiva e o aerossolizador não tinha eficiência suficiente [53, 54].

Existem dois ataques Aum bem divulgados com agentes químicos (Matsumoto, 3 kg de Sarin puro, metrô de Tóquio de 1994, 6-7 kg de Sarin 30% puro, 1995), este último feito em uma área confinada, limitando um efeito prejudicial da corrente de ar. No entanto, o ataque de Matsumoto matou apenas sete inocentes não direcionados, e em Tóquio apenas 12 pessoas morreram por contato direto com o líquido e não por fumaça [54].

Uma descrição mais detalhada da avaliação de risco por terrorismo com armas químicas e biológicas pode ser encontrada em [54]. Este artigo fornece resultados de simulação computacional para dispersão de agentes químicos e biológicos em várias condições atmosféricas e seus parâmetros de impacto na saúde humana.

7.3 Perspectiva Comparativa

Os analistas definiram Mass Casualty como algo entre 100 e 1.000 pessoas chegando aos hospitais. Os números da seção anterior estão relacionados a mortes e um fator de até cerca de dez deve ser aplicado para incluir indivíduos que sofreram lesões não letais. Evidentemente, fatores semelhantes devem ser usados ​​para vítimas de armas convencionais na guerra.

Na discussão do terrorismo por agente biológico como um evento potencial de morte em massa, é bastante revelador observar a mortalidade anual em vários setores da saúde pública nos EUA [53]:

• Incidência de doenças transmitidas por alimentos: 76 milhões de casos por ano
315.000 hospitalizações por ano
5.000 mortes por ano
• Mortalidade por erro médico: entre 44.000 e 98.000 mortes por ano
• Infecções contraídas em hospitais: 20.000 mortes por ano
• O surto de cryptosporidium de 1993 em Milwaukee (poluição da água) adoeceu 400.000 pessoas
• A poluição do ar nos EUA resulta em 50.000 mortes por ano
• As armas de fogo resultam em 35.000 mortes por ano.

Comparado com esses dados, o impacto do terrorismo de agentes biológicos e químicos no passado é insignificante e permanecerá provavelmente (espero!) Pequeno.

8. Implementação da Convenção e Conclusões sobre Armas Químicas e Biológicas

Como a maioria dos desenvolvimentos científicos e industriais, existe a possibilidade de aplicá-los para o bem ou para o mal. A responsabilidade dos cientistas, bem como dos políticos e militares, é desafiada. A produção do material básico para aplicação militar ou civil está intimamente ligada. Isso torna extraordinariamente difícil qualquer inspeção e acusação de uso militar pretendido. Além disso, os fabricantes temem por suas patentes e estão preocupados com a espionagem industrial.

A produção de agentes de guerra biológica pode ser feita em qualquer hospital ou salas de porão em pequenas quantidades por pessoal qualificado, para produtos químicos requer fábricas maiores. Os 121 Estados Partes e 48 Estados signatários da Convenção de Armas Químicas têm um órgão de implementação, o Organização para a proibição de armas químicas (OPCW), que está operacional há dois anos a partir de Haia [7]. Já realizou mais de 500 fiscalizações. A OPCW tem cerca de 500 funcionários, sendo 200 inspetores e 300 funcionários administrativos. Destes 300 administradores, a maioria são especialistas em verificação e planejadores de inspeção. Entre as questões antigas mais importantes estão: diretrizes para baixas concentrações, a usabilidade de armas químicas antigas e abandonadas. Conforme mencionado acima, a Convenção de Armas Químicas (CWC) não cobre armas químicas despejadas no mar.

Ainda não houve progresso no estabelecimento de uma organização analógica para a Convenção sobre Armas Biológicas e Tóxicas (BWC). Pode ser colocado em Haia ou em Genebra. O trabalho no protocolo para fortalecer a Convenção de Armas Biológicas, bem como o protocolo de verificação ainda está em seu estado inicial, e o sucesso da 5ª Conferência de Revisão do BWC a ser realizada em Genebra em novembro de 2001 não está de todo garantido [46] . Dos 141 Estados Partes do BWC, apenas cerca de 60 enviam delegações ao Grupo Ad Hoc (AHG). Nem todos os AHG aceitam o conceito de visitas aleatórias. O estabelecimento de uma organização internacional para supervisionar a implementação do protocolo BWC é estimado em uma equipe de 233 pessoas e um custo anual de aproximadamente $ 30 milhões. Pode haver cerca de 70 inspetores realizando aproximadamente 100 visitas por ano. Um dos temas em disputa está relacionado às novas formas de armas biológicas, provocadas pela revolução da biotecnologia [38]. O sistema de entrega ou a eficiência desses novos agentes não mudou, mas sua capacidade de manipular os próprios processos da vida humana. As armas biológicas agora devem ser vistas como uma ameaça global para a espécie humana, mas não como uma arma eficiente na guerra.

As inspeções de agentes biológicos atingirão mais resistência da indústria farmacêutica e biotécnica do que a da indústria química.

As perigosas sobras da corrida das armas químicas, como as da construção de armas nucleares, sem esquecer as minas terrestres, ainda ficarão por muito tempo. Ética, política e segurança internacional devem ser estreitamente entrelaçadas para remover essas armas desumanas da Terra. É uma excelente oportunidade para uma colaboração frutífera entre o setor de conversão de defesa e a comunidade ambiental.

O CBWC certamente tem o efeito benéfico de reduzir o arsenal de armas antigas, mas não dará garantia de que novos desenvolvimentos clandestinos em vários países passarão despercebidos.

A dificuldade de usar essas armas com eficiência é em geral subestimada, mas seu impacto é exagerado. Essa combinação causa medo injustificável do público e leva os formuladores de políticas a conclusões equivocadas, entre eles a de designá-los como WMDs e manter as armas nucleares como meio de dissuasão.

A avaliação crítica e comparativa dos três tipos de armas (pode-se querer incluir armas radiológicas) apresentada neste artigo não tem a intenção de desacelerar os esforços para a eliminação de armas químicas e biológicas. O CBWC deve continuar a ser um tratado importante e as negociações sobre as disposições de aplicação devem ser aceleradas, para que possa eventualmente ser totalmente implementado. Em particular, o arsenal de armas não utilizadas, estando em armazenamento ou & # 8220disposto& # 8221 nos oceanos ou em outro lugar, representa um perigo considerável a curto e longo prazo para os humanos e o meio ambiente. Qualquer um morto por essas armas é demais. No entanto, temos que colocar essas armas e as convenções ratificadas na perspectiva quantitativa correta.

Na opinião do autor, a maioria das armas convencionais, em particular as armas pequenas, são armas de Matança em massa: De acordo com um inquérito da Cruz Vermelha [57] Fuzis de assalto, como AK47s, pistolas e minas terrestres, causou 64%, 10% e 10% das vítimas civis, respectivamente. Os 16% restantes são quase igualmente compartilhados entre Granadas de mão, artilharia (incluindo bombas de fragmentação e incineração), morteiros e armas principais. Durante o século 20, essas armas foram usadas para matar 34 milhões de soldados em combate, 80 milhões de civis, além de soldados que morreram por ferimentos, acidentes ou doenças. O mundo era & # 8220afortunado& # 8221 que apenas duas bombas nucleares foram lançadas na guerra até agora. Eles mataram & # 8220

200.000 pessoas. No entanto, o arsenal nuclear tem que estar no topo da categoria WMD, já que tem o potencial de apagar os humanos de nosso planeta em quase nenhum momento.

Manutenção de armas nucleares pelos Estados com Armamento Nuclear (NWS) para impedir a produção e o armazenamento de armas químicas e biológicas, principalmente em países de preocupação, só pode ser interpretado como um pretexto injustificável e irracional para manter as armas nucleares indefinidamente em estoque. É politicamente sensato mudar a definição infeliz e enganosa de armas de destruição em massa (WMD = NW + CW + BW), repetido várias vezes na mídia e profundamente gravado na mente das pessoas? Uma nova definição desviará a atenção da importância dos dois tratados universalmente ratificados? Pode ser contraproducente fazer isso em uma época em que os cientistas estão sob crescente escrutínio e ataques?

O autor sentiu que informar o público instruído e os formuladores de políticas sobre uma redefinição de ADM justifica a mudança e supera as possíveis repercussões negativas.

Gosto de agradecer ao professor W.K.H. Panofsky pela leitura cuidadosa de uma versão anterior deste artigo e pelas valiosas críticas e sugestões úteis. Agradecemos ao Dr. Milton Leitenberg por fornecer uma grande quantidade de literatura relevante e por compartilhar comigo seu profundo conhecimento e visão sobre o problema da guerra biológica e do terrorismo. Aproveitei muito a participação nas oficinas de Como / Itália e Roma, organizadas pelo Professor Maurizio Martellini, e agradeço o amável convite para esses eventos. As opiniões expressas neste artigo são do autor e sob sua exclusiva responsabilidade.

[1] G. Harigel, & # 8220Possible Consequences of the misuse of Biological Sciences & # 8221, Inauguração da Escola Internacional da UNESCO para a Paz, Villa Olmo, Como, 3-6 de dezembro de 1997, Proceedings of the First Forum, Editores: E Becker et al., Pp.475-477 (477). e & # 8220O problema duplo das ogivas e seus veículos de entrega. Onde colocar a prioridade durante as futuras negociações do tratado & # 8221, ISODARCO Seminário de Pequim, outubro / novembro de 1998, paginação não consecutiva.

[2] W.K.H. Panofsky, & # 8220Dismantling the Concept of & # 8216Weapons of Mass Destruction '& # 8221, Arms Control Today, abril de 1998, pp. 3-8.

[3] M. Meselson, & # 8220The Myth of Chemical Superweapons & # 8221, The Bulletin of Atomic Scientists, abril de 1991, pp. 12-15.

[4] L.A.Cole, & # 8221 The Spectre of Biological Weapons & # 8221, Scientific American, dezembro de 1996, pp. 30-35.

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[6] Henry Sokolski, & # 8220Looming Security Threats, Rethinking Bio-Chemical Dangers & # 8221, Orbis, Spring 2000, http://www.wizard.net/

[7] & # 8220The Chemical Weapons Convention & # 8221, SIPRI Fact sheet, abril de 1997, reproduzido em SIPRI Yearbook 1993: World Armaments and Disarmament (Oxford University Press: Oxford, 1993), Apêndice 14A, pp. 735-56.

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[8] & # 8220O CWC no marco de dois anos: uma entrevista com o Dr. John Gee & # 8221 Arms Control Today, abril / maio de 1999, pp. 3-9.

[9] & # 8220Verifying CW Destruction & # 8221, Trust & amp Verify, novembro de 2000, Issue Number 94, pp. 4-7.

[10] & # 8220Características de agentes de guerra química e resíduos de armamento tóxico & # 8221, em O Desafio das Antigas Munições Químicas e Resíduos de Armamento Tóxico, Editado por Thomas Stock e Karlheinz Lohs, SIPRI, Oxford University Press, 1997, pp. 15-34.

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[15] & # 8220Factfile: US Unitary and Binary Chemical Stockpiles & # 8221, Arms Control Today, fevereiro de 1996, p. 34

[16] SIPRI Yearbook 1993, World Armaments and Disarmament, Oxford University Press, 1993, pp. 277-281.

[17] P.Doty, & # 8220The Challenge of Destroying Chemical Weapons & # 8221, Arms Control Today, outubro de 1992, pp. 25-46.

[18] Derek Averre & amp Igor Khripunov, & # 8220Chemical Weapons Disposal: Russia Tries Again & # 8221 Bulletin of the Atomic Scientists, 57-63, setembro / outubro de 2001.

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[21] A.E. Smithson, & # 8220Chemicals Destruction: The Work Begins & # 8221, The Bulletin of Atomic Scientists, abril de 1993, pp. 38-43.

[22] H.P.Smith, & # 8220Funding CW Demilitarization in Russia: Time to Share the Burden & # 8221, Arms Control Today, novembro / dezembro de 1998, pp. 16-20.

[23] Oficina Pugwash Moscow-Snezhinsk, & # 8220The Future of Nuclear Weapons Complexes of Russia and the USA & # 8221, 8-14 de setembro de 1997, Comunicação privada.

[24] R.A. Saar, & # 8220Tracking the Dangers of Mercury & # 8221 International Herald Tribune, 10 de novembro de 1999.

[25] G. Charpak, R. Garwin, Feux Follets et Champignons Nucléaires, Edições Odile Jacob, 1997.

[26] D. Hoffman, & # 8220Missile Expert Warns of & # 8216100s of Chernobyls '& # 8221, International Herald Tribune, 15 de maio de 1998.

[27] http://www.altavista.com/cgibin/query?pg=q&sc=on&hl=on&q=Zyklon+B&kl= XX & ampstype = stext & ampsearch.x = 24 & ampsearch.y = 7

[28] & # 8220A lista de lavanderia não letal & # 8221, The Bulletin of Atomic Scientists, setembro / outubro de 1994, p. 43

[29] Protocolo IV sobre armas laser para cegueira, http://www.austlii.edu.au/au/other/dfat/multi/19980730.html

[30] P. Leahy, & # 8220The CCW Review Conference: An Opportunity for US Leadership & # 8221, Arms Control Today, setembro de 1995, pp. 20-24.

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[35] & # 8220Toxic Bullets & # 8211 An Update & # 8221, The Defense Monitor, Vol.XXVIII, Número 8, pp. 1, 3.

[36] St. Fetter & amp F. von Hippel, & # 8220Após a poeira assentar & # 8221, The Bulletin of Atomic Scientists, novembro / dezembro de 1999, pp. 42-45.

[37] Jürgen Kremb, & # 8220Die neuen Opfer des Kalten Krieges & # 8221, Der Spiegel, 17/2000, pp. 194-196.

[38] Convenção sobre a proibição de uso militar ou qualquer outro uso hostil de técnicas de modificação ambiental (ENMOD), http://www.law.berkeley.edu/faculty/ddcaron/courses/iel/ie01013.htm

[39] Biological and Toxin Weapons Today, editado por E. Geissler, SIPRI, Oxford University Press, 1986, pp. 36-56.

[40] J. A. Poupard, L.A. Miller, & # 8220History of Biological Warfare: Catapults to Capsomeres & # 8221, em O Microbiólogo e Pesquisa de Defesa Biológica, Ética, Política e Segurança Internacional, Editado por R. A. Zilinskas, Annales of The New York Academy of Sciences, Volume 666, New York, N.Y., 1992, pp. 9-20.

[41] The Henry Stimson Center, & # 8220History of the US Offensive Biological Warfare Program (1941-1973), http://www.stimson.org/cwc/bwushis.htm

[42] Judith Miller, Stephen Engelberg e Willaim J.Broad, & # 8220A New Treaty Issue: U.S. Germ Labs & # 8221, International Herald Tribune, 5 de setembro de 2001.

[43] Milton Leitenberg, & # 8220The Biological Weapons Program of the Ex Soviética Union & # 8221, Biologicals, Volume 31, Número 3, pp. 187-191, setembro de 1993.

[44] Iris Hunger, & # 8220O controle de armas biológicas bem-sucedido é uma tarefa abrangente e da responsabilidade de todos & # 8221, declaração do Grupo de Trabalho INES sobre Controle de Armas Biológicas e Tóxicas, preparada para a Quarta Conferência de Revisão da Convenção de Armas Biológicas, 25 de novembro & # 8211 6 de dezembro de 1996, Genebra. e Iris Hunger, & # 8220Improving Biological Security: The Process of Strengthening the BTW Convention & # 8221, Primeiro Fórum do Painel Científico Internacional sobre as Possíveis Consequências do Uso Indevido de Ciências Biológicas, Science for Peace Series, UNESCO, volume no.6, 1997, pp. 367-388.

[45] P. Rogers, S. Whitby e M. Dando, & # 8220Biological Warfare against Crops & # 8221, Scientific American, junho de 1999, pp. 62-67.

[46] Milton Leitenberg, & # 8220Biological Weapons in the Twentieth Century: A Review and Analysis & # 8221, 7º Simpósio Internacional de Proteção contra Guerra Química e Biológica, Estocolmo, Suécia, junho de 2001, http://www.fas.org/ bwc / papers / bw20th.htm

[47] Andrew M. Sessler. John M. Cornwall, Bob Dietz, Steve Fetter, Sherman Frankel, Richard L. Garwin, Kurt Gottfried, Lisbeth Gronlund, George N. Lewis, Theodore A. Postol, David C. Wright, & # 8220Countermeasures: A Technical Evaluation of the Operational Effectiveness of the Planned US National Missile Defense System & # 8221, Union of Concerned Scientists, MIT Security Studies Program, abril de 2000.

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[49] & # 8220Biological Weapons & # 8221, Center for Defense and International Security, http://www.cdiss.org/bw.htm

[50] K. Clements, Malcolm Dando, & # 8220A Wall against These Living Weapons & # 8221, International Herald Tribune, 3.9.1993.

[51] Steve Fetter, & # 8220Ballistic Missiles and Weapons of Mass Destruction, & # 8221 International Security Vol.16 (verão de 1991).

[52] Milton Leitenberg, & # 8220 Terrorismo e armas de destruição em massa & # 8221, ISPAC, Conselho Consultivo Científico e Profissional Internacional do Programa de Prevenção do Crime e Justiça Criminal das Nações Unidas, Conferência Internacional sobre Combate ao Terrorismo Através da Cooperação Internacional Aprimorada, Courmayeur, Mont Blanc , pp. 1-33, 22-24 de setembro de 2000.

[53] Milton Leitenberg, & # 8220An Assessment of the Threat of the Use of Biological Weapons or Biological Agents & # 8221, Paper apresentado for Landau Network & # 8211 Centro Volta Conference, Roma, 18-19 de setembro de 2000.

[54] Jean Pascal Zanders, Edvard Karlsson, Lena Melin, Erik Näslund e Lennart Thaning, em SIPRI Year book 2000, Oxford University Press, Apêndice 9A. & # 8220Avaliação de risco de terrorismo com armas químicas e biológicas & # 8221.

[55] Milton Leitenberg, & # 8220Biological Weapons: A Reawakened Concern & # 8221, The World & amp I, pp. 289-305, janeiro de 1999.

[56] Milton Leitenberg, & # 8220Biological Weapons Arms Control & # 8221, Projeto sobre Repensando o Controle de Armas, Centro para Estudos Internacionais e de Segurança em Maryland, PRAC Paper No. 16, maio de 1996, http://www.puaf.umd.edu /CISSM/publications/bwarmscon.pdf

[57] Jeffrey Boutwell e Michael T. Klare, & # 8220A Scourge of Small Arms & # 8221, Scientific American, junho de 2000, pp. 30-35.


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