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7.25C: Northern Blots - Biologia

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Northern blots permitem aos investigadores determinar o peso molecular do RNA mensageiro e o conteúdo da amostra.

objetivos de aprendizado

  • Avalie as aplicações de Northern Blots

Pontos chave

  • O RNA (RNA total ou apenas mRNA) é separado por eletroforese em gel, geralmente um gel de agarose. Como existem tantas moléculas de RNA diferentes no gel, geralmente aparece como uma mancha em vez de bandas discretas.
  • O RNA é transferido para uma folha de papel mata-borrão especial chamada nitrocelulose, embora outros tipos de papel ou membranas possam ser usados. As moléculas de RNA mantêm o mesmo padrão de separação que tinham no gel.
  • O blot é incubado com uma sonda de DNA de fita simples. Esta sonda formará pares de bases com sua sequência de RNA complementar e se ligará para formar uma molécula de RNA-DNA de fita dupla. A sonda é radioativa ou possui uma enzima ligada a ela.

Termos chave

  • hibridização: O ato de hibridizar ou o estado de ser hibridizado.

O Northern blot é uma técnica utilizada em pesquisas de biologia molecular para estudar a expressão gênica em uma amostra, por meio da detecção de RNA (ou RNA mensageiro isolado). Com o Northern blotting, é possível observar o controle celular sobre a estrutura e função, determinando os níveis de expressão de genes específicos durante a diferenciação, morfogênese, bem como condições anormais ou de doença. Northern blotting envolve o uso de eletroforese para separar amostras de RNA por tamanho e detecção com uma sonda de hibridização complementar a parte ou a toda a sequência alvo.

O termo "Northern blot" na verdade se refere especificamente à transferência capilar de RNA do gel de eletroforese para a membrana de blotting. No entanto, o inteira processo é comumente referido como Northern blotting. A técnica do Northern blot foi desenvolvida em 1977 por James Alwine, David Kemp e George Stark na Universidade de Stanford. O Northern blotting leva o nome de sua semelhança com a primeira técnica de blotting, o Southern blot, em homenagem ao biólogo Edwin Southern. A principal diferença é que o RNA, ao invés do DNA, é analisado no Northern blot.

Um procedimento de blotting geral começa com a extração do RNA total de uma amostra de tecido homogeneizado ou de células. O mRNA eucariótico pode então ser isolado através do uso de cromatografia de oligo (dT) celulose para isolar apenas os RNAs com uma cauda poli (A). As amostras de RNA são então separadas por eletroforese em gel. Como os géis são frágeis e as sondas não conseguem entrar na matriz, as amostras de RNA, agora separadas por tamanho, são transferidas para uma membrana de náilon por meio de um capilar ou sistema de transferência a vácuo.


Técnicas de Blotting Usadas para Expressão Gênica | Genética

A técnica de blotting é uma ferramenta extremamente poderosa para analisar a estrutura do gene e usada para estudar a expressão do gene, uma vez que o cDNA clonado é isolado. Existem três tipos importantes de técnicas de transferência: 1. Southern Blotting 2. Northern Blotting 3. Western Blotting.

Técnica # 1. Southern Blotting:

Desenvolvido por E.M. Southern, a técnica de Southern blotting é um dos métodos mais importantes usados ​​em biologia molecular. No Southern blotting, o DNA é transferido de um gel para uma membrana para análise de hibridização. Nesta técnica, o DNA é cortado com enzimas de re & shystriction adequadas e executado em um gel. O tratamento com NaOH desnatura o DNA para formar uma fita única.

A transferência de DNA do gel de agarose para a membrana é realizada por ação capilar. O gel é colocado acima do papel de filtro saturado com tampão. A membrana de nitrocelulose é colocada acima do gel e coberta por 2-3 camadas de toalha de papel de filtro seca. Um fluxo de tampão ocorre através do gel e da membrana para os papéis superiores.

O fluxo carrega consigo o fragmento de DNA. No entanto, o DNA não consegue passar pela membrana e é fixado firmemente ao papel. A membrana, na qual o DNA é preso, é então exposta durante a noite a uma solução contendo a sonda de cDNA marcada com rádio. A ligação da sonda à sua sequência complementar é então detectada por autorradiografia (Fig. 13.3 (a)).

Southern blotting é útil para detectar arranjos de genes principais. Esta técnica desempenha um papel importante na impressão digital de DNA, identificação de novo gene, identificação de genes estruturalmente relacionados na espécie, etc.

Técnica # 2. Northern Blotting:

Northern blotting é uma técnica usada para analisar RNA. No Northern blot, o RNA é transferido do gel de agarose para o papel de nitrocelulose para análise de hibridização. O RNA celular total ou RNA poli (A) é separado por tamanho em um gel de agarose. As moléculas de RNA no gel podem ser transferidas para nitrocelulose ou membrana de náilon.

As moléculas de RNA são separadas em gel de agarose contendo formaldeído ou dimetilsulfóxido. O formaldeído é usado para alterar a estrutura secundária das moléculas de RNA. O papel de filtro de Ni e shitrocelulose liga-se fortemente ao RNA desnaturado, mas não ao RNA com estrutura secundária. O papel de nitrocelulose torna-se retivo após o tratamento com aminobenziloximetil.

Depois de blotting RNA para papel quimicamente reativo, eles são hibridizados para sonda de DNA radiomarcada. A autorradiografia é então realizada para localizar bandas de RNA que são complementares à sonda (Fig. 13.3 (b)).

O Northern blotting é útil na identificação de uma expressão de gene particular em um tecido ou tipo de célula. É útil na clonagem de cDNA porque o tamanho de um mRNA específico pode ser comparado com o tamanho do cDNA clonado.

Técnica # 3. Western Blotting:

O Western blotting está associado à transferência de proteínas do gel de acrilamida para nitro e shicelulose ou membrana de náilon. Esta técnica é útil na identificação de um produto gênico particular. Qualquer proteína alvo pode ser identificada pelo método de triagem imunológica.


Uma comparação do Northern Blot vs. Técnica Southern Blot

Northern blotting e Southern blotting são técnicas utilizadas em biologia molecular, utilizadas para detectar alterações macromoleculares relacionadas ao DNA. BiologyWise explica a natureza e o princípio dessas técnicas e compara as diferenças entre elas.

Northern blotting e Southern blotting são técnicas utilizadas em biologia molecular, utilizadas para detectar alterações macromoleculares relacionadas ao DNA. BiologyWise explica a natureza e o princípio dessas técnicas e compara as diferenças entre elas.

Etimologia

Southern blotting tem o nome de Sir E. M. Southern, um biólogo britânico que desenvolveu esta técnica. As técnicas de blotting subsequentes (Northern blotting, Western blotting, etc.), que se baseiam no mesmo princípio, são nomeadas com o mesmo nome.

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Em biologia molecular e genética, várias técnicas de blotting são empregadas para detectar e estudar níveis variáveis ​​de proteínas, DNA ou RNA, e também para estudar as interações que ocorrem entre eles. Southern blotting é usado no caso de DNA, Northern blotting no caso de RNA, Western blotting no caso de proteínas e Eastern blotting no caso de modificações pós-tradução de proteínas. O propósito de cada técnica pode ser diferente, mas todas compartilham o mesmo princípio e metodologia, com alguns pequenos desvios e modificações.

Princípio

Todas as técnicas de transferência baseiam-se no mesmo princípio de emparelhamento de bases específicas das sequências da sonda às sequências imobilizadas na membrana. Qualquer alteração nas sequências da amostra fará com que as sondas não se liguem ou se liguem de forma não específica. Esta mudança na afinidade de ligação será visualizada após hibridização secundária com uma sonda marcada. A intensidade do corante ou fluorescência resultante indicará a especificidade da ligação juntamente com outras características, como número de cópias, expressão gênica, etc.

Técnicas de borrão do norte e do sul

Northern blotting é uma técnica usada para detectar e estudar moléculas de RNA específicas de uma mistura de diferentes RNA, todos isolados de um determinado tecido ou tipo de célula. Ele permite que o investigador determine o peso molecular do mRNA e também a quantidade relativa de mRNA (expressão do gene) em diferentes amostras.

Southern blotting é usado para detectar e estudar sequências de DNA específicas. Ele permite estudar fragmentos de DNA restritos (cortados), mudanças na sequência e sua quantidade relativa em diferentes amostras.

Metodologia

✦ Inicialmente, a amostra purificada é carregada em um gel de agarose e submetida à eletroforese, fazendo com que a amostra se separe em bandas. As bandas são então transferidas para uma membrana portadora pelo princípio da ação capilar ou da corrente elétrica direcionada. A membrana com as bandas transferidas é então selada cozendo em um forno ou tratando-a com uma solução de bloqueio. Isso garante que a transferência se torne permanente e que a superfície não ligada da membrana seja bloqueada, de modo a evitar a ligação de moléculas indesejadas e a possibilidade de um resultado prejudicado.

✦ Uma vez feito o bloqueio, a membrana é lavada suavemente para remover vestígios da solução de bloqueio. A membrana é então tratada com sondas alvo específicas que se ligam às bandas transferidas. A ligação da sonda à molécula alvo é chamada de hibridização primária. A membrana é lavada suavemente para eliminar o excesso de sondas e, em seguida, sofre hibridização secundária, onde a sonda alvo é marcada com um elemento radioativo, um corante fluorescente ou mesmo um corante cromogênico. O excesso é novamente lavado.

✦ Dependendo do tipo de sonda secundária usada, a membrana é visualizada de acordo. No caso de marcação radioativa ou uso de corante fluorescente, um filme de raios X é exposto à membrana por alguns segundos e revelado. Se um corante cromogênico for usado, os resultados podem ser vistos na própria membrana. Hoje em dia, os corantes fluorescentes são preferidos à marcação radioativa para evitar a exposição indevida à radiação. No entanto, existem alguns casos em que é necessário usar rotulagem radioativa.

Northern Blot vs. Southern Blot

Northern Blot Southern Blot
Desenvolvimento
Foi desenvolvido por James Alwine, David Kemp e George Stark em 1977. Foi desenvolvido por Sir Edwin Mellor Southern em 1975.
Origem do Nome
O nome é um nome impróprio - um derivado epônimo de Southern blotting. Recebeu o nome de seu inventor, E. M. Southern.
Propósito
Ele detecta a presença de sequências de RNA específicas. Ele detecta mudanças em sequências de DNA específicas.
Preparação de amostra
A amostra é usada em seu estado nativo. A amostra deve ser desnaturada.
Membrana
A membrana usada é uma membrana de papel de filtro de aminobenziloximetil. A membrana usada é uma membrana de nitrocelulose.
Tipo de Hibridação
Hibridização RNA-DNA Hibridização DNA-DNA
Aplicativo
Para estudar perfis de expressão gênica. Para estudar mudanças genéticas no DNA, ele também pode ser usado para clonagem baseada em homologia.
Derivado
Estudos de blotting do noroeste que detectam interações entre RNA e proteínas. Estudos de blotting do sudoeste que detectam proteínas de ligação ao DNA.

As duas técnicas partem do mesmo princípio e diferem no tipo de moléculas que visam. O desenvolvimento das técnicas de transferência ajudou a fornecer aos cientistas uma ferramenta para estudar as interações moleculares e detectar mudanças, se houver.

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