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Maneiras de medir a eficácia de um ensaio de terapia genética?

Maneiras de medir a eficácia de um ensaio de terapia genética?



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Eu entendo que a hibridização fluorescente in situ pode ser usada para medir a eficácia de um experimento / ensaio de terapia genética.

Mas quais são algumas outras técnicas genéticas para medir a eficácia de um ensaio clínico de terapia genética. O blotting (norte / sul) e a PCR seriam uma forma de saber se um novo genoma foi integrado às células existentes?

Obrigado


Se você só se importasse com a integração genômica, sua melhor aposta seria algum tipo de sequenciamento. Se você sequenciar a região modificada e as regiões flanqueadoras, poderá ter certeza de que a nova sequência estava presente no genoma.

Provavelmente seria mais interessante observar como os novos genes afetam a célula. Por exemplo, você pode observar as diferenças entre a expressão de proteínas em células modificadas e não modificadas. Para isso, você pode usar RNAseq.


UC lança ensaio de terapia genética para transformar o tratamento da doença falciforme

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Uma equipe de cientistas da Universidade da Califórnia está lançando o primeiro estudo em humanos de uma nova e poderosa técnica de edição de genes para consertar o gene ruim que causa a doença das células falciformes, oferecendo a promessa de uma cura para a doença sanguínea devastadora.

Na terça-feira, os pesquisadores anunciaram que receberam a aprovação da Food and Drug Administration dos EUA para testar a abordagem, usando uma técnica chamada CRISPR-Cas9, no Hospital Oakland da UCSF Benioff Children e no Broad Stem Cell Research Center da UCLA.

“Nosso objetivo é ser capaz de fornecer uma terapia segura e eficaz que possamos administrar assim que tivermos o diagnóstico & # 8212 e poupar essas crianças e adultos jovens de todas as complicações desse distúrbio.” disse o Dr. Mark Walters, professor de pediatria da UCSF e principal investigador do projeto.

Por 65 anos, os cientistas conheceram a causa da doença falciforme, mas não conseguiram curá-la sem um transplante de medula óssea. Ao consertar o problema genético subjacente, a nova pesquisa alimenta esperanças para milhares de pessoas que sofrem & # 8212 e abre a possibilidade de tratar outras doenças hereditárias simples.

Estima-se que 6.200 californianos vivam com a doença. Afeta principalmente pessoas de ascendência africana, cerca de 40% têm menos de 18 anos. É causada por uma mutação de um único gene que faz com que as células vermelhas do sangue deformem e obstruam as artérias, causando uma dor terrível e, muitas vezes, a morte. Os tratamentos disponíveis são limitados, envolvendo transfusões regulares.

O estudo, que durará quatro anos, planeja inscrever seus primeiros pacientes neste outono. Ele começará com seis pacientes adultos com idades entre 18 e 35 anos que estão muito doentes. Uma vez comprovado que é seguro e eficaz, ele será testado em três pacientes mais jovens e saudáveis.

Um estudo semelhante está planejado em Stanford e começará a recrutar pacientes assim que a universidade concluir sua revisão, de acordo com o Dr. Matthew Porteus, professor associado de pediatria.

Os novos esforços de pesquisa incluem CRISPR-Cas9 como um bisturi microscópico, realizando cirurgia genômica com precisão e eficiência.

CRISPR - que significa “repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas” ou grupos de sequências curtas de DNA que são lidas de forma semelhante para frente e para trás - funciona como a função de busca e substituição de um computador.

É uma pesquisa transformadora, com cientistas usando-a para tentar consertar os genes que causam distrofia muscular, cegueira hereditária, doença de Huntington, síndrome de Sanfilippo e fibrose cística.

Estima-se que 10.000 doenças humanas são causadas por um único defeito genético que poderia ser corrigido pelo CRISPR, de acordo com a Dra. Maria Grazia Roncarolo, codiretora do Instituto de Biologia de Células Tronco e Medicina Regenerativa de Stanford.

Para a doença falciforme, a grande incógnita é a melhor forma de administrar a correção genética do CRISPR.

Enquanto testes em outras universidades adicionaram com sucesso cópias extras do gene saudável ou eliminaram o gene ruim, o novo teste é um gene "knock-in". É muito direcionado & # 8212 substituir o gene defeituoso por uma versão reparada.

Os cientistas da UC farão isso colhendo algumas das células-tronco, que geram células do sangue, na medula óssea de um paciente.

No laboratório, eles irão extirpar a região ruim do gene da beta-globina do paciente & # 8217s das células-tronco, usando o CRISPR, e então introduzir um bom segmento genético. Esta parte do projeto será conduzida em uma fábrica com sede em Los Angeles no Broad Stem Cell Research Center da UCLA, liderado pelo Dr. Donald Kohn.

As células reparadas serão incubadas por vários dias e, em seguida, enviadas para Oakland. Enquanto isso, o paciente seria submetido a quimioterapia intensiva para matar as células-tronco doentes restantes e abrir espaço para novas.

As células-tronco corrigidas serão infundidas no paciente. Uma vez no lugar, eles devem produzir células saudáveis ​​para substituir as células doentes - para que o paciente se cure.

No laboratório, nem todas as células sanguíneas ruins devem ser reparadas. A equipe está corrigindo atualmente cerca de 20% a 25% dos genes. O objetivo é aumentar a eficiência e corrigir pelo menos 40% das células-tronco do sangue.

"Espero que reconstitua um sistema sanguíneo que não produz mais um número significativo de glóbulos vermelhos falciformes", disse Walters. & # 8220A mutação falciforme desapareceu e a hemoglobina normal e saudável é produzida em seu lugar. & # 8221

O tratamento apresenta risco significativo. A quimioterapia em altas doses pode causar efeitos colaterais de curto prazo. E é perigoso sem um sistema imunológico forte, um paciente pode desenvolver infecções mortais ou leucemia.

O estudo será considerado bem-sucedido se atender a dois objetivos: reconstituir um sistema sanguíneo saudável e reduzir a dor do paciente.

O suporte analítico para o ensaio & # 8212 contando o número de células reconstituídas, estudando células & # 8217 biologia e comportamento e monitorando o bem-estar do paciente & # 8212 será conduzido pelo Innovative Genome Institute da Bay Area, uma colaboração de pesquisa conjunta entre UC- Berkeley e UC San Francisco.

“Estamos motivados para trabalhar em direção a uma cura que pode ser acessível e acessível para pacientes em todo o mundo”, disse Jennifer Doudna da UC Berkeley, que lidera o laboratório de diagnóstico clínico do IGI, e junto com França & # 8217s Emmanuelle Charpentier, ganhou o Prêmio Nobel de Química em 2020 para a descoberta do CRISPR. “O lançamento deste teste é um primeiro passo essencial nesse caminho.”

Cada tratamento experimental é extraordinariamente caro, custando entre US $ 500.000 e US $ 750.000 por paciente.


Editar a resposta imunológica pode tornar a terapia genética mais eficaz

Samira Kiani, M.D, professora associada de patologia, membro do Pittsburgh Liver Research Center e do McGowan Institute for Regenerative Medicine. Crédito: Universidade de Pittsburgh

A terapia gênica geralmente depende de vírus, como o vírus adeno-associado (AAV), para entregar genes em uma célula. No caso de terapias gênicas baseadas em CRISPR, tesouras moleculares podem cortar um gene defeituoso, adicionar uma sequência ausente ou decretar uma mudança temporária em sua expressão, mas a resposta imunológica do corpo ao AAV pode frustrar todo o esforço.

Para superar esse obstáculo, pesquisadores da Escola de Medicina da Universidade de Pittsburgh criaram um sistema que usa o CRISPR de uma maneira diferente. Seu sistema suprime brevemente genes relacionados à produção de anticorpos AAV para que o vírus possa entregar sua carga desimpedida. Esses resultados publicados hoje em Nature Cell Biology.

"Muitos ensaios clínicos falham por causa da resposta imunológica contra a terapia gênica AAV", disse a co-autora sênior do estudo Samira Kiani, médica, professora associada de patologia da Pitt e membro do Pittsburgh Liver Research Center (PLRC) e do McGowan Institute for Regenerative Medicine (MIRM). "E então você não pode readministrar a injeção porque as pessoas desenvolveram imunidade."

Então Kiani e seu colaborador de longa data Mo Ebrahimkhani, M.D., professor associado de patologia da Pitt, membro do PLRC e MIRM, começaram a modificar a expressão do gene relacionado à resposta imunológica do corpo ao AAV. Mas esse gene é importante para a função imunológica normal, então os pesquisadores não queriam desligá-lo para sempre, apenas sufocá-lo momentaneamente.

Como o CRISPR é um sistema conveniente para editar o genoma, a dupla imaginou que o usaria para alterar as chaves mestras que orquestram os genes envolvidos na resposta imunológica.

"Estamos acertando dois coelhos com uma cajadada", disse Ebrahimkhani. "Você pode usar o CRISPR para fazer sua terapia genética e também pode usar o CRISPR para controlar a resposta imunológica."

Quando os pesquisadores trataram camundongos com seu sistema de imunossupressão controlado por CRISPR e os expuseram ao AAV novamente, os animais não produziram mais anticorpos contra o vírus. Esses animais foram mais receptivos à terapia genética subsequente com AAV em comparação com os controles.

Além da terapia genética, o estudo também mostra que a supressão imunológica baseada em CRISPR pode prevenir ou tratar a sepse em camundongos, destacando o potencial dessa ferramenta ser amplamente útil para uma variedade de condições inflamatórias, incluindo tempestade de citocinas e síndrome do desconforto respiratório agudo, ambos de que pode surgir com o COVID-19, embora mais estudos sejam necessários para projetar recursos de segurança.

"O principal objetivo deste estudo foi desenvolver ferramentas baseadas em CRISPR para condições inflamatórias", disse o autor principal do estudo, Farzaneh Moghadam, Ph.D. estudante no laboratório de Kiani. "Mas quando olhamos as amostras de medula óssea, vimos que o grupo tratado com nossa ferramenta mostrou uma resposta imunológica mais baixa ao AAV em comparação com o grupo de controle. Isso foi muito interessante, então começamos a explorar como essa ferramenta contribui para a formação de anticorpos contra AAV e poderia potencialmente abordar questões de segurança e eficácia com ensaios de terapia genética. "

Kiani fundou a SafeGen Therapeutics com o objetivo de trazer essa tecnologia para a clínica.


Referências

Leiper AD. Complicações tardias não endócrinas do transplante de medula óssea na infância: Parte II. Br J Haematol 2002 118: 23–43.

Cavazzana-Calvo M et al. Terapia gênica da imunodeficiência humana combinada grave (SCID) -X1 doença. Ciência 2000 288: 669–672.

Communique de Presse, Déficit Immunitaire Combiné Sévère: suspensão d'un essai clinque. Agence Française De Securite Sanitaire Des Produits de Sante, 3 de outubro de 2002.

Food and Drug Administration Center for Biologics Evaluation and Research, Biological Response Modifers Advisory Committee, Meeting # 33, October 10th, 2002.

Comunicado à imprensa, Comitê Consultivo de Terapia Genética emite Conselhos sobre Ensaios de Terapia Genética X-SCID. Departamento de Saúde, 3 de outubro de 2002.


Ensaios clínicos randomizados & # x02014 o padrão ouro para pesquisa de eficácia

Os ensaios clínicos randomizados (RCT) são estudos prospectivos que medem a eficácia de uma nova intervenção ou tratamento. Embora nenhum estudo possa, por si só, provar a causalidade, a randomização reduz o viés e fornece uma ferramenta rigorosa para examinar as relações de causa e efeito entre uma intervenção e o resultado. Isso ocorre porque o ato de randomização equilibra as características dos participantes (observadas e não observadas) entre os grupos, permitindo a atribuição de quaisquer diferenças no resultado à intervenção do estudo. Isso não é possível com nenhum outro desenho de estudo.

Ao projetar um ECR, os pesquisadores devem selecionar cuidadosamente a população, as intervenções a serem comparadas e os resultados de interesse. Uma vez que estes são definidos, o número de participantes necessários para determinar com segurança se tal relação existe é calculado (cálculo de poder). Os participantes são então recrutados e atribuídos aleatoriamente ao grupo de intervenção ou ao grupo de comparação. 1 É importante garantir que no momento do recrutamento não haja conhecimento de qual grupo o participante será alocado, isto é conhecido como ocultação. Isso é frequentemente garantido pelo uso de sistemas automatizados de randomização (por exemplo, gerados por computador). Os ECRs geralmente são cegos para que os participantes e médicos, enfermeiras ou pesquisadores não saibam qual tratamento cada participante está recebendo, minimizando ainda mais o preconceito.

Os ECRs podem ser analisados ​​por análise de intenção de tratar (sujeitos ITT analisados ​​nos grupos para os quais foram randomizados), por protocolo (apenas os participantes que completaram o tratamento originalmente alocado são analisados), ou outras variações, com ITT frequentemente considerado menos tendencioso. Todos os ECRs devem ter desfechos primários pré-especificados, devem ser registrados em um banco de dados de ensaios clínicos e devem ter aprovações éticas apropriadas.

Os ECRs podem ter suas desvantagens, incluindo seu alto custo em termos de tempo e dinheiro, problemas de generalização (os participantes que se oferecem para participar podem não ser representativos da população em estudo) e perda de acompanhamento.

RECURSOS ÚTEIS

Declaração CONSORT: Diretrizes do CONsolidated Standards of Reporting Trials elaboradas para melhorar o relato de ensaios clínicos randomizados de grupos paralelos - http://www.consort-statement.org/consort-2010

Link para um ensaio clínico randomizado e controlado de sulfato de magnésio para a prevenção da paralisia cerebral no New England Journal of Medicine & # x02013 Um RCT bem projetado que teve um impacto significativo nos padrões de prática. http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0801187#t=abstract

PONTOS DE APRENDIZAGEM

Embora caros e demorados, os ECRs são o padrão-ouro para estudar relações causais, pois a randomização elimina muito do viés inerente a outros desenhos de estudo.

Para fornecer uma avaliação verdadeira da causalidade, os RCTs precisam ser conduzidos de forma adequada (ou seja, tendo ocultação da alocação, análise ITT e ocultação quando apropriado)


Supervisão da terapia genética

A terapia genética tem a promessa de curar doenças e melhorar a qualidade de vida de milhões de americanos que sofrem de fibrose cística, câncer e outras doenças. Na verdade, os jornais de hoje relatam que a terapia genética ofereceu esperança para os milhares de americanos que sofrem de hemofilia. Centenas de testes clínicos foram iniciados ao longo dos anos, à medida que o governo e a indústria privada trabalharam juntos para pesquisar várias maneiras de essa tecnologia atingir seu potencial.

A terapia genética está sujeita a uma supervisão maior do que praticamente todas as outras tecnologias. O FDA, por meio de seu papel estatutário como regulador do desenvolvimento de medicamentos, e o NIH / RAC como fórum de discussão pública, têm servido para proteger os pacientes ao mesmo tempo em que garantem o avanço de pesquisas importantes.

Recentemente, no entanto, surgiram dúvidas sobre a adequação desse processo de supervisão. A trágica morte de um paciente no ensaio clínico da Universidade da Pensilvânia (UPenn) levou a um reexame dos papéis do FDA e do NIH. Foram levantadas questões que devem ser melhor abordadas a fim de mover com segurança e eficiência a pesquisa e o desenvolvimento da terapia genética para o século 21:

  • Quais devem ser as funções respectivas e apropriadas do FDA e OBA / RAC?
  • Quais devem ser os requisitos e mecanismos para relatar eventos adversos graves ao FDA e OBA / RAC?
  • Quais informações devem ser divulgadas publicamente?

Este artigo representa a visão da Organização da Indústria de Biotecnologia (BIO), que representa 850 empresas, instituições acadêmicas e centros estaduais de biotecnologia engajados em pesquisas biotecnológicas em medicamentos, diagnósticos, agricultura, controle de poluição e aplicações industriais. Ele apresenta uma breve visão geral da tecnologia de terapia genética e sua regulamentação e supervisão atuais. Ele também recomenda esclarecimentos sobre as funções e responsabilidades das agências governamentais que atualmente supervisionam os ensaios de terapia gênica para garantir que o melhor equilíbrio seja alcançado entre a necessidade contínua de segurança do paciente e o desenvolvimento futuro dessas novas terapias potencialmente importantes.

Tecnologia de terapia genética

Desde que o primeiro ensaio clínico foi iniciado em 1990, a área de terapia gênica se expandiu muito com um número crescente de patrocinadores e pesquisadores acadêmicos conduzindo ensaios em humanos. Milhares de pacientes já receberam terapias genéticas experimentais. As indicações-alvo para terapias genéticas incluem doenças genéticas e metabólicas, câncer, doenças adquiridas como AIDS e doenças cardiovasculares. O campo da terapia genética continua a concentrar seus esforços em pacientes com doenças graves e potencialmente fatais que geralmente têm poucas opções de tratamento ou que falharam em todas as terapias disponíveis atualmente.

A tecnologia da terapia gênica é muito mais complexa do que substituir um gene danificado ou adicionar um gene para provocar um efeito direto. Pesquisa identificada como terapia de genes evoluiu para incluir a imunoterapia contra o câncer, a angiogênese, a anti-angiogênese, a destruição dos vasos sanguíneos que dão suporte ao crescimento do tumor e uma série de outras intervenções terapêuticas potenciais. Da mesma forma, os vetores usados ​​na terapia gênica continuam a ser refinados. Além de vetores de adenovírus, retrovírus, sistemas de entrega de DNA / lipídeo de plasmídeo, vírus adeno-associado (AAV) e outras tecnologias estão em uso clínico.

Desenvolvimento técnico

Os pesquisadores da terapia gênica ainda enfrentam muitos dos desafios que existiam há uma década: perfeição do projeto do vetor e entrega a locais específicos, controle e persistência da expressão, uma vez entregue ao local alvo, eliminação de respostas imunológicas negativas ao vetor e identificação do produto gênico do alvo locais e heterogeneidade da doença. Superar esses obstáculos requer uma modificação contínua do sistema de entrega de genes, o que contribui para os longos tempos de desenvolvimento desses produtos. No entanto, com o contínuo desenvolvimento pré-clínico e clínico, os pesquisadores avançam em direção ao estabelecimento de produtos de terapia gênica seguros e eficazes projetados para tratar doenças graves e potencialmente fatais.

Mesmo depois de uma década de pesquisa e desenvolvimento clínico, muitos dos ensaios clínicos de terapia gênica que estão ativos hoje estão em um estágio inicial de desenvolvimento. Esses estudos de fase inicial (Fase I / II) são projetados especificamente para avaliar a segurança do vetor sob investigação. Esses estudos continuam em desenvolvimento inicial, não devido a problemas no estabelecimento de um perfil de segurança, mas porque os pesquisadores estão explorando suas opções com indicações, vias de administração, regimes de dosagem, populações de pacientes, terapias combinadas e novos vetores. Muitos estudos também são projetados para avaliar a dose máxima tolerada, com a expectativa de que eventos adversos ocorrerão em algum nível de dose. Essa abordagem é padrão em qualquer processo de desenvolvimento de medicamentos. Além disso, os marcadores biológicos de atividade, não de eficácia, às vezes são avaliados em um estudo de combinação de Fase I / II para avaliar se o vetor está tendo o efeito biológico desejado.

Um alto nível de escrutínio e avaliação tem se concentrado nas terapias genéticas, mais do que em quase qualquer outra tecnologia de saúde. Os ensaios clínicos realizados nos EUA são revisados ​​por quatro órgãos distintos: Food and Drug Administration (FDA), Institutional Review Boards (IRB), Institutional Biosafety Committees (IBC) locais e o National Institutes of Health (NIH) Office of Biotechnology Activities (anteriormente Office of Recombinant DNA Activities). A maioria dos medicamentos e produtos biológicos padrão só são revisados ​​pelo FDA e pelos IRBs.

Os candidatos a novos produtos desenvolvidos pela academia e / ou indústria devem atender a certos padrões definidos antes do teste em humanos. Antes de iniciar estudos em humanos, os candidatos a produtos são rigorosamente testados em modelos pré-clínicos para determinar os parâmetros iniciais de segurança. O FDA é o único órgão com autoridade legal para regular os testes clínicos e produtos de terapia genética.

Para iniciar um ensaio clínico nos Estados Unidos, uma Aplicação Investigacional de Novo Medicamento (IND) deve ser enviada ao FDA. A submissão de INDs é um processo bem definido que está descrito no Código de Regulamentações Federais (CFR). O FDA recebe do patrocinador um pacote de dados completo que inclui todas as informações exigidas pelo 21 CFR 312. O FDA protege diretamente a segurança do paciente por meio da avaliação completa dos dados pré-clínicos, dados de fabricação, quaisquer dados clínicos disponíveis e documentos de consentimento informado. Cada membro da equipe de revisão da FDA traz uma riqueza de experiência e conhecimento em sua especialidade e para o processo de revisão em geral. Todas as comunicações e envios de dados ao FDA são confidenciais e o FDA é legalmente obrigado a manter essa confidencialidade. Por meio desse processo, os patrocinadores e o FDA desenvolvem um relacionamento colaborativo que fornece o desenvolvimento de designs de teste ideais e uma discussão aberta sobre os problemas no desenvolvimento de um produto.

Na condução de qualquer ensaio clínico, o patrocinador tem a obrigação estatutária de acordo com o 21 CFR 312 de relatar eventos adversos (AE) e eventos adversos graves (SAE) ao FDA. Eventos adversos sérios são relatados ao FDA como um relatório rápido (dentro de 7 dias após o recebimento inicial do patrocinador das informações sobre o evento para eventos que são fatais ou com risco de vida, inesperados e associados ao medicamento ou dentro de 15 dias para eventos que são sérios, inesperados e associados ao medicamento) ou no relatório anual do IND (um resumo da experiência de segurança). Uma das responsabilidades do FDA é monitorar e revisar esses relatórios de segurança em andamento e a segurança dos protocolos de terapia genética em geral.

Essas instituições locais garantem que os protocolos de terapia gênica e locais de ensaios clínicos tomem medidas para proteger os pacientes e profissionais de saúde de riscos desnecessários. Eles monitoram os ensaios clínicos em nível local e estão em contato próximo com os pesquisadores. Todos os relatórios de sete e quinze dias enviados ao FDA também são enviados pelos patrocinadores aos investigadores e encaminhados aos IRBs. Novamente, os dados são mantidos em sigilo em um esforço para proteger os direitos de privacidade e segurança do paciente, bem como a tecnologia e / ou dados proprietários do patrocinador.

O NIH Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) foi estabelecido em 1974 como um fórum para divulgar e debater publicamente a ética e o impacto social da pesquisa científica envolvendo organismos geneticamente modificados. Não foi estabelecido de acordo com qualquer mandato estatutário. É um órgão consultivo cujos membros, que são uma mescla de representantes da comunidade científica e leiga, recebem e avaliam as inscrições para conduzir investigações clínicas de terapia gênica. O conteúdo desses aplicativos e discussões relacionadas são abertos ao público.

As diretrizes originais do NIH foram escritas em resposta ao desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante e para tratar de incertezas científicas. No início, todos os experimentos de DNA recombinante foram submetidos a um intenso escrutínio. A BIO apoiou o papel que o RAC desempenhou durante o desenvolvimento inicial desta tecnologia. Forneceu um fórum público apropriado para a discussão de questões científicas de "vanguarda". Nas últimas duas décadas, no entanto, a indústria e a academia demonstraram que os produtos que usam a tecnologia de DNA / proteína recombinante são seguros e eficazes. Vários desses produtos tiveram impacto significativo em pacientes com condições graves e potencialmente fatais, incluindo câncer, esclerose múltipla e transplante de medula óssea. Mais de 80 medicamentos e vacinas desenvolvidos por meio da biotecnologia estão no mercado hoje e centenas de milhões de pessoas se beneficiaram deles.

Com o passar do tempo, essas diretrizes RAC foram modificadas e algumas funções desempenhadas pelo NIH foram cedidas a agências regulatórias que tinham jurisdição legal sobre os testes e produtos relevantes. O RAC continua, no entanto, a solicitar informações de entidades que realizam ensaios clínicos. O NIH não pode obrigar legalmente os patrocinadores a fornecer dados e nunca teve autoridade estatutária para aprovar, desaprovar ou modificar os ensaios clínicos. No entanto, ao longo dos anos, muitas empresas patrocinadoras cumpriram voluntariamente as diretrizes do NIH e participaram do processo de RAC.

A BIO considera o RAC como um grupo cujas principais responsabilidades são:

  1. avaliar as questões sociais e éticas da terapia genética e pesquisas relacionadas e
  2. informar pacientes passados, atuais e futuros de terapia gênica e o público em geral sobre o progresso no campo.

Os patrocinadores e a comunidade da terapia genética em geral, incluindo representantes dos pacientes e a imprensa, procuram a RAC para obter informações e recomendações nessas áreas. Em vista do envolvimento da OBA / RAC, que torna os protocolos de terapia gênica disponíveis ao público e revisa publicamente as tecnologias propostas de transferência de genes para ensaios clínicos, o desenvolvimento da terapia gênica permanece muito mais aberto ao escrutínio público do que qualquer outra forma de desenvolvimento de drogas. Isso aumenta a confiança do público nos ensaios clínicos e a disposição dos pacientes em se inscrever neles.

Um Novo Ambiente Regulatório

Apesar dessa abertura, há quem argumente que mais informações sobre eventos adversos em ensaios clínicos de terapia gênica devam ser submetidas ao RAC e tornadas públicas. A investigação da morte do paciente no ensaio clínico na UPenn levou a uma série de matérias na imprensa que sugerem que a terapia genética é perigosa e que a indústria está operando em segredo e escondendo eventos adversos. Isso, de acordo com alguns, coloca o público em risco porque os verdadeiros perigos da terapia genética não estão sendo divulgados.

Essa pressão por divulgação culminou em uma nova proposta do RAC. Por meio de uma proposta de emenda às diretrizes do NIH, o RAC "esclareceu" suas expectativas quanto ao acesso a relatórios de eventos adversos de instituições e investigadores que recebem financiamento do NIH. A proposta foi publicada no Federal Register em 22 de novembro de 1999. De acordo com a proposta, o NIH solicitaria a notificação ao RAC de eventos adversos graves - independentemente de o evento estar ou não associado ou esperado da intervenção - usando um formato específico e dentro de um período de tempo especificado. Solicitaria também que os relatórios não contivessem segredos comerciais ou informações comerciais ou financeiras confidenciais.

Após a revisão desta proposta, a BIO tem as seguintes preocupações: os padrões delineados para relatórios acelerados são inconsistentes com os padrões atualmente reconhecidos, o formato de relatório SAE é inconsistente com os padrões regulatórios atuais da FDA, o contexto de divulgação de relatórios de segurança por RAC não está definido e o exigido a divulgação conflita com os atuais estatutos federais de confidencialidade.

Propomos uma abordagem alternativa para a notificação de dados de eventos adversos pelos patrocinadores. Nossa proposta constituiria um acordo entre as principais agências federais e a indústria que fornecerá ao RAC dados de segurança e, ao mesmo tempo, garantirá que a confidencialidade do paciente e os dados de segredos comerciais sejam protegidos.

Nossa proposta foi aceita por todos os membros da BIO envolvidos na pesquisa em terapia gênica. A proposta estabelece um padrão que todas essas empresas irão atender. O conteúdo da proposta aumentará substancialmente os dados que serão transmitidos ao NIH e, portanto, ao RAC. Acreditamos que isso tranquilizará efetivamente os pacientes e o público em relação à segurança e eficácia dos ensaios clínicos de terapia genética, aumentará a capacidade dos pesquisadores de inscrever pacientes nesses ensaios e aumentará o papel do RAC no processo. Ao mesmo tempo, é consistente com as obrigações e regras de confidencialidade da FDA da indústria.

A diretriz de notificação proposta recomendaria inadequadamente a notificação imediata de eventos adversos graves não relacionados.

De acordo com o 21 CFR 312, os patrocinadores são obrigados a notificar a FDA e todos os investigadores participantes de qualquer evento adverso "sério" e "inesperado" associado com o uso da droga sendo testado no ensaio clínico dentro de 7 dias da notificação do evento se o evento foi fatal ou com risco de vida, ou 15 dias para outros eventos associados sérios e inesperados. ("associado" refere-se à possibilidade razoável de causalidade) Este processo garante que os reguladores federais tenham as informações de que precisam para fazer uma determinação oportuna sobre o andamento de um estudo e se os pacientes estão em perigo. Também garante que os investigadores participantes estejam cientes de informações importantes sobre segurança. Se os pacientes estiverem em perigo, o FDA tem autoridade para suspender um ensaio clínico ou proibir novas inscrições. Os SAEs não relacionados à intervenção são relatados ao FDA como parte do relatório anual do IND submetido pelos patrocinadores porque não há risco de segurança iminente. Essa estrutura de relatório é aplicável ao processo de desenvolvimento de todos os medicamentos e produtos biológicos.

A proposta do NIH define a notificação "imediata" como no máximo 15 dias corridos após a ocorrência do evento adverso. No entanto, os regulamentos da FDA especificam que o patrocinador deve relatar no prazo de 15 dias corridos após recebendo notificação do investigador que o evento ocorreu. Portanto, é importante reconhecer as responsabilidades distintas e separadas de um investigador financiado pelo NIH e um patrocinador regulamentado pela FDA de ensaios clínicos.

Um sistema de relatório que envolve o relatório de tudo Os SAEs de forma acelerada são inadequados e desnecessários. O público já está protegido pelo relato imediato de eventos relacionados que alertam a FDA e todos os investigadores participantes sobre quaisquer perigos para os pacientes em ensaios clínicos. Além disso, o FDA tem o mandato, a qualquer momento durante o curso de um estudo clínico, de exigir que o patrocinador forneça informações e análises completas sobre todos os eventos adversos observados. Os eventos adversos podem ocorrer durante um ensaio que nada tem a ver com a intervenção. Relato público deles, no entanto, na ausência de informações contextuais completas sobre o agente investigacional, pode resultar em percepções prematuras e potencialmente enganosas do perfil de um produto. Isso pode ser prejudicial para o desenvolvimento de novas terapias potencialmente salvadoras de vidas.

A proposta cria outro formato de relatório desnecessário e duplicado.

O formato para relatar SAEs está bem estabelecido nas regulamentações federais. 21 CFR descreve em detalhes o processo e as informações a serem usados ​​pelos patrocinadores que enviam relatórios de eventos adversos. Criar um novo formato simplesmente criaria encargos adicionais que não aumentariam a compreensão de um evento de segurança potencialmente importante.

Uma vez que o relatório solicitado pelo NIH, por definição, conteria segredos comerciais e informações comerciais confidenciais e informações privadas de pacientes, o RAC não pode divulgar legalmente seu conteúdo.

A proposta afirma que segredos comerciais e informações confidenciais devem ser removidos do relatório de evento adverso enviado ao NIH. Também requer que os identificadores do paciente sejam removidos. Agradecemos o reconhecimento do NIH de que os relatórios de eventos adversos contêm informações que não podem ser legalmente divulgadas publicamente. Também apreciamos seu reconhecimento de que a divulgação de informações do paciente violaria os direitos de privacidade do indivíduo e prejudicaria a capacidade dos patrocinadores e investigadores de recrutar pacientes para ensaios clínicos.

No entanto, os dados e informações que seriam apresentados ao abrigo da proposta são, por definição, segredos comerciais e informações comerciais confidenciais. Praticamente todos os detalhes sobre o desenho, tamanho ou status de um ensaio clínico têm valor competitivo potencial. Indeed, FDA explicitly recognizes that adverse events are confidential commercial information. Therefore, the proposal’s requirement of deletion of this information is illogical.

The same argument applies to patient data. BIO is concerned that confidential patient information will still be disclosed because other information in the report will be made public and this information could be used to identify a patient in a clinical trial.

Therefore, the proposal would require reporting of data that would provide the RAC with confidential information that cannot be disclosed. It is well settled law that three federal confidentiality statutes – the confidentiality provisions of the Freedom of Information Act, the federal Trade Secrets Act, and the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act – preclude the FDA from publicly disclosing clinical protocols, adverse events, and other confidential commercial and trade secret information in the drug development process. The first two statutes also apply to the NIH. Since the NIH cannot legally apply the same federal statutes to the identical scientific data and information in a completely inconsistent way, if the RAC were to obtain data as contemplated by the proposal, it would not be allowed to disclose them to the public.

Consequently, the proposal has the ironic effect of providing the RAC with data it cannot use to further its mission of public discussion. Thus, the RAC proposal is internally inconsistent. It requires reporting of data for use in a public forum, while acknowledging by its own terms that this data must remain confidential.

BIO Recommendations for Gene Therapy Oversight

Gene therapy is a highly promising technology that has the potential to cure disease and improve the quality of life for thousands of patients. In addition, like other new drugs or biologics under investigation, gene therapy is already strictly regulated. Sponsors of gene therapy clinical trials must comply with federal regulations governing the development of all new drug products. Hundreds of gene therapy clinical trials have been approved over the past decade and thousands of patients have safely received investigational gene therapies.

The FDA regulates clinical trials of gene therapy and has the statutory authority to permit an IND to go into effect or, if necessary, place an IND on clinical hold to ensure safety of human subjects. Under existing federal regulations, serious adverse events are reported in a timely fashion to the FDA. This regulatory oversight role is critical to the FDA’s mission and provides effective protection for the public. BIO believes that only FDA has the scientific expertise needed to review and assess adverse events and that this should remain a statutory responsibility of the FDA. To protect patient confidentiality and because the information in an adverse event report may be of a proprietary nature for the sponsor, the FDA, by law, is not allowed to publicly disclose this information.

BIO continues to support the RAC’s role to publicly discuss the social and ethical implications of new technologies, such as gene therapy. The RAC can and should continue to play a critical role in publicly debating novel scientific and ethical issues associated with certain types of clinical gene therapy research. In this way, the RAC complements the FDA’s regulatory responsibility to oversee the development of individual drug products. However, the RAC should not, and legally may not, publicly disclose confidential commercial and trade secret data and personal patient information relating to gene therapy drugs and clinical trials submitted to it.

As an alternative to the NIH proposal, BIO companies propose the following structure for the future oversight of gene therapy:

The NIH does not have the legal authority to compel adverse event reporting by sponsors of clinical trials using gene therapy. Nonetheless, sponsors agree to voluntarily provide serious, related and unexpected adverse event reports (serious adverse events or SAEs) that are currently sent on an expedited basis to the FDA to the NIH/OBA. Sponsors would also send to RAC the safety data summarized in the IND annual progress report currently provided to FDA. That report contains summaries of all adverse events, whether or not the event was related to the drug in development and an overview of all other adverse events. In this way, OBA and the RAC would have access to adverse event reports at the same time as the FDA.

Thus, within the current scope of NIH guidelines, the RAC should adopt safety reporting guidelines that harmonize with the IND reporting rules and format outlined in 21 CFR 312 and current international standards. As noted, those regulations require sponsors to notify FDA of any serious and unexpected adverse event associated with the use of the drug being tested in the clinical trial within 7 days if the event was fatal or life-threatening, or 15 days for other serious and unexpected events. This process ensures that federal officials have the information they need to make a timely determination about the progress of a trial and whether patients’ safety is in danger. In addition, it protects patients’ privacy rights and maintains the integrity of the drug development process. Harmonization with the FDA requirements would simplify the reporting requirement and would lead to increased compliance.

Coordinating the procedures of the FDA and NIH will also help ensure a discussion between the two agencies as they interpret the data. It is essential that the review and interpretation of submitted safety data be coordinated between FDA and NIH to ensure a single, agreed-upon interpretation of those data. Specifically, if after an initial review, the RAC feels there may be potential safety concerns, we recommend a joint evaluation of the data between the RAC and the FDA. The results of these joint deliberations could form the basis of public discussion at the RAC meeting. Prior to any presentation of the conclusions from this assessment, however, the sponsor should be made aware of the findings, and have the opportunity to provide additional information or comment. Sponsors should also have the opportunity to present data at the RAC meeting.

Although the NIH guidelines and FDA reporting requirements would coincide, the respective roles of the agencies would remain the same. FDA would remain the only agency with regulatory authority and the ability to approve a trial or put a trial on hold. The RAC would maintain its role as an educational advisory body.

Reporting of adverse events to NIH/RAC in addition to FDA is only acceptable to BIO in the case of gene therapy because of the established role that NIH has to oversee novel human gene therapy experiments. Our proposed reporting structure is not applicable to the development process for other drugs and biological products.

The industry’s willingness to provide adverse event data to the RAC is contingent upon an agreement between NIH and industry that would memorialize how the data will be used. OBA would be responsible for ensuring that patient privacy rights are protected and that trade secret data remains confidential. How will the agency carry out that mission? What patient data will become public? How will the RAC ensure that confidential commercial and financial information from companies will not be disclosed? How will the RAC use this data to complement the oversight role of the FDA? We call upon the OBA to develop a proposal that would answer these questions. OBA should work with FDA and industry to develop a process that will provide the RAC with adverse event data it needs to do its job effectively, but also will ensure that this information will be used appropriately. The industry stands ready to work with OBA and FDA on this matter. We look forward to this collaboration.

Once the RAC, FDA, and industry agree to a reporting structure, BIO recommends that the process have a life span of one year. At the end of that year, industry will, in consultation with RAC and FDA, evaluate the system to determine if it should continue or if it needs modification.

The initial promise of gene therapy technology has not yet been realized. Despite the recent tragedy at UPenn, data obtained in gene therapy trials thus far are encouraging, and it is BIO’s belief that gene therapy currently has a good safety profile, as determined by more than a decade of pre-clinical and human clinical data. The biotechnology and pharmaceutical industry involved in gene therapy development fully supports presenting to the public a practical and balanced assessment of the benefits and risks of the technology.

The organizations represented by BIO remain fully committed to providing the resources necessary to fully realize the promise of gene therapy for the treatment of serious medical conditions such as cancer, cardiovascular disease, and genetic and metabolic diseases. It is vital that patients with these conditions have access to novel and innovative therapies. To meet that end, gene therapy research and clinical trials must be regulated in an efficient, thorough, and expeditious manner, in accordance with clear federal statutes and guidelines.


Gene Therapy Manufacturing

Gene therapy manufacturing is a critical part of whether a gene therapy will be successfully commercialized or not. Can the product be manufactured in the quantity and of the quality needed to meet demand? Can it be manufactured at a cost that makes it accessible for patients? These are just some of the issues that need to be addressed.

It is important for stakeholders to include process development and manufacturing programs as early as possible in development to keep pace with the rapid movement of gene-based products through the clinical landscape. There is a key balance to be struck between investing too early in manufacturing technology before the product has been fully characterized and running the risk that the manufacturing process doesn’t produce the correct product. On the opposite end, investing too late means attempting to scale up a process that may not meet needs, which could become very expensive and risky.

Gene therapy companies also need to understand what regulatory pathways are available to them based on whether their product fills an unmet need or addresses a serious, life-threatening condition. As such, there are several expedited pathways that may be available for gene therapy developers. If the product is designated under an expedited timeline then this will impact manufacturing timelines and thus needs to be considered during process design, scale-up, qualification, and continuous verification.

Viral vector systems are by far the most widely used methods to delivery therapeutic gene products because of their infectious nature and ability to introduce specific genes into a cell. Most often, the therapeutic DNA is delivered using viral vector systems based on adeno associated viruses (AAV), lentiviruses (LV), and adenoviruses (Ad). Of these, AAV-based vectors are the most widely used vehicles for delivery in gene therapy indications. According to market experts, AAVs are used in nearly 50% of the 483 currently ongoing gene therapy trials. 3 However, a major hurdle for translation of promising research through clinical evaluation to market approval of these therapeutics is meeting the demand for large quantities of viral vectors that this requires. The vector production gap is one of the main challenges facing the industry today. Key elements to the development of large-scale, optimized production are harvesting and purification strategies and the analytical tools to monitor quality attributes ensuring a safe and efficacious product. For the purposes of this article we will focus on viral vector manufacturing.


Gene Therapy Adopts New Tools to Guarantee Quality

Lonza provides varied technology and service options to support the development and commercialization of cell and gene therapies. For example, the contract development and manufacturing organization offers extensive analytical expertise—ranging from early-stage development to downstream manufacturing—under a single roof.

The global gene therapy market is growing rapidly. According to Polaris Market Research, the market, valued at $1.46 billion in 2020, is estimated to reach $5.02 billion by 2028. This growth is driven by the potential that gene therapies hold to address the rising prevalence of oncological and neurological disorders, as well as of rare genetic disorders. According to the National Center for Advancing Translational Sciences, gene therapy is particularly relevant to rare disease patients, as more than 80% of rare diseases have a known monogenic cause.

Gene therapy can permanently treat genetic diseases by replacing a missing or mutated gene with a functional copy. To do so, however, gene therapy requires a suitable delivery technology. Among the most promising delivery technologies is the adeno-associated virus (AAV) vector. An example of an AAV vector–based gene therapy is Novartis’ Luxturna ® , the first gene therapy approved in the United States.

Since Luxturna ® was approved in 2017 for the treatment of an inherited form vision loss, gene therapies have come to be developed at a quicker pace. Five first-time approvals are expected this year in the European Union alone. Also, several hundred gene therapies are in development.

To help ensure the success of new gene therapies, developers and manufacturers are working to consistently deliver high-quality products. Companies are offering new services, or adapting existing ones, to improve genetic characterization and quality control. Aqui, GEN speaks to several companies about the latest trends.

Meeting regulatory requirements

As new gene therapies have entered the marketplace, regulators have “raised the bar” on the research required to gain approval, according to Jennifer S. Chadwick, PhD, vice president of biologic development at BioAnalytix. “As the first AAV vectors came through the regulatory process, a lot of questions arose,” she recalls. “The expectation to address those questions with data is what we’re seeing now.”

BioAnalytix applies analytical approaches to enhance the development of cell and gene therapies. For example, the company can assess vector proteins, as suggested by this diagram, which depicts four common gene therapies (left) the use of SDS-PAGE to visualize the differences in complexity (middle) and the use of liquid chromatography–mass spectrometry to identify and quantify therapeutic protein components, such as AAV capsid proteins, as well as process- and product-related impurities (right).

Gene therapies are expensive. Luxturna, for example, has a list price of $425,000 per eye. With regulatory demands increasing, these high costs make analytics essential. “You need to show you’re making the right product, that it persists in the body, and that efficacy is long term,” Chadwick asserts. “Otherwise, you’re unlikely to get paid.”

Although reimbursement would be smoothed by analytics, the market for them remains underdeveloped. “The trend we see as an analytical solutions provider is there’s a real gap in analytics in the gene therapy space,” observes Susan Darling, senior director of CE and biopharma at Sciex. “Gene therapies are where monoclonal antibodies were years ago. They need better, faster, and stronger analytical solutions to characterize the product into manufacturing and quality control.”

A similar point is made by Behnam Baghbaderani, PhD, global head of process development, Cell and Gene Technologies, Lonza. “Some of the technologies used in current analytical methods are in the early development phase and face GMP compliance or regulatory challenges,” he maintains. “The pace of technological development may not be in line with the pace of growth.”

New capabilities for capsids

A critical factor in the effectiveness of gene therapy is whether AAV capsids contain the intended gene of interest. Therapeutic benefits of empty or partially filled capsids can be questionable, and/or they may have detrimental impact from safety and efficacy perspectives. According to Baghbaderani, this unwanted impact may be attributed to undesirable immune responses or competition with full capsids for vector binding sites on cells.

The main methods for detecting full and empty capsids are analytical ultracentrifugation (AUC) and liquid chromatography (LC). Analytical ultracentrifugation, Chadwick points out, is the “gold standard” method in this application area. It uses a specialized ultracentrifuge with optical sensors to monitor the size and density of capsids in solution.

“Although AUC gives you a simple readout, it can be quite a complex assay to apply,” Chadwick adds. “So, we also do a lot of LC separations.” Liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS) uses an LC instrument to separate sample components, which are fed into an MS instrument that can detect the mass, structure, and quantity of capsid proteins. LC-MS is becoming more popular for gene therapy analytics, she explains, because of the high level of detail it provides to AAV developers about the viral capsids and the specific attributes of the capsid proteins. Such information can suggest how well the capsids will perform in the body.

Results obtained with AUC or LC may be confirmed by transmission electron microscopy (TEM), a technique for viewing capsids directly. It works like light microscopy but uses a beam of electrons to create an image. An elaboration of TEM is cryogenic TEM (cryo-TEM), where samples are examined at cryogenic temperatures. It is gaining popularity in structural biology because it avoids the need for crystallization of macromolecules.

High-resolution cryo-TEM has been added to the services that Charles River Laboratories offers to gene therapy developers and manufacturers. “Cryo-TEM complements our negative-staining TEM capabilities,” states Rob Stachlewitz, PhD, corporate vice president, science and strategy lead, Global Lab Sciences, Charles River.

“Cryo-TEM,” he asserts, “will allow us to provide evaluation of capsid integrity and quantitation of empty/partial/full capsids without fixative and with a higher resolution than any other provider.” He adds that the number of empty/full/partial capsids may be measured if cryo-TEM is combined with artificial intelligence–based image analysis.

Assessing viral vector integration

Real-time or quantitative polymerase chain reaction (qPCR) technology is well established as a means of measuring viral titers. However, multiple studies have shown that droplet digital PCR (ddPCR) technology can generate more reproducible and statistically significant results. ddPCR uses a water–oil emulsion to divide nucleic acids among tens of thousands of droplets, each of which acts as a tiny test tube. Droplets may be arrayed on multiwell plates.

Although BioAnalytix focuses on protein content, Chadwick highlights ddPCR as a current trend in gene therapy analytics. “That’s what people are expecting now,” she says. “It’s so much more accurate.”

Bio-Rad Laboratories provides the QX ONE Droplet Digital PCR System, which can serve as a quality control tool during cell and gene therapy production. For example, it can establish the identity and integrity of viral vector products.

According to Bio-Rad Laboratories, ddPCR uses smaller sample sizes than qPCR because the PCR amplification is carried out on each droplet. Moreover, the subdivision of the sample occurs in a single step, due to the chemistry of the surfactants. This avoids not only the pipetting errors in serial dilution, but also the need for complex microfluidics.

“Recently, we implemented patent-pending ddPCR methods to our analytical capabilities as they can provide highly reliable data … for some of the key assays used to evaluate titers and to determine the identity and integrity of viral vector products,” Baghbaderani tells GEN. He notes that Lonza is moving its qPCR-based analyses of host cell contaminants to ddPCR.

Another company deploying ddPCR is Charles River, which is bringing the technology to all its laboratory sites during 2021. The company intends to take advantage of ddPCR’s capabilities in molecular biology and states that compared with traditional PCR, ddPCR provides “increased sensitivity and lower interference.”

Innovations in sequencing

Gene therapy development may benefit from applications of next-generation sequencing (NGS). For example, NGS may be used to confirm on-target effects or detect off-target effects, or to check whether a viral sequence has been correctly integrated into a cell line. NGS capabilities are being added to many companies’ service offerings. For example, Charles River is introducing NGS capabilities to its North American sites.

Cergentis offers a proprietary genetic sequencing technology called Targeted Locus Amplification (TLA). The company claims that TLA can sequence any transgene or locus of interest and allow for the detection of integration site(s) and of sequence and structural variants in the integrated transgene as well as in the surrounding host genome.

Targeted Locus Amplification (TLA), a technology developed by Cergentis, can enable the targeted enrichment and sequencing of loci or (trans)genes of interest, as well as the detection of single nucleotide variants and structural variants. In a recent study about CRISPR-engineered CAR T cells (Nature 2017 543: 113-117), TLA was used for the whole-genome mapping of AAV6 TRAC-1928z integration.

According to Judith Bergboer, PhD, head of services at Cergentis, TLA can help with quality control in upstream manufacturing by allowing companies to check whether a viral vector has correctly integrated into a cell line. TLA can also allow companies to check the genetic makeup of the virus at an early stage in cell line development—ensuring that there are no undesirable structural variants. Moreover, she says, the technology can be used to evaluate heterogeneous cell samples for the integration patterns and integrity of the transgene.

“The hallmark of our TLA technology is that it allows you to check both the [transgene] integration site and the integrity of the integrated sequence,” she emphasizes. “What is quite elegant is that you can see everything that’s interesting about a genetic locus. And with TLA, unlike a lot of technologies, you only need to know very limited sequence information on your locus of interest. TLA is hypothesis neutral.”

Embracing integration

The PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System was developed by Sciex to characterize biotherapeutics for a range of applications. In cell and gene therapy applications, for example, the system can assess the purity of capsid proteins and analyze nucleic acids and plasmids.

“People don’t want a system that can only do one thing,” says Darling. “They want to grow, stretch, and move with changing pipelines.” A key benefit of the Sciex PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System, she asserts, is that it can do three gene therapy assays at once and also run assays for other therapeutics. “You can buy one platform to assess the transgene integrity and purity of AAV,” she continues, “and if you’re also developing bispecifics [bispecific monoclonal antibodies], you can analyze them on the same platform.”

A similar point is made by Baghbaderani. He notes that gene therapy developers are keen to streamline the move from small-scale development to commercialization: “It’s important to focus on incorporating automated, high-throughput analytical methods into the manufacturing process to allow more efficient and expedited development activities.”

He adds that gene therapy developers can benefit from working with a contract development and manufacturing organization such as Lonza. According to Baghbaderani, Lonza can offer extensive analytical expertise—ranging from early-stage development to downstream manufacturing—under a single roof.

Looking toward the future

Looking to the future, Baghbaderani sees gene therapy analytics as crucial to the development of streamlined, robust GMP-compliant manufacturing processes. Using process control analytics to ensure a consistency of product is also important, adds Chadwick.

Companies are also looking to provide a wider range of services. Sciex, for example, is repurposing its work on AAV vectors to meet a growing demand for assays designed for lentiviruses, Darling points out. The company is also looking into gene therapies that use liposomes instead of viral vectors, and it is developing techniques for RNA analysis. Cergentis is also developing a broader range of services. The company, Bergboer notes, is making its TLA analysis service available as a kit for in-house use.


Stunning gene therapy breakthroughs are a riposte to our truth-tarnished times

T here has been a surprising outbreak of the use of the c-word among medical researchers over the past few days. Normally cautious in their language, they have nevertheless been wielding the term “cure” when discussing the long-term potential of two separate treatments for inherited ailments that were announced last week. Such enthusiasm is striking.

In one case, scientists based at St Bartholomew’s, London – who have been working on the inherited bleeding disorder haemophilia A – outlined how they had used a virus to carry the gene for the blood-clotting chemical, factor VIII (which patients lack) to their livers. Production of the missing chemical was restored and their bleeding halted. The development, according to the World Federation of Hemophilia, now points “the way to a cure” for the condition, which affects around 400,000 people worldwide.

In the other case, scientists led by Professor Sarah Tabrizi, of University College London, revealed they had found a way to suppress the build-up of harmful proteins in patients suffering from the incurable degenerative condition, Huntington’s disease. Injections of the drug Ionis-HTTRx destroyed genetic messengers that directed the manufacture of these proteins. Dementia experts hailed the news as a “tremendous step forward” because it could be used not only to target proteins involved in Huntington’s but in other neural conditions, such as Alzheimer’s disease.

Please note: neither the work on haemophilia or the work on Huntington’s can yet be termed as cures, but they point to the prospect of effective treatments being developed in future. Hence the outbreak of the use of the c-word last week. It is also worth noting that both techniques are forms of gene therapy, in which a mutated gene is either replaced with a healthy copy (as with the haemophilia trials) or is inactivated or “silenced” (as with the Huntington’s work). And that development is also worthy of note.

Twenty-five years ago, as molecular biologists first honed the tools that now allow them to manipulate DNA at will, it was claimed that gene therapy could soon free humanity from the misery of countless conditions including haemophilia, Alzheimer’s and some cancers – simply by altering a person’s genetic make-up. It proved to be an overly ambitious goal, as gene therapy pioneer Professor Eric Alton, of Imperial College London, acknowledged. “Over the past couple of decades, the reputation of gene therapy has gone from being a cure for all known diseases to something that you wouldn’t give your dog.”

Part of the problem lay with the deaths of some patients during trials of different gene therapies. However, the main reason for gene therapy’s fall from grace was its simple failure to produce the goods as quickly as predicted. Fiddling with our genes proved to be a lot trickier than anticipated by some scientists.

This point is acknowledged by Professor James Gusella, the Harvard University geneticist who first pinpointed the gene that causes Huntington’s and who was always cautious about the likely rate of developing gene therapy. “You have to appreciate that the symptoms of the disease, like any other illness, are the end result of a long series of processes that take place inside the body,” he said.

And it takes time to understand that pathway. It begins with the cause of a particular disease – an infection or the inheritance of a gene – and then leads through a series of knock-on effects that eventually produce symptoms. Researchers then have to pinpoint which stage is the one most susceptible to intervention. It has taken 25 years to get to this position with Huntington’s disease.

Alton agreed progress has been slow. For decades, his team has been developing gene therapy treatments for cystic fibrosis – an inherited lung and digestion disorder that affects 10,000 people in Britain – and only now is it emerging as a potential treatment. “However, the crucial point is that we getting there.”

And that point needs stressing. Others may have dismissed the prospects of gene therapy, after its initial hyping, but its advocates still ploughed on, bouncing back after each setback, until success was eventually achieved. Apart from last week’s developments, gene therapy has also helped treat immune conditions and some forms of blindness. In each case, it has taken a great deal of hard graft to reach these goals.

This is the way that science progresses, of course – not along an unswerving trajectory towards the truth but by staggering through disappointments, reversals and reappraisals. “Progress is usually a very slow, drawn-out business that features many setbacks and occasional small advances,” says Professor Robert Lechler, of King’s College London. Eureka moments of triumphant discovery are certainly the exception.

The fact that science is rarely presented this way has much to do with the natural enthusiasm of scientists for their particular projects and with the tendency of journalists like myself to push them into guessing when their work might be ready for clinical use. Five years is the usual answer I get, no matter what the trials involve.

In the case of gene therapy, the answer should have been about 25 years – though I would have had difficulty selling such a remote prospect as a story to my newsdesk, while the poor scientists would have found it hard to acknowledge how long they still had to toil to achieve their goal. Hence those over-optimistic claims.

That last issue should be kept in mind when considering other medical developments that are being worked on, added Lechler. “Both stem cell science and gene editing have been highlighted as having enormous potential to treat illnesses – and of course they do. However, it may take longer than we expect – certainly if the example of gene therapy tells us anything. We shouldn’t disparage these technologies if they don’t reach fruition straightaway, however.”

Scientists are human and are sometimes prone to exaggeration and a bit of self-deception for good measure. But they do seek the truth. Even in relatively sane periods, that urge should be cherished. In today’s truth-tarnished times – assailed as we are by the egregious advocates of unreason who promote climate change denial, vaccine repudiation and other deceptions – we have never needed an example of dedicated, effective science so desperately. Researchers – working in the face of setbacks for decades – have now come close to finding treatments for some truly terrible conditions and have rightly been hailed for their work.

Their achievements should also be borne in mind the next time someone challenges a scientific truth just because it is inconvenient. That truth, no doubt gained at some personal cost, is something to be treasured, not denied.


Minipig Study Tests Gene Therapy for Huntington's Disease

Huntington's disease is a progressive neurodegenerative disorder that results from a mutation in the huntingtin gene, HTT. Currently, there is no cure for the disease.

As we learn more about the underlying pathophysiology of Huntington's disease, researchers continue to focus on the development of treatments that target the specific cause, rather than simply alleviating the disease symptoms. Gene therapy is one example of such therapeutic, and research in this area continues to grow, both in academia and industry.

A new body of work published in Ciência, Medicina Translacional outlines the preclinical testing of a microRNA-based gene therapy for Huntington's disease – AMT-130 – in minipigs.

In simplistic terms, the therapy aims to prevent the production of the toxic mutant version of the HTT protein that causes Huntington's disease. The research data from minipigs showed that intracerebral delivery of the therapy into the striatum resulted in widespread distribution and reduced mutant HTT protein for up to 12 months post injection.

Technology Networks spoke with Astrid Vallès , a ssociate director in translational biology at uniQure, and Melvin Evers, senior director of preclinical biology at uniQure to learn more about the preclinical study, the gene therapy landscape and the next steps in the development of AMT-130.

Q: Why are current treatment options for Huntington's disease limited, and why is a gene therapy approach favorable?

UMA:
Huntington’s disease is an autosomal dominant neurodegenerative disorder, caused by mutations (increased polyglutamine tract) in the huntingtin – HTT – gene. Current treatment options are indeed limited and only symptomatic, but fortunately, many promising therapies are in development as there is increased knowledge of the disease mechanisms. One of the most promising approach is to lower the expression of (mutant) HTT. With gene therapy, we can specifically and effectively reduce the expression of the disease-causative gene. Next to being very long lasting (a single administration of gene therapy can be effective for years), the big advantage of gene therapy is that it has the potential to be disease modifying.

Q: What are some of the key considerations when developing and testing a gene therapy for a neurodegenerative disorder?

UMA:
Key considerations are biodistribution, safety, efficacy and biomarkers. Para biodistribution, it is important to establish the brain regions where the gene therapy needs to be effective. In the case of Huntington’s disease, the first affected areas are caudate and putamen (deep brain regions), while other brain areas (like cortical regions) are affected later in the disease. For this reason, targeting both deep brain regions and cortical regions is considered key for disease modification.

Para safety, it important that the approach has no detrimental effects. Many preclinical studies are done to assess the potential toxicology of the gene therapy product, before going into humans.

The gene therapy must have demonstrated efficacy for it to be successful. We evaluate this first in preclinical disease models, by showing that there is the desired biological response and disease modification in these models. In humans, the use of biomarkers (measured in blood, cerebrospinal fluid (CSF) or through MR-imaging methods) is key to help us predict clinical efficacy in the patients, especially for neurodegenerative disorders with slow disease progression.

Q: Can you talk about how the gene therapy works to treat Huntington's disease?

UMA:
Our gene therapy for Huntington’s disease is named AMT-130. It consists of a capsid, an inactivated virus called adeno-associated virus, or AAV. Inside the AAV a piece of DNA is encapsulated. After direct administration into the brain tissue, the AAV is taken up by brain cells and transported to the cell nucleus. In the nucleus, the AAV opens up and the piece of DNA is released and stays in the nucleus. This piece of DNA encodes a therapeutic transgene called a microRNA. This microRNA has been engineered to specifically target the HTT messenger RNA.

The microRNA technology used is called miQURE and the specific microRNA is called miHTT. Upon binding of miHTT to HTT messenger RNA, the huntingtin messenger RNA is broken down, thus preventing the production of the toxic mutant HTT protein that causes Huntington’s disease.

Q: Why was the study conducted in minipigs as opposed to other in vivo models, such as mice?

UMA:
We have conducted several preclinical studies to test the biodistribution, safety and efficacy of our therapy. Other na Vivo models (mice and rats) were used in previous studies, tailored to show mechanism of action of the drug (that is, does the drug work as predicted), and proof-of-concept (i.e., does the drug modify the disease-like phenotype in this model?).

When it comes to biodistribution (does the drug reach the right brain area?), it is very important to test this in a larger brain. This is because, very often, approaches that work in small animals do not work in larger species. If in this case the approach is effective in a larger brain, it gives much more confidence that it may work in humans.

Q: The study found "strong, sustained, and brain-widespread vector distribution, human HTT protein lowering, and associated biomarker changes". Can you talk about some of the key findings on the success of the therapy in more detail?

UMA:
The minipig model we used for the study is very valuable, because it expresses a fragment of mutant HTT as transgene. This allowed us to (i) test our gene therapy in a large brain, (ii) evaluate how efficient it is across the many brain regions and (iii) establish how long-lasting the effects of a single administration of our gene therapy was.

We observed a very efficacious reduction of mutant HTT in all brain regions that are relevant for the disease for up to one year after administering the therapy. We also evaluated the potential of candidate biomarkers to follow-up efficacy of the therapy. This is important, as in humans, it will not be possible to directly measure the effects in the brain, and efficacy biomarkers (surrogate measures of efficacy) are needed. Among others, we measured miHTT (the active molecule of our gene therapy) and mutant HTT in CSF.

Our conclusion is that, to follow-up efficacy of AMT-130, miHTT in CSF has greater potential value than mutant HTT in CSF (as the latter underestimates the effects seen in deep regions of the brain, which are the regions AMT-130 predominantly targets and are most relevant for the disease). This will be valuable information to aid interpretation of the biomarkers measured in our clinical trial.

Q: The study involves a surgical protocol for gene therapy delivery. How will this be adapted for clinical translation?

UMA:
We have committed substantial effort to mirroring the clinical procedure in the large animals. While setting up the procedure, we have learned and adapted a lot of the knowledge from deep brain stimulation surgeries.

As in the clinical setting, the Huntington’s disease minipigs were placed in the magnetic resonance imaging (MRI) to visualize the brain and plan the surgical catheter implementation. After this planning phase, the catheters were placed, fixed in a surgical suite. Subsequently, the subjects were again placed in the MRI and the catheter connected to a pump to infuse AMT-130. This infusion is done under MRI guidance – thus the filling of the brain structures (the striatum) is tracked live. After administration, the catheters are removed, and subjects returned for a quick recover.

Q: For our readers that may be unfamiliar, what are some of the drawbacks associated with gene therapy, and how have you considered this in the development of this therapeutic?

UMA:
The main advantage of gene therapy using AAVs is its durable effect after a one-time treatment. This durability is also the major drawback.

Once administered there is no option to modulate the expression of the therapeutic transgene. Also, due to the antibodies that will be generated against the AAV capsid, re-administration is not feasible yet. Thus, you have one shot to give the patient the most optimal dose for life. Therefore, extensive preclinical efficacy and safety studies have been performed, also in large animals, to get better understanding on the long-term efficacy and safety of the AMT-130 gene therapy to come up with a clinical dose that is considered to be both safe and efficacious.

Q: The development and manufacturing of gene therapies can carry increased costs compared to traditional therapies. How will you ensure that, if made clinically available, this therapy is accessible?

UMA:
There are no current treatments for Huntington’s disease and the need for a therapy should one be approved by regulators will have profound impact on patients and their families. uniQure has formed important relationships and collaborations with patient advocacy and academic groups who are committed to finding a treatment option for this devastating disease. We would build on these relationships to partner our efforts to create accessibility to meet demand, and this also could include collaboration with other health care providers in the biotech and pharmaceutical industries. We are early in the clinical development of AMT-130 and look forward to pursuing patient access strategies as we move forward over the next few years.

Q: What are your next steps?

UMA:
We are continuing with our Phase I/II clinical trial of AMT-130, which is a randomized, sham controlled, double-blinded study to explore the safety, tolerability, and proof of concept of AMT-130 in patients with early manifest Huntington’s disease. The study, which includes two dose cohorts, will randomize a total of 26 patients to either treatment with AMT-130 or an imitation surgical procedure.

The first dose cohort includes 10 patients, of which six patients received treatment with AMT-130 and four patients received imitation surgery. The second dose cohort is planned to include 16 patients, of which 10 patients will receive treatment with AMT-130 and six patients will receive imitation surgery. The trial consists of a blinded 12-month study period followed by unblinded long-term follow up for five years after administration of AMT-130.

Patients receive a single administration of AMT-130 through MRI-guided, convection-enhanced stereotactic neurosurgical delivery directly into the striatum (caudate and putamen). The planned Phase Ib/II study of AMT-130 will be conducted in Europe and is expected to begin enrolling patients in the second half of 2021. This open-label study will enrol 15 patients with early manifest Huntington’s disease across two dose cohorts.

Together with the U.S. study, the European study is intended to establish safety, proof of concept, and the optimal dose of AMT-130 to take forward into Phase III development or into a confirmatory study should an accelerated registration pathway be feasible.

Melvin M. Evers and Astrid Vallès were speaking to Molly Campbell, Science Writer for Technology Networks.


Assista o vídeo: Terapia gênica: suas perguntas respondidas (Agosto 2022).