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Resoluções espaciais em microscopia óptica

Resoluções espaciais em microscopia óptica



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Eu li que diferentes técnicas de imagem óptica, como microscopia de campo amplo, microscopia confocal ou microscopia STED, podem teoricamente atingir uma resolução espacial diferente.

No entanto, só consegui encontrar informações sobre a resolução espacial da microscopia STED (5,8 nm) na Wikipedia.

Alguém conhece alguma referência ou leitura recomendada (de preferência gratuita) onde eu possa aprender mais sobre os diferentes métodos de microscopia óptica e como lidar com o limite de difração?


A resolução teórica para um microscópio óptico depende do comprimento de onda usado, mas está perto de 0,22 um (220 nm). A microscopia confocal não melhora muito a resolução axial; melhora drasticamente a resolução no plano (direções xey, excluindo luz estranha). Não há muito o que fazer para "lidar" com isso usando essas técnicas. Se precisar de mais resolução, você pode usar as técnicas de super-resolução que mencionou ou o bom e velho TEM.

Há mais algumas informações no site da Nikon: http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasresolution.html

e no site da Olympus: http://www.olympusconfocal.com/theory/resolutionintro.html


Você também pode dar uma olhada no Laboratório de Ciências da Leica Microsystems. Você encontrará muitos artigos e tutoriais sobre os diferentes métodos de microscopia, desde o conhecimento básico da microscopia até o know-how específico, incluindo as informações mais recentes sobre STED: www.leica-microsystems.com/science-lab

Por exemplo: Microscopia gCW-STED: Quando a hora de chegada de um fóton é importante http://www.leica-microsystems.com/science-lab/gcw-sted-microscopy-when-the-arrival-time-of-a- fóton-importa /

From Molecules to Tissues - Optical Tools for Cancer Research http://www.leica-microsystems.com/science-lab/from-molecules-to-tissues-optical-tools-for-cancer-research/

(Divulgação: estive envolvido no lançamento do Leica Science Lab)


Alguns artigos de revisão que você pode ler.

1) Leung BO, Chou KC. Revisão da microscopia de fluorescência de super-resolução para biologia. Appl Spectrosc. Setembro de 2011; 65 (9): 967-80.

2) Huang B, Bates M, Zhuang X. Microscopia de fluorescência de super-resolução. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 993-1016.


Freqüência Espacial e Resolução de Imagem

Um método frequentemente utilizado na definição da resolução limite de um microscópio óptico é observar a imagem conoscópica de grades de linhas periódicas em função da frequência espacial e da abertura numérica. As imagens conoscópicas da abertura da íris do condensador, que representam um padrão de difração induzido pelo espaçamento periódico na amostra, são orientadas em ângulos retos ao longo eixo das linhas que formam a grade periódica. Se a grade tiver espaçamentos muito grandes entre as linhas adjacentes, várias imagens da íris do condensador aparecem dentro da abertura da lente objetiva quando o plano focal traseiro é visto com um telescópio de focagem ou lente Bertrand. Nos casos em que a íris não está fechada em seu menor tamanho, essas imagens podem se sobrepor. Este artigo explora a relação entre a distância que separa essas imagens de abertura da íris e o espaçamento periódico (frequência espacial) das linhas na grade.

O desenho esquemático do microscópio (no lado esquerdo do tutorial) descreve as ondas de luz difratadas de ordem zero e de ordem superior que são focadas no plano focal traseiro objetivo. Tanto o condensador quanto a objetiva são representados por um único elemento de lente, e a abertura do diafragma de íris do condensador é mostrada na parte inferior da figura. O espécime (uma grade de linha) é representado como uma linha tracejada através da qual os raios de luz iluminantes passam da íris do condensador. A orientação dos raios difratados é governada pela equação:

S / f ≈ λ / D = sin (φ) (1)

onde f é o comprimento focal objetivo, λ é o comprimento de onda da luz no plano da amostra e φ é o ângulo entre o eixo da lente e a onda difratada. O período da imagem conoscópica entre as ordens de difração focadas, (S), é proporcional à abertura numérica dos raios de luz que entram na lente objetiva:

S / f ≈ n (sin (φ)) (2)

onde n é o índice de refração do meio de imagem. Ernst Abbe demonstrou que, para que a imagem da grade de difração seja resolvida, pelo menos duas ordens de difração (geralmente o zero e a primeira) devem ser capturadas pela lente objetiva e focadas no plano focal posterior. À medida que a abertura numérica aumenta, raios adicionais de ordem superior são incluídos no padrão de difração e a integridade da amostra (grade de linha) torna-se mais clara. Quando apenas o zero e as primeiras ordens são capturados, o espécime é mal resolvido, tendo apenas uma distribuição de intensidade sinusoidal dentro da imagem.

Autores Contribuintes

Christopher E. Steenerson e Michael W. Davidson - Laboratório Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Flórida, 32310.


Definindo super resolução

O limite de resolução da microscopia de luz convencional é

250 nm no x e y direção e & gt450-700 nm no z direção. Este limite, também chamado de função de propagação de ponto (PSF), é o tamanho fixo da propagação de um único ponto de luz que é difratado através de um microscópio e também é uma medida da fonte de ponto de tamanho mínimo ou objeto que pode ser resolvido por um microscópio. Objetos menores que o PSF parecem ter o mesmo tamanho que o PSF no microscópio, e objetos que estão mais próximos do que a largura do PSF não podem ser distinguidos como separados. Uma medida comumente usada da largura do PSF é o critério de Rayleigh (R): R = 0,61λ / NA, onde NA é a abertura numérica. Qualquer técnica de microscopia que ultrapasse o limite de resolução da microscopia de luz convencional em pelo menos um fator de dois é considerada uma técnica de super-resolução.

As técnicas de super-resolução quebram o limite de difração ao modular temporal ou espacialmente a excitação ou luz de ativação. Por exemplo, a microscopia de iluminação estruturada (SIM) ilumina todo o campo com um padrão de luz listrado (Gustafsson, 2000). Quando esse padrão de excitação se mistura com o padrão espacial da amostra, ele produz um padrão de interferência (chamado de franja moiré) que é muito mais grosso do que qualquer um dos padrões sozinho e é detectável pelo microscópio. O padrão de excitação é transladado e girado para gerar uma série de imagens com diferentes franjas moiré. Como o padrão de iluminação é conhecido, ele pode ser removido matematicamente do moiré para obter acesso às informações de alta resolução normalmente insolúveis na amostra. SIM aumenta a resolução para

100 nm no x-y direção e

400 nm axialmente (Schermelleh et al., 2008). O SIM é limitado a essa melhoria de fator de dois porque a periodicidade do padrão de iluminação é criada pela ótica limitada por difração e é, portanto, limitada pelo PSF da microscopia convencional (Gustafsson, 2000).

Outras técnicas de imagem de super-resolução modulam a luz de excitação para explorar a capacidade de saturar a emissão de fluoróforos, a fim de quebrar a barreira de difração em uma quantidade maior. A saturação pode ser alcançada usando iluminação intensa para produzir uma transição fotofísica do fluoróforo para um estado escuro transitório que pode levar a um estado permanentemente escuro (branqueamento) ou a emissão de luz em uma escala de tempo de microssegundo ou milissegundo, que é muito mais lenta do que a escala de tempo de nanossegundos de fluorescência. Alternativamente, as técnicas de super-resolução podem usar luz para induzir reações fotoquímicas em fluoróforos fotoativáveis ​​ou fotoativáveis ​​e fazer a transição entre os estados ligado e desligado ou alterar sua cor. Desde que essas transições possam ser limitadas a um subconjunto de fluoróforos que são separados espacialmente pela distância do microscópio PSF, as moléculas podem ser localizadas com uma precisão de aproximadamente 5 nm. As técnicas de super-resolução podem ser separadas em duas categorias, dependendo se esses efeitos são explorados no nível de conjunto ou no nível de uma única molécula.


Nova microscopia sob ambiente atinge resolução espacial inferior a 10 nm na medição do potencial de superfície

Crédito: ACS

Uma nova abordagem de microscopia de nanomateriais chamada Pulsed Force Kelvin Probe Force Microscopy (PF-KPFM), permite medições de menos de 10 nanômetros de função de trabalho e potencial de superfície em uma varredura AFM de passagem única. Os resultados foram publicados em dois artigos relacionados em ACS Nano e Angewandte Chemie International Edition.

À medida que a tecnologia diminui, a necessidade de caracterizar as propriedades de materiais muito pequenos - medidos em nanômetros (1 nanômetro = 1 bilionésimo de um metro) - torna-se cada vez mais importante. Os nanomateriais que medem de 1 a 20 nanômetros são promissores para uso em dispositivos eletrônicos de última geração, células solares, tecnologia a laser e produtos químicos e biossensores, para citar alguns. Em escala, a largura de um cabelo humano é de 75.000 nanômetros.

Para entender o potencial de superfície dos nanomateriais, a ferramenta de nanociência mais comumente usada é a Kelvin Probe Force Microscopy (KPFM), que é uma técnica baseada em microscopia de força atômica (AFM) que mede a função de trabalho e o potencial de superfície. Infelizmente, o KPFM tem suas limitações devido ao uso de tensão CA para carregar a ponta de prova AFM.

"Cada técnica KPFM opera no mesmo paradigma de medição: a voltagem AC é usada para carregar completamente uma sonda AFM, produzindo assim uma força eletrostática detectável para aquisição de imagem", explica Xiaoji Xu, professor assistente no Departamento de Química da Universidade de Lehigh. "Sobrecarregar a sonda com cargas força um limite na resolução espacial, uma vez que as cargas não se limitam ao ápice da sonda AFM. Em vez disso, as cargas em excesso ocupam todo o cantilever e contribuem para o sinal."

Agora, Xu e seu aluno de graduação Devon S. Jakob introduziram um paradigma de medição totalmente novo com base no alinhamento nos níveis de Fermi. Enquanto os métodos KPFM tradicionais produzem imagens com uma resolução espacial de 30 a 100 nanômetros, o novo método do Grupo de Pesquisa Xu, chamado Pulsed Force Kelvin Probe Force Microscopy (PF-KPFM), permite medições de menos de 10 nanômetros de função de trabalho e potencial de superfície em uma varredura AFM de passagem única. Suas descobertas foram publicadas em um artigo em ACS Nano: "Microscopia de força de sonda Kelvin de força pulsada."

"Na microscopia de força de sonda Kelvin de força pulsada, removemos a necessidade da tensão CA implementando um circuito personalizado de um transistor de efeito de campo entre a ponta e a amostra que atua como uma chave binária", diz Xu. "Quando a chave está ligada, o circuito atua como um fio simples, permitindo que as cargas passem entre a ponta e a amostra. Uma pequena quantidade de cargas migra espontaneamente entre a ponta e a amostra com base na diferença relativa em seus níveis intrínsecos de Fermi. Quando a chave está desligado, o circuito não permite a passagem de cargas e atua como um capacitor para reabsorver as cargas da ponta e da região da amostra. "

O PF-KPFM também opera exclusivamente no modo de força pulsada, de acordo com Xu. Usando o modo de força pulsada, diz ele, as medições PF-KPFM podem ser obtidas com precisão em distâncias ponta-amostra muito pequenas, onde a força elétrica é grande, permitindo que pequenas heterogeneidades de amostra sejam reveladas.

"O próximo passo lógico foi combinar PF-KPFM com microscopia de Peak Force Infrared (PFIR), uma técnica de imagem infravermelha inventada em nosso laboratório, já que ambas as técnicas usam o modo de força pulsada", diz Xu. "A técnica resultante, denominada PFIR-KPFM, fornece informações topográficas, mecânicas, químicas e elétricas em

Devon S. Jakob et al. Microscopia de força de sonda Kelvin de força pulsada, ACS Nano (2020). DOI: 10.1021 / acsnano.0c00767


Imagem de super-resolução de campo distante via modulação de freqüência espacial

O limite de difração impede substancialmente a resolução do microscópio óptico convencional. Sob a iluminação tradicional, a luz de alta frequência espacial correspondente às informações de sub-comprimento de onda dos objetos está localizada no campo próximo na forma de ondas evanescentes e, portanto, não detectável por objetivas de campo distante convencionais. Avanços recentes em nanomateriais e metamateriais fornecem novas abordagens para quebrar essa limitação, utilizando ondas evanescentes de vetor de ondas grandes. Aqui, uma revisão abrangente deste campo emergente e de rápido crescimento é apresentada. As técnicas de imagem de superresolução atuais baseadas na modulação de frequência espacial assistida por ondas evanescentes, incluindo hiperlentes, lentes de microesferas e microscopia de deslocamento de frequência espacial iluminada por campo evanescente, são ilustradas. Eles são promissores na investigação de detalhes e processos não observados em campos como medicina, biologia e pesquisa de materiais. Alguns desafios atuais e possibilidades futuras desses métodos de superresolução também são discutidos.


Qual é a resolução espacial do TERS?

Na imagem de campo distante convencional, onde todos os pontos no espaço são constantemente iluminados durante a imagem, é convencional definir a melhor resolução lateral teórica pelo Critério de Rayleigh, ou aquela distância entre dois pontos dispersores onde o disco central de Airy de um se sobrepõe ao primeiro anel escuro do segundo, levando a uma queda significativa de intensidade (pelo menos 26%) entre os dois: r = (0,61 x comprimento de onda) / (abertura numérica) - digamos dois terços de um mícron. A resolução em z (foco) é muito pior, sendo da ordem de dezenas de mícrons.

Microscopia confocal é uma técnica de campo distante projetada para melhorar a resolução iluminando um volume limitado por difração isolado e coletando a luz espalhada do mesmo volume: a resolução aqui é convencionalmente definida como a dimensão largura total-meia-altura da resposta de espalhamento medida: agora r = (0,41 x comprimento de onda) / (abertura numérica) talvez um pouco melhor do que um terço de mícron para resolução lateral e apenas cerca de três vezes pior em z (foco). As técnicas de campo próximo visam reduzir ainda mais o volume iluminado.

Microscopia óptica de varredura de campo próximo (NSOM ou SNOM, dependendo se você seguir o exemplo da IBM ou do Bell Lab) emprega uma pequena abertura, na ponta, na metalização de uma fibra óptica desenhada que permite que a luz vaze por uma distância muito curta (um campo evanescente), iluminando assim um volume do diâmetro da abertura e apenas alguns nanômetros de profundidade. A luz dispersa deste volume é então coletada no campo distante.

É claro que esse processo pode ser revertido com a coleta pela abertura, do mesmo volume que é iluminado no campo distante. É até possível iluminar e coletar através da fibra, embora cada passagem atenua o feixe em alguns milhões de vezes, então isso só pode ser útil para espalhamento muito forte.

O feedback de altura para rastrear a topografia da superfície e manter uma separação ponta / superfície fixa, tem sido tradicionalmente por feedback de força de cisalhamento, onde a ponta é oscilada lateralmente enquanto fixada a um dente de um diapasão na ressonância e fixando a mudança de fase para manter a interação constante com a superfície, isso é lento um tanto insensível e leva ao desgaste da abertura (alargamento) por colisão com qualquer topografia significativa da superfície. Ultimamente, outros esquemas foram concebidos usando uma abertura semelhante no ápice de uma ponta AFM oca para realizar este tipo de NSOM, permitindo um feedback um pouco mais robusto.

Como as aberturas menores que iluminam um volume menor transmitem menos fótons, essa técnica é limitada, na prática, a resoluções de 100 nm (ou com mais dificuldade), talvez metade disso. Também existem artefatos significativos associados com, por exemplo: rendimento variável da abertura quando mantida perto de uma superfície ou pela variação na altura de feedback devido à largura (diâmetro da abertura + duas vezes a espessura de metalização) interagindo com a rugosidade da superfície e variação de polarização através do abertura. Deve-se notar que escanear essas aberturas sobre uma borda (mesmo na ausência de topografia) gera um artefato com o tamanho de metade da largura da abertura, que às vezes é confundido com resolução.

Scattering-SNOM (sSNOM), do qual o TERS é um exemplo, usa uma ponta física para definir o volume da espectroscopia passivamente, por sua presença física, ou ativamente, por seus efeitos fotônicos. Por exemplo, uma ponta física escaneada dentro de nanômetros da superfície de um cristal TIRF, onde um feixe de excitação totalmente refletido internamente fornece um campo evanescente raso irá gerar luz propagando para o campo distante do volume imediatamente ao redor da ponta física que, portanto, define a resolução.

TERS e técnicas de TEOS associadas empregam um revestimento de metal cuja atividade fotônica faz com que ele atue como uma antena que medeia a transferência de energia do feixe de excitação do campo distante para o campo próximo. Os chamados “pontos quentes” na ponta são campos não propagantes de dipolo elétrico extremamente alto, que iluminam efetivamente um volume com apenas alguns nanômetros de diâmetro. Embora ainda seja necessário desconvolver a resposta de campo distante limitada por difração da resposta de campo próximo em escala nanométrica, isso é possível e, no caso de dispersores fortes, não é estritamente necessário, uma vez que o aumento da ponta pode ser da ordem de 10 7 ou mais.

Atualmente, há muita discussão entre os profissionais sobre as definições de resolução para as técnicas de TEOS e ainda há trabalho teórico a ser feito para compreender completamente quais dos mecanismos de contraste vistos são úteis.

Fig. 7: imagem TERS de 100 nm × 100 nm (75 × 75 pixels) de um nanotubo de carbono mostrando uma resolução espacial óptica de até 8 nm, tempo total de aquisição do mapa & lt 9 minutos.

Neste exemplo apresentado na Fig. 7, a imagem TERS (área de varredura de 100 × 100 nm, com um tamanho de etapa de pixel de 1,3 nm, tempo de aquisição total & lt 9 min, tempo de integração de 100 ms por pixel), mostrou imagem química em nanoescala de um único nanotubo de carbono com resolução espacial de 8 nm, confirmado a partir da análise de seção da intensidade da TERS.

Como uma primeira aproximação, esta resolução depende do raio de curvatura da própria ponta do TERS, aqueles "8 nanômetros" resultam da convolução do raio da ponta. Assim, a resolução TERS alcançável pode ser aproximada e considerada igual à metade do raio de curvatura da ponta.


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ZEISS LSM 900 com Airyscan 2
Para observar processos dinâmicos em células vivas, o ZEISS LSM 900 com Airyscan 2 oferece a mais alta sensibilidade e taxas de quadros para imagens suaves e é adaptado precisamente para suas aplicações de células vivas. O LSM 900 com Airyscan 2 oferece uma gama de soluções de imagem, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e FRAP, bem como aquisição paralela e unmixing linear em amostras com múltiplos fluoróforos sobrepostos. O LSM 900 com Airyscan 2 ocupa um espaço genuinamente pequeno e reduz a complexidade, economizando valioso espaço de laboratório e minimizando o tempo de treinamento. Com o software de imagem ZEN, a configuração e o uso são simples, permitindo resultados reproduzíveis no menor tempo possível para aumentar sua produtividade. Você pode analisar eventos de branqueamento em uma série temporal usando o Módulo de Análise de Eficiência FRAP para ZEN.

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O ZEISS Elyra 7 com Lattice SIM é a plataforma flexível para microscopia 3D SR rápida e suave que leva o SIM a um novo nível. Quer você trabalhe com células vivas, organoides ou tecido, o Elyra 7 com Lattice SIM oferece uma variedade de técnicas de SMLM, incluindo PALM. O padrão de pontos Lattice SIM tem uma eficiência de amostragem duas vezes mais alta que o SIM clássico, uma velocidade de imagem de até 255 fps e uma dose de laser mais baixa garantindo fototoxicidade reduzida. Esta imagem rápida, suave e com baixo consumo de luz garante que você possa revelar detalhes mecanísticos e dinâmicos em células vivas pela primeira vez. Aplicações como o tráfego de vesículas e a reorganização do citoesqueleto e da membrana são exemplos em biologia celular em que nunca é possível ter resolução temporal e espacial suficiente para descobrir novos caminhos e mecanismos. O modo Apotome do Elyra 7 oferece rápido corte ótico com alta resolução lateral e axial para contraste nítido, menos fora de foco e sinal de fundo. Com uma riqueza de técnicas de contraste e SR, combinadas com corte óptico, o Elyra 7 é feito sob medida precisamente para suas aplicações de imagem de células vivas. De imagens de nível molecular, como dinâmica de adesão focal de células cancerosas, à captura de células inteiras em uma única imagem, o Elyra 7 é uma plataforma de SR excelente com a flexibilidade para corresponder perfeitamente às suas aplicações.

ZEISS Sigma
A família de SEM (FE-SEM) de emissão de campo ZEISS Sigma compreende o Sigma 300 e o Sigma 500. A nova geração de detectores de elétrons secundários na família Sigma produz imagens com 50% a mais de sinal e 85% a mais de contraste com o novo C2D (Cascade Current Detector) e detectores VPSE (Variable Pressure SE) no modo de pressão variável. Com um fluxo de trabalho de 4 etapas semiautomático e de alta velocidade, você pode criar imagens em várias regiões de interesse, beneficiando-se do rápido tempo de obtenção de imagens, além de economizar tempo no treinamento, especialmente em um ambiente multiusuário. O C2D é capaz de fornecer imagens ultraestruturais nítidas de amostras biológicas crio-fixadas, e biomateriais não condutores (como dentes e osso) podem ser estudados sem revestimento usando o modo VP avançado ou abordagens de baixa tensão.

ZEISS GeminiSEM
A família ZEISS Gemini FE-SEM inclui o GeminiSEM 300, GeminiSEM 450 e GeminiSEM 500. O GeminiSEM 500 oferece mais sinal e mais detalhes, com danos mínimos à amostra. Qualidade de imagem perfeita e resolução de 1,0 nm são obtidas em baixas tensões sem a necessidade de desaceleração do feixe. Aplicar a desaceleração do feixe com a opção de desaceleração Tandem resolve para 0,8 nm a 1 kV. Os recursos de imagem do GeminiSEM 500, combinados com o detector de microscópio eletrônico de transmissão de varredura anular (aSTEM), fornecem detalhes ultraestruturais em espécimes biológicos, como bicamadas lipídicas de células cerebrais.
Seu instrumento especialista em velocidade e sensibilidade de superfície em imagens e análises é o GeminiSEM 450. O design óptico garante que não haja realinhamentos demorados enquanto você trabalha. Com o GeminiSEM 450, você pode alternar perfeitamente entre os modos analíticos em altas correntes de feixe e imagens de alta resolução em baixas correntes. Usando a alta corrente do feixe, você pode capturar grandes áreas de ultraestrutura celular de alta resolução.
Para flexibilidade de imagem, o GeminiSEM 300 oferece alta resolução e alto contraste, mesmo em campos de visão extremamente grandes. Mesmo com amostras não condutoras, o novo modo de alta resolução da pistola atinge excelente resolução e imagens sem distorção. Quando combinado com o modo de pressão variável, o revestimento por pulverização catódica não é necessário para analisar a topologia de amostras biológicas.

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Com base na nova ótica Gemini e nas capacidades de baixa tensão da coluna FIB Ion-escultor, ZEISS Crossbeam 350 e Crossbeam 550 fornecem informações de amostra verdadeiras a partir de imagens de alta resolução, danos mínimos de amostra e amostras ultrafinas. Para suas caracterizações mais exigentes, Crossbeam 550 apresenta uma grande câmara opcional com 22 portas configuráveis. Os recursos de imagem da família Crossbeam podem ser aplicados à tomografia FIB de amostras biológicas. Isso permite que você investigue diferentes compartimentos celulares em células individuais ou compreenda a morfologia 3D de organismos modelo completos com a mais alta resolução e confiabilidade.

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Nem todos os produtos estão disponíveis em todos os países. O uso de produtos para fins de diagnóstico médico, terapêutico ou de tratamento pode ser limitado por regulamentações locais. Entre em contato com seu provedor ZEISS local para obter mais informações.


Imagem intravital de vasoatividade na árvore de vasculatura arterial uterina durante a gravidez

Resumo do capítulo

A microscopia intravital incorpora uma grande variedade de técnicas de microscopia e as modifica e adapta para facilitar a visualização de processos biológicos em animais vivos anestesiados. Envolve a exteriorização do tecido, mas o tecido permanece intacto e preso ao animal anestesiado e, assim, permite que o comportamento do tecido e as respostas sejam observados em tempo real sob condições semelhantes às in vivo. A microvasculatura foi estudada dessa maneira por muitos anos em muitos tecidos diferentes. Aqui, adaptamos essas técnicas para observar a microvasculatura endometrial e sua reatividade em camundongos prenhes. Este modelo nos permite visualizar as artérias uterina, radial, arqueada, basal e espiral como uma rede conectada e observar sua reatividade em seu ambiente nativo. Este modelo permitirá a exploração da fisiologia do controle do fluxo sanguíneo para o concepto em desenvolvimento e pode ser usado com a maioria das cepas de camundongos geneticamente modificados amplamente disponíveis.


Seccionamento óptico e microscopia confocal

01: 00: 11.00 Então, eu sou Kurt Thorn, diretor da Nikon
01: 00: 14.00 Imaging Center na UC San Francisco
01: 00: 16.17 e vou falar sobre
01: 00: 17.20 corte óptico e microscopia confocal
01: 00: 19,28 e como podemos usar isso para fazer
01: 00: 20.28 Imagens tridimensionais de amostras biológicas.
01: 00: 24.18 Então, nosso objetivo é
01: 00: 25.00 construir imagens tridimensionais de
01: 00: 26.00 amostras biológicas usando um microscópio.
01: 00: 28.00 E o exemplo que estou mostrando aqui é um
01: 00: 31.00 pulmão embrionário de camundongo, é cerca de 200
01: 00: 34.00 microns de espessura e como você pode ver aqui em
01: 00: 37.00 esta animação, capturamos um
01: 00: 38.00 imagem tridimensional aqui, onde nós
01: 00: 40.00 pode ver a estrutura completa deste
01: 00: 42.00 este pulmão de rato em 3D e girá-lo
01: 00: 45.00 ao redor e olhe dentro dele e veja o que
01: 00: 47.00 acontecendo. E vou falar agora sobre
01: 00: 49.00 como fazemos isso.
01: 00: 51.20 Então, a fim de construir um
01: 00: 52.00 imagem tridimensional, primeiro pegamos uma
01: 00: 55.00 grupo de imagens em fatias separadas
01: 00: 57.00 através da amostra, em diferentes alturas
01: 00: 58,00 na amostra.
01: 01: 00.01 E então, à esquerda aqui está um painel
01: 01: 01.20 mostrando 12 imagens tiradas em
01: 01: 05.00 alturas diferentes através de uma célula de fermento.
01: 01: 06.00 E, temos este conjunto de bidimensionais
01: 01: 10.00 imagens e o que podemos fazer agora é mover
01: 01: 11.00 através das diferentes imagens,
01: 01: 13.08 empilhando-os em uma pilha tridimensional.
01: 01: 15.00 O que chamamos de pilha z.
01: 01: 17.13 E então, estou pegando aqui
01: 01: 18.12 a imagem inferior, depois a próxima
01: 01: 19.00 imagem, colocando isso em cima, a imagem
01: 01: 21.00 depois disso, colocar isso no topo, e assim por diante
01: 01: 23.00 até termos um completo
01: 01: 24.00 pilha tridimensional dessas imagens.
01: 01: 25.00 Agora podemos fazer isso em um computador e
01: 01: 28.00 fazer o computador calcular o que isso
01: 01: 30.00 estrutura pareceria se vista de
01: 01: 31.00 ângulos diferentes. E é assim que conseguimos
01: 01: 33.00 esse tipo de filme e estou exibindo
01: 01: 34.00 aqui embaixo uma rotação em torno do eixo de
01: 01: 38.00 essas duas células de levedura aqui, para que você
01: 01: 40.00 pode agora, a partir do conjunto de imagens 2D,
01: 01: 42.00 aprecie sua estrutura tridimensional
01: 01: 44,00 e layout.
01: 01: 48.01 Então, como fazemos isso? Nós precisamos
01: 01: 49.00 um microscópio onde podemos tirar imagens em
01: 01: 52.00 alturas diferentes. Então, nós temos nosso
01: 01: 53.00 amostra aqui, ilustrada por este pequeno cubo.
01: 01: 57.24 Tiramos uma foto até
01: 01: 59.00 obter uma fatia da amostra, que
01: 02: 00.00 se parece com este retângulo.
01: 02: 02.14 Em seguida, mudamos o foco.
01: 02: 04.09 Nós movemos fisicamente a amostra para cima ou para baixo.
01: 02: 07.03 Neste caso, movemos o
01: 02: 08.00 amostra para baixo da objetiva para
01: 02: 09.00 pegue uma segunda fatia por meio de um
01: 02: 12.00 parte do nosso cubinho aqui, então nós
01: 02: 13.00 obter um retângulo menor.
01: 02: 15.15 E podemos continuar fazendo isso,
01: 02: 16.00 obtendo fatias através de diferentes partes
01: 02: 19.00 deste objeto e então obtemos, conforme eu
01: 02: 21.00 mostrada antes, uma pilha dessas imagens
01: 02: 22.00 onde podemos agora no computador
01: 02: 25.00 monte estes em um tridimensional
01: 02: 27.00 estrutura. E agora podemos
01: 02: 29.00 olhe através disso em diferentes ângulos para
01: 02: 31.00 gerar um tridimensional
01: 02: 32.00 reconstrução de como isso ficaria se
01: 02: 34.00 visto de diferentes ângulos.
01: 02: 38.04 Aqui está outro exemplo
01: 02: 39.01 Este é um verme, C. elegans,
01: 02: 41.00 expressando dois sensoriais diferentes
01: 02: 43.00 neurônios rotulados em verde e vermelho e eu estou
01: 02: 45.00 mostrando aqui 85 fatias Z se movendo
01: 02: 48.00 toda a espessura da cabeça deste verme.
01: 02: 49.00 E você pode ver, há muitos
01: 02: 51.00 informações lá, mas é difícil
01: 02: 52.00 interpretar qual a conectividade destes
01: 02: 56.00 neurônios é, qual o tipo de
01: 02: 58.00 estrutura é, apenas a partir das fatias Z sozinho.
01: 03: 02.12 Então, quando os rendermos em 3D agora,
01: 03: 05.00 vamos calcular essas visualizações olhando
01: 03: 07.00 através de diferentes orientações do
01: 03: 09.00 amostra. Então, temos uma série de rotação, é
01: 03: 11.00 agora muito mais fácil apreciar o que o
01: 03: 12.00 geometria desses neurônios é e qual
01: 03: 14.00 a estrutura se parece.
01: 03: 16.08 Então, espero que motive o porquê
01: 03: 17.27 queremos ser capazes de fazer este tipo
01: 03: 19.14 de reconstrução tridimensional.
01: 03: 22.28 Então, o desafio de fazer esse tipo de trabalho
01: 03: 26.18 é que microscópios convencionais,
01: 03: 28.15 um microscópio de campo amplo convencional,
01: 03: 30.18 vê as informações em foco que são
01: 03: 32.23 as informações que estão em foco no
01: 03: 34.08 Fatia Z que estamos olhando, bem como luz
01: 03: 37.14 que vem de cima e de baixo lá
01: 03: 39.04 de outras regiões na amostra que
01: 03: 40.11 não estão em foco. E então, você pode ver em
01: 03: 41.00 esta imagem convencional aqui. Isto é um
01: 03: 44.00 imagem apenas de um pedaço de tecido de camundongo.
01: 03: 46.00 Você pode ver que há muito embaçado,
01: 03: 49.00 luz difusa fora de foco aqui em
01: 03: 51.00 além dessas, você sabe, bordas afiadas.
01: 03: 52.00 Eles estão sobrepostos com isso
01: 03: 54.00 luz borrada fora de foco e isso
01: 03: 56.00 reduz nossa capacidade de ver o que está acontecendo.
01: 03: 59.00 Se usarmos algo chamado confocal
01: 04: 01.00 microscópio, que bloqueia aquele
01: 04: 03.00 luz fora de foco, você vê que esta
01: 04: 05.00 a imagem agora fica muito mais nítida e muito
01: 04: 07.00 mais nítido porque estamos vendo apenas o
01: 04: 08.00 informações em foco. Não estamos vendo o
01: 04: 10.00 luz que saiu de foco.
01: 04: 13.00 E então, é sobre isso que vou falar
01: 04: 14.00 para a maior parte do resto desta palestra é como um
01: 04: 17.00 desses microscópios confocais funciona,
01: 04: 18.22 como ele rejeita essa luz fora de foco,
01: 04: 20.14 e como nos permite obter essas
01: 04: 22.00 fatias nítidas em foco, que podemos então
01: 04: 24.00 use para fazer reconstruções tridimensionais
01: 04: 26,00 de objetos.
01: 04: 28.07 Então, se considerarmos como um
01: 04: 29.00 microscópio convencional funciona quando
01: 04: 31.00 iluminando um único ponto em nosso
01: 04: 32.00 amostra, temos essa excitação azul
01: 04: 34.00 luz entrando aqui, é levado a um
01: 04: 36.00 foco em um ponto em nossa amostra de ciano, e
01: 04: 38.00 esse ponto emite luz. Essa luz é
01: 04: 41.00 coletado pela lente objetiva e foco
01: 04: 43.00 para um ponto correspondente em nossa câmera
01: 04: 45,00 pela lente do tubo.
01: 04: 46.26 Então, vemos esta mancha verde em nossa amostra
01: 04: 49.11 em foco.
01: 04: 50.29 No entanto,
01: 04: 51.00 também há luz vindo de outro
01: 04: 53,00 regiões na amostra, como estas
01: 04: 55.00 pontos fora de foco e acima de nossa amostra.
01: 04: 57.00 E essa luz será coletada pelo
01: 05: 00.00 objetiva e a lente do tubo. Mas isso
01: 05: 01.00 não se concentra na câmera,
01: 05: 03.00 chega a um foco em algum lugar por trás disso.
01: 05: 05.00 E então, isso dará origem a um disco de
01: 05: 06.00 luz difusa fora de foco sobrepondo nosso
01: 05: 09.00 imagem em foco.
01: 05: 10.16 Então, vemos tanto o
01: 05: 12.00 luz fora de foco deste ponto aqui,
01: 05: 13.00, bem como a luz em foco do
01: 05: 15.00 local que queremos criar uma imagem.
01: 05: 18.04 Então esse, o problema aqui
01: 05: 19.07 é que a fluorescência é emitida junto
01: 05: 21.03 todo o cone iluminado deste spot
01: 05: 23.01 em nosso microscópio
01: 05: 23.29 não apenas no foco.
01: 05: 27.09 Então, o truque em um microscópio confocal
01: 05: 29.17 é bloquear fisicamente aquela luz fora de foco.
01: 05: 31.22 E a maneira como fazemos isso é substituindo
01: 05: 33.09 nossa câmera aqui com um furo de alfinete.
01: 05: 35.07 E aquele orifício é colocado de tal forma que
01: 05: 38.11 exatamente vai passar a luz que está em foco,
01: 05: 41.08 aquela luz virá para um foco naquele ponto,
01: 05: 42.25 atravesse o orifício e alcance
01: 05: 43.18 o detector.
01: 05: 44.24 Então, se agora eu desenhar o
01: 05: 45.19 emitiu luz daquele ponto em foco,
01: 05: 47.17 você vê que vem aqui e risca
01: 05: 48.27 focar exatamente onde o orifício está
01: 05: 50.24 colocado, o que significa que vai conseguir
01: 05: 52.17 por aquele orifício, alcance o detector,
01: 05: 54.24 e ser registrado pelo nosso microscópio.
01: 05: 56.26 Se considerarmos agora o correspondente
01: 05: 58.00 luz fora de foco, tornará este grande
01: 06: 02.00 disco fuzzy no pinhole, que vai
01: 06: 04.00 bloqueia a maior parte dessa luz e
01: 06: 05.00 evitar que chegue ao detector.
01: 06: 07.00 Então agora, nós arranjamos nosso
01: 06: 10.00 microscópios de modo que só vemos o
01: 06: 11.00 informações em foco.
01: 06: 12.22 As informações fora de foco nunca
01: 06: 14.04 chega ao detector.
01: 06: 15.21 Então, isso nos dá uma maneira de apenas
01: 06: 16.26 gravando a luz em foco.
01: 06: 19.16 O problema agora é
01: 06: 20.24 estamos apenas imaginando um único ponto.
01: 06: 22.27 E para conseguir uma imagem você precisa de mais
01: 06: 24.09 do que um único ponto.
01: 06: 25.25 E a maneira como resolvemos esse problema
01: 06: 27.00 é gravando muitos
01: 06: 30.00 pontos diferentes em nossa amostra,
01: 06: 31.18 dispostos em toda a extensão.
01: 06: 32.17 E então, a ideia é se você tiver
01: 06: 33.00 sua amostra aqui, você constrói uma grade de
01: 06: 36,01 pontos que você deseja registrar,
01: 06: 37.29 e então você marcha para o ponto de laser,
01: 06: 40.00 o ponto focal
01: 06: 40.22 através da amostra ponto a ponto.
01: 06: 43.06 E então use isso para registrar a intensidade
01: 06: 45,07 em cada ponto da amostra
01: 06: 46.10 e reconstruir essa imagem
01: 06: 47.28 como uma grade 2D de pontos.
01: 06: 53.08 Então, para fazer isso, precisamos de uma maneira de focar nosso
01: 06: 56.00 luz para um único ponto para que possamos
01: 06: 57.00 detectar o foco correspondente
01: 07: 00.00 informações provenientes desse local.
01: 07: 02.14 E para fazer isso
01: 07: 03.19 usamos um laser porque dá
01: 07: 05.00 iluminação altamente colimada e também
01: 07: 07.00 alta potência para que possamos muito rapidamente
01: 07: 09.00 registrar esta fluorescência do ponto.
01: 07: 11.00 Já que precisamos registrar muitos pontos
01: 07: 13.00 para construir uma imagem, não queremos
01: 07: 14.00 passa muito tempo olhando para cada um ou
01: 07: 16.00 vai demorar uma eternidade para conseguir uma imagem.
01: 07: 17.29 Então, a ideia é trazermos esta
01: 07: 19.00 feixe colimado e como você pode ver aqui
01: 07: 21.00 um feixe colimado nos dá uma
01: 07: 23.00 único ponto focal na amostra e nós
01: 07: 25.00 pode registrar essa informação.
01: 07: 27.05 Como movemos aquele local, certo?
01: 07: 28.18 Não nos faz nenhum bem
01: 07: 29.27 para apenas imaginar um único ponto em nossa amostra.
01: 07: 31.14 Queremos ter essa grade de pontos.
01: 07: 33.14 E então, para fazer isso, podemos mudar o ângulo
01: 07: 36.02 de iluminação ao entrar na objetiva.
01: 07: 39.05 E então, veja aqui, se viermos
01: 07: 40.20 com a luz que está chegando
01: 07: 42.04 perpendicular ao plano do
01: 07: 44.06 objetivo aqui, trata-se de um foco
01: 07: 46.03 exatamente no centro do campo de visão.
01: 07: 48.10 Se agora inclinarmos essa viga para que seja
01: 07: 49.22 vindo em ângulo, movemos o foco
01: 07: 52.07 fora do eixo e agora podemos registrar
01: 07: 54.23 do lado esquerdo deste objeto.
01: 07: 56.21 Se, em vez disso, mudarmos o ângulo para o outro
01: 07: 58.00 orientação, agora registramos um ponto de
01: 08: 01.00 lado direito da amostra.
01: 08: 02.25 Então, mudando o ângulo de iluminação
01: 08: 05.18 ao entrar no objetivo,
01: 08: 07.01 podemos mover o ponto de iluminação
01: 08: 08.13 em toda a amostra.
01: 08: 12.08 Você deve estar se perguntando agora
01: 08: 13.24 como ainda detectamos o
01: 08: 15.22 ou como ainda bloqueamos a luz fora de foco?
01: 08: 17.05 Porque agora nosso lugar não será mais
01: 08: 19.25 ser necessariamente coincidente com um furo de alfinete.
01: 08: 22.00 Certo, antes de desenharmos o orifício
01: 08: 23.14 exatamente no centro deste eixo óptico
01: 08: 26.11 do nosso microscópio.
01: 08: 27.17 E agora, enquanto movemos o ponto focal para fora do eixo,
01: 08: 29.27 como podemos ter certeza de que essa luz
01: 08: 31.17 ainda chega ao orifício e vai
01: 08: 33.01 através dele, e não é bloqueado por
01: 08: 34.10 o orifício.
01: 08: 35.15 Então, aqui está o caminho óptico do
01: 08: 36.24 microscópio confocal que permite
01: 08: 38.04 para fazermos a varredura.
01: 08: 40.07 E o cerne disso é
01: 08: 41.05 este conjunto de espelhos de varredura aqui,
01: 08: 43.00 que nos permite girar o ângulo em
01: 08: 44.23 em que o feixe de laser entra no
01: 08: 46.03 objetivo, e assim mover o local
01: 08: 48.18 em todo o campo de visão,
01: 08: 49,27 em nossa amostra.
01: 08: 52.04 Então, se você seguir isso aqui, nós
01: 08: 53.01 temos um laser que entra em nosso microscópio.
01: 08: 56.10 É escaneado por esses espelhos de varredura
01: 08: 57.29 aqui, que muda seu ângulo para que uma vez
01: 09: 00.08 é focado pelo objetivo, o local
01: 09: 02.01 ilumina em nossas mudanças de amostra.
01: 09: 05.08 Agora, se você imaginar o que está acontecendo com
01: 09: 06.21 a luz que é emitida por aquele ponto,
01: 09: 08.15 vai sair, ser recolhido por
01: 09: 10.06 o objetivo, e vai sair
01: 09: 11.19 no mesmo ângulo em que entrou.
01: 09: 13.10 Porque a objetiva mapeia ângulos em
01: 09: 15.08 posição.
01: 09: 16.08 E então, a luz que vem
01: 09: 17.29 daquele ponto emitido, daquele ponto excitado,
01: 09: 20.22 está saindo do mesmo ângulo que
01: 09: 22.15 o feixe de laser entrou.
01: 09: 23.26 E se não movermos esses espelhos
01: 09: 27.12 que a luz emitida será refletida
01: 09: 28.25 por esses espelhos ao longo exatamente da mesma
01: 09: 30.17 caminho que o laser percorreu.
01: 09: 32.14 E isso significa que a luz
01: 09: 34.28 aqui está sempre vindo na mesma
01: 09: 36.08 direção independente de qual ponto
01: 09: 37.22 veio porque os espelhos de varredura
01: 09: 39.01 desfazemos exatamente a mudança de ângulo que nós
01: 09: 41.01 aplicam-se à luz de iluminação.
01: 09: 43.06 Eles desfazem exatamente aquela mudança de ângulo
01: 09: 44.22 na luz emitida.
01: 09: 46.11 Então, tudo o que precisamos é de um espelho dicróico,
01: 09: 48.00 este espelho de 45 graus aqui,
01: 09: 50.05 que separa a luz emitida
01: 09: 51,15 do laser. E agora podemos passar
01: 09: 53.12 através do nosso orifício de novo e
01: 09: 55.12 alcançará o detector independentemente de
01: 09: 58.07 de onde veio na amostra.
01: 10: 00.09 Então, usando o mesmo par
01: 10: 01.28 de escanear nervos duas vezes,
01: 10: 02.24 uma vez para fazer a varredura da luz iluminada,
01: 10: 04.09 e uma segunda vez para cancelar a varredura do
01: 10: 05.25 luz emitida, podemos manter nosso orifício
01: 10: 09.02 corrigido porque a luz emitida
01: 10: 11.02 sempre voltam pelo mesmo caminho
01: 10: 12.14 independentemente de onde veio no
01: 10: 13,17 amostra.
01: 10: 14,19 Então isso torna esta construção
01: 10: 15.21 muito simples.
01: 10: 16.09 Temos apenas um único orifício fixo,
01: 10: 17.20 colocamos um detector atrás dele
01: 10: 19.03 e agora podemos ver a luz emitida
01: 10: 20.26, independentemente de onde veio no
01: 10: 22.11 amostra.
01: 10: 26.09 Então, o detector necessário para um
01: 10: 29.04 microscópio confocal é um pouco
01: 10: 31.07 diferente de um detector para um
01: 10: 32.17 microscópio comum,
01: 10: 33.10 onde podemos usar apenas uma câmera.
01: 10: 35.05 Em primeiro lugar, não precisamos de um
01: 10: 36.07 câmera porque estamos apenas imaginando um
01: 10: 37.20 um único ponto de cada vez,
01: 10: 38.20 estamos apenas imaginando a quantidade total de luz
01: 10: 40.10 que chega aos orifícios.
01: 10: 41.10 Não precisamos de nenhuma habilidade para detectar
01: 10: 42.18 de onde veio.
01: 10: 44.18 Mas queremos ser muito rápidos.
01: 10: 46.02 Porque, novamente, temos que
01: 10: 46,28 escaneie o ponto sobre a amostra, e assim se
01: 10: 48.09 leva-nos, você sabe, um segundo para coletar
01: 10: 50.15 uma imagem que vai levar horas para
01: 10: 51.29 construir uma imagem.
01: 10: 53.10 Então, em vez disso, usamos um
Detector 01: 10: 54.08, um tubo fotomultiplicador
01: 10: 57.07 principalmente porque é muito rápido.
01: 10: 58.22 E assim, um tubo fotomultiplicador pode responder
01: 11: 00.11 em nanossegundos para a luz incidir sobre ele.
01: 11: 05.00 E então, isso nos permite coletar um único
01: 11: 06,27 pixel em nossa imagem confocal em apenas um
01: 11: 08.17 alguns microssegundos.
01: 11: 10.17 Não quero falar muito
01: 11: 11.11 sobre tubos fotomultiplicadores
01: 11: 12.20 e como funcionam,
01: 11: 14.23 mas descreverei brevemente o funcionamento deles.
01: 11: 16.28 E então, a ideia é que temos
01: 11: 18.11 um feixe de luz que entra no
01: 11: 20.00 tubo fotomultiplicador e atinge um
01: 11: 24.00 objeto denominado fotocátodo,
01: 11: 25.00 que o converte em elétrons.
01: 11: 26.24 E esses elétrons são então excitados por um
01: 11: 30.29 alta tensão em um eletrodo aqui,
01: 11: 33.16 e eles estão se movendo rápido o suficiente
01: 11: 35.05 que quando eles atingem aquele eletrodo
01: 11: 36.03 eles expulsam elétrons adicionais.
01: 11: 39.14 E colocando uma série dessas
01: 11: 41.02 eletrodos em nosso pedido aqui,
01: 11: 43.24 podemos multiplicar o sinal por um
01: 11: 46,22 quantidade muito grande.
01: 11: 47.28 A maioria dos tubos fotomultiplicadores
01: 11: 48.29 tem multiplicações no pedido
01: 11: 50,12 de um milhão ou dez milhões.
01: 11: 53.10 Para que um único fóton que entre no
01: 11: 55.00 tubo fotomultiplicador dará origem a
01: 11: 57.00 digamos 10 milhões de elétrons no ânodo
01: 12: 00.00 aqui no final desta multiplicação
01: 12: 01.00 cadeia, que será muito fácil de detectar.
01: 12: 06.00 Então, isso significa que são sensíveis
01: 12: 08.00 a níveis de luz muito baixos e eles estão
01: 12: 10.00 muito rápido então, você sabe, em alguns
01: 12: 12.00 microssegundos, podemos gravar um monte de
01: 12: 13,00 fótons de um único pixel em nosso
01: 12: 15,00 amostra e, em seguida, use-a para registrar o
01: 12: 18.00 intensidade lá, e depois vá para o
01: 12: 20.00 próximo pixel e repita este processo.
01: 12: 22.09 Então, juntando tudo isso, aqui está novamente
01: 12: 24.17 nossa imagem não confocal à direita,
01: 12: 27.02 nossa imagem confocal à esquerda,
01: 12: 28.24 e agora você pode ver como isso funciona.
01: 12: 30.17 Tiramos a luz fora de foco
01: 12: 34.00 que está na versão não confocal aqui,
01: 12: 35.00 e o eliminou completamente digitalizando o
01: 12: 37.00 ponto na amostra e em todos esses pixels,
01: 12: 39.16 e apenas registrando a luz
01: 12: 40.26 que está em foco e passa por nosso
01: 12: 42,00 pinhole.
01: 12: 45.17 E de novo, juntando tudo isso
01: 12: 47,00 em um contexto 3D.
01: 12: 48.02 Se tirarmos muitas dessas imagens
01: 12: 49.03 em diferentes alturas e então
01: 12: 52.06 reconstruí-los no computador,
01: 12: 53.10 podemos obter imagens muito bonitas como esta
01: 12: 56.00 visualização de alta ampliação do mouse
01: 12: 58.00 pulmão que mostrei antes, onde podemos
01: 13: 00.00 agora veja as células individuais.
01: 13: 00.16 E então, se você olhar para isso,
01: 13: 02.06 você pode ver os contornos de
01: 13: 04.00 essas células individuais, aqui o preto
01: 13: 05.00 áreas no centro são o citoplasma.
01: 13: 08.00 Nós rotulamos apenas as membranas celulares aqui.
01: 13: 11.16 E então, esta é a verdadeira força de
01: 13: 13.00 a imagem confocal está obtendo
01: 13: 15.00 imagens 3D de alta resolução de espessura
01: 13: 18.00 amostras biológicas
01: 13: 20.16 Então, em que não é tão bom.
01: 13: 22.19 Então, há algumas desvantagens de
01: 13: 24.00 para um microscópio confocal como eu
01: 13: 26.00 descreveu aqui, que é chamado de
01: 13: 27.00 microscópio confocal de varredura a laser
01: 13: 29.00 porque usamos uma varredura a laser em
01: 13: 31.00 a amostra para construir a imagem.
01: 13: 32.20 O primeiro é, como já mencionei,
01: 13: 34.00 estamos construindo esta imagem
01: 13: 35,26 ponto a ponto.
01: 13: 37.03 E embora tenhamos estes PMTs rápidos
01: 13: 39,07 se você tiver,
01: 13: 39.13 se você gastar um microssegundo em cada pixel e
01: 13: 42.00 você deseja gravar uma imagem de 1 megapixel,
01: 13: 44.00 ainda é um segundo para gravar uma imagem.
01: 13: 46.24 Então, isso significa que é um lento
01: 13: 49.00 microscópio em geral. se você quiser
01: 13: 50.02 seguir as coisas que estão acontecendo muito
01: 13: 51.08 rapidamente, esta não é uma ótima maneira de fazer isso.
01: 13: 54.00 Em segundo lugar, tende a não ser incrivelmente
01: 13: 58.00 luz eficiente, nós não,
01: 13: 58.29 perdemos muita luz neste processo.
01: 14: 00.25 E em parte isso porque
01: 14: 02.03 o tubo fotomultiplicador é
01: 14: 04.11 não é um detector fantástico de luz
01: 14: 06.09 sensibilidade.
01: 14: 07.25 É muito, tem um ganho muito alto, é muito
01: 14: 10.00 rápido, mas perde muitos fótons
01: 14: 12.00 que acertou.
01: 14: 12.22 Então, ele só registra algo como
01: 14: 13,29 25% dos fótons que chegam lá.
01: 14: 17.04 E se você colocar essas duas coisas
01: 14: 18.00 juntos, isso significa que se você está tentando
01: 14: 20.00 vá muito rápido e você não tem realmente
01: 14: 22.00 detector de alta eficiência, significa que você está
01: 14: 23.00 geralmente não registrando muitos
01: 14: 24,00 fótons de cada pixel.
01: 14: 25.12 Então, para sinais escuros isso não funciona muito bem.
01: 14: 29.17 E assim, as duas grandes desvantagens de um laser
01: 14: 31.00 microscópio confocal de varredura é que
01: 14: 33.00 é lento e não é muito bom para
01: 14: 35.00 luz muito baixa, amostras muito fracas.
01: 14: 38.00 Felizmente, há uma solução para obter
01: 14: 41.00 em torno disso, que é em vez de usar um
01: 14: 43.00 orifício único e um PMT usamos muitos
01: 14: 45.00 furos em uma câmera.
01: 14: 46.15 E isso nos permite abordar
01: 14: 47.00 ambos os problemas.
01: 14: 49.26 Existem várias geometrias
01: 14: 51.10 você pode usar para fazer isso.
01: 14: 52.23 Número de empresas fizeram
01: 14: 54.00 microscópios diferentes que usam múltiplos
01: 14: 57.00 furos e câmeras para registrar imagens.
01: 14: 59.00 Mas o mais comum, e aquele
01: 15: 00.13 que alcançou provavelmente o maior uso,
01: 15: 02.28 é chamado de confocal de disco giratório.
01: 15: 05.00 E então, é isso que descreverei aqui.
01: 15: 07.16 Então, um confocal de disco giratório faz é
01: 15: 09.16 em vez de usar um
01: 15: 11.00 orifício único para iluminar a amostra,
01: 15: 12.00 colocamos um disco que é perfurado com muitos
01: 15: 15.00 furos nele, e eles estão dispostos em
01: 15: 17.00 um padrão que se girarmos este disco
01: 15: 19.00 em torno de seu eixo, esses furos vão
01: 15: 21.00 varrer todos os pontos em nosso
01: 15: 23,00 amostra uma vez e apenas uma vez.
01: 15: 24.22 Assim, para cada rotação do disco
01: 15: 27.00 iluminar todos os pontos em nossa amostra
01: 15: 29.00 uma vez e apenas uma vez.
01: 15: 29.25 E então, você pode ver
01: 15: 31.00 aqui temos esses orifícios
01: 15: 31.25 eles são colocados exatamente no mesmo foco
01: 15: 34.02 plano como o confocal de varredura a laser
01: 15: 36,00 microscópio.
01: 15: 37.08 Mas você pode ver agora ao invés
01: 15: 39.00 de iluminar um único ponto em nosso
01: 15: 40.00 espécime, iluminamos muitos pontos
01: 15: 41.13 em nosso espécime.
01: 15: 42.26 E então porque estamos fazendo isso e
01: 15: 44.23 o disco gira muito rápido, de modo que vai
01: 15: 47.00 iluminar todos os pontos em nossa amostra,
01: 15: 48.14 digamos em um micro ou em um milissegundo,
01: 15: 52.15 podemos então apenas registrar a luz emitida
01: 15: 55.25 em uma câmera porque agora estamos construindo
01: 15: 58.00 uma imagem ao varrer esses orifícios
01: 16: 00.00 em toda a amostra, em vez de mover um
01: 16: 02.00 ponto único pixel a pixel.
01: 16: 05.29 E caso contrário, os objetos são basicamente
01: 16: 08.04 exatamente o mesmo.
01: 16: 09.15 Os furos, usamos o mesmo
01: 16: 12.00 furo de alfinete para excitação e emissão.
01: 16: 14.02 O disco gira rápido, mas está lento
01: 16: 16.00 em comparação com a velocidade da luz para que
01: 16: 18.00 a luz emitida volta para o
01: 16: 20.00 mesmo furo de alfinete que o excitou.
01: 16: 22.07 E então a única outra coisa
01: 16: 23.03 que precisamos adicionar é,
01: 16: 24.00 há um refinamento técnico aqui,
01: 16: 26.00 que é colocar microlentes,
01: 16: 27.22 um conjunto correspondente de micro lentes,
01: 16: 30.21 na frente desses furos,
01: 16: 31.15 para que possamos focar nosso
01: 16: 33.00 feixes de laser firmemente através dos furos
01: 16: 36.00 no disco giratório aqui para obter
01: 16: 38.00 alta eficiência de luz entregue ao
01: 16: 40.17 amostra, para que possamos obter o máximo de nossa luz
01: 16: 42,00 atingindo a amostra.
01: 16: 44.07 Então, isso resolve nosso problema lento
01: 16: 45.00 porque agora estamos aprendendo
01: 16: 47.00 de muitos furos. Podemos coletar uma imagem
01: 16: 49,00 em milissegundos de toda a amostra.
01: 16: 51.04 E também elimina muitos dos nossos pobres
01: 16: 56.00 problemas de eficiência de luz porque podemos
01: 16: 57.00 agora usam um CCD de eficiência muito alta,
01: 16: 59.20 como um CCD de multiplicação de elétrons,
01: 17: 01.15 ou um CCD back-thinned,
01: 17: 03.20 para registrar a luz emitida.
01: 17: 06.11 E então, agora gravamos quase todos
01: 17: 07.22 fóton que sai de nossa amostra.
01: 17: 10.18 É assim que os furos se parecem.
01: 17: 12.17 Então, esta é apenas uma imagem que tirei
01: 17: 13.26 do nosso disco giratório, onde
01: 17: 16.00 paramos a rotação do disco.
01: 17: 16.18 Então, o disco está estacionado
01: 17: 18.03 e apenas brilhe a luz através dele.
01: 17: 19.29 E então, você pode ver lá, aqui está o
01: 17: 22.00 grade pinhole desse pedacinho do disco.
01: 17: 23.00 E gira de tal forma que estes
01: 17: 26.00 furos de alfinetes irão varrer todos os
01: 17: 28,00 ponto na amostra uma vez e apenas uma vez.
01: 17: 31.00 Aqui está um exemplo de filme adquirido
01: 17: 33.00 com um confocal de disco giratório.
01: 17: 33.22 Então, este é um filme de lapso de tempo
01: 17: 35.19 de uma célula S2 de Drosophila em divisão.
01: 17: 40.13 Isso leva cerca de 15 minutos
01: 17: 43.16 comprimido para você sabe
01: 17: 44.14 alguns segundos aqui.
01: 17: 45.27 Então, porque eles são rápidos e
01: 17: 48.00 alta eficiência de luz,
01: 17: 48.24 discos giratórios são muito bons para samples ao vivo.
01: 17: 51.12 Aqui está uma reconstrução tridimensional
01: 17: 53.09 de uma célula de levedura expressando um
01: 17: 55.27 RFP direcionado mitocondrialmente.
01: 17: 57.11 Estes são realmente os mesmos
01: 17: 59.00 células de levedura que mostrei bem no
01: 18: 00.00 início desta palestra.
01: 18: 01.07 Então, faz um bom trabalho fazendo
01: 18: 02.01 Reconstruções 3D também.
01: 18: 05.26 Então, qual é a sua desvantagem?
01: 18: 08.25 Então, imagine aqui
01: 18: 10.00 iluminando um único desses
01: 18: 12.00 furos no disco giratório.
01: 18: 13.08 Na realidade, estão todos sendo iluminados
01: 18: 15.02 Mas consideremos apenas um.
01: 18: 16.20 Então, você pode ver aqui no centro,
01: 18: 18.03 Eu marquei este furo de agulha aqui
01: 18: 19.20 com um pequeno ponto verde.
01: 18: 20.19 Esse é o cara que é empolgante
01: 18: 22.17 Então agora, se a amostra
01: 18: 25.00 está em foco, vamos criar um pequeno spot
01: 18: 26,00 de verde em nossa amostra. Vai emitir e
01: 18: 29.00 vamos coletar aquela luz em foco de volta
01: 18: 31.00 por esse mesmo orifício.
01: 18: 31.23 Agora o que acontece se começarmos a nos mover
01: 18: 32.28 aquela amostra fora de foco?
01: 18: 35.14 O que vai acontecer é que o disco
01: 18: 37.01 de luz fora de foco vai começar a crescer.
01: 18: 39.04 Conforme sai de foco e a amostra
01: 18: 41.27 fica cada vez mais fora de foco,
01: 18: 42.29 aquele disco está fora de foco,
01: 18: 44.05 a luz fica cada vez maior.
01: 18: 46.02 E, eventualmente,
01: 18: 46.23 será grande o suficiente para
01: 18: 48.15 se sobrepõem a orifícios adjacentes no disco.
01: 18: 50.29 E quando isso acontece, paramos de bloquear
01: 18: 52.25 aquela luz totalmente fora de foco
01: 18: 54.06 porque agora estamos pegando
01: 18: 55.05 esses orifícios vizinhos.
01: 18: 57.03 E então, esta é a principal limitação
01: 18: 58.21 do sistema de disco giratório é
01: 19: 00.06 que limitou a rejeição fora de foco.
01: 19: 02.16 Se sua amostra estiver suficientemente fora de foco,
01: 19: 04.17 Essa luz vai passar através de orifícios adjacentes
01: 19: 07.01 e isso significa que você não é mais
01: 19: 08.08 bloqueando toda a luz fora de foco.
01: 19: 11.12 Você pode quantificar isso.
01: 19: 14.00 E então, o que estou mostrando aqui
01: 19: 15.05 é um enredo de basicamente como
01: 19: 17.04 muito da luz fora de foco é
01: 19: 18.14 transmitido em função de quão longe
01: 19: 21.02 de foco, você está no eixo x.
01: 19: 23.04 E então, nesta curva vermelha aqui,
01: 19: 24.12 você pode ver o confocal de varredura a laser,
01: 19: 26.19 onde não importa o quão longe você fique fora de foco,
01: 19: 29.08 você continua a rejeitar essa luz.
01: 19: 31.28 É, você sabe,
01: 19: 32.24 apenas você o atenua mais e mais
01: 19: 34.00 quanto mais fora de foco estiver.
01: 19: 35.24 O disco giratório aqui, mostrado em azul,
01: 19: 38.02 para pequenas quantidades de fora de foco,
01: 19: 40.04 para pequenas quantidades de desfocagem,
01: 19: 41.20 executa exatamente o mesmo
01: 19: 42.22 como um confocal de varredura a laser.
01: 19: 44.10 É aqui que aquele disco fora de foco
01: 19: 47.00 não é grande o suficiente para alcançar o adjacente
01: 19: 49.00 furos ainda.
01: 19: 49.27 No entanto, uma vez que atinge
01: 19: 51.08 aqueles orifícios adjacentes que você pode ver aqui
01: 19: 52.19 existe esse platô.
01: 19: 54.12 E assim que chegarmos a esse planalto,
01: 19: 55.16 basicamente paramos de melhorar
01: 19: 56.27 nossa rejeição fora de foco.
01: 19: 58.23 E então, o que isso significa é que
01: 19: 59.27 se a sua amostra for muito espessa,
01: 20: 02.03 a luz fora de foco de
01: 20: 03.04 as partes distantes vão para
01: 20: 05.21 contribuem com um histórico significativo
01: 20: 06.26 à sua imagem que normalmente
01: 20: 08.19 ser bloqueado por um confocal de varredura a laser.
01: 20: 10.11 Essa é a diferença entre o
01: 20: 11.10 curva do disco giratório aqui
01: 20: 12.19 e o confocal de varredura a laser.
01: 20: 15.08 E então, há um cruzamento
01: 20: 19.00 ponto aqui, onde para muito grosso
01: 20: 22.00 amostras deste sistema de digitalização a laser
01: 20: 23.00 ser melhor que o disco giratório.
01: 20: 24.09 E esse crossover está no terceiro
01: 20: 25,24 de faixa de 20 a 30 mícrons de espessura.
01: 20: 28.11 Isso depende um pouco
01: 20: 29.17 no design do disco giratório
01: 20: 31.05 e a objetiva que você está usando
01: 20: 32.25 mas para a objetiva 100x comumente usada
01: 20: 35.00 e o sistema de disco giratório do Yokogawa,
01: 20: 37.00 é cerca de 20 ou 30 mícrons.
01: 20: 38.25 E então, para amostras mais grossas você não
01: 20: 41.14 ver tanto benefício com o
01: 20: 42.25 disco giratório como você esperaria.
01: 20: 44.23 Não significa que você não possa usá-lo.
01: 20: 46.07 Significa apenas que não funcionará
01: 20: 47.10 tão bem quanto você gostaria.
01: 20: 50.16 Então, juntando tudo isso, podemos
01: 20: 52.22 apresentar algumas diretrizes gerais como
01: 20: 54,07 para quando usar microscopia confocal.
01: 20: 56.20 E vou falar separadamente aqui sobre
01: 20: 57,27 amostras fixas e amostras vivas porque
01: 21: 00.24 amostras fixas são muito menos sensíveis a
01: 21: 02.25 a quantidade de luz que você coloca neles.
01: 21: 03.28 Para células vivas, se você brilhar muita luz
01: 21: 06.02 neles eles morrem ou você tem danos na foto
01: 21: 08.05 para as células, o que te impede de
01: 21: 09.28 de obter os dados que você deseja.
01: 21: 11.21 Portanto, para amostras fixas, podemos primeiro considerar
01: 21: 15.12 amostras finas, ou onde você está trabalhando
01: 21: 18.00 ampliação muito baixa, onde o
01: 21: 20.00 a espessura da sua amostra não é muito
01: 21: 22.00 grande em comparação com o volume focal de
01: 21: 24.00 seu microscópio, a região que seu
01: 21: 26.00 microscópio detecta em foco.
01: 21: 27.05 Então, se houver se essencialmente toda a sua amostra
01: 21: 31.00 está em foco, não há fora de foco
01: 21: 32.00 luz e então confocal não te dá
01: 21: 34.00 quaisquer vantagens.
01: 21: 34.12 Você pode usar apenas o comum
01: 21: 36.00 microscopia de campo amplo convencional.
01: 21: 39.00 No entanto, assim que suas amostras começarem a receber
01: 21: 41.00 de espessura em relação ao foco
01: 21: 43.00 volume que seu microscópio pode registrar,
01: 21: 46.00 diga se você está usando uma objetiva 100x com um,
01: 21: 46.26 você sabe, volume focal de 700 nanômetros,
01: 21: 50.06 e suas amostras de 10 mícrons de espessura,
01: 21: 51.28 então agora você tem uma vantagem
01: 21: 53.03 para fazer confocal.
01: 21: 54.16 E normalmente, para espécimes fixos, você
01: 21: 57.00 usa digitalização confocal a laser porque o
01: 21: 59.00 rejeição fora de foco é melhor do que
01: 22: 02.00 para um sistema de disco giratório.
01: 22: 03.10 A única exceção pode ser como se você estivesse olhando
01: 22: 06.00 em amostras fixas muito fracas, onde o maior
01: 22: 08.00 visão sensível à luz em disco giratório
01: 22: 09.00 pode ser uma vantagem.
01: 22: 10.18 Conforme suas amostras ficam mais espessas,
01: 22: 12.27 você sabe em uma faixa de 30 a 50 mícrons,
01: 22: 14.27 o confocal de varredura a laser fica melhor e
01: 22: 16.17 melhor porque nesta faixa o disco giratório
01: 22: 19.15 o sistema para de rejeitar tanto
01: 22: 21.00 luz fora de foco como a varredura a laser
01: 22: 22,15 sistema.
01: 22: 24.00 Portanto, este é provavelmente o caminho preferido a seguir.
01: 22: 27.00 E então, conforme você fica ainda mais espesso
01: 22: 29,00 espécimes além de 100 ou 200 mícrons
01: 22: 32.00 o confocal de varredura a laser começa a
01: 22: 34.00 tem problemas em lidar com a quantidade de
01: 22: 36.00 luz fora de foco e então você precisa
01: 22: 37.00 vá para microscopia de dois fótons ou outro
01: 22: 39.00 técnicas especializadas, que abordaremos
01: 22: 40,00 em outra palestra aqui.
01: 22: 45.01 Para amostras ao vivo, é uma história um pouco diferente.
01: 22: 49.19 Para fino
01: 22: 51.00 novamente, para fina e baixa ampliação
01: 22: 53,00 amostras, onde sua amostra é fina
01: 22: 56,00 em comparação com o volume focal do seu
01: 22: 57.00 microscópio, geralmente você usaria amplo
01: 22: 59.00 sistemas de campo aqui.
01: 23: 00.21 Porque o confocal de novo
01: 23: 01.26 não compra nenhum benefício,
01: 23: 05.00 pode haver alguma vantagem em usar o
01: 23: 06.00 disco giratório porque parecem estar
01: 23: 07.00 mais compatível com células vivas do que campo amplo.
01: 23: 09.00 Mas isso depende muito dos detalhes de
01: 23: 12.00 sua instrumentação e é difícil dar
01: 23: 13.00 orientações gerais.
01: 23: 14.08 Se suas amostras forem novamente,
01: 23: 15.18 você sabe, fino, mas mais grosso que o
01: 23: 18.00 volume focal de sua objetiva,
01: 23: 20.00 então, diga novamente, você conhece seus 10 mícrons
01: 23: 22.00 célula e você está usando objetiva 100x
01: 23: 23.00 com um volume focal de 700 nanômetros
01: 23: 25.22 e você precisa fazer pilhas Z,
01: 23: 27.01 você precisa cortar esses caras,
01: 23: 28.14 então discos giratórios são realmente o microscópio
01: 23: 30,27 de escolha.
01: 23: 33.01 Para espécimes grossos,
01: 23: 34.16 fica um pouco mais complicado aqui.
01: 23: 35.28 Então, uma vez que você chega a esta faixa,
01: 23: 37.02 onde o disco giratório está
01: 23: 39.00 não rejeitando mais tão fora de foco
01: 23: 41.00 luz como o sistema de varredura a laser
01: 23: 44.00 agora começa a importar se você realmente
01: 23: 47.00 precisa de rejeição extra fora de foco ou
01: 23: 49.00 você precisa de mais compatibilidade com células vivas
01: 23: 51.00 e maior sensibilidade do disco giratório.
01: 23: 51.29 E então, é difícil dar uma ideia geral
01: 23: 55.00 recomendações neste intervalo porque
01: 23: 56.00 você pode achar que é melhor
01: 23: 58.00 rejeição fora de foco e o laser
01: 24: 00.00 sistema de digitalização é necessário para obter
01: 24: 01.00 imagens nítidas. Ou você pode descobrir que seu
01: 24: 04.00 a amostra não está muito rotulada,
01: 24: 05.00 há apenas uma pequena quantidade de
01: 24: 07.00 fora de foco da luz e, portanto, quanto mais alto
01: 24: 09.00 sensibilidade e melhor célula viva
01: 24: 10.00 facilidade do disco giratório é um
01: 24: 12,00 vantagem.
01: 24: 12.19 E novamente, quando suas amostras
01: 24: 15.00 fica bem espesso, microscopia de dois fótons,
01: 24: 17.00 outra técnica especializada entra em cena
01: 24: 19.00 jogo e nenhum desses sistemas são
01: 24: 21.00 realmente capaz de lidar com isso.


5. Seção Experimental

Preparação de amostra de tecido

Os tecidos de cérebro e rim de camundongos foram adquiridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd. Sexo e idade dos camundongos ICR não foram especificados. Tecidos pulmonares metastáticos derivados do modelo de camundongos com câncer de mama MMTV-PyMT foram coletados do laboratório do Dr. Tang-Long Shen (Universidade Nacional de Taiwan) e os detalhes experimentais foram descritos em outro lugar. [57,58] Todos os procedimentos experimentais foram tratados de acordo com os protocolos e os regulamentos éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Nacional de Taiwan (aprovação do IACUC Nº NTU104-EL-00003). Os órgãos intactos foram retirados assim que a eutanásia. O tecido de câncer de mama humano Luminal B foi coletado do National Taiwan University Hospital. Todos os procedimentos em tecido humano foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa B do National Taiwan University Hospital (aprovação NTUH-REC nº 201812125RINB). Os órgãos intactos e as amostras de tecido foram armazenados a -80 ° C antes do crio-seccionamento. Para o crio-seccionamento do tecido, órgãos e amostras de tecido foram congelados rapidamente com nitrogênio líquido e mantidos abaixo de -20 ° C no tomo frio (LEICA, CM1900) para atingir a temperatura ideal antes do corte. As amostras foram seccionadas em seções de 14 μm de espessura e descongeladas nas lâminas e armazenadas a −80 ° C antes da análise sem fixação. As lâminas usadas para a análise nanoDESI MSI eram de vidro liso normal sem qualquer revestimento. Para DESI, coloração de H & ampE e imunocoloração, os tecidos foram descongelados em lâminas revestidas com silano, enquanto as lâminas para análise de MALDI-TOF foram revestidas com óxido de índio e estanho. Antes da interrogação do nanoDESI MS, as seções de tecido foram secas em um dessecador por

1 hora e depois enxaguado com 50 ml de clorofórmio durante 1 min. O pré-tratamento da seção de tecido adjacente para validação MALDI-TOF é conforme descrito a seguir. A aplicação da matriz foi realizada pelo método de sublimação, que foi descrito em outro lugar, [59] seguido por uma etapa de recristalização. [60] O aparelho de sublimação foi adquirido de Singlong (Taichung, Taiwan) e colocado em um banho de areia em uma placa quente durante a aplicação da matriz. As seções do cérebro foram coladas em lâminas de vidro revestidas com ITO por uma fita condutora e armazenadas a -80 ° C antes da aplicação da matriz. A sublimação foi realizada usando 2,5-dihidroxiacetofenona (2,5-DHA). A sublimação da matriz e a aplicação foram realizadas a 110 ° C com vácuo de 0,7 Torr por 10 minutos. A quantidade de matrizes aplicadas foi determinada pelo tempo de exposição. As amostras revestidas com matriz foram reidratadas com solução de TFA a 50% em uma incubadora a 37 ° C por 4 minutos. Uma etapa de sonicação foi adicionada para aumentar o sinal para a análise de proteínas. [61] A sonicação foi operada pelo ultrasonicator Elmasonic S 30 H em modo contínuo com uma frequência de 37 KHz. Quanto à interrogação DESI MS, as seções de tecido foram secas em um dessecador por

1 hora, nenhum outro pré-tratamento da amostra foi realizado antes da análise.

Imagens de espectrometria de massa de ionização de ambiente

Para DESI MSI, a fonte comercial de DESI (Prosolia Inc., IN, EUA) foi montada no Orbitrap Elite para realizar as medições de MSI (faixa de massa de 200 a 1000 m / z) A pressão do gás de nitrogênio foi ajustada em 150 psi, o ângulo da cabeça de pulverização foi ajustado para 55 °, a taxa de fluxo do solvente (DMF: ACN = 1: 1) foi de 2 μl / min e a voltagem foi de 3,5 kV. O sistema nanoDESI foi modificado a partir da plataforma DESI comercial (faixa de massa 700 a 800 m / z), em que dois capilares fundidos puxados por chama (O.D: 360 μm, I.D: 250 μm) foram implantados e usados ​​para substituir o emissor DESI original. O capilar de liberação de solvente (primário) (65% ACN com 1% de ácido fórmico), foi aplicado em alta voltagem (2,5kV) para extrair e ionizar o composto na superfície da amostra. O capilar secundário foi usado para entregar os extratos da amostra ao espectrômetro de massa. Os experimentos MSI foram conduzidos usando o sistema DESI 2D da Prosolia. As taxas de varredura do estágio do motor para DESI e nanoDESI MSI foram definidas em aproximadamente 150 μm s −1 e 30 μm s −1, respectivamente.Os dados brutos adquiridos foram então importados para Firefly ™ 2.2 para conversão de dados, então importamos os dados convertidos para BioMAP para obter o DESI final e nanoDESI MSI. Para a coloração de H & ampE, as lâminas de tecido foram enxaguadas com EtOH 70% e, em seguida, EtOH 100% por 30 segundos cada e deixadas secar sob vácuo. A coloração com hematoxilina foi aplicada a 60 ° C durante 40 seg. Após a coloração com hematoxilina, as lâminas foram enxaguadas com H2O, em seguida, enxaguado com EtOH acidificado 0,3% por 3 segundos, depois enxaguado com H2O. O azulado foi alcançado por 1% de NH4OH e finalmente H2O sob temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram mergulhadas na coloração de eosina por 20 segundos, em seguida, as lâminas foram enxaguadas com H2O, depois 80% de EtOH, depois 90% de EtOH e, finalmente, 99% de EtOH à temperatura ambiente.

Pré-processamento de dados para fusão de imagens

Os dados MSI foram convertidos em um arquivo * .img pelo Firefly ™ 2.2 e exportados para um pacote MSiReader embutido em Matlab. Cada conjunto de dados foi sobreposto com a imagem H & ampE e os dados MSI no MSiReader para determinar a região de interesse. [62] Os sinais espectrais de massa foram agrupados em 2.000 recursos (equivalente a 0,4 m / z cada um para DESI MSI e 0,05 m / z cada um para nanoDESI MSI) e somados antes de exportados como um arquivo de texto uniformemente espaçado. As imagens do microscópio foram coletadas por um microscópio óptico (WHITED INC., Taipei, Taiwan) com uma câmera digital PSC600-05C (OPLENIC CORP., EUA) e os dados da imagem foram processados ​​por AOR AJ-VERT. As imagens microscópicas foram então exportadas como uma matriz de dados uniforme pelo script Matlab feito em casa. Uma matriz de transformação afim que pode descrever a relação espacial entre os dados de MSI e os dados de microscopia foi calculada usando um segundo script Matlab feito em casa. Posteriormente, o melhor ajuste entre os dados MSI e os dados microscópicos pode ser encontrado para garantir o alinhamento ideal. Os dados processados ​​foram exportados por script Matlab gerado internamente e importados para o "Sistema de fusão de imagem molecular" na interface de linha de comando para gerar os conjuntos de dados MSI preditivos. [38] O MSI de alta resolução de saída com pontuação de reconstrução & gt75% foi exportado para análise de curvas ROC AUC adicional.

Curva característica de operação do receptor

As curvas ROC foram construídas por nosso código MATLAB desenvolvido em casa. A curva ROC é dada pelos valores correspondentes da sensibilidade e (1-especificidade) em vários limiares de intensidade de íons para indivíduos m / z para determinar a classificação binária do tecido. Se a intensidade de um específico m / z pico em um determinado pixel era maior do que o limite de intensidade, o pixel foi então considerado como “Câncer”. Caso contrário, o pixel foi atribuído como “Normal”. Os conjuntos de atribuições resultantes foram comparados, pixel por pixel, com os rótulos da imagem de tecido pulmonar metastático corada com H & ampE avaliada pelo patologista para calcular a sensibilidade e a especificidade de cada íon. A sensibilidade (taxa de verdadeiro positivo) foi definida como a razão entre "o número de pixels cancerígenos determinados por MSI e o patologista" e "o número de pixels cancerígenos marcados pelo patologista" a (especificidade 1), ou taxa de falsos positivos , foi definido como a razão entre “o número de pixels cancerígenos determinados por MSI na região do tecido normal” e “o número de pixels normais rotulados pelo patologista”. As curvas ROC de um m / z pico foram esboçados definindo o limite de intensidade de 0% a 100% da intensidade mais alta do íon em todos os pixels.

Coloração de imunofluorescência

Todos os procedimentos de imunomarcação foram baseados nos protocolos do kit comercial (TAHC03, BioTnA, Kaohsiung, Taiwan). Após a imunocoloração, as lâminas foram montadas e digitalizadas com um scanner digital de slides Motic Easyscan (Motic Hong Kong Limited, Hong Kong, China) a 40 × (0,26 µm / pixel) com alta precisão (foco automático de alta precisão). As imagens do slide inteiro do Motic Easyscan foram visualizadas com os softwares DSAssistant e EasyScanner na Litzung Biotechnology INC (Kaohsiung, Taiwan).

Imagens de espectrometria de massa de tempo de voo com dessorção / ionização a laser assistida por matriz

Os resultados de MALDI-TOF MSI foram adquiridos usando espectrometria de massa MALDI-TOF / TOF (sistema Autoflex Speed ​​MALDI TOF / TOF, Bruker Daltonics). O instrumento foi equipado com o terceiro harmônico do laser Nd: YAG SmartBeamTM-II (355nm). Os espectros de imagem foram registrados e processados ​​por FlexControl 3.4 e FlexImaging 3.0 (Bruker Daltonics). Os espectros foram adquiridos em polaridade positiva com resolução pixel a pixel de 60 μm usando os seguintes parâmetros: atenuador de laser offset em 80% da potência máxima de operação do laser em 90% no modo linear para análise de proteínas e 80% no modo reflectron para análise de lipídios com parâmetro de feixe inteligente em 2_pequena taxa de repetição de laser em tomadas de aquisição de 1 kHz acumuladas a 1.000 fotos por pixel para análise de imagem. Os espectros de imagem resultantes foram processados ​​usando a subtração de linha de base TopHat e normalizados para as contagens de íons totais por pixel.

Identificações moleculares baseadas em espectrometria de massa

Os íons de proteína gerados pela fonte nanoDESI foram introduzidos diretamente no LTQ Orbitrap Elite para análise de massa em tandem de cima para baixo [45,46]. Os íons de proteína de interesse foram escolhidos como o centro de massa de 5m / z janela de isolamento com uma energia de ativação Q de 0,25 e utiliza energia de colisão de 30%. Os dados foram importados para o Prosight PTM para identificação [63,64]. Espécies de lipídios no tecido cerebral foram extraídas com métodos de MTBE para posterior análise de massa em tandem [65]. A análise HPLC-MS / MS foi realizada usando HPLC (LC-20AD, Shimadzu, Tóquio, Japão), juntamente com Orbitrap Elite (Thermo Scientific). Os experimentos de HPLC foram realizados usando coluna C18 (100 * 2,1 mm, 3,5 μm, Agilent) e seguindo o gradiente de eluição: fase móvel A = água com ácido fórmico 0,1% (v / v) fase móvel B = acetonitrila e isopropanol (10:90 , v / v) com perfil de eluição de ácido fórmico 0,1% (v / v) = 0,0-5,0 min (40% da fase móvel B) 5,0-35,0 min (40-90% da fase móvel B) 35,0-50,0 min (90% móvel fase B), forno de coluna a 25 ° C, injeção de volume de 10 μL e taxa de fluxo de 0,15 mL / min. Os parâmetros de aquisição de espectrometria de massa foram os seguintes: modo de íons positivos, temperatura do aquecedor 180 ° C, taxa de fluxo do gás do invólucro 35 arb, taxa de fluxo do gás auxiliar 10 arb, taxa de fluxo do gás de varredura 10 arb, voltagem de spray 3,5 kV e temperatura capilar 350 ° C. A fragmentação de CID foi realizada para atingir picos de íons observados na análise DESI com energia de colisão de 30% e um Q de ativação de 0,25. Os espectros de massa foram coletados no modo FT com 30.000 poder de resolução. A análise espectral de massa foi processada por Xcalibur QualBrowser.


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