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Quais são as unidades das intensidades das bandas em uma imagem de western blot?

Quais são as unidades das intensidades das bandas em uma imagem de western blot?



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Fiz um Western blot e estou medindo as intensidades da banda na imagem J. Usando a ferramenta retângulo, delineei a banda e calculei a área e a intensidade média da banda. Calculei então a intensidade total da banda multiplicando a área da banda pela intensidade média. Eu estava me perguntando, quais são as unidades de intensidade da banda? Eles estão em unidades arbitrárias? Todos os insights são apreciados.


As unidades no seu caso são unidades arbitrárias.

Por exemplo, você pode ter tirado uma foto das bandas com uma câmera que salvou um arquivo em escala de cinza com uma profundidade de 8 bits. Isso significa que os valores de brilho de cada pixel têm 256 gradações (ou 2 ^ 8 valores de brilho possíveis entre mínimo / em branco e máximo / saturado). O programa apenas pega o valor de brilho do pixel em qualquer lugar entre preto (0) e totalmente branco (256) e simplesmente executa os cálculos. Não há conexão real entre a intensidade da banda real e a saída do ImageJ ou de qualquer software.

Alternativamente, você também pode ter unidades relativas. Digamos que você tenha uma referência: um controle positivo ou negativo. Se sua referência tem um brilho de 10 e sua banda tem um brilho de 7, você pode expressar a intensidade da banda como "0,7 unidades relativas"; aqui você tem que especificar sua referência, ou seja, para o que você está calibrando suas unidades relativas, daí o termo relativo.


Teoria:

Métodos de visualização e análise de imagem são essenciais para a compreensão de vários recursos de aplicações de biologia celular, biologia molecular e neurociência. Os avanços recentes no campo biológico e médico tornaram a análise de imagens cada vez mais importante nesta disciplina. Uma série de ferramentas online disponíveis gratuitamente estão atualmente disponíveis para analisar as imagens biológicas. Nesta seção, a análise de densitometria, ou seja, a determinação das variações na densidade das amostras de proteínas comparando-a com um determinado valor padrão / determinação da intensidade das bandas específicas no western blot é feita por meio do software Image J. It é basicamente um programa de processamento de imagem Java de domínio público que foi desenvolvido no National Institute of Health. As etapas básicas envolvidas na análise de densitometria de proteínas são as seguintes:

  1. As imagens de blot são importadas para o software e o contraste é ajustado de forma a obter uma imagem de western blot nítida.
  2. Usando a ferramenta de seleção retangular, a área ao redor de cada banda a ser analisada é selecionada.
  3. As bandas são então analisadas.
  4. As intensidades das bandas são exibidas e a concentração relativa de proteína na amostra é quantificada.

PROCESSO

Preparação de amostra

A proteína pode ser medida a partir de tecidos inteiros ou de extratos de cultura de tecidos. As células e os tecidos devem ser rapidamente congelados com nitrogênio líquido para evitar a degradação das proteínas por protease ou coletados e lisados ​​o mais rápido possível. Também deve ser observado que ciclos repetidos de congelamento / descongelamento podem ter um efeito adverso na qualidade da proteína e devem ser evitados. O tecido sólido é quebrado mecanicamente, geralmente usando um homogeneizador ou por sonicação em um tampão de lise (veja abaixo). A preparação do tecido pode ser realizada em temperaturas frias para evitar a desnaturação e degradação da proteína.

Buffers de lise

Vários detergentes, sais e tampões podem ser usados ​​para permitir a lise de células e para solubilizar proteínas. Existem muitos tampões de lise diferentes, que podem ser escolhidos com base na proteína de interesse. Para evitar a degradação da proteína (tanto as proteases como as fosfatases podem ser liberadas durante a lise), os inibidores de protease e fosfatase podem ser incluídos no tampão de lise. Muitos desses inibidores vêm em forma de comprimido e podem ser simplesmente dissolvidos no tampão de lise antes do uso. Os tampões de lise usados ​​na preparação da amostra para western blotting devem permitir a extração eficiente da proteína e manter o reconhecimento do anti-soro da proteína (MacPhee, 2010). É importante ressaltar que a quantificação e a comparação com outras amostras na análise de western blot dependem dos lisados ​​de proteína preparados para a eletroforese em gel de poliacrilamida.

Determinação da concentração de proteína

As concentrações de proteína das amostras a serem carregadas em um gel precisam ser determinadas. A quantificação da proteína total pode ser obtida medindo amostras a 280 nm em um espectrofotômetro, mas o tampão não deve conter materiais absorventes. Quando o tampão contém materiais absorventes, o ensaio de Bradford (Bradford, 1976) pode ser usado onde uma curva padrão é criada para determinar concentrações de amostra desconhecidas.

Eletroforese em Gel

Para uma separação ideal, é importante determinar a proporção ideal bisacrilamida: acrilamida antes da eletroforese. As proteínas são então separadas por eletroforese em gel. As proteínas podem ser separadas por ponto isoelétrico, peso molecular, carga elétrica ou uma combinação destes. O tipo mais comum de eletroforese usa géis de poliacrilamida e tampões carregados com SDS. O procedimento do SDS-PAGE é baseado nas características do SDS, que é um detergente fortemente aniônico. Como as proteínas não têm todas a mesma carga elétrica, a mistura é tratada com SDS e, assim, as proteínas tornam-se desnaturadas e carregadas negativamente. Como resultado, isso permite a separação de proteínas por peso molecular. O tratamento com um agente redutor para remover as ligações dissulfeto e a fervura das amostras pode facilitar a desnaturação. Quando a voltagem é aplicada ao gel, as proteínas migram em velocidades diferentes e essas taxas diferentes resultam na separação em bandas dentro de cada pista. Um gel bidimensional também pode ser usado. Este tipo de gel espalha as proteínas de uma amostra em duas dimensões. As proteínas são separadas por ponto isoelétrico na primeira dimensão e por peso molecular na segunda dimensão.

Ao contrário dos géis SDS-PAGE, que desdobram e desnaturam a estrutura nativa de uma proteína, géis não desnaturantes ou nativos podem ser usados ​​para manter complexos de proteínas para detecção após a transferência. No entanto, os complexos podem não se separar de forma limpa ou previsível, porque eles são incapazes de se mover através do gel de poliacrilamida tão rapidamente quanto as proteínas desnaturadas individuais.

Carregando géis - o que deve ser incluído?

As amostras são carregadas no gel. Uma pista deve incluir um marcador de peso molecular que é usado para determinar o peso molecular da proteína alvo. Outra via deve incluir um controle interno, de preferência com uma concentração e peso molecular conhecidos para determinar se o anticorpo primário é eficaz (consulte os sites mais adiante e a Fig. 1).

(UMA) Exemplo representativo de um western blot mostrando a expressão de conexina 43 (Cx43) após o tratamento com drogas. O seguinte é mostrado no blot: um marcador de peso molecular (MW) que pode ser visto a olho nu, amostras sob diferentes concentrações de drogas, controle (Cont.), Albumina de soro bovino (BSA), a linha celular CHME e mágica mark (Magic), que é um marcador de peso molecular observado sob quimioluminescência. D12 e D16 referem-se aos tempos de tratamento (B) Western blot de (A) que foi removido e reprobed para GAPDH para normalização.

Transferência de proteínas

Uma vez que a eletroforese está completa, as proteínas separadas podem ser transferidas de dentro do gel para uma membrana (um western blot) feita de nitrocelulose, difluoreto de polivinilideno, papel ativado ou náilon ativado (Towbin et al., 1979 Kurien e Scofield, 2006). A nitrocelulose é a membrana mais comumente usada. O eletroblotting é o procedimento mais popular para a transferência de proteínas de um gel para uma membrana. Suas principais vantagens são a rapidez e a abrangência da transferência. Este processo usa uma corrente elétrica para puxar as proteínas do gel para a membrana. Isso pode ser obtido por imersão de um sanduíche de membrana de gel (transferência úmida) ou colocando o sanduíche de membrana de gel entre papel absorvente que foi embebido em tampão de transferência (transferência semidry). A eficácia da transferência de proteínas depende do tipo de gel usado, da massa molecular da proteína e do tipo de membrana. Algumas limitações associadas à transferência de proteínas incluem um limite de peso molecular inferior de ∼10 kDa, o uso de tampões de transferência especializados (por exemplo, ácido 3- (ciclohexilamino) - L-propanossulfônico) para facilitar a transferência de proteínas com um ponto elétrico isolado alto e problemas associado ao uso de um tampão de transferência com um pH mais baixo do que o ponto isoelétrico da proteína (ou seja, a proteína funcionará para trás).

Bloqueio e anticorpos

É importante evitar interações entre a membrana e o anticorpo escolhido para detectar a proteína alvo. Para bloquear a ligação inespecífica, a membrana é colocada em uma solução diluída de proteína, como albumina de soro bovino e leite em pó desnatado. Os pesquisadores devem garantir que o tampão de bloqueio apropriado para o anti-soro específico também seja apropriado para o tipo de membrana. O bloqueio ajuda a mascarar quaisquer potenciais locais de ligação não específicos na membrana, reduzindo assim o “ruído” de fundo no produto final do western blot, eliminando falsos positivos e fornecendo um resultado claro.

Após o bloqueio, o método mais popular é incubar a membrana com o anticorpo primário, lavar, rebloquear e então incubar com o anticorpo secundário e lavar novamente. É importante determinar a concentração ideal de anticorpos antes de executar todas as amostras, pois a otimização é o principal determinante da sensibilidade do ensaio (Burnette, 1981). A concentração de anticorpos deve ser otimizada para fornecer a melhor relação sinal-ruído. Tanto os anticorpos monoclonais quanto os policlonais podem ser usados ​​para análises ocidentais, com vantagens e desvantagens no uso de qualquer um dos tipos (MacPhee, 2010).

Detecção

As sondas que são marcadas e ligadas à proteína de interesse precisam ser detectadas no Western blot. Para métodos de detecção, métodos colorimétricos, radioativos e fluorescentes podem ser usados. No entanto, a detecção quimioluminescente é usada com mais frequência e, portanto, será brevemente descrita. A quimioluminescência aprimorada (ECL) é um método sensível e pode ser usado para quantificação relativa da proteína de interesse (Kurien e Scofield, 2006 MacPhee, 2010). O anticorpo primário se liga à proteína de interesse e o anticorpo secundário, geralmente ligado à peroxidase de rábano, é usado para clivar um agente quimioluminescente. O produto da reação produz luminescência, que está relacionada à quantidade de proteína. Apenas um único detector de luz é necessário, e a luz é detectada por filme fotográfico ou por uma câmera de dispositivo de dupla carga (mais sensível, maior resolução e uma gama maior de exposições do que filme). É útil que muitos fabricantes produzam uma variedade de kits de detecção de western blot baseados em ECL de acordo com as necessidades específicas dos pesquisadores.

Uma vez que as exposições tenham sido capturadas, os blots podem ser lavados em um tampão e então “removidos”, o que envolve a remoção dos anti-soros ligados para permitir a reutilização do blot. Os borrões podem ser armazenados para uma nova pesquisa futura várias vezes. No entanto, reprobing subsequente pode interferir com antígenos protéicos, resultando em uma diminuição do sinal (Alegria-Schaffer et al., 2009).


Visualização de proteínas na membrana com vermelho Ponceau

Para verificar o sucesso da transferência, lave a membrana em TBST. Diluir o estoque Ponceau Red 1: 100. O estoque é feito de 2% de Ponceau S em 30% de ácido tricloroacético e 30% de ácido sulfossalicílico.

Incubar em um agitador por 5 min, em seguida, lave abundantemente em água até que a água esteja límpida e as bandas de proteína estejam bem definidas. A membrana pode ser descolorida completamente por lavagem repetida em TBST ou água. Ao usar uma membrana PVDF, reative a membrana com metanol e lave novamente em TBST.

Por 1 L
24,23 g Trizma HCl
80,06 g de NaCl
Dissolva em 800 mL de água destilada
pH a 7,6 com HCl
Complete até 1 L

Por 1 L
100 mL TBS 10x
900 mL de água destilada
1 mL Tween 20

O Tween 20 é muito viscoso e adere à ponta das pipetas de medição. Certifique-se de adicionar a quantidade certa de detergente ao tampão Tris. Uma solução a 10% é mais fácil de dispensar do que Tween 20 não diluído.


Imunodetecção tradicional

Materiais

  • Anticorpos Primários e Secundários
  • Agitador orbital * (Produto No. Z768499)
  • Calhas de 2 a 3 mm de profundidade, ligeiramente maiores do que o tamanho do seu borrão
  • Substratos de detecção (para uso com conjugados de peroxidase ou fosfatase-anticorpo)
    - Substratos de quimioluminescência
    - Substratos cromogênicos

* Agitador e calhas necessários apenas para imunodetecção tradicional para imunodetecção rápida por vácuo usando o
SNAP i.d. ® sistema, consulte o SNAP i.d. ® protocolo de imunodetecção.

  1. Coloque o blot na solução de bloqueio e incube com agitação por 1 hora.
  2. Coloque o blot na solução de anticorpo primário, por exemplo, anticorpo monoclonal anti-beta-actina e incube com agitação por 1 hora. A solução deve mover-se livremente pela superfície da membrana.
  3. Coloque o blot em PBS e lave por 10 minutos. Repita duas vezes com tampão fresco.
  4. Coloque o blot na solução de anticorpo secundário e incube com agitação por 1 hora à temperatura ambiente ou 37 ° C.
  5. Coloque o blot em PBS e lave por 10 minutos. Repita duas vezes com tampão fresco.
  6. Prossiga com a detecção cromogênica, quimioluminescente ou fluorescente. Veja também os recursos relacionados à detecção de proteínas:
    Detecção cromogênica e quimioluminescente de proteínas
    Imunodetecção usando substrato BCIP / NBT

Guia do Better Western Blotting

Dicas, técnicas e tecnologias dos especialistas em Western Blotting da Bio-Rad Laboratories

Protocolos

Determinando a carga de amostra apropriada para Western Blots (PDF 180 KB)

Determinação da carga de amostra apropriada ao realizar um Western Blot sem manchas (PDF 182 KB)

Western Blotting sem manchas (PDF 589 KB)

Validando a consistência de expressão de uma proteína doméstica (PDF 198 KB)

Protocolo Geral para Western Blotting (PDF 96 KB)

Protocolo geral de Western Blotting sem manchas (PDF 578 KB)

& raquo Baixe a Lista de Publicação de Normalização de Proteína Total (PDF 197 KB)


Os dois métodos principais

Existem duas abordagens para normalização ao avaliar um western blot: detecção de proteína única e normalização de proteína total.

De longe, a abordagem mais comum para a detecção de proteína única é usar proteínas de manutenção. Sua abundância em uma amostra serve como um proxy para toda a população de proteínas. A chave para o sucesso com esta abordagem é basear a normalização em uma proteína que pode assumir o papel de ser um padrão interno. Isso quer dizer que sua proteína doméstica não será seu alvo, mas ainda assim deve ser onipresente e consistentemente expressa em sua amostra. Felizmente, graças à natureza das proteínas domésticas, os anticorpos para elas estão prontamente disponíveis e a detecção de proteínas onipresentes é fácil.

Mas, Dr. Oh adverte que existem restrições ao uso de detecção de proteína única. Os controles positivos e negativos devem ser estabelecidos separadamente, os níveis de expressão de proteína consistentes em diferentes amostras devem ser testados e uma resposta de sinal linear escalar precisa ser confirmada em uma gama de quantidades de carga de proteína (Janes 2015). Tudo isso é necessário, mas também é tedioso e demorado.

Ao realizar a normalização de proteína total, no entanto, tudo das proteínas em uma amostra são visualizadas e sua abundância total serve como a base da normalização. Não depender de uma proteína de manutenção é um afastamento da precedência histórica que a normalização de manutenção tem sido utilizada por mais de 30 anos. Porém, a normalização total da proteína freqüentemente prova ser uma opção mais precisa.

Lembre-se, o objetivo da normalização é levar em consideração as diferenças da proteína total de cada amostra decorrentes do erro experimental. Que melhor maneira de medir essas diferenças do que realmente medir a abundância total de proteínas de cada amostra? A normalização da proteína total é realizada com coloração reversível (ocorrendo pré-imunodetecção), coloração irreversível (ocorrendo pós-imunodetecção) ou métodos sem manchas. E a normalização da proteína sem manchas é única.


Western Blotting

A análise de Western blot pode detectar 1 proteína em uma mistura de qualquer número de proteínas, enquanto fornece informações sobre o tamanho da proteína. Não importa se a proteína foi sintetizada in vivo ou in vitro. Este método é, no entanto, dependente do uso de um anticorpo de alta qualidade dirigido contra uma proteína desejada. Portanto, você deve ser capaz de produzir pelo menos uma pequena porção da proteína a partir de um fragmento de DNA clonado. Você usará este anticorpo como uma sonda para detectar a proteína de interesse.

O Western blotting informa a quantidade de proteína acumulada nas células. Se você estiver interessado na taxa de síntese de uma proteína, a precipitação radioimune (RIP) pode ser o melhor ensaio para você. Além disso, se uma proteína se degradar rapidamente, o Western blotting não a detectará bem, você precisará usar (RIP). Consulte a seção sobre RIP para obter mais informações, bem como um gráfico comparativo útil que ilustra as diferenças entre essas duas técnicas.

Vamos examinar essa técnica com mais detalhes.

1. Separe as proteínas usando eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (também conhecido como SDS-PAGE). Isso separa as proteínas por tamanho.

2. Coloque uma membrana de nitrocelulose no gel e, usando eletroforese, conduza as bandas de proteína (polipeptídeo) para a membrana de nitrocelulose. Você deseja que a carga negativa esteja do lado do gel e a carga positiva do lado da membrana de nitrocelulose para conduzir as proteínas com carga negativa para a membrana de nitrocelulose com carga positiva. Isso dá a você uma membrana de nitrocelulose impressa com as mesmas bandas de proteína do gel.

Uma coisa a estar ciente é que as proteínas se ligam melhor à nitrocelulose em um pH baixo. Você pode precisar passar por algumas tentativas e erros para encontrar o pH ideal. Você também precisa ter certeza de que não há bolhas de ar entre a nitrocelulose e o gel, ou suas proteínas não serão transferidas.

3. Incube a membrana de nitrocelulose com um anticorpo primário. Clique aqui para saber mais sobre como fazer um anticorpo primário. O anticorpo primário, que é o anticorpo específico mencionado acima, adere à sua proteína e forma um complexo anticorpo-proteína com a proteína de interesse.

4. Incube a membrana de nitrocelulose com um anticorpo secundário. Este anticorpo deve ser um conjugado anticorpo-enzima. O anticorpo secundário deve ser um anticorpo contra o anticorpo primário. Isso significa que o anticorpo secundário "grudará" no anticorpo primário, assim como o anticorpo primário "grudará" na proteína. A enzima conjugada existe para permitir que você visualize tudo isso. É como uma explosão molecular presa nos anticorpos para que você possa visualizar o que está acontecendo.

5. Para realmente ver sua enzima em ação, você precisará incubá-lo em uma mistura de reação específica para sua enzima. Se tudo funcionou corretamente, você verá bandas onde quer que haja um complexo proteína-anticorpo primário-anticorpo secundário-enzima, ou, em outras palavras, onde quer que sua proteína esteja.

6. Coloque filme de raio-x em seu gel para detectar um flash de luz, que é emitido pela enzima. A reação geralmente termina em cerca de uma hora.

Fazendo um anticorpo primário

Esta descrição pressupõe que você tenha proteína purificada disponível. Execute a proteína em um gel SDS-PAGE. Mancha o gel com KCl. O KCl forma um precipitado com o SDS. Como a área com a proteína tem uma baixa concentração de SDS, a área com a proteína não apresentará precipitado. Isso permitirá que você veja a faixa de proteína como uma faixa clara contra um precipitado branco leitoso no resto do gel.

Corte cuidadosamente a banda e mergulhe-a em 1 mL de tampão PBS. Esmague-o e faça uma emulsão com 1 mL de Adjuvante Completo de Freund (que é uma substância oleosa). O adjuvante completo contém microbactérias (um estimulante imune) para aumentar a resposta imune. Injetar subescapularmente em um coelho. Esta é sua primeira inoculação. Use apenas o adjuvante completo para a primeira inoculação. NUNCA injetar em um coelho o adjuvante completo mais de uma vez.

Descanse o coelho por um mês e, em seguida, repita o processo usando um incompleto adjuvante. Você pode esperar bons títulos de anticorpos cerca de 10 dias após o segundo reforço.

Sangre o coelho. Você pode esperar cerca de 30 a 40 mL por sangramento e cerca de 50 por cento do volume é soro. Agora você tem anti-soros de coelho.

Para obter o seu anticorpo primário, dilua o anti-soro de coelho em blotto (também conhecido como Leite Instantâneo Seco Desnatado Carnation) e aplique-o no blot de nitrocelulose. Certifique-se de diluir 1: 500 a 1: 100 em blotto, menos diluição irá dar-lhe ligação de fundo e realmente turvar seus resultados.

Anticorpo Secundário

Isso é muito mais fácil do que o procedimento para o anticorpo primário. Pegue um catálogo e procure um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP). O anti-coelho de cabra é o seu anticorpo secundário (aquele que se "cola" ao anticorpo primário) e o HRP é a enzima conjugada que lhe permitirá visualizar a sua proteína.


2. Subtrair o fundo

Infelizmente, a maioria dos Western blots e capturas de imagens estão infiltrados com imperfeições aleatórias. Por exemplo, o lado esquerdo da mancha pode ser um pouco mais escuro (fundo mais alto) ou sua faixa menos abundante pode ter mais fundo ou um arranhão escuro irritante. Essas diferenças podem causar inconsistências em seus resultados. Muitos pacotes de software podem calcular o histórico em torno de sua banda de interesse, usando alguma variação do método “rolling ball” (mais uma vez, leve um tempo para entender o seu software). O plano de fundo deve ser subtraído de suas bandas de interesse e das bandas para as quais você está normalizando. A perfeição aqui é um desafio, basta fazer o seu melhor e deixar as estatísticas estimarem a resposta real quando você terminar (Etapa 4).


Visão geral

Um uso simples e comum do Western blot é identificar se uma determinada proteína está presente ou ausente em uma amostra, procurando uma faixa do tamanho correto em um Western blot. Este tipo de Western blot de rotina é usado para testar a expressão celular endógena de uma proteína alvo ou para examinar linhas de células transfectadas para ver se a expressão foi conferida pela introdução de uma construção de DNA.

Ele também é usado com técnicas como purificação de proteínas e fracionamento celular para identificar quais amostras têm a proteína alvo e, portanto, é um auxílio para decidir quais amostras combinar ou descartar. Após a imunodetecção, uma banda correspondente ao tamanho da proteína alvo deve se tornar visível nas amostras de teste positivas e no controle positivo, em comparação com uma amostra celular nula conhecida. Na figura abaixo, as células HEK293 transfectadas com três isoformas da proteína Homer 1 são comparadas ao extrato cortical de rato como um controle positivo.

O blot mostra que o anticorpo usado, Bio-Rad & rsquos AHP737, reconhece a isoforma 1c de Homer, mas não 2b ou 1a. A presença de células não transfectadas (pista 2) confirma que o sinal é específico para transfecção com a construção apropriada. A faixa tênue vista na pista 4 é, na verdade, uma pequena quantidade de transbordamento da pista 5.

Figura 16: Detecção de isoformas de proteína de Homero de rato. Western blot de isoformas de Homer sondadas com anti-Homer [177-366] (AHP737) que detecta o controle e a isoforma 1c. Lane 1: controle, 30 mg de extrato cortical de rato. Lane 2: controle não transfectado. Lane 3: Isoforma 1a. Lane 4: Isoforma 2b. Lane 5: Isoforma 1c


Assista o vídeo: Western Blot E-Learning Workshop Part 2: Western Blot: A Step-by-Step Guide (Agosto 2022).