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Proteínas da membrana plasmática e fixação do citoesqueleto

Proteínas da membrana plasmática e fixação do citoesqueleto



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Com relação às funções das proteínas de membrana, qual das afirmações a seguir está CORRETA?

uma. As proteínas de membrana são responsáveis ​​pelo reconhecimento de célula a célula e pela ancoragem celular e são estabilizadas por meio da ligação às fibras citoesqueléticas dos microtubulelos.

b. Uma proteína que é enzimaticamente ativa e ligada à membrana funcionará de maneira significativamente diferente de uma proteína que é enzimaticamente ativa e citosólica.

c. As proteínas da membrana são fabricadas na cavidade interna (lúmen) do RE rugoso.

d. Danos ao ER liso podem alterar a composição das moléculas que são exibidas na superfície da célula.

Em relação às proteínas de membrana, o que está incorreto na afirmação “As proteínas de membrana são responsáveis ​​pelo reconhecimento célula-célula e pela ancoragem celular, e são estabilizadas por meio da ligação às fibras citoesqueléticas dos microtúbulos”?

Acredito que isso esteja errado porque normalmente são filamentos de actina e filamentos intermediários que se ligam às proteínas integrinas na membrana da superfície celular.


uma. As proteínas de membrana são responsáveis ​​pelo reconhecimento de célula a célula e pela ancoragem celular e são estabilizadas por meio da ligação às fibras citoesqueléticas dos microtubulelos.

Não totalmente correto, como você mesmo observou que as integrinas se ligam aos filamentos de actina.

b. Uma proteína que é enzimaticamente ativa e ligada à membrana funcionará de maneira significativamente diferente de uma proteína que é enzimaticamente ativa e citosólica.

Possível, mas não necessário.

c. As proteínas da membrana são fabricadas na cavidade interna (lúmen) do RE rugoso.

Eles são secretados no ER e modificados lá também, mas não são fabricados lá.

d. Danos ao ER liso podem alterar a composição das moléculas que são exibidas na superfície da célula.

Parece correto porque a afirmação em si não reivindica certeza. Diz que a composição das moléculas da superfície celular (que podem ser lipídios ou proteínas) poderia mudança em resposta a danos do SER.


Elucidando a estrutura da membrana e o comportamento da proteína usando vesículas gigantes da membrana plasmática

A observação da separação de fases em membranas plasmáticas intactas isoladas de células vivas é um avanço para a pesquisa da heterogeneidade lateral da membrana eucariótica, especificamente no contexto de jangadas de membrana. Essas observações são feitas em vesículas de membrana plasmática gigantes (GPMVs), que podem ser isoladas por vesiculantes químicos de uma variedade de tipos de células e observadas microscopicamente usando reagentes básicos e equipamentos disponíveis em qualquer laboratório de biologia celular. A separação de fase microscópica é detectável por marcação fluorescente, seguida pelo resfriamento das membranas abaixo de sua temperatura de transição de fase de miscibilidade. Este protocolo descreve os métodos para preparar e isolar as vesículas, equipamentos para observá-las em condições de temperatura controlada e três exemplos de análise de fluorescência: (i) espectroscopia de fluorescência com um corante sensível ao ambiente (laurdan) (ii) microscopia de dois fótons de o mesmo corante e (iii) microscopia confocal quantitativa para determinar a partição de componentes entre as fases jangada e não-rascunho. A preparação e o isolamento de GPMV, incluindo marcação fluorescente e observação, podem ser realizados em 4 h.


Proteínas em Membranas de Plasma

As proteínas constituem o segundo componente principal das membranas plasmáticas. Proteínas integrais são, como o nome sugere, completamente integrados na estrutura da membrana. Na verdade, suas regiões hidrofóbicas que abrangem a membrana interagem com a região hidrofóbica da bicamada fosfolipídica. Nós nos referimos a alguns tipos especializados de proteínas integrais como integrinas. Veja a imagem abaixo.

O modelo de mosaico fluido da membrana plasmática descreve a membrana plasmática como uma combinação fluida de fosfolipídios, colesterol e proteínas. Os carboidratos ligados aos lipídios (glicolipídios) e às proteínas (glicoproteínas) se estendem da superfície externa da membrana. Atribuição de imagem: OpenStax Biology

As proteínas integrais de membrana de passagem única geralmente têm um segmento transmembranar hidrofóbico que consiste em 20-25 aminoácidos. Alguns abrangem apenas parte da membrana - associando-se a uma única camada. Por outro lado, outras se estendem de um lado a outro da membrana e ficam expostas em ambos os lados.

Algumas proteínas complexas consistem em até 12 segmentos de uma única proteína. Essas proteínas se dobram extensivamente e se incorporam à membrana (veja a imagem abaixo). Este tipo de proteína tem uma região ou regiões hidrofílicas e uma ou várias regiões levemente hidrofóbicas. Este arranjo de regiões da proteína tende a orientar a proteína ao lado dos fosfolipídios, com a região hidrofóbica da proteína adjacente às caudas dos fosfolipídios e a região ou regiões hidrofílicas da proteína projetando-se da membrana e em contato com o citosol ou fluido extracelular.

As proteínas de membranas integrais podem ter uma ou mais alfa-hélices que abrangem a membrana (exemplos 1 e 2). Por outro lado, eles podem ter folhas beta que abrangem a membrana (exemplo 3). Atribuição de imagem: “Foobar” / Wikimedia Commons

Proteínas Periféricas

Podemos encontrar proteínas periféricas nas superfícies externas e internas das membranas. Na verdade, eles se ligam a proteínas integrais ou a fosfolipídios. Junto com as proteínas integrais, as proteínas periféricas podem servir como enzimas. Eles também podem servir como acessórios estruturais para as fibras do citoesqueleto. Além disso, eles podem servir como parte dos locais de reconhecimento da célula. Às vezes nos referimos a isso como proteínas “específicas da célula”. O corpo reconhece suas próprias proteínas e ataca proteínas estranhas associadas a patógenos invasivos.


Proteínas da membrana plasmática da membrana celular Biologia celular Funções do plasma

As células, sejam animais, vegetais ou bactérias, têm muitas partes ou organelas diferentes. Cada organela tem uma função diferente e importante dentro da célula. Se alguma das partes falhar, a célula para de funcionar e começa a morrer.

Uma das partes mais importantes de uma célula é chamada de membrana plasmática (ou membrana celular). A membrana celular tem muitas funções importantes, incluindo reconhecimento de célula para célula, regulação do que entra e sai da célula e comunicação de célula para célula. A química única da membrana plasmática permite que ela execute essas funções.

A membrana plasmática é composta por uma bicamada fosfolipídica que contém proteínas e carboidratos embutidos. Um lipídio ou triglicerídeo típico é composto de três ácidos graxos quimicamente ligados a uma molécula de glicerol. Os lipídios regulares são insolúveis em água. Um exemplo dessa insolubilidade pode ser visto em molhos para salada, como os molhos para salada italianos, nos quais as camadas se separam quando deixam assentar. Uma camada é a camada de água e a outra a camada de óleo ou lipídio. Os lipídios encontrados na bicamada lipídica da membrana plasmática trocaram uma das moléculas de ácido graxo por uma molécula de fosfato. Isso muda a química da molécula de lipídio, dando-lhe uma & # 8220head & # 8221 polar ou carregada e uma & # 8220nonpolar & # 8221 ou sem carga & # 8220tail & # 8221.

A bicamada lipídica é composta por duas camadas desses fosfolipídios com as cabeças apontando & # 8220 para fora & # 8221. Isso significa que uma cabeça polar está em contato com o exterior da célula e uma cabeça polar está em contato com o interior da célula . E tanto o ambiente externo quanto o interno são ambientes à base de água. As caudas ou as porções não polares dos fosfolipídios são sequestradas juntas para longe do ambiente aquático. Se você colocar os fosofolipídios em um ambiente à base de água, eles formarão espontaneamente a bicamada descrita acima.

Embutidas na membrana plasmática estão proteínas que podem ter várias funções, incluindo: serem moléculas marcadoras, proteínas de fixação, proteínas de transporte, proteínas receptoras ou enzimas. Este modelo de lipídio incorporado em proteína é chamado de modelo de mosaico fluido porque as proteínas não são estacionárias dentro da membrana lipídica.

As proteínas da molécula marcadora ajudam as células a se reconhecerem. Por exemplo, as moléculas marcadoras permitem que o sistema imunológico identifique a diferença entre as células próprias e as células ou corpos invasores. As proteínas de ligação podem ligar a célula a outras células ou a outras moléculas extracelulares. As proteínas de transporte permitem que moléculas muito grandes ou com carga entrem na membrana, uma vez que apenas moléculas pequenas e sem carga podem passar pela membrana sem o auxílio das proteínas de transporte. Isso se deve à natureza hidrofílica e hidrofóbica da membrana. As proteínas receptoras funcionam na comunicação célula a célula. Eles aceitam ou reconhecem o sinal químico de entrada de outras células. E as enzimas da membrana funcionam como quaisquer outras enzimas, pois reduzem a energia de ativação das reações químicas.

Também pode haver moléculas de carboidratos ligadas às moléculas de proteínas ou lipídios da membrana plasmática. Esses carboidratos auxiliam no reconhecimento celular e nas funções de sinalização celular. Existem também moléculas de colesterol na membrana que determinam o grau de fluidez da membrana.

São as proteínas, lipídios e carboidratos mencionados acima que conferem à membrana suas propriedades químicas e, portanto, determinam a função da membrana plasmática que é a regulação do que entra e sai da célula.


O que as membranas fazem?

As membranas celulares funcionam como barreiras e guardiões. Eles são semipermeáveis, o que significa que algumas moléculas podem se difundir através da bicamada lipídica, mas outras não. Pequenas moléculas hidrofóbicas e gases como oxigênio e dióxido de carbono atravessam as membranas rapidamente. Pequenas moléculas polares, como água e etanol, também podem passar pelas membranas, mas o fazem mais lentamente. Por outro lado, as membranas celulares restringem a difusão de moléculas altamente carregadas, como íons, e moléculas grandes, como açúcares e aminoácidos. A passagem dessas moléculas depende de proteínas de transporte específicas embutidas na membrana.

Figura 3: Transporte seletivo Proteínas especializadas na membrana celular regulam a concentração de moléculas específicas dentro da célula. © 2010 Nature Education Todos os direitos reservados.

As proteínas de transporte de membrana são específicas e seletivas para as moléculas que movem e costumam usar energia para catalisar a passagem. Além disso, essas proteínas transportam alguns nutrientes contra o gradiente de concentração, o que requer energia adicional. A capacidade de manter gradientes de concentração e às vezes mover materiais contra eles é vital para a saúde e manutenção das células. Graças às barreiras de membrana e às proteínas de transporte, a célula pode acumular nutrientes em concentrações maiores do que as existentes no meio ambiente e, inversamente, descartar produtos residuais (Figura 3).

Outras proteínas transmembrana têm funções relacionadas à comunicação. Essas proteínas ligam sinais, como hormônios ou mediadores imunológicos, às suas porções extracelulares. A ligação causa uma mudança conformacional na proteína que transmite um sinal para as moléculas mensageiras intracelulares. Assim como as proteínas de transporte, as proteínas receptoras são específicas e seletivas para as moléculas às quais se ligam (Figura 4).

Figura 4: Exemplos da ação de proteínas transmembrana Os transportadores carregam uma molécula (como a glicose) de um lado para o outro da membrana plasmática. Os receptores podem se ligar a uma molécula extracelular (triângulo), e isso ativa um processo intracelular. As enzimas da membrana podem fazer a mesma coisa que fazem no citoplasma de uma célula: transformar uma molécula em outra forma. Proteínas âncora podem ligar fisicamente estruturas intracelulares com estruturas extracelulares. © 2010 Nature Education Todos os direitos reservados.

Proteínas de membrana periférica estão associados à membrana, mas não são inseridos na bicamada. Em vez disso, geralmente estão ligados a outras proteínas da membrana. Algumas proteínas periféricas formam uma rede filamentosa logo abaixo da membrana que fornece locais de fixação para proteínas transmembrana. Outras proteínas periféricas são secretadas pela célula e formam uma matriz extracelular que funciona no reconhecimento celular.


CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS

Estudos recentes revelaram que a produção da parede celular depende de uma interação próxima entre a membrana plasmática e o citoesqueleto subjacente nas plantas. O nexo parede celular, membrana plasmática e citoesqueleto pode ser mediado por uma única proteína ponte ou por várias proteínas que formam uma estrutura de suporte ou que podem participar de vias de sinalização. No entanto, os papéis das proteínas candidatas já identificadas não são esclarecidos e mais estudos neste campo são necessários. Pode-se antecipar que a proteômica de ponta ajudará na identificação de proteínas adicionais que ligam o citoesqueleto e a membrana plasmática e que em vitro e na Vivo trabalhos usando técnicas de biologia celular de ponta revelarão suas funções. Esses dados devem avançar significativamente em nossa compreensão de como o citoesqueleto é amarrado à membrana plasmática e provavelmente revelarão insights sobre as diferenças nos arranjos do citoesqueleto em comparação com as células de levedura e animais.


O comportamento da membrana plasmática durante a plasmólise: um estudo por microscopia UV

Um microscópio de campo claro ultravioleta (UV) de alta resolução foi usado para analisar a formação de filamentos Hechtianos e a reticulação Hechtiana que permanecem presos à parede celular após a plasmólise e deplasmólise das células epidérmicas internas da cebola. Em imagens de vídeo em tempo real, a microscopia UV permitiu uma investigação detalhada do comportamento dinâmico da membrana plasmática durante os processos de perda e absorção osmótica de água. Além disso, o papel dos elementos do citoesqueleto como possíveis ligantes da membrana plasmática à parede celular foi investigado pela aplicação de drogas do citoesqueleto durante a plasmólise. Os microtúbulos foram despolimerizados em orizalina e a latrunculina B foi usada para desestabilizar os microfilamentos de actina. Os resultados não mostraram mudanças visíveis na formação da reticulação Hechtiana ou fios. As formas de plasmólise pareciam normais, indicando fortes ligações membrana a parede, independentemente dos elementos do citoesqueleto. Durante a reexpansão do protoplasto na deplasmólise, a membrana plasmática incorporou filamentos e subprotoplastos Hechtianos, fundidos com a reticulação Hechtiana e finalmente realinhada na parede celular.


Proteínas da membrana plasmática e fixação do citoesqueleto - Biologia

As proteínas do citoesqueleto são proteínas que compõem o citoesqueleto, flagelos ou cílios das células. Geralmente, as proteínas do citoesqueleto são polímeros e incluem tubulina (o componente proteico dos microtúbulos), actina (o componente dos microfilamentos) e lamina (o componente dos filamentos intermediários. O citoesqueleto é uma estrutura tridimensional dinâmica que preenche o citoplasma e é presente em células eucarióticas e procarióticas. O citoesqueleto atua como músculo e esqueleto e desempenha um papel na proteção celular, motilidade celular (migração), citocinese, transporte intracelular, divisão celular e organização das organelas dentro da célula.

Conexões citoesqueléticas

Os elementos do citoesqueleto não são independentes. Diferentes filamentos estão conectados uns aos outros e à superfície da célula. As proteínas motoras, que não apenas se conectam ao citoesqueleto, mas também impulsionam os filamentos para cima e para baixo, são um caso especial. As células rastejantes precisam se anexar a superfícies, os tecidos em organismos multicelulares devem estar ligados uns aos outros e é obviamente importante conectar o citoesqueleto aos locais de fixação. Várias proteínas são responsáveis ​​por conectar o citoesqueleto de actina à membrana plasmática. O sistema mais bem caracterizado está nos glóbulos vermelhos (eritrócitos), que precisam manter uma grande área de superfície para a troca gasosa máxima, mas permanecem flexíveis o suficiente para viajar através dos capilares. A forma bicôncava característica é gerada usando a tensão de uma rede de F-actina, ligada à membrana por meio de grandes complexos de várias proteínas. Duas proteínas, banda III e glicoforina, são proteínas integrais que abrangem a membrana e unem os complexos à própria membrana. A actina é ligada por uma grande proteína chamada espectrina, que por sua vez é conectada à banda III através da anquirina e à glicoforina. O resultado líquido é uma matriz compacta reticulada de proteínas conectando vários filamentos de actina a toda a área da membrana.

Figura 1. O citoesqueleto. Os filamentos de actina são mostrados em vermelho, os microtúbulos em verde e os núcleos em azul.

Proteínas do citoesqueleto e doenças

Uma vez que o citoesqueleto é fundamental para a vida das células, não é surpreendente descobrir que é altamente relevante para a medicina moderna. Vários patógenos (por exemplo, a bactéria Shigella e o vírus Vaccinia) fazem uso do citoesqueleto do hospedeiro para entrar e infectar células vizinhas. Outros organismos (por exemplo, o cogumelo venenoso Amanita phalloides e o açafrão dos prados Colchicum) produzem toxinas que interferem em aspectos particulares da função citoesquelética. Por outro lado, um número crescente de medicamentos atua atacando o citoesqueleto de células causadoras de doenças, por exemplo, paclitaxel para câncer e fluconazol para infecções fúngicas.

1. Fuchs E. O citoesqueleto e a doença: distúrbios genéticos dos filamentos intermediários. Revisão Anual da Genética, 1996, 30: 197 e ndash231.

2. Desai A. Dinâmica de polimerização de microtúbulos. Revisão Anual da Biologia Celular e de Desenvolvimento, 1998, 13: 83 e ndash117.


Proteínas envolvidas na fixação da actina à membrana plasmática

As proteínas que podem estar envolvidas em dois tipos de associação actina-membrana são discutidas. O primeiro conjunto inclui α-actinina, vinculina, fimbrina e uma nova proteína do citoesqueleto que estão todas concentradas em placas de adesão, aquelas regiões de fibroblastos cultivados onde feixes de microfilamentos de actina terminam e onde a membrana plasmática se aproxima do substrato subjacente. As propriedades da α-actinina não muscular sugerem que ela funciona para reticular os filamentos de actina e, assim, estabilizar os feixes de microfilamentos em vez de funcionar em sua fixação à membrana. A fimbrina também parece estar envolvida no agrupamento de filamentos, e não no apego. Em contraste, a vinculina se liga às extremidades dos filamentos de actina em vitro e é provavelmente o melhor candidato para um papel na fixação da actina às membranas na placa de adesão. A descoberta de uma nova proteína, 215k, de função desconhecida, na placa de adesão sugere que muito mais proteínas ainda precisam ser identificadas nessa região. A ligação de filamentos de actina a outras regiões da membrana plasmática também é considerada e é descrita uma proteína que parece ser homóloga da espectrina no cérebro e em outros tecidos. A proteína do cérebro se assemelha à espectrina eritrocitária em suas propriedades físicas, na ligação da actina, em estar associada às membranas celulares e na reação cruzada imunologicamente. Sugerimos que a proteína do cérebro e a espectrina eritrocitária pertencem a uma família de proteínas relacionadas (as espectrinas) que funcionam na fixação da actina às membranas em muitos tipos de células diferentes.


MATERIAIS E MÉTODOS

Anticorpos

O anticorpo anti-TTLL4 foi criado em porquinhos-da-índia imunizados com a glutationa S-transferase (GST) - domínio C-terminal fundido de TTLL4 (TTLL4 C′50AA). O anticorpo policlonal anti-Ttll4 foi purificado usando uma coluna preenchida com o domínio C-terminal TTLL4 marcado com GST (TTLL4 C′50AA). O anticorpo anti-TTLL4 fracionado foi posteriormente pré-depurado contra lisados ​​de tecido TTLL4 KO. O mAb 4A8 para NAP1 foi um gentil presente de Yukio Ishimi (Universidade de Ibaraki, Mito, Japão). Outros anticorpos usados ​​neste estudo foram os seguintes: poliglutamilação (mAb de camundongo GT335 AG-20B-0020-C100 AdipoGen, San Diego, CA) NAP1LI (policlonal de coelho ab33076 Abcam, Cambridge, Reino Unido) glicoforina A (mAb de camundongo ab129024 Abcam) carbônico anidrase1 (ab86280 Abcam policlonal de coelho) tropomiosina (ab7785 Abcam monoclonal de camundongo) tropomodulina1 (ab119025 Abcam monoclonal de camundongo) α-aducina (policlonal de coelho A303-713A Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) β-adducina (B741A policlonal de coelho B741A30) β74130 (TX) Alexa Fluor 488 anti-rato TER-119 / anticorpo de células eritróides 116215 BioLegend, San Diego, CA) actina (policlonal de coelho A2066 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) espectrina de cadeia β (coelho policlonal ABT185 Millipore, Billerica, MA) , Anticorpos secundários conjugados com fluoróforo Alexa para imunofluorescência (Invitrogen, Carlsbad, CA) e anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano para análise de Western blot (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA).

Todos os experimentos e tratamentos em camundongos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais Institucionais da Escola de Medicina da Universidade de Hamamatsu. Ttll4 camundongos capturados com alelo foram adquiridos da Trans Genic (Kobe, Japão) e acasalados com camundongos C57BL / 6J de tipo selvagem por pelo menos 10 gerações. Ttll4/−, Ttll4 + /-, e irmãos de ninhada de tipo selvagem foram obtidos a partir de acasalamento heterozigótico. Camundongos de 8 a 12 meses de idade, independentemente do sexo, a menos que especificado de outra forma, foram usados ​​para cada experimento. A medula óssea e o baço foram dissecados de C57BL / 6J adulto de tipo selvagem e Ttll4- / - ratos. Os órgãos foram homogeneizados em tampão de lise (Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, Triton X-100 a 1%). Para o modelo de anemia hemolítica, adulto C57BL / 6J e Ttll4- / - camundongos foram injetados com 20 mg / kg de PHZ (Sigma-Aldrich 114715) a cada 24 horas por dois dias consecutivos. Os camundongos foram mortos 48 h após a injeção e os parâmetros hematológicos foram analisados.

Genotipagem de progênies por PCR

O DNA genômico foi preparado a partir de amostras de cauda de 4 a 5 mm e, em seguida, utilizado para genotipagem por PCR. Os oligonucleotídeos usados ​​foram 5′-TTCTGTAGCTGGGCTTATT-3 ′ como o iniciador direto para o alelo de tipo selvagem, 5′-AATCCCATGGTCCCACAAA-3 ′ como o iniciador direto para o vetor de armadilha e 5′-CGGTGAAACCTCGACACA-3 ′ como o iniciador reverso para ambos os alelos do tipo selvagem e capturados.

PCR de transcrição reversa

O RNA total foi extraído dos testículos e tecidos musculares. Em seguida, 1 µg de RNA por amostra foi transcrito reversamente em cDNA com RTace (Toyobo, Osaka, Japão) e iniciador oligoT15. O cDNA resultante foi amplificado com iniciadores específicos para Ttll4: para a frente, 5′-TATC TCGGAACTGTGTGGATTTGA-3 ′, e reverso, 5′-GAATGACCTGAATGCCAATGC-3 ′ e AmpliTaq Gold.

Coleta de sangue e análises hematológicas

Sangue total (200 μl) de adulto Ttll4-KO e C57BL / 6J de tipo selvagem foram coletados por punção cardíaca ou da veia da cauda para tubos Eppendorf contendo 2 μl de EDTA a 10% ou tubos capilares heparinizados. As contagens e índices de RBC foram medidos por um analisador hematológico automatizado (Celltac α Nihon Kohden, Tóquio, Japão) calibrado para sangue de camundongo. Para a coloração de Giemsa, esfregaços de sangue total foram secos ao ar, fixados em metanol e corados com Giemsa. As contagens de sangue periférico também foram determinadas pela diluição de hemácias em fluido diluente de hemácias (citrato de sódio a 3%, formalina a 1%) e, em seguida, por contagem manual usando um hemocitômetro. Os reticulócitos foram contados manualmente após a coloração com novo azul de metileno (Sigma-Aldrich). As imagens foram adquiridas com um microscópio Olympus BX51 equipado com uma câmera Olympus DP-72 (Tóquio, Japão).

Fragilidade osmótica e análise de deformabilidade

A fragilidade osmótica foi medida pelo método de Gilligan et al. (1999). O sangue total foi lavado três vezes em tampão isotônico e o hematócrito final foi ajustado para 5%. RBCs diluídos em um volume de 10 µl foram adicionados a 290 µl de tampão de lise de concentração de sal apropriada e incubados por 20 min em temperatura ambiente. A suspensão de RBC lisada foi então centrifugada e a absorvância do sobrenadante foi medida a 540 nm. Para medir a deformabilidade, 30 µl de sangue total foram misturados com 4 ml de solução de polivinilpirrolidona a 3,5%, e o índice de deformabilidade foi registrado aumentando a tensão aplicada de 0 a 50 dinas / cm 2 usando um ectacitômetro customizado.

Purificação e preparação de RBC

Usamos três métodos diferentes para purificar RBCs. RBCs foram peletizados a 600 × g por 10 min a 4 ° C. Após a remoção do plasma e da camada celular superior, incluindo a camada leucocitária, as células foram lavadas seis vezes em tampão de lavagem de RBC (ácido etilenoglicol tetraacético 5 mM [EGTA], NaCl 0,25%, Na 5,0 mM2HPO4, pH 7,5). Em segundo lugar, para purificação por FACS, o sangue total foi lavado uma vez com PBS e, em seguida, 10 µl de sangue foram ressuspensos em tampão FACS (PBS, 0,5% de albumina de soro bovino [BSA], 1 mM de EGTA, pH 7,5). A suspensão de células foi corada com anticorpo conjugado a TER-119 Alexa 488 e, em seguida, lavada com PBS. RBCs corados foram classificados em um BD FACSAria (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e fechados com base em seus sinais de dispersão lateral, sinais de dispersão direta e coloração positiva com TER-119 Alexa-488. Os dados foram analisados ​​usando o software FlowJo-V10. Terceiro, um gradiente descontínuo de 75% e 76,9% de Percoll (Sigma-Aldrich) foi usado para separar os eritrócitos.

Preparação de membranas RBC

Para fracionar os componentes solúveis e de membrana de RBCs, RBCs lavados foram lisados ​​com tampão hipotônico (20 mM Tris-Cl, 1 mM EGTA, pH 7,5), e o sobrenadante foi separado por centrifugação. Em seguida, o pellet celular foi lavado repetidamente para remover todo o conteúdo citoplasmático, e o pellet final consistindo de fantasmas de membrana de RBC foi lisado diretamente em tampão de amostra SDS-PAGE, tampão de lise NP-40 ou tampão RIPA. Os fantasmas de membrana de Mg 2+ e esqueletos insolúveis em Triton foram preparados conforme descrito anteriormente (Moyer et al., 2010). As concentrações de proteína foram medidas usando o ensaio BCA (Pierce, Rockford, IL). Para determinar a afinidade de ligação de NAP1 glutamilada e não glutamilada com a membrana de RBC, os fantasmas da membrana Mg 2+ foram tratados com concentrações crescentes (110, 210 e 310 mM) de KCl em um meio de tampão de lise (50 mM 4- (2- ácido hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfônico, MgCl 1 mM2, EGTA 1 mM, ditiotreitol 1 mM, Triton X-100 a 0,2%, glicerol a 10%, pH 7,5) por 1,0 h e depois centrifugado a 20.000 × g por 30 min a 4 ° C. Após a centrifugação, o sobrenadante foi coletado e o pellet restante foi diretamente lisado em tampão de amostra SDS-PAGE.

Ensaio de imunoprecipitação

Para imunoprecipitar proteínas glutamiladas, o mAb GT335 (Adipogen) foi ligado a grânulos de proteína G Sepharose (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Para imunoprecipitação de NAP1LI, o anticorpo anti-NAP1L1 (Abcam) foi ligado a pérolas de proteína G. Todo o lisado de RBC foi adicionado às contas e incubado durante a noite a 4 ° C. As proteínas ligadas foram eluídas diretamente no tampão de amostra SDS-PAGE.

Imunoblotting e imunofluorescência

SDS – PAGE foi realizado conforme descrito por Laemmli (1970). Buffer de corrida de Fairbanks (Fairbanks et al., 1971) foi usado para separar a anquirina das espectrinas. Os géis foram corados com azul Coomassie ou transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore) para imunotransferência. As membranas foram sondadas com vários anticorpos primários, seguidos por anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. Os blots foram desenvolvidos com reagentes quimioluminescentes aprimorados (ECL GE Healthcare) e expostos em uma Fuji Film Intelligent Dark Box (Tóquio, Japão), onde as imagens foram capturadas com o software Image Reader LAS-3000. Para imunohistoquímica, as amostras de RBC foram lavadas três vezes com PBS (330 mOsm) contendo glicose 5 mM, fixadas por 20 min em paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 0,02% em PBS à temperatura ambiente, e enxaguadas três vezes em tampão de lavagem (PBS contendo 0,1 M glicina). As células fixadas foram então permeabilizadas com PBS contendo 0,1 M de glicina e 0,1% de Triton X-100 por 5 min em temperatura ambiente e novamente enxaguadas três vezes em PBS contendo 0,1 M de glicina. Para garantir a neutralização completa dos aldeídos que não reagiram, os RBCs foram então incubados em tampão de lavagem em temperatura ambiente por 1,5 h. A ligação não específica foi bloqueada por incubação em tampão de bloqueio (PBS contendo 0,05 mM de glicina, 0,2% de BSA e 5% de soro de cabra) durante a noite a 4 ° C. Após a imunocoloração, os RBCs foram fixados em lamínulas de vidro por 20 min em uma câmara umidificada e montados em lâminas de vidro usando meio de montagem Vectashield para fluorescência (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e observados por microscopia confocal de varredura a laser (FluoView FV1000 Olympus).

Estudos de ultraestrutura

Para SEM, o sangue total foi fixado com glutaraldeído a 2% em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,4, e pós-fixado em OsO a 1%4. Em seguida, as células fixadas foram desidratadas, liofilizadas e revestidas com plasma. As células foram fotografadas usando um microscópio eletrônico de varredura Hitachi S-4800. Para TEM do esqueleto da membrana RBC, grades de cobre de 400 mesh (Nisshin-EM, Tóquio, Japão) foram revestidas com 0,5% (peso / vol) de Formvar em dicloreto de etileno (Davison e Colquhoun, 1985) e, em seguida, foram revestidas com carbono e submetido a descarga cintilante (HDT-400 Hydrophilic Treatment Device JEOL Datum, Tóquio, Japão). As células sanguíneas coletadas foram lavadas com PBS contendo Mg e EGTA (Pi / NaCl / Mg 150 mM NaCl, 5 mM NaH2PO4, 2 mM NaN3, 2 mM MgCl2, EGTA 1 mM, pH 5,5). RBCs lavados foram então revestidos nas grades conforme descrito por Byers e Branton (1985). Digno de nota, o protocolo de Byers e Branton (1985) é para espalhar o esqueleto de RBC na grade, no entanto, nossos resultados (Figura 3A) indicam que as membranas de RBC não se espalharam e permaneceram no tamanho de RBC nativo de camundongo. Imagens TEM de membranas de RBC foram obtidas usando um microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM-1220 com uma tensão de aceleração de 80 kV e equipado com uma câmera Gatan-Bioscan, Modelo 792 (Pleasanton, CA).


Assista o vídeo: CLASIFICACIÓN de las proteínas TRANSPORTADORAS de membrana (Agosto 2022).