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Relação de proteínas de ligação a RNA para peptidil-prolil cis-trans isomerase

Relação de proteínas de ligação a RNA para peptidil-prolil cis-trans isomerase



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Estou estudando um Plasmodium gene, conhecido por codificar uma proteína de ligação a RNA. No entanto, uma pesquisa BLAST traz principalmente peptidil-prolil cis-trans isomerases de outras espécies. Por que isso seria assim?


Sem ver a sequência da proteína de ligação ao RNA, é impossível ter certeza, mas a conclusão óbvia é:

A proteína de ligação ao RNA é um peptidil-prolil cis-trans isomerase.

É conhecido desde 1989 que o peptidil-prolil cis-trans isomerase é uma proteína de função múltipla, também exibindo propriedades do ciclofilinas, proteínas que se ligam à ciclosporina A. O post levantou a possibilidade de que ela possa ter outras atividades e uma pesquisa na literatura revela vários trabalhos mais recentes que indicam que a cilcofilina A pode se ligar a certos RNAs. Eu listo alguns dos títulos:

Ciclofilina nuclear de ligação a RNA em células T humanas (1996) FEBS Letters 398 201-205

Clonagem molecular, estrutura e expressão de um novo gene semelhante à ciclofilina de ligação a RNA nuclear (PPIL4) de cérebro fetal humano (2001) Cytogenet Cell Genet 95 43-47

A ciclofilina A se liga ao RNA viral e às proteínas de replicação, resultando na inibição da montagem da réplica do tombusviral (2013) J. Virol. 87 13330-13342

Estrutura da proteína semelhante à Ciclofilina A que interage com o RNA de Piriformospora indica que fornece tolerância ao estresse salino em plantas (2013) Relatórios Científicos 3 : 3001, DOI: 10.1038 / srep03001


Isolamento e caracterização de proteína de conotoxina de Conus inscriptus e sua atividade anticâncer potencial contra o câncer cervical (associado a HeLa-HPV 16) linhas celulares

Os caracóis marinhos são fontes abundantes de conopeptídeos biologicamente importantes com suas aplicações potenciais no desenvolvimento de drogas. O presente estudo teve como objetivo identificar os potenciais conopeptídeos do ducto do veneno de Conus inscriptus. Após a extração, os conopeptídeos foram caracterizados por cromatografia líquida - análise de espectrometria de massa mostrando um total de 29 sequências de proteínas com ligações dissulfeto de diferentes massas moleculares distribuídas na faixa de 387–1536 m / z e os peptídeos mostrando principalmente a superfamília T de conotoxinas com calor de 78 kDa proteínas de choque. Os peptídeos de veneno apresentaram seis bandas de peso molecular diferentes (37, 51, 60, 70, 80 e 90 kDa) acima de 30 kDa após digestão enzimática em gel. Além disso, os conopeptídeos exibem potencial atividade citotóxica contra HeLa-HPV 16 associado, linhagens celulares Vero (normais) e artêmia. A análise de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier confirma os grupos estruturais e funcionais. Os resultados observados sugerem que os peptídeos de veneno de C. inscriptus como um potencial agente anticâncer.

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Resumo

Os proteomas expressos a 4 ° C e 18 ° C pela bactéria psicrofílica antártica Pseudoalteromonas haloplanktis foram comparados usando eletroforese em gel bidimensional diferencial, mostrando que tradução, dobramento de proteínas, integridade de membrana e atividades antioxidantes são reguladas positivamente a 4 ° C. Esta análise proteômica revelou que o fator desencadeante é a principal proteína regulada positivamente em baixa temperatura. O fator desencadeador é o primeiro chaperone molecular interagindo com virtualmente todos os polipeptídeos recentemente sintetizados no ribossomo e também possui um peptidil-prolil cis-trans atividade de isomerase. Isso sugere que o enovelamento de proteínas em baixas temperaturas é uma etapa limitante da taxa para o crescimento bacteriano em ambientes frios. É proposto que o fator desencadeante psicrofílico resgata a função chaperona, pois tanto DnaK quanto GroEL (as principais chaperonas bacterianas, mas também proteínas de choque térmico) são regulados para baixo a 4 ° C. O fator desencadeador psicrofílico recombinante é um monômero que exibe estabilidade conformacional incomumente baixa com um Tm valor de 33 ° C, sugerindo que a função chaperona essencial requer flexibilidade e dinâmica consideráveis ​​para compensar a redução dos movimentos moleculares em temperaturas de congelamento. Sua atividade chaperona é fortemente dependente da temperatura e requer temperatura próxima de zero para se ligar de forma estável a um polipeptídeo desdobrado de modelo.


Resultados

Treinamento do classificador ensemble EffectorP 2.0

EffectorP 1.0 é um classificador Naïve Bayes que foi treinado em um conjunto de treinamento positivo de 58 efetores de fungos com suporte experimental de 16 espécies de fungos. Desde o seu desenvolvimento, foram descritos efetores fúngicos adicionais e, para o EffectorP 2.0, usamos um conjunto de treinamento expandido de 94 efetores fúngicos secretados de 23 espécies (Tabela 1). O EffectorP 1.0 prevê 73% dos efetores invisíveis corretamente, o que demonstra sua capacidade de identificar novos efetores, mas também deixa espaço para melhorias. Começamos a investigar se o novo treinamento de EffectorP melhoraria a precisão da previsão.

Espécies Efetora
Melampsora lini AvrM, AvrL567-A, AvrP123, AvrP4, AvrM14, AvrL2-A
Uromyces fabae RTP1
Puccinia graminis f. sp. tritici PGTAUSPE-10-1, AvrSr50
Puccinia striiformis f. sp. tritici PstSCR1, Pec6
Phakopsora pachyrhizi PpEC23
Blumeria graminis f. sp. Hordei Avrk1, Avra1, Avra13
Blumeria graminis f. sp. tritici AvrPm2
Cladosporium fulvum Avr9, Avr4, Avr4E, Avr2, Avr5, Ecp1, Ecp2, Ecp4, Ecp5, Ecp6
Leptosphaeria maculans AvrLm6, AvrLm4–7, AvrLm1, AvrLm11
Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici Seis4, Seis3, Seis1, Seis6, Seis2, Seis5, Seis7, Seis8
Magnaporthe oryzae Avr-Pita, Pwl1, Avr-Pia, Bas3, Bas2, Bas4, Bas1, MC69, AvrPiz-t, Avr1-CO39, Avr-Pii, Avr-Pik, Bas107, AvrPib, Iug6, Iug9, Msp1, MoHEG13, MoCDIP1, MoCDIP2, MoCDIP3, MoCDIP4, MoCDIP5, SPD2, SPD4, SPD7, SPD9, SPD10, Bas162, AvrPi9
Rhynchosporium secalis NIP1, NIP2, NIP3
Verticillium dahliae Vdlsc1, Ave1, VdSCP7, PevD1
Ustilago Maydis Cmu1, Pep1, Pit2, Tin2, eff1-1, Veja 1
Ustilago hordei UhAvr1
Stagonospora nodorum ToxA, Tox1, Tox3
Botrytis cinerea Nep1
Pyrenophora tritici-repentis ToxB
Laccaria bicolor MiSSP7
Zymoseptoria tritici AvrStb6, Zt6
Colletotrichum graminicola CgEP1, Cgfl
Fusarium graminearum FGL1
Sclerotinia sclerotiorum SsSSVP1
  • Noventa e quatro efetores fúngicos foram coletados da literatura se tivessem suporte experimental e não compartilhassem a homologia de sequência. Os efetores que não faziam parte do conjunto de treinamento EffectorP 1.0 estão marcados em negrito. Todas as sequências estão disponíveis em: http://effectorp.csiro.au/data.html.

EffectorP 1.0 foi treinado em um conjunto negativo consistindo de proteínas secretadas previstas da mesma espécie de patógeno que os efetores conhecidos. Assim, o conjunto de treinamento negativo inclui tanto os efetores não descobertos quanto os não-efetores e, portanto, apresenta um problema de classificação de dados não rotulados. Embora os classificadores Naïve Bayes sejam bastante robustos para classificação de dados não rotulados e possam tolerar dados ruidosos (Bing et al., 2007), outros classificadores de aprendizado de máquina podem não ser capazes de aprender efetivamente com esses conjuntos. Para melhorar as previsões, coletamos três subconjuntos diferentes de dados de treinamento negativos que são menos prováveis ​​de conter instâncias positivas, ou seja, efetores fúngicos. Em primeiro lugar, os secretomas foram previstos da mesma espécie de patógeno / simbionte fúngica usada no conjunto positivo se eles tivessem um conjunto de genes previstos disponível publicamente (Tabela 1). O secretoma combinado foi reduzido em homologia e isso resultou em um secretoma de patógeno predito filtrado de 11.277 proteínas. Este conjunto conterá efetores não descobertos e não efetores segregados, o que representa um desafio para classificadores de aprendizado de máquina que tradicionalmente aprendem com dados rotulados. Portanto, aplicamos EffectorP 1.0 para excluir efetores previstos dos secretomas (n = 6138). Este procedimento removeu proteínas ricas em cisteína predominantemente pequenas do conjunto de treinamento negativo (comprimento médio da sequência, conteúdo médio de cisteína de 137 aminoácidos, 3,55%). Também coletamos conjuntos de proteínas fúngicas secretadas com homologia reduzida de fungos não patogênicos em plantas, ou seja, de 27 secretomas saprófitas (n = 12 939) e de 10 secretomes de fungos patogênicos para animais (n = 2763). Esses conjuntos são menos propensos a conter efetores fitopatogênicos e não foram filtrados para efetores previstos pelo EffectorP 1.0.

Como temos grandes quantidades de dados de treinamento negativos (n = 21 840), usamos uma abordagem de aprendizagem de conjunto de classificadores, cada um tendo um subconjunto diferente de dados de treinamento negativos e, portanto, fornecendo uma visão diferente sobre a classificação (Fig. 1). No geral, escolhemos um total de 50 modelos de melhor desempenho compreendendo: 10 classificadores Naïve Bayes e 10 árvores de decisão C4.5 que discriminam entre efetores fúngicos e proteínas patogênicas secretadas 10 classificadores Naïve Bayes e 10 árvores de decisão C4.5 que discriminam entre efetores fúngicos e proteínas saprófitas secretadas e cinco classificadores Naïve Bayes e cinco árvores de decisão C4.5 que discriminam entre efetores de fungos e proteínas de patógenos animais secretadas. Na validação cruzada de 10 vezes, os classificadores Naïve Bayes alcançam, em média, alta sensibilidade, enquanto as árvores de decisão C4.5 mostram alta especificidade (Tabela S2, consulte as Informações de Apoio). Para gerar o EffectorP 2.0, combinamos esses 50 modelos em um classificador de conjunto para utilizar suas forças de predição distintas (Fig. 1). Cada modelo viu um subconjunto diferente de dados de treinamento negativos e, para uma determinada entrada de sequência de proteína, retorna uma probabilidade de ser um efetor ou um não efetor. O EffectorP 2.0 retorna uma previsão final usando uma abordagem de votação nas probabilidades previstas de cada modelo. Uma proteína é classificada como efetora se a probabilidade média para a classe 'efetora' for maior do que a probabilidade média para a classe 'não efetora'. Para cada proteína no conjunto de treinamento, EffectorP 1.0 utiliza um vetor de característica que é calculado usando frequências de aminoácidos, frequências de classe de aminoácidos, peso molecular, comprimento de sequência e carga líquida de proteína (Sperschneider et al., 1996). EffectorP 2.0 usa um vetor de recursos atualizado que inclui frequências de aminoácidos, frequências de classe de aminoácidos, peso molecular, carga líquida de proteína, grande média de hidrofobicidade, bem como as médias de exposição à superfície, propensão a desordem, hidrofobicidade, volume e propensão de interface (Tabela 2).

Fluxo de trabalho para o classificador EffectorP 2.0 que combina um conjunto de classificadores de aprendizado de máquina. Cada classificador Ceu viu um subconjunto diferente de dados de treinamento negativos e prevê efetuadores em dados invisíveis com probabilidade Peu. As probabilidades são combinadas em uma votação geral sobre se uma proteína invisível é efetora ou não efetora.

Recursos usados ​​no treinamento e classificação Método
Frequências de aminoácidos (A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y) na sequência pepstats (arroz et al., 2000 )
Frequências de classes de aminoácidos na sequência:
Minúsculo (A + C + G + S + T)
Pequeno (A + B + C + D + G + N + P + S + T + V)
Alifático (I + L + V)
Aromático (F + H + W + Y)
Não polar (A + C + F + G + I + L + M + P + V + W + Y)
Polar (D + E + H + K + N + Q + R + S + T + Z)
Carregado (B + D + E + H + K + R + Z)
Básico (H + K + R)
Ácido (B + D + E + Z)
Peso molecular
Carga líquida de proteína
Grande média de hidropaticidade (GRAVY, Kyle e Doolittle, 1982) ProtParam (Gasteiger et al., 2005 )
Média de exposição de superfície (Janin, 1979) Agrupamentos de aminoácidos e escalas retiradas do Composition Profiler (Vacic et al., 2007 )
Média de propensão à desordem (Dunker et al., 2001 )
Média de hidrofobicidade (Fauchere e Pliska, 1983)
Média de volume (Zimmerman et al., 1968 )
Média da propensão da interface (Jones e Thornton, 1997)

As características influentes para a previsão do efetor incluem o tamanho da proteína, a carga líquida da proteína, bem como os aminoácidos serina e cisteína

Para detectar as características mais discriminativas na classificação EffectorP 2.0, analisamos a distribuição das características para as proteínas empregadas no treinamento de todos os 50 modelos. Quatro características foram consideradas diferentes em um limite de significância de P & lt 10-5 na distribuição entre o conjunto de seqüência positiva (efetores) e o conjunto de seqüência negativa (proteínas rotuladas como não efetoras) (Fig. 2). As diferenças na distribuição de recursos para esses quatro recursos também foram relatadas anteriormente no modelo EffectorP 1.0 como particularmente notável (Sperschneider et al., 1996), confirmando sua importância na classificação dos efetores fúngicos. Como grupo, os efetores exibem menor peso molecular, maior porcentagem de cisteínas (C) e menor porcentagem de serinas (S) do que as proteínas do conjunto de sequência negativa. A distribuição da carga líquida da proteína para efetores ocupa uma faixa estreita em torno de neutra a ligeiramente positiva (Fig. 2). Também encontramos diferenças significativas (P & lt 0,05) na distribuição entre os efetores e o conjunto de sequência negativa para recursos adicionais (Fig. 2). Estes foram depleção em aminoácidos alifáticos, leucina (L), prolina (P), treonina (T), triptofano (W), propensão a desordem e volume, bem como enriquecimento em aminoácidos básicos, propensão de interface, glicina (G), lisina (K) e asparagina (N), para efetores. Apenas o enriquecimento no conteúdo de triptofano em efetores também foi relatado no modelo EffectorP 1.0.

As características mais influentes na predição efetora parecem ser um pequeno tamanho de proteína, baixo teor de serina, uma carga líquida de proteína em torno da faixa neutra e um alto teor de cisteína. Diferenças significantes (P & lt 0,05) na distribuição entre os efetores e a sequência negativa definida para recursos adicionais também foram observados. Estes foram depleção em aminoácidos alifáticos, leucina (L), prolina (P), treonina (T), triptofano (W), propensão a desordem e volume, bem como enriquecimento em aminoácidos básicos, propensão de interface, glicina (G), lisina (K) e asparagina (N), para efetores. Outliers extremos no gráfico de carga líquida da proteína foram removidos para maior clareza (figura completa fornecida na Fig. S3, consulte as Informações de Apoio). Todos os pontos de dados são desenhados na parte superior dos gráficos de caixa como pontos pretos. A significância entre os grupos é mostrada como colchetes horizontais e foi avaliada usando t-testes. As dobradiças inferior e superior correspondem ao primeiro e terceiro quartis e os bigodes superiores (inferiores) estendem-se da dobradiça ao maior (menor) valor que está dentro de 1,5 vezes o intervalo interquartil da dobradiça. Os dados além do final dos bigodes são discrepantes.

O aprendizado de máquina pode ser um processo de aprendizado de caixa preta em que os motivos para uma previsão individual são ocultados. No entanto, as árvores de decisão C4.5 são modelos de caixa branca e seu processo de tomada de decisão é transparente por meio da navegação ao longo dos galhos da árvore. Como exemplos, traçamos duas das 10 árvores de decisão C4.5 que discriminam entre os efetores fúngicos e as proteínas do patógeno segregadas (Figs S1 e S2, consulte as Informações de Apoio). Isso demonstra que os classificadores da árvore de decisão usam um conjunto complexo de características e não apenas as características mais discriminativas (tamanho da proteína, carga líquida da proteína, bem como os aminoácidos serina e cisteína) para a classificação efetora. Em particular, a árvore de decisão na Fig. S2 não utiliza o conteúdo de serina como um recurso na classificação e ainda atinge alta precisão de classificação. Tomados em conjunto, esta análise confirma a importância de combinações específicas de recursos, conforme encontrado anteriormente no modelo EffectorP 1.0, mas também ilustra que classificadores de aprendizado de máquina de predição de efetores fúngicos precisos dependem de um conjunto diversificado de recursos.

EffectorP 2.0 melhora a precisão da predição do efetor de fungos a partir dos secretomas

Classificadores de aprendizado de máquina podem overfit / overtrain para memorizar os dados de treinamento, o que leva a uma baixa precisão em dados invisíveis. Portanto, conjuntos de testes independentes são importantes para estimar a capacidade de previsão. Coletamos conjuntos de testes positivos e negativos independentes para avaliar o desempenho do EffectorP 2.0. Para estimar a taxa de falsos positivos, primeiro usamos proteínas de fungos, plantas e mamíferos com peptídeos de sinal previstos que não eram extracelulares [localização no retículo endoplasmático, Golgi ou membranas ou com âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI)]. Uma baixa taxa de falsos positivos nessas proteínas garante que EffectorP não está meramente prevendo a presença de um peptídeo sinal. Também usamos proteínas saprófitas secretadas, bem como proteínas fúngicas da base de PHI (Urban et al., 2007) que foram anotados como tendo um fenótipo de patogenicidade não afetado. Embora as proteínas com um fenótipo de patogenicidade não afetado não sejam necessariamente não efetoras, esperamos ver uma baixa porcentagem de efetores previstos. Um classificador simples baseado em um pequeno tamanho de proteína (≤300 aminoácidos) tem uma taxa de falsos positivos de 40,4% nesses três conjuntos. Um pequeno classificador rico em cisteína (≤300 aminoácidos ≥4 cisteínas) tem uma taxa de falsos positivos de 19%, e EffectorP 1.0 tem uma taxa de falsos positivos de 18,3%. EffectorP 2.0 tem a menor taxa de falsos positivos de 11,2% (Tabela 3). Uma combinação de EffectorP 1.0 e 2.0, em que uma proteína é um efetor previsto apenas se ambos os classificadores a rotulam como um efetor, atinge a menor taxa de falsos positivos de 9,4%.

Efetores preditos
Conjunto de dados # de proteínas EffectorP 2.0 EffectorP 1.0 EffectorP 1.0 e 2.0 Classificador de tamanho pequeno Classificador pequeno e rico em cisteína
Proteínas fúngicas secretadas por saprófitas 24 432 2865 (11.7%) 4774 (19.5%) 2444 (10%) 10 529 (43.1%) 4961 (20.3%)
Proteínas fúngicas, vegetais e de mamíferos com peptídeo sinal e localização no retículo endoplasmático, Golgi, membranas ou com âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) 2631 220 (8.4%) 294 (11.2%) 164 (6.2%) 654 (24.9%) 307 (11.7%)
Proteínas fúngicas com fenótipo de patogenicidade não afetado 938 45 (4.8%) 59 (6.3%) 36 (3.8%) 128 (13.6%) 60 (6.4%)
28 001 3130 (11.2%) 5127 (18.3%) 2644 (9.4%) 11 311 (40.4%) 5328 (19%)
Conjunto de treinamento fúngico efetor positivo 94 89 (94.7%) 80 (85.1%) 79 (84%) 88 (93.6%) 53 (56.4%)
Conjunto de teste independente de efetor fúngico 21 16 (76.2%) 16 (76.2%) 16 (76.2%) 19 (90.5%) 10 (47.6%)
Precisão 88.8% 81.7% 90.5% 59.8% 80.9%

Para avaliar as previsões de falsos negativos, também aplicamos esses preditores aos dados de treinamento de 94 efetores fúngicos (Tabela 3). O EffectorP 2.0 prevê apenas cinco dessas proteínas como não efetoras: o Phakopsora pachyrhizi efetor PpEC23, o Blumeria graminis f. sp. Hordei efetor Avrk1, o Magnaporthe Oryzae efetor MoCDIP2, o Ustilago Maydis efetor ef1-1 e o Colletotrichum graminicola Cgfl efetor de metaloproteinase. Esta é uma melhoria no EffectorP 1.0, que previu corretamente apenas 80 dos 94 exemplos positivos. No entanto, também é importante avaliar o sobreajuste nos dados de treinamento e usar efetores fúngicos invisíveis, independentes do conjunto de treinamento, para a validação da taxa positiva verdadeira estimada. Portanto, coletamos 21 efetores (Tabela 4) que compartilhavam similaridade de sequência com um efetor no conjunto de treinamento e, portanto, foram eliminados na etapa de redução de homologia (Mg3LysM, BEC1054, BEC1011, AvrLm2) ou foram negligenciados durante as pesquisas iniciais da literatura para o treinamento do Modelo EffectorP 2.0 (SAD1, CSEP-07, CSEP-09, SIS1, CSEP0055, BEC1019, Bcg1, CSEP0105, CSEP0162, AvrLmJ1, AvrLm3, XylA, Ecp7, PIIN_08944, FGB1, AvrPm3, AvrSr35). Nesse conjunto de teste independente, tanto o EffectorP 1.0 quanto o 2.0 mostram desempenho igual e predizem corretamente 76,2% dos efetores (Tabelas 3 e 4). No conjunto total de 115 efetores, o classificador de tamanho pequeno prediz corretamente 93% dos efetores, mas o classificador pequeno e rico em cisteína prevê corretamente apenas 54,8% dos efetores. Nos conjuntos combinados de positivo e negativo, EffectorP 2.0 tem a maior precisão de 88,8% dos quatro classificadores individuais. O classificador simples baseado em um tamanho pequeno tem a menor precisão de 59,8%, principalmente por causa de sua alta taxa de falsos positivos (Tabela 3). O classificador combinado EffectorP 1.0 / 2.0 atinge a maior precisão de 90,5% devido à sua baixa taxa de falsos positivos. Embora o classificador combinado EffectorP 1.0 / 2.0 perca mais efetores do que o EffectorP 2.0 ou 1.0, é um método altamente rigoroso para a previsão de efetores em secretomas. A seguir, avaliamos as habilidades de previsão do EffectorP 1.0 em comparação com o EffectorP 2.0 em mais detalhes.

Espécies Efetora EffectorP 1.0 (probabilidade) EffectorP 2.0 (probabilidade) Classificador de tamanho pequeno Classificador pequeno e rico em cisteína
Sporisorium reilianum SAD1 Efetora (0,97) Efetora (0,621) Efetora Não efetivo
Phakopsora pachyrhizi CSEP-07 Efetora (0,608) Efetora (0,688) Efetora Efetora
CSEP-09 Efetora (0,999) Efetora (0,842) Efetora Efetora
Zymoseptoria tritici Mg3LysM Não efetivo (0,556) Não efetivo (0,561) Efetora Efetora
Blumeria graminis f. sp. Hordei BEC1054 Efetora (0,935) Efetora (0,869) Efetora Não efetivo
BEC1011 Efetora (0,974) Efetora (0,947) Efetora Não efetivo
BEC1019 Não efetivo (0,986) Não efetivo (0,551) Não efetivo Não efetivo
CSEP0055 Efetora (0,649) Efetora (0,732) Efetora Não efetivo
Bcg1 Efetora (0,971) Efetora (0,896) Efetora Não efetivo
CSEP0105 Não efetivo (0,511) Não efetivo (0,595) Efetora Efetora
CSEP0162 Efetora (0,854) Efetora (0,693) Efetora Efetora
Rhizophagus irregularis SIS1 Efetora (0,973) Efetora (0,611) Efetora Não efetivo
Leptosphaeria maculans AvrLmJ1 Efetora (0,999) Efetora (0,727) Efetora Efetora
AvrLm2 Efetora (0,764) Efetora (0,578) Efetora Efetora
AvrLm3 Efetora (1.0) Efetora (0,91) Efetora Efetora
Fusarium graminearum XylA Efetora (0,882) Efetora (0,865) Efetora Não efetivo
Cladosporium fulvum Ecp7 Efetora (0,997) Efetora (0,96) Efetora Efetora
Piriformospora indica PIIN_08944 Não efetivo (0,886) Não efetivo (0,539) Efetora Não efetivo
FGB1 Efetora (1.0) Efetora (0,929) Efetora Efetora
Blumeria graminis f. sp. tritici AvrPm3 Efetora (0,979) Efetora (0,913) Efetora Não efetivo
Puccinia graminis f. sp. tritici AvrSr35 Não efetivo (1.0) Não efetivo (0,918) Não efetivo Não efetivo

Conjuntos de proteínas induzidas por infecção são enriquecidos para efetores previstos por EffectorP 2.0

Os efetores são frequentemente induzidos durante a infecção e, portanto, o conjunto de genes diferencialmente expressos durante a infecção deve ser enriquecido para os efetores. No entanto, nem todos os genes que são expressos diferencialmente durante a infecção codificam proteínas efetoras e, portanto, conjuntos de genes expressos diferencialmente precisam ser filtrados adicionalmente para detectar efetores. Coletamos 13 conjuntos de genes da literatura que foram rotulados como contendo candidatos efetores com base em sua indução durante a infecção, bem como outros critérios (Tabela 5). Por exemplo, um estudo de Germain et al. (2011) identificou 16 candidatos a efetores de 1184 pequenos, secretados Melampsora larici-populina proteínas. Esses 16 candidatos foram selecionados com base em sua expressão em uma biblioteca de cDNA específica para haustórios e no transcriptoma de folhas de choupo infectadas com ferrugem e microdissecadas a laser, bem como seu pequeno tamanho de menos de 300 aminoácidos. Como outro exemplo, chaleiras et al. (2017) selecionou 63 Zymoseptoria tritici candidatos a efetores com base em serem induzidos durante a infecção inicial da folha do trigo, levando à transição para a fase de crescimento necrotrófico. No total, quatro dos 13 conjuntos continham candidatos a efetores induzidos por infecção que foram pré-selecionados com base em um tamanho pequeno (≤300 aminoácidos).

Conjunto de dados de expressão No. de proteínas Método Efetores preditos Efetores preditos no secretome Enriquecimento (teste exato de Fisher)
Colletotrichum higginsianum: candidatos efetores associados à biotrofia (Kleemann et al., 2012 ) 102 Tamanho pequeno 100 (98%) 845 (56.6%) & lt0.0001
Pequeno, rico em cisteína 46 (45.1%) 412 (27.6%) 0.0003
EffectorP 1.0 73 (71.6%) 490 (32.8%) & lt0.0001
EffectorP 2.0 49 (48%) 378 (25.3%) & lt0.0001
Cladosporium fulvum: in planta induziu pequenos candidatos a efetores apoplásticos secretados (Mesarich et al., 2017 ) 75 Tamanho pequeno
Pequeno, rico em cisteína 70 (93.3%) 272 (25%) & lt0.0001
EffectorP 1.0 68 (90.7%) 237 (21.8%) & lt0.0001
EffectorP 2.0 64 (85.3%) 190 (17.5%) & lt0.0001
Magnaporthe Oryzae: genes com expressão diferencial ≥50 vezes em hifas invasivas biotróficas (Mosquera et al., 2009 ) 15 Tamanho pequeno 15 (100%) 907 (55.6%) 0.0002
Pequeno, rico em cisteína 9 (60%) 500 (30.7%) 0.0221
EffectorP 1.0 14 (93.3%) 614 (37.7%) & lt0.0001
EffectorP 2.0 13 (86.7%) 489 (30%) & lt0.0001
Blumeria graminis f. sp. Hordei: Candidatos a Proteínas Efetoras Secretas (CSEPs) (Pedersen et al., 2012 ) 491 Tamanho pequeno 347 (70.7%) 426 (58.8%) & lt0.0001
Pequeno, rico em cisteína 133 (27.1%) 169 (23.3%) NS
EffectorP 1.0 274 (55.8%) 302 (41.7%) & lt0.0001
EffectorP 2.0 256 (52.1%) 276 (38.1%) & lt0.0001
Melampsora larici-populina: pequenas proteínas secretadas específicas expressas em haustórios (Petre et al., 2015 ) 24 Tamanho pequeno
Pequeno, rico em cisteína 15 (62.5%) 707 (38.8%) 0.0210
EffectorP 1.0 20 (83.3%) 780 (42.8%) & lt0.0001
EffectorP 2.0 18 (75%) 752 (41.3%) 0.0013
Melampsora larici-populina: pequenas proteínas secretadas específicas expressas durante a infecção (Germain et al., 2011) 16 Tamanho pequeno
Pequeno, rico em cisteína 10 (62.5%) 707 (38.8%) NS
EffectorP 1.0 15 (93.8%) 780 (42.8%) & lt0.0001
EffectorP 2.0 14 (87.5%) 752 (41.3%) 0.0004
Laccaria bicolor: pequenas proteínas segregadas reguladas por ectomicorriza (MiSSPs) (Martin et al., 2008 ) 21 Tamanho pequeno
Pequeno, rico em cisteína 10 (47.6%) 362 (29.2%) NS
EffectorP 1.0 11 (52.4%) 380 (30.7%) NS
EffectorP 2.0 10 (47.6%) 246 (19.9%) 0.0043
Puccinia graminis f. sp. tritici: proteínas secretadas reguladas positivamente em haustoria (log FC & gt 10) (Upadhyaya et al., 2015 ) 55 Tamanho pequeno 38 (69.1%) 1223 (64.7%) NS
Pequeno, rico em cisteína 7 (12.7%) 710 (37.6%) NS
EffectorP 1.0 25 (45.5%) 841 (44.5%) NS
EffectorP 2.0 22 (40%) 758 (40.1%) NS
Zymoseptoria tritici candidatos a efetores (Kettles et al., 2017) 63 Tamanho pequeno 56 (88.9%) 426 (42.7%) & lt0.0001
Pequeno, rico em cisteína 43 (68.3%) 259 (26%) & lt0.0001
EffectorP 1.0 41 (65.1%) 260 (26.1%) & lt0.0001
EffectorP 2.0 42 (66.7%) 232 (23.3%) & lt0.0001
Zymoseptoria tritici candidatos a efetores com fenótipo em Nicotiana benthamiana (Kettles et al., 2017) 14 Tamanho pequeno 12 (85.7%) 426 (42.7%) 0.0017
Pequeno, rico em cisteína 10 (71.4%) 259 (26%) 0.0005
EffectorP 1.0 8 (57.1%) 260 (26.1%) 0.0143
EffectorP 2.0 9 (64.3%) 232 (23.3%) 0.0014
Ustilago Maydis candidatos efetores (Tollot et al., 2016 ) 198 Tamanho pequeno 130 (65.7%) 242 (46.8%) & lt0.0001
Pequeno, rico em cisteína 49 (24.7%) 101 (19.5%) NS
EffectorP 1.0 79 (39.9%) 140 (27.1%) 0.0011
EffectorP 2.0 67 (33.8%) 124 (24%) 0.0106
Leptosphaeria maculans candidatos iniciais efetores altamente expressos (Gervais et al., 2017 ) 49 Tamanho pequeno 44 (89.9%) 514 (49.7%) & lt0.0001
Pequeno, rico em cisteína 23 (46.9%) 258 (24.9%) 0.0013
EffectorP 1.0 29 (59.2%) 283 (27.3%) & lt0.0001
EffectorP 2.0 26 (53.1%) 215 (20.8%) & lt0.0001
Leptosphaeria maculans candidatos efetores tardios altamente expressos (Gervais et al., 2017 ) 50 Tamanho pequeno 33 (66%) 514 (49.7%) 0.0292
Pequeno, rico em cisteína 16 (32%) 258 (24.9%) NS
EffectorP 1.0 19 (38%) 283 (27.3%) NS
EffectorP 2.0 19 (38%) 215 (20.8%) 0.0073
  • Para cada conjunto de dados de expressão, a porcentagem de candidatos efetores previstos por EffectorP é mostrada e comparada com a porcentagem de candidatos efetores previstos no secretome. O classificador de tamanho pequeno só é aplicado a conjuntos que não são pré-selecionados com base em um tamanho pequeno.

Avaliamos se os 13 conjuntos contendo candidatos a efetores induzidos por infecção também são enriquecidos para candidatos a efetores previstos por EffectorP 1.0 ou 2.0, por um classificador de pequeno tamanho ou por um classificador pequeno e rico em cisteína quando comparado com todo o secretomo de cada espécie. Não testamos o classificador de tamanho pequeno em conjuntos contendo candidatos a efetores que foram pré-selecionados com base em um tamanho pequeno (≤300 aminoácidos). Encontramos enriquecimentos significativos para candidatos a efetores previstos em 12 de 13 conjuntos (92,3%) usando EffectorP 2.0 (Tabela 5). Um pequeno classificador rico em cisteína retorna apenas enriquecimentos significativos para efetores previstos em sete de 13 conjuntos (53,9%) e EffectorP 1.0 em 10 de 13 conjuntos (76,9%). Um classificador de tamanho pequeno retorna enriquecimentos significativos para efetores previstos em oito dos nove conjuntos (88,9%). Surpreendentemente, não observamos enriquecimento para efetores previstos com qualquer um dos quatro classificadores em proteínas secretadas de P. graminis f. sp. tritici altamente regulado em haustórios em comparação com esporos germinados (Tabela 5). Isso pode indicar que as ferrugens podem utilizar proteínas efetoras não descobertas com propriedades diferentes para o conjunto de treinamento, como efetores de tamanho maior. Isso é apoiado pela recente descoberta de AvrSr35, um 578-aminoácido P. graminis f. sp. tritici proteína efetora (Salcedo et al., 2005). Alternativamente, os secretomas haustorial podem conter muitos não-efetores, como proteínas envolvidas na sinalização ou na incorporação de nutrientes do hospedeiro (Garnica et al., 2005). Tomados em conjunto, embora a função efetora não tenha sido estabelecida para todos os genes nesses conjuntos candidatos, o enriquecimento para efetores previstos em conjuntos induzidos por infecção sublinha a capacidade do EffectorP 2.0 de predizer com precisão efetores invisíveis.

EffectorP 2.0 reduz o número médio de efetores previstos para plantas fúngicas simbiontes e saprófitas em 40%

Testamos o EffectorP 2.0 em secretomas previstos de 93 espécies de fungos, incluindo patógenos e não patógenos (Tabela S3, consulte as informações de apoio) e registramos as porcentagens de proteínas secretadas que são efetores previstos (Tabela S4, consulte as informações de apoio). As maiores proporções de efetores previstos foram encontrados nos biotrofos obrigatórios Melampsora laricis-populina (41.3%), Puccinia graminis f. sp. tritici (40.3%), Blumeria graminis f. sp. Hordei (38,1%) e Puccinia striiformis f. sp. tritici (37,6%). Entre os patógenos fúngicos de plantas, as menores proporções de efetores previstos foram registradas para os necrotróficos. Heterobasidion annosum (10.4%), Sclerotinia sclerotiorum (13.6%), Botrytis cinerea (13,7%) e Penicillium digitatum (13,9%). Patógenos necrotróficos utilizam muitos PCWDEs secretados para superar a barreira da parede celular da planta. EffectorP prevê algumas proteínas secretadas com domínios enzimáticos como efetores, como o Fusarium graminearum xilanase XylA, que tem a capacidade de induzir necrose no trigo independente de sua atividade enzimática (Tabela 4) (Belien et al., 2011 Sella et al., 2016 Sperschneider et al., 1996). No entanto, EffectorP foi treinado em efetores que predominantemente carecem de domínios funcionais reconhecíveis e interferem nos processos do hospedeiro de maneiras diferentes dos PCWDEs que atuam na parede celular da planta. Portanto, as proporções mais baixas de efetores previstos por EffectorP em secretomes de patógenos fúngicos necrotróficos são esperadas.

Em média, o EffectorP 2.0 prediz que os secretomos de patógenos vegetais consistem em 24,9% de efetores e que os secretomos de saprófitas consistem em 11,7% de efetores (Tabelas 5 e 6). EffectorP 2.0 reduz o número médio de efetores previstos em planta fúngica simbionte e secretomes de saprófitos fúngicos em mais de 40% quando comparado com EffectorP 1.0 (Tabela 6, Fig. 3). Ambos EffectorP 2.0 e EffectorP 1.0 também predizem proporções mais baixas de efetores para patógenos fúngicos de animais do que para patógenos de plantas fúngicas (Tabela 6), sugerindo que repertórios efetores de patógenos de animais fúngicos são diferentes daqueles de suas contrapartes patogênicas de plantas. Uma exceção notável é o secretome de Enterocytozoon bieneusi, um parasita intracelular obrigatório (49 efetores previstos, 36% do secretoma previsto como efetores). Sequências encurtadas de codificação de proteínas causadas pela compactação do genoma foram relatadas em E. bieneusi (Akiyoshi et al., 2009) e pode levar a previsões de falsos positivos maiores do que o esperado. Portanto, também avaliamos as taxas de predição efetoras para pequenas proteínas secretadas (& lt300 aminoácidos) apenas. Para fitopatógenos, EffectorP 2.0 prevê que 47,8% das pequenas proteínas secretadas são efetoras, ao passo que, para plantas simbiontes e saprófitas, isso é reduzido para 29,9% e 26,3%, respectivamente. Isso sublinha que o EffectorP 2.0 não seleciona os efetores com base apenas em um tamanho pequeno. As pequenas proteínas secretadas em saprófitas são principalmente funcionalmente não caracterizadas e podem funcionar em uma variedade de processos não relacionados às interações planta-patógeno. Comparado com um pequeno classificador rico em cisteína, EffectorP 2.0 prevê proporções significativamente mais baixas de efetores para simbiontes e saprófitas de plantas, mas não para patógenos de plantas (Fig. 3). Esta falta de correlação para todos os grupos testados sublinha que EffectorP 2.0 não seleciona efetores com base em um tamanho pequeno e um alto teor de cisteína sozinho, e reflete a taxa de falsos positivos reduzida de EffectorP 2.0.

Média de efetores previstos
Secretomes EffectorP 1.0 EffectorP 2.0 % de redução nos efetores previstos (EffectorP 2.0 em comparação com EffectorP 1.0)
Patógenos de plantas 338 (29.6%) 284 (24.9%) −16.0%
Simbiontes fúngicos de plantas 305 (30.8%) 177 (17.8%) −42.0%
Patógenos fúngicos de animais 108 (20.9%) 83 (16.1%) −23.2%
Saprófitas 177 (19.5%) 106 (11.7%) −40.1%

Proporções de efetores previstos em secretomas de fungos usando EffectorP 1.0, EffectorP 2.0, um classificador de tamanho pequeno e um classificador rico em cisteína. Todos os pontos de dados são desenhados na parte superior dos gráficos de caixa como pontos pretos. A significância entre os grupos é mostrada como colchetes horizontais e foi avaliada usando t-testes (NS, não significativo *P & lt 0,05, **P & lt 0,01 e ***P & lt 0,001). As dobradiças inferior e superior correspondem ao primeiro e terceiro quartis e os bigodes superiores (inferiores) estendem-se da dobradiça ao maior (menor) valor que está dentro de 1,5 vezes o intervalo interquartil da dobradiça. Os dados além do final dos bigodes são discrepantes.

Em seguida, investigamos ainda as propriedades dos efetores que são previstos apenas por uma das versões do EffectorP, mas não pela outra, para todos os 93 secretomes (Tabela S4). Candidatos a efetores previstos apenas pelo EffectorP 2.0 são, em média, de maior comprimento de sequência (n = 2304 comprimento de sequência médio, 229 aminoácidos) do que aqueles que são apenas previstos por EffectorP 1.0 (n = 8635 comprimento de sequência médio, 138 aminoácidos) ou por ambas as versões (n = Comprimento médio de sequência de 14 128, 148 aminoácidos) (Fig. 4). Candidatos efetores previstos apenas por EffectorP 1.0 ou 2.0 são mais baixos em conteúdo de cisteína em comparação com candidatos efetores previstos por ambas as versões (Fig. 4). Em seguida, testamos o enriquecimento e o esgotamento das classes funcionais de proteínas entre os candidatos efetores previstos por EffectorP 1.0 e 2.0 de um total de 24.075 proteínas secretadas dos 21 fitopatógenos (Tabela 7). A grande maioria dos candidatos a efetores previstos por EffectorP 1.0 ou 2.0 são proteínas sem anotação funcional. No entanto, observamos que ambos os conjuntos de candidatos efetores previstos são enriquecidos por proteínas com atividade de pectato-liase, peptidil-prolil cis-trans atividade da isomerase e atividade do inibidor da endopeptidase (Tabela 7). Algumas proteínas com peptidil-prolil cis-trans A atividade da isomerase foi implicada em funcionar como fatores de virulência (Unal e Steinert, 2009). Uma ciclofilina com peptidil-prolil cistrans A atividade da isomerase funciona como um fator de patogenicidade em Puccinia triticina (Panwar et al., 2012). Os efetores previstos pelo EffectorP 2.0 são enriquecidos para proteínas envolvidas na patogênese e na resposta de defesa (Tabela 7). No entanto, os candidatos a efetores previstos para EffectorP 1.0 também são enriquecidos para proteínas que não parecem estar relacionadas com a função efetora ou com proteínas secretadas, mas sim com proteínas intracelulares (Tabela 7), e podem refletir a maior taxa de falso positivo de EffectorP 1.0, bem como a taxa de falsos positivos das ferramentas de predição de peptídeo de sinal SignalP 3.0 e TargetP.

Diferenças no comprimento da sequência (aas, aminoácidos) e conteúdo de cisteína para efetores previstos por diferentes versões de EffectorP. Todos os pontos de dados são desenhados na parte superior dos gráficos de caixa como pontos pretos. A significância entre os grupos é mostrada como colchetes horizontais e foi avaliada usando t-testes. As dobradiças inferior e superior correspondem ao primeiro e terceiro quartis e os bigodes superiores (inferiores) estendem-se da dobradiça ao maior (menor) valor que está dentro de 1,5 vezes o intervalo interquartil da dobradiça. Os dados além do final dos bigodes são discrepantes.

Conjunto de teste: EffectorP 2.0 previsto

Conjunto de referência: Proteínas patogênicas secretadas

Conjunto de teste: EffectorP 1.0 previsto

Conjunto de referência: Proteínas patogênicas secretadas


RESULTADOS

Várias proteínas de F. alocis D-62D foram aumentados em abundância durante a coinfecção de células epiteliais com P. gingivalis W83.

Porque as variações no potencial patogênico do F. alocis cepas em cocultura com P. gingivalis pode estar relacionado à abundância relativa de fatores específicos de proteínas bacterianas, examinamos o proteoma de F. alocis durante a coinfecção de células epiteliais com P. gingivalis. Como mostrado na Fig. 1, aproximadamente 20% a 30% (comparando as barras C e F com a barra G) mais proteínas foram observadas em F. alocis durante a coinfecção com P. gingivalis (P & # x0003c 0.01). diferente F. alocis ATCC 35896, a cepa D-62D expressou mais proteínas interagindo com P. gingivalis W83 do que com P. gingivalis 33277. A modulação do proteoma de F. alocis durante a coinfecção com P. gingivalis W83 mostrou um total de 490 proteínas com uma alteração na expressão de & # x0003e1 vezes em contraste com 400 proteínas que tiveram uma alteração na expressão de 0,5 vezes a 1,0 vezes.As proteínas que foram mais altamente reguladas foram classificadas como proteínas hipotéticas (13%), regulatórias (7%) e de transporte e ligação (6%) e relacionadas a processos celulares (6%) e biossíntese de aminoácidos (6%) (Fig. . 2). Várias proteínas de adesão de superfície que foram reguladas positivamente durante a coinfecção incluem proteína de adesão de colágeno, proteína de ligação de fibronectina, proteínas de repetição de ácido de ligação de cálcio e proteína de ligação de cálcio hemolisina III. Além disso, muitas proteínas hipotéticas com motivos de âncora de parede celular (HMPREF0389_1719, HMPREF0389_00599, HMPREF0389_00019, HMPREF0389_00672, HMPREF0389_1172 e HMPREF0389_1476) também foram encontradas em abundância. A proteína hipotética HMPREF0389_00967 foi altamente (6,4 vezes) regulada positivamente na coinfecção de F. alocis cepa clínica D-62D com P. gingivalis W83 (Tabela 1).

Porcentagem de proteína expressa durante a cocultura ou monocultura usando várias cepas de P. gingivalis e F. alocis. As células HeLa foram infectadas com F. alocis Cepas ATCC 35896 e D-62D (MOI de 1: 100 [10 5 células epiteliais]) em monocultura ou cocultura com P. gingivalis W83 conforme relatado anteriormente (6). A análise de marcação de massa isobárica em tandem de coculturas e monoculturas foi realizada usando Orbitrap. (*, P & # x0003c 0,01.) Barra A, P. gingivalis (33277) mais F. alocis (D-62D) versus P. gingivalis (33277) mais F. alocis (ATCC) barra B, P. gingivalis (33277) mais F. alocis (D-62D) versus P. gingivalis (W83) mais F. alocis (D-62D) bar C, P. gingivalis (33277) mais F. alocis (D-62D) versus F. alocis (D-62D) barra D, P. gingivalis (33277) mais F. alocis (ATCC) versus P. gingivalis (W83) mais F. alocis (ATCC) barra E, P. gingivalis (W83) mais F. alocis (D-62D) versus P. gingivalis (W83) mais F. alocis (ATCC) barra F, P. gingivalis (W83) mais F. alocis (D-62D) versus F. alocis (D-62D) barra G, F. alocis (D-62D).

Regulação positiva no perfil de proteoma mostrando várias classes de proteínas observadas durante a infecção de cocultura com P. gingivalis e Filifactor alocis em células epiteliais. As células HeLa foram infectadas com F. alocis Cepas ATCC 35896 e D-62D (MOI de 1: 100 [10 5 células epiteliais]) em monocultura ou cocultura com P. gingivalis W83 conforme relatado anteriormente (6). A análise de marcação de massa isobárica em tandem de coculturas e monoculturas foi realizada usando Orbitrap. o F. alocis as proteínas foram analisadas usando MASCOT, e a análise funcional foi realizada usando o banco de dados de proteoma UNIPROT. A, biossíntese de aminoácidos B, biossíntese de cofatores, grupos protéticos e portadores C, envelope celular D, processos celulares E, metabolismo intermediário central F, metabolismo de DNA G, metabolismo de energia H, metabolismo de ácidos graxos e fosfolipídios I, hipotético / não atribuído / funções J não categorizadas / desconhecidas, funções de elementos móveis e extracromossômicos K, destino de proteína L, purinas, pirimidinas, nucleosídeos e nucleotídeos M, funções regulatórias N, replicação O, transcrição P, tradução Q, transporte e ligação R, funções de transposon. Alteração da expressão da proteína & # x0003e 1 vez, n = 490 alteração da expressão da proteína & # x0003c 1 vez, n = 400.

TABELA 1

F. alocis coinfecção com P. gingivalis: abundância relativa de proteínas com motivo de parede celular

AnotaçãoNome
HMPREF0389_01580Proteína de ligação de ATP de translocação de leucotoxina
HMPREF0389_00575Proteína de ligação à fibronectina
HMPREF0389_00426Proteína de montagem do pilus tipo IV
HMPREF0389_00816Proteína de partícula de reconhecimento de sinal
HMPREF0389_01719Proteína hipotética
HMPREF0389_00599Proteína hipotética
HMPREF0389_00019Proteína hipotética
HMPREF0389_01532Proteína de repetição de ácido de ligação de cálcio
HMPREF0389_01139Proteína contendo domínio Y de camada S
HMPREF0389_00672Proteína hipotética
HMPREF0389_01172Proteína hipotética
HMPREF0389_00415Proteína de montagem fimbrial
HMPREF0389_01657Proteína de membrana
HMPREF0389_01476Proteína hipotética
HMPREF0389_01477Proteína de ligação ao cálcio do tipo hemolisina III
HMPREF0389_01478Proteína exportar proteína de membrana
HMPREF0389_01006Proteína de adesão de colágeno

Regulamentação positiva de F. alocis proteínas envolvidas na sinalização da célula hospedeira.

F. alocis cepas ATCC-35896 e D-62D co-cultivadas com P. gingivalis mostraram a regulação positiva de proteínas bacterianas que são relatadas como envolvidas na transcrição eucariótica (Tabela 2). A coinfecção também mostrou abundância relativa de RNAs não codificantes, como RNA de repetição palindrômica curta regularmente interespaçada (CRISPR) e proteínas do sistema toxina-antitoxina. Peptidil prolil cis-trans a isomerase, uma enzima envolvida na via de modificação da histona, também foi regulada positivamente. Dados relevantes da rede de genes com base na mineração de dados do proteoma do hospedeiro sugerem a regulação positiva dos processos de transdução de sinal da célula hospedeira, no entanto, a análise também mostrou a regulação negativa das atividades de ligação da quinase e proteína. Muitos processos celulares vitais, como fosforilação, apoptose, expressão gênica, proliferação celular e crescimento celular foram modulados (ver Fig. S1 e S2 no material suplementar).

MESA 2

F. alocis proteínas encontradas em abundância relativa durante a coinfecção

Gene IDAnotaçãoMudança de dobra
D-62DATCC
HMPREF0389_ 00905Proteína da família do simportador do neurotransmissor de sódio3.642.76
HMPREF0389_ 00296Proteína da família PP loop6.381.15
HMPREF0389_ 01047Regulador transcricional da família TetR1.751.04
HMPREF0389_ 01180Fator anti-anti-sigma RsbV2.921.09
HMPREF0389_ 00038Hipoxantina fosforibosil transferase1.702.09
HMPREF0389_ 01084Proteína hipotética (contendo receptores & # x022127TM com diversas moléculas de sinalização intracelular)1.631.20
HMPREF0389_ 01060GMP sintase1.631.10
HMPREF0389_ 01081Proteína da família da aminoprotease Caax1.681.75
HMPREF0389_ 00290Família do regulador translacional LacI2.381.20
HMPREF0389_ 01109Montagem FeS ATPase SufC2.081.50
HMPREF0389_ 01107Transportador tipo ABC regulado por ferro1.512.5
HMPREF0389_ 00519Proteína hipotética (contendo domínio putativo de fita de zinco)2.183.3
HMPREF0389_ 00052CDP-diacil glicerol-glicerol 3 fosfato 3 fosfatidil transferase2.061.90
HMPREF0389_ 00948Fosfoglicerato desidrogenase1.951.52
HMPREF0389_ 01590Família AraC do regulador transcricional1.551.03
HMPREF0389_ 01398Coproporfirinogênio III oxidase independente de oxigênio1.831.08
HMPREF0389_ 01164Proteína hipotética2.281.31
HMPREF0389_ 00472Família gama glutamil ligase1.921.40
HMPREF0389_ 00387Piruvato quinase2.470.74
HMPREF0389_ 00382Proteína hipotética (proteína de domínio VCBS)4.111.13
HMPREF0389_ 00294Proteína permease transportadora Ribose ABC1.742.4
HMPREF0389_ 00212Proteína 2 Cas2 associada a CRISPR2.121.4
HMPREF0389_ 00211Proteína 1 Cas1 associada a CRISPR1.40.70
HMPREF0389_ 00210Proteína Csn1 associada a CRISPR1.0461.00
HMPREF0389_ 01169Proteína Csd1 associada a CRISPR0.9600.95
HMPREF0389_ 01170Proteína Cas5 associada a CRISPR0.7480.78
HMPREF0389_ 01165Proteína Cas2 associada a CRISPR1.301.20
HMPREF0389_ 01167Proteína Cas4 associada a CRISPR1.011.00
HMPREF0389_ 00275Peptidil prolil isomerase1.2431.0
HMPREF0389_ 01236Proteína ribossômica 30S S183.91.5
HMPREF0389_ 00068Proteína hipotética1.81.1
HMPREF0389_ 00044Glutamato sintase, família RluA2.080.8
HMPREF0389_ 00019Proteína da membrana externa2.341.8
HMPREF0389_ 00569tRNA delta (2) isopentenil pirofosfato / glucosamina 1 fosfato N acetiltransferase1.831.1
HMPREF0389_ 00756Citidilato quinase1.702.3
HMPREF0389_ 00967Proteína hipotética (domínio CHASE 3)3.106.4
HMPREF0389_ 00243Toxina-antitoxina componente fita-hélice-hélice dobrada proteína0.8210.88
HMPREF0389_ 00201Proteína hipotética (proteína de domínio HTH3)1.381.36
HMPREF0389_ 00275Peptidil prolil isomerase1.240.99
HMPREF0389_ 00359Peptidil prolil cis-trans isomerase1.241.10

Perfil de proteoma de células epiteliais co-infectadas com F. alocis e P. gingivalis.

Células epiteliais co-infectadas com F. alocis e P. gingivalis cepas mostraram ativação de várias proteínas eucarióticas envolvidas na resposta inflamatória, sinalização celular e morte celular (Fig. 3). A análise do proteoma global do hospedeiro mostrou modulação na expressão de 209 proteínas. Entre elas, as proteínas envolvidas na organização e biogênese do citoesqueleto foram as mais afetadas (17%), seguidas pelas proteínas envolvidas na regulação da expressão gênica e modificação epigenética (9%), regulação do transporte de proteínas (7%), início da transcrição (7%) , regulação da biossíntese de proteínas (6%), processamento de proteínas (5%), regulação da transdução de sinal (4%) e morte celular-apoptose (3%). Proteínas altamente reguladas durante a coinfecção incluem fator de iniciação da tradução eucariótica, fatores de splicing, aglomerados de proteínas de histona e outras proteínas de sinalização, como vimentina, proibitina e proteínas redox. Proteínas altamente reguladas incluem as proteínas da família do oncogene RAS, proteínas envolvidas na sinalização de granzima e proteínas da matriz do citoesqueleto (Tabela 3). Uma análise da via Ingenuity mostrou expressão aumentada de genes eucarióticos envolvidos na apresentação de antígenos, movimento celular, sistema hematológico, tráfego de células e resposta inflamatória (ver Fig. S3 no material suplementar).

Perfil de proteoma eucariótico mostrando várias classes de proteínas moduladas durante a infecção de cocultura com P. gingivalis e Filifactor alocis. Seção 1, GO: 0005975 (metabolismo de carboidratos) seção 2, GO: 0006260 (replicação de DNA) seção 3, GO: 0006352 (iniciação da transcrição) seção 4, GO: 0006353 (terminação da transcrição) seção 5, GO: 0006360 (transcrição de RNA promotor da polimerase I) seção 6, GO: 0006417 (regulação da biossíntese de proteínas) seção 7, GO: 0006457 (dobramento de proteínas) seção 8, GO: 0006512 (ciclo da ubiquitina) seção 9, GO: 0006839 (transporte mitocondrial) seção 10, GO : 0007005 (organização da mitocôndria e biogênese) seção 11, GO: 0007010 (organização do citoesqueleto e biogênese) seção 12, GO: 0007047 (organização da parede celular e biogênese) seção 13, GO: 0007166 (transdução de sinal ligada ao receptor da superfície celular) seção 14 , GO: 0007264 (transdução de sinal mediada por pequena GTPase) seção 15, GO: 0008219 (morte celular) seção 16, GO: 0009890 (regulação negativa da biossíntese) seção 17, GO: 0009966 (regulação de transdução de sinal) seção 18, GO: 0015931 (organização de vesículas e biogênese) seita íon 19, GO: 0016071 (metabolismo de mRNA) seção 20, GO: 0016481 (regulação negativa da transcrição) seção 21, GO: 0016485 (processamento de proteína) seção 22, GO: 0018193 (modificação de peptidil aminoácido) seção 23, GO: 0019932 (sinalização mediada por mensageiro secundário) seção 24, GO: 0030705 (transporte intracelular dependente do citoesqueleto) seção 25, GO: 0040029 (regulação da expressão gênica, epigenética) seção 26, GO: 0045333 (respiração celular) seção 27, GO: 0045454 (homeostase celular redox) seção 28, GO: 0051049 (regulação do transporte) seção 29, GO: 0051052 (regulação do metabolismo do DNA).

TABELA 3

Proteínas hospedeiras moduladas durante a coinfecção com F. alocis e P. gingivalis

GeneMudança de dobraAnotação
Proteínas reguladas negativamente
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003EIF4B& # x022123.675Fator de iniciação da tradução eucariótica 4B
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003HIST1H1C& # x022122.742Grupo de histona 1, H1c
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003HIST1H1E& # x022122.643Grupo de histona 1, H1e
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003HIST1H2BL& # x022122.790Grupo de histona 1, H2bl
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003PPIA& # x022123.307Peptidil prolil isomerase A (ciclofilina A)
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003VIM& # x022122.158Vimentin
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003SRSF14.049Fator de splicing 1 rico em serina / arginina
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003PHB Proibina
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003TRAP 1& # x022121.035Proteína 1 associada ao receptor de TNF
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003PRDX1& # x022121.219Peroxiredoxina 1 e 5
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003PRDX5& # x022121.201
Proteínas reguladas positivamente
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003NACA2.310Subunidade alfa complexa associada a polipeptídeo nascente
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003IMPDH22.472Inosina-5 & # x02032-monofosfato desidrogenase 2
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003AGF31.774Proteína 2 semelhante a AFG3
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003RAB 101.128Membro da família RAS oncogene
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003RAB 7A1.028Membro da família RAS oncogene
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003ITGB11.356Integrina
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003PHB1.260Proibitina
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003VCL2.189Vinculin
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003IGAAD Proteínas de sinalização de granzima A
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003HSP102.160Proteína de choque térmico de 10 kDa (mitocondrial)
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003LDHA1.516Isoforma 1 da cadeia A de l-lactato desidrogenase
1.512Proteína 46 kDa
1.907Proteína de 26 kDa
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003NACA2.310Complexo nascente associado a polipeptídeo
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003KRT11.461Queratina tipo II citoesquelético I
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003HNRPR1.728Ribonucleoproteína R nuclear heterogênea

Muitas proteínas reguladoras da célula hospedeira que estão envolvidas na integridade do citoesqueleto foram moduladas. Os genes da integrina beta-1 (ITGB1) são regulados negativamente na cocultura. O gene da proteína contendo valosina (VCP) envolvido na degradação da proteína dependente da ubiquitina é regulado para baixo na cocultura. Tanto na cocultura quanto na monocultura de F. alocis, houve regulação positiva do gene poli - & # x003b2-hidroxibutirato (PHB) envolvido na regulação negativa da proliferação celular (ver Fig. S4 no material suplementar). O gene vinculina (VCL) que codifica para a proteína do citoesqueleto de membrana vinculina e o gene do canal de ânion dependente de voltagem (VDAC1) foram regulados positivamente durante a coinfecção. Proteínas envolvidas em importantes redes de regulação celular, como fator de splicing 1 rico em serina / arginina (SRSF1), anexina-2 (ANXA2), proteínas de choque térmico (HSPA8, HSP9 e HSPE1), proteína de ligação de sinaptotagmina (SYNCRIP), fator de iniciação eucariótica 4A-1, proteína de tradução dependente de proteína-SRP de 19 kDa, proteína S100A11 e outras proteínas do citoesqueleto, como as proteínas lamina A / C, também foram moduladas (ver Tabela S2). Houve uma regulação negativa generalizada da via da actina (ver Fig. S5).

A fim de identificar variações na morfologia da superfície da célula hospedeira e morte celular entre coinfecção e monoinfecção, células epiteliais co-infectadas com F. alocis e P. gingivalis foram submetidos a estudo de microscopia eletrônica. Uma ampla variação morfológica da célula hospedeira foi observada após a coinfecção em comparação com a monoinfecção com qualquer F. alocis ou P. gingivalis. As células epiteliais infectadas mostram modificação das projeções filopodiais da superfície celular que foram usadas por ambos F. alocis e P. gingivalis para aderir à superfície celular e formação de microdomínios de membrana, como as jangadas de lipídios (Fig. 4, painéis 1 e 2). As células infectadas mostraram apoptose precoce durante a coinfecção em comparação com a monoinfecção (Fig. 4A a & # x200B toL). EU ). Modificações de superfície das células epiteliais co-infectadas foram observadas em ambos F. alocis ATCC 35896 e a cepa clínica D-62D, no entanto, o nível de projeções filopodiais foi maior no F. alocis Cepa D-62D do que na F. alocis Cepa ATCC 35896 (Fig. 4O e & # x200B e P). P). Tais variações morfológicas não foram observadas em células epiteliais monoinfetadas (Fig. 4M e & # x200B e N N).

Coinfecção de P. gingivalis e Filifactor alocis, mostrando variações morfológicas durante a aderência levando à apoptose das células epiteliais. Imagens de microscopia eletrônica de varredura mostram modificação da superfície celular com projeções filapodiais em células epiteliais infectadas que foram usadas por ambos F. alocis e P. gingivalis para aderir à superfície da célula (painéis 1 e 2). As células infectadas mostraram apoptose precoce durante a coinfecção em comparação com a monoinfecção (A a L). Variações morfológicas de superfície não foram observadas em células epiteliais monoinfetadas (M e N). As projeções filopodiais foram mais aumentadas no F. alocis Cepa D-62D (O e P). Setas laranja, F. alocis setas verdes claras, P. gingivalis setas verde-escuras, projeções filapodiais.

Muitas proteínas do hospedeiro envolvidas na função da cromatina e na remodelação foram reguladas para baixo durante F. alocis coinfecção com P. gingivalis. Foi observada uma regulação negativa geral das proteínas do agrupamento de histonas e PPIA-peptidil prolil isomerase (Fig. 5) (Tabela 2). Os níveis de expressão relativa dessas proteínas foram os mais baixos em F. alocis coinfecção de cepas clínicas em comparação com a coinfecção de cepas do tipo (dados não mostrados). Proteína ribonuclear nuclear heterogênea A2 / B1 foi encontrada em menor abundância durante a coinfecção. As proteínas envolvidas nas vias de transporte e secreção, como a proteína 1 do receptor de transferrina (envolvida no transporte de ferro), proteína 10 contendo o domínio emp24 transmembrana e dineína (envolvida no tráfego de proteínas vesiculares), excesso 4 e proteínas da família de transportadores de soluto também foram menos expressas durante a coinfecção.

Coinfecção de Filifactor alocis com P. gingivalis mostrando a regulação negativa de proteínas envolvidas na expressão gênica e nas vias de síntese de proteínas. As células HeLa foram infectadas com o F. alocis Cepas ATCC 35896 e D-62D (MOI de 1: 100 [10 5 células epiteliais]) em monocultura ou cocultura com P. gingivalis cepas como relatado anteriormente (6). A análise de marcação de massa isobárica em tandem de coculturas e monoculturas foi realizada usando Orbitrap. As proteínas eucarióticas foram analisadas usando MASCOT, e a análise funcional foi realizada usando o software de análise de via Ingenuity. A classificação da ontologia do gene foi usada para referenciar o proteoma. F. alocis coinfecção com P. gingivalis mostraram regulação negativa geral de proteínas de agrupamento de histonas (histona [Hist] H1, Hist 1H1B, Hist 1H1C e Hist 1H1E) (mostrado dentro do círculo), peptidil prolil isomerase (PPIA e PPIB) e enzimas antioxidantes (PRDX1 e PRDX5). Verde, vermelho de regulação negativa, linhas sólidas de regulação superior, linhas pontilhadas de interação direta, interação indireta.

Proteínas que são conhecidas por ativar oncogenes direta ou indiretamente foram expressas em alta abundância durante F. alocis cocultura. As proteínas principais que estavam presentes em alta abundância durante a coinfecção foram RAB 7A, proteínas RAB10 pertencentes à família de oncogene RAS, proteína de ligação poli (rC) 2 (PCBP2), proteína de canal de ânion dependente de voltagem 1, copina-1 (dependente de cálcio proteína de ligação à membrana) e precursor da cadeia alfa-2 (V) do colágeno (Tabela 3).

Muitas proteínas da célula hospedeira que estão envolvidas na adesão celular e interações citoesqueléticas foram reguladas positivamente durante a coinfecção de F. alocis com P. gingivalis. Proteínas do citoesqueleto do hospedeiro, como vimentina, actina, plectina, vinculina, profilina e transgelina, e proteínas chaperonas como HSP90 e endoplasmina e proteínas como filamina B e filamina C envolvidas na comunicação celular foram moduladas. As proteínas de transdução de sinal galectina, subunidade alfa do proteassoma tipo 6 e proteína teta 14-3-3 foram relativamente menos abundantes. Verificou-se que a inosina 5 & # x02032 monofosfato desidrogenase (IMPDH), cinectina do receptor e peroxirredoxinas eram altamente expressas durante a coinfecção (ver Tabela S2).

Análise oribtrap de todo o proteoma de F. alocis cocultura com P. gingivalis revelou muitas proteínas de células hospedeiras reguladas positivamente que estão envolvidas na apoptose, regulação celular e vias de diferenciação. Proteínas como as proibitinas e proteína Rab 10 relacionada com Ras e proteínas de translocação Rab 7 SET relacionadas com Ras que estão envolvidas na apoptose e ligação de histona foram reguladas positivamente. Além disso, a proteína SRSF1 codificada por um proto-oncogene, proteína nascente-associada a polipeptídeo complexo alfa (NACA) (coativador transcricional), NPM1 (nucleofosmina) envolvida em apoptose e tumorigênese, e CALR (calreticulina) envolvida na ligação e armazenamento de cálcio foram altamente regulado positivamente (Fig. 6). Além disso, nossa análise mostrou a regulação positiva de proteínas envolvidas na via do proteassoma da ubiquitina e na via de sinalização apoptótica mediada pela granzima (ver Fig. S6 no material suplementar).

Coinfecção de Filifactor alocis com P. gingivalis mostrando a regulação positiva de proteínas envolvidas no câncer e nas vias de morte celular. As células HeLa foram infectadas com F. alocis Cepas ATCC 35896 e D-62D (MOI de 1: 100 [10 5 células epiteliais]) em monocultura ou cocultura com P. gingivalis cepas como relatado anteriormente (6). A análise de marcação de massa isobárica em tandem de coculturas e monoculturas foi realizada usando Orbitrap. As proteínas eucarióticas foram analisadas usando MASCOT, e a análise funcional foi realizada usando o software de análise de via Ingenuity. A classificação da ontologia do gene foi usada para referenciar o proteoma. Proteínas como as proibitinas, a proteína Rab 10 relacionada a Ras e a proteína de translocação Rab 7 SET da proteína relacionada a Ras que estão envolvidas na apoptose e na ligação das histonas foram reguladas positivamente. Além disso, a proteína SRSF1 codificada por um proto-oncogene, proteína NACA (coativador transcricional), NPM1 (nucleofosmina envolvida na apoptose e tumorigênese) e CALR (calreticulina envolvida na ligação e armazenamento de cálcio) foram altamente reguladas. Verde, vermelho de regulação negativa, regulação superior.

As vias metabólicas do hospedeiro moduladas durante a coinfecção são fornecidas na Tabela 4. As vias relacionadas à síntese de amônia, biossíntese de urato, degradação de aminoácidos (valina e aspartato), síntese de lipídios e síntese de palmitato e ácidos graxos foram altamente reguladas. Houve regulação negativa das vias excretórias de aminoácidos e vias de transporte, como a troca de glutamil / arginina e a via do triptofano. Coinfecção de F. alocis foi mostrado para afetar as vias de energia básicas, como glicólise e biossíntese de acetil coenzima A (CoA).

TABELA 4

Variação do metaboloma na proteína do hospedeiro durante F. alocis coinfecção

Categoria de expressão e caminho
Regulado
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Produção de amônia
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Biossíntese da taxa de inosina 5 & # x02032 degradação do fosfato
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Degradação de vibração
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Degradação de aspartato
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 l -Síntese de asparagina
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Degradação de CoA do glutaraldeído
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Biossíntese de ácidos graxos
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Via da fosfato de pentose
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003TCA ciclo uma
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Fermentação de piruvato para lactato
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Via da tioredoxina
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Biossíntese de palmas
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003Purina de novo síntese
Regulamentado para baixo
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Troca de glutamil / arginina independente de sódio
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 l -Transporte de Tryptophan
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Degradação da sacarose
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Síntese de peptidil prolina
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Síntese de fosfoproteínas
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Biossíntese de acetil CoA a partir de citrato
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003Glicólise
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Reparo NADH

Papéis das ciclofilinas no cloroplasto

A atividade da PPIase sensível a CsA em cloroplastos foi demonstrada pela primeira vez em ervilhas por Breiman et al. (1992). Desde a caracterização de TLP40, uma ciclofilina de lúmen tilacóide de 40 kDa de cloroplastos de espinafre (Fulgosi et al., 1998), abordagens de proteômica e bioinformática resultaram na identificação de 11 FKBPs e 5 ciclofilinas no lúmen do cloroplasto de Arabidopsis (Edvardsson et al., 2007 Trivedi et al., 2012). TLP40 é uma ciclofilina de múltiplos domínios que mostra atividade PPIase e atua como um regulador negativo da proteína fosfatase da membrana do tilacóide (Fulgosi et al., 1998 Vener et al., 1999). Esta proteína desempenha um papel essencial no crescimento e desenvolvimento das plantas, uma vez que mutações em sua Arabidopsis ortólogo, AtCYP38, resultou no desenvolvimento prejudicado de cloroplastos, crescimento retardado da planta, hipersensibilidade à luz e degradação aumentada dos componentes D1 e D2 de PSII sob condições de alta luz (Fu et al., 2007 Sirpi & # x000f6 et al., 2008 Vasudevan et al., 2012 Vojta et al., 2019). Juntamente com outras imunofilinas, como FKBP13 e FKBP20-2, que são necessárias para o acúmulo do complexo citocromo b6f e supercomplexos PSII, respectivamente (Gupta et al., 2002 Lima et al., 2006), AtCYP38, apesar da falta de atividade de PPIase, aparece ser indispensável para a biogênese adequada e manutenção dos complexos fotossintéticos. Pelo contrário, o funcionamento prejudicado de AtCYP20-2, uma PPIase altamente ativa e ortóloga à ciclofilina do espinafre TLP20, não teve efeito fenotípico aparente, sugerindo redundância na função dessas proteínas (Fulgosi et al., 1998 Sirpi & # x000f6 et al. , 2009). Foi proposto que enquanto o TLP40 desempenha funções regulatórias especializadas, o TLP20 pode atuar como um catalisador de dobramento de proteína geral (Edvardsson et al., 2003). A proteína estromal do cloroplasto AtCYP20-3, 65,64% idêntica a AtCYP20-2, facilita o dobramento da serina acetiltransferase (SAT) que catalisa a etapa final na biossíntese de Cys, que é importante para a formação de glutationa. A PPIase e atividades de dobramento de AtCYP20-3, sensível à fotooxidação e ROS induzida por estresse, foram restauradas após redução por Trx fotoreduzida (Laxa et al., 2007). Mutação em AtCYP20-3 resultou em hipersensibilidade ao estresse oxidativo em Arabidopsis (Dominguez-Solis et al., 2008), o que implica que permite que a via de biossíntese de tiol baseada em Cys se ajuste às condições de luz e estresse. Os ensaios de microcalorimetria de titulação isotérmica e de sobreposição de gel indicaram ainda que AtCYP20-3 interage com peroxidases à base de tiol, peroxirredoxinas de 2-cisteína (2-CysPrx), que podem existir como dímero ou decâmero. A forma de dímero é favorecida em condições de oxidação, enquanto o decâmero é formado em condições de redução. A alta afinidade de AtCYP20-3 para o dímero leva a uma diminuição na concentração de dímero livre. Assim, parece que o AtCYP20-3 regula o valor da concentração de transição crítica (concentração responsável pela transição da forma dímero-decamérica) de 2-CysPrx, sugerindo a dinâmica conformacional dependente de redox desta proteína (Liebthal et al., 2016).


TPL2 e tumorigênese

Inicialmente, o TPL2 foi identificado como um alvo para a integração do provírus em linfomas de células T induzidos pelo vírus da leucemia murina Moloney (MoMuLV) e carcinomas mamários induzidos pelo vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV) em camundongos [4, 5]. A inserção viral induziu a geração de uma forma truncada da proteína TPL2, que retrata aumento da atividade e estabilidade com potencial de transformação aumentado, ilustrando a importância do aumento da atividade da TPL2 quinase na tumorigênese [4]. Embora as mutações de TPL2 sejam raras em cânceres humanos, há algumas evidências de mutações que induzem a amplificação do sinal de TPL2 e a atividade de quinase constitutiva ocorrendo no câncer de mama e adenocarcinoma de pulmão, levantando a possibilidade de que o terminal C de TPL2 possa ser um alvo de mutação em alguns cânceres [ 5, 36, 37]. No entanto, o número de tumores com superexpressão e ativação de TPL2 é muito mais significativo do que a subfração de tumores com mutações confirmadas, sugerindo que a superexpressão e ativação de TPL2 são os principais eventos associados ao aumento da tumorigênese [5]. A superexpressão e o aumento da atividade de TPL2 estão associados a mau prognóstico e à progressão de vários cânceres humanos, incluindo câncer de pele, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gástrico, carcinoma nasofaríngeo relacionado ao EBV, anaplásico grande linfoma celular (ALCL), carcinoma associado a colite, câncer de bexiga e câncer cervical (Figura 3) [6, 8, 36, 38-40]. Congruentemente, a atividade da quinase TPL2 tem sido implicada em todos os estágios da tumorigênese, incluindo iniciação tumoral, promoção tumoral e progressão tumoral, onde modula a proliferação celular, aquisição de células-tronco, angiogênese, progressão EMT, migração, invasão e metástase [5, 9].

A sinalização TPL2. A via de sinalização de TPL2 é ativada após a estimulação de vários receptores, incluindo TNFR, IL-1R, TLRs, CD40 e TCR. A TPL2 ativada subsequentemente ativa o sinal de MAPKs: ERK1 / 2, p38 & # 945, JNK e Akt que regulam a ativação de vários fatores de transcrição: NF - & # 954B, AP1, STAT3, C / EBP & # 946, CREB, ZEB1 e NFATc1. Esses fatores de transcrição induzem a expressão de vários genes, como TNF & # 945, IL-6, IL-1 & # 946, COX2, VEGF, CXCR4, ciclina D1, HER, EGFR, MMP2, MMP9 e vimentina que estão envolvidos na inflamação, célula proliferação e sobrevivência, angiogênese e metástase. Além disso, o TPL2 promove a sobrevivência celular ao inibir a expressão de p27kip, desativando o p53 por meio da atividade de PP2A e da regulação da expressão de TACE. A sinalização de TPL2 também está envolvida na estabilização do mRNA e na tradução de proteínas. No citoplasma, ERK1 / 2 e Akt ativados por TPL2 regulam a via de sinalização mTORC1 / S6 que modula a tradução de proteínas de fatores inflamatórios, incluindo TNF & # 945, COX2, CXCL1, IL-1 & # 946 e IL-18. O p38 ativado também pode promover a estabilização do mRNA ao ativar o MK2. Além disso, a ativação de RSK1 e MSK1 por ERK1 / 2 e p38 & # 945 pode promover a ativação do fator de transcrição, estabilização de mRNA e tradução. (TPL2: tumor progressivo locus 2 TNFR: receptor de fator de necrose tumoral IL-1R: receptor de interleucina 1 TLRs: receptores semelhantes a toll CD40: grupo de diferenciação 40 TCR: receptor de células T ERK1 / 2: quinases extracelulares reguladas por sinal 1/2 JNK : c-Jun N-terminal quinase Akt: proteína quinase B MAPKs: proteína quinases ativadas por mitogênio mTORC1: mamífero alvo do complexo de rapamicina 1 NF - & # 954B: fator nuclear kappa-light-chain-enhancer de B AP1 ativado: proteína ativadora 1 STAT: transdutor de sinal e ativador da transcrição C / EBP & # 946: proteínas de ligação do intensificador de CCAAT - & # 946 CREB: proteína de ligação do elemento de resposta do cAMP ZEB1: homeobox de ligação da E-box de dedo de zinco 1 NFATc1: fator nuclear de ativado Células T, citoplasmática 1 TNF: receptor de fator de necrose tumoral IL: interleucina COX2: ciclooxigenase 2 CXCL: ligante de quimiocina CXC CXCR: receptor de quimiocina CXC VEGF: fator de crescimento endotelial vascular EGFR, receptor de fator de crescimento epidérmico MMP: matriz metaloproteinase Pin1: peptidilase de matriz isômeros -prolil cis / trans e HER: receptor do fator de crescimento epidérmico humano EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico RSK1: proteína ribossomal S6 quinase 1 MSK1: mitógeno e quinase 1 ativada por estresse MK2: proteína quinase ativada por MAPK 2).

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No entanto, a expressão suprimida de TPL2 também é relatada em alguns cânceres [9]. Por exemplo, foi demonstrado que a expressão de TPL2 reduzida se correlaciona com mau prognóstico e agressividade do tumor em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) [41, 42]. Consequentemente, camundongos TPL2 - / - expostos ao carcinógeno pulmonar uretano demonstraram que a perda da proteína TPL2 promove aumento da proliferação celular e resistência à apoptose devido à sinalização desregulada de p53 [41]. Além disso, mecanismos de controle genético e epigenético, como frequência de perda de heterozigosidade (LOH) no locus TPL2 e regulação positiva de miR370 também estão associados à supressão de TPL2 [41]. No entanto, ainda não está claro se esses mecanismos contribuem diretamente para a supressão de TPL2 no câncer de pulmão. Este estudo também propôs que a sinalização oncogênica de Ras pode contribuir para a supressão de TPL2 no câncer de pulmão por meio da redução da proteína NF - & # 954B1 p105 [41]. De forma consistente, camundongos com deficiência de NF - & # 954B1 p105 tratados com uretano, semelhantes aos camundongos TPL2 - / -, exibiram suscetibilidade aumentada ao câncer de pulmão que foi associado a dano pulmonar aumentado, inflamação e mutação K-Ras [43]. Além disso, a reconstituição da expressão de TPL2 em camundongos deficientes em NF - & # 954B1 p105 e TPL2 inibiu a tumorigênese, possivelmente por alguns mecanismos desconhecidos que suprimem a sinalização de Ras oncogênica. Correspondentemente, esses estudos destacam a importância da proteína TPL2 na tumorigênese e inflamação pró-tumorigênica. Além disso, devido à sua interação com NF - & # 954B1 p105 e proteína ABIN2, é possível que a expressão alterada da proteína TPL2 possa contribuir para a ativação ou supressão aberrante de outras vias de sinalização, promovendo assim a inflamação pró-tumorigênica e a tumorigênese. Portanto, são necessários mais estudos que investiguem a função distinta da proteína TPL2 e da atividade da quinase TPL2 no câncer de pulmão e na tumorigênese.

Efeitos pró e antitumorigênicos da sinalização de TPL2. A atividade da TPL2 quinase funciona como um potente promotor de tumor na maioria dos cânceres, onde está predominantemente associada com aumento da inflamação, transformação maligna, crescimento do tumor, aquisição de células-tronco, angiogênese, metástase e mau prognóstico. No entanto, a expressão suprimida de TPL2 também é relatada em alguns tipos de câncer, como o câncer de pulmão, e sua ablação está associada ao aumento da tumorigênese em câncer de pele experimental e câncer intestinal. É importante notar que o aumento da tumorigênese no carcinoma de células escamosas induzido por carcinogênio suprimido por TPL2, câncer associado à colite induzida por carcinogênio, câncer de pulmão e câncer colorretal esporádico é principalmente dependente da presença de condições promotoras de tumor, como inflamação, dano tecidual e NF- Sinalização & # 954B. (A figura foi criada com BioRender.com, & # 169BioRender 2020).

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Figura 5

Figura 5. A expressão de K6W-ubiquitina reduz os níveis de periaxina e interrompe a organização da fibra. Lentes de camundongos transgênicos recém-nascidos (P1) WT e de alta expressão K6W-Ub foram criosseccionadas no plano equatorial. As seções foram imunocoradas com anticorpo para periaxina e anticorpo secundário marcado com FITC. F-actina foi corada com faloidina marcada com rodamina. Fotomicrografias confocais foram tiradas usando um sistema confocal Leica. Esses dados indicam que a periaxina é regulada negativamente na maioria das fibras de lentes de lentes K6W-Ub e o diâmetro das fibras de lentes de lentes K6W-ub é significativamente maior do que as lentes WT.


Informações de Apoio

Figura S1.

Fluxograma da montagem e anotação automatizada de 454 leituras. A) Conjunto de 454 leituras. Leituras brutas: cromatogramas produzidos por 454 sequenciamento de titânio Leituras cortadas: leituras processadas para montagem de Singletons: transcrições putativas identificadas por uma leitura Singletons & gt 200 nt: transcrições putativas identificadas por uma leitura & gt 200 de comprimento de nucleotídeo Isotigs: transcrições putativas identificadas por pelo menos duas leituras Consenso sequências: sequências não redundantes (singletons + isotigs). B) Processo de anotação automatizado. Cada sequência de consenso, convertida para o formato FASTA, foi pesquisada localmente em um banco de dados de nucleotídeos baixado dos bancos de dados NCBI e UniProtUK usando, respectivamente, Blast-X e Blast-N. Consulte Material e métodos para obter mais detalhes.

Figura S2.

Análise funcional de transcrições expressas diferencialmente. A) Um diagrama de Venn ponderado que mostra a porção relativa nos genes diferencialmente expressos daqueles com padrões de expressão sinusoidal (análise CircWaveBatch). B) Os genes anotados diferencialmente expressos (336 sequências de consenso) foram classificados em 12 categorias funcionais diferentes. O diagrama mostra a proporção de cada categoria funcional. C) Os 159 transcritos anotados mostrando padrões oscilatórios sinusoidais foram agrupados em 12 categorias funcionais. As transcrições caracterizadas por uma periodicidade de expressão de 24 horas (75 em 159) ou 12 horas (84 em 159) são mostradas separadamente. Consulte a Tabela S1 para obter mais detalhes.

Figura S3.

Validação de valores de expressão de microarray por qRT-PCR. Os níveis de expressão de mRNA são representados por gráficos de caixa e bigode. Os dados de qRT-PCR normalizados são expressos como alterações de dobra (FC) em relação à expressão mediana para cada ponto de tempo. 18S rRNA foi usado como um controle endógeno. O perfil de expressão de microarray de cada gene é mostrado abaixo do gráfico de caixa qRT-PCR. A correlação de Pearson foi calculada para estimar a associação entre os dados do microarray e os resultados do qRT-PCR (p & gt 0,7 é considerado estatisticamente significativo).

Figura S4.

Representação esquemática de um protocolo de construção de biblioteca de cDNA normalizado. Uma combinação de dois protocolos diferentes - a “amplificação do transcriptoma inteiro (WTA)” e “normalização de nuclease específica de duplex (DSN)” - foi adotada. Consulte Material e métodos para obter mais detalhes.

Tabela S1.

A lista de 336 genes anotados diferencialmente expressos agrupados em categorias funcionais. Os níveis de expressão em um ciclo de 24 horas são mostrados. As transcrições identificadas como cíclicas pelo CircWaveBatch V. 3.3 são indicadas em negrito. Os tempos de amostragem são indicados. a Anotação = descrição do gene b e-value: pontuação da anotação com Blast-N e / ou Blast-X c Sonda: ID da sequência da sonda na plataforma de microarray “Krill 1.1” Agilent.

Tabela S2.

Primers usados ​​em RT-PCR quantitativo.


Publicações de autores chamados "Kyung Yeon Han"

Samsung Genome Institute, Samsung Medical Center, Seoul 06351, South Korea.

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SIDR: isolamento simultâneo e sequenciamento paralelo de DNA genômico e RNA total de células individuais.

Autores:

Genome Res 2018 01 528 (1): 75-87. Epub 2017, 5 de dezembro.

Samsung Genome Institute, Samsung Medical Center, Seoul 06351, South Korea.

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Separação magnética vertical de células tumorais circulantes para análise de alteração genômica somática em pacientes com câncer de pulmão.

Autores:

Sci Rep 2016 11 286: 37392. Epub 2016, 28 de novembro.

Samsung Genome Institute (SGI), Samsung Medical Center (SMC), Seul 06351, Coreia.

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Microesferas de sílica opticamente inativas e altamente densas para o isolamento e identificação de células tumorais circulantes.

Autores:

Biomaterials 2016 Jan 2375: 271-278. Epub, 23 de outubro de 2015.

Samsung Genome Institute (SGI), Samsung Medical Center (SMC), Seul 135-710, Departamento de Biologia Celular Molecular da Coreia do Sul, Escola de Medicina da Universidade Sungkyunkwan, Suwon 440-746, Coreia do Sul. Endereço eletrônico:

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Escherichia coli EDA é um novo parceiro de expressão de fusão para melhorar a solubilidade de proteínas heterólogas com tendência à agregação.

Autores:

J Biotechnol, janeiro de 2015, 5194: 39-47. Epub 2014, 5 de dezembro.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Seongbuk-Gu, Seul 136-713, República da Coreia. Endereço eletrônico:

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Síntese de Mycoplasma arginina desiminase em E. coli usando proteínas responsivas ao estresse.

Autores:

Enzyme Microb Technol 2014 Set 2763: 46-9. Epub 2014, 27 de maio.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul 136-713, República da Coreia. Endereço eletrônico:

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Uma proteína de Escherichia coli responsiva ao estresse, CysQ é um intensificador de solubilidade altamente eficaz para proteínas heterólogas com tendência à agregação.

Autores:

Protein Expr Purif 2014 Set 17101: 91-8. Epub 2014, 17 de junho.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Faculdade de Engenharia, Universidade da Coreia, Anam-Ro 145, Seul 136-713, República da Coreia. Endereço eletrônico:

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Plataforma de isolamento de células tumorais circulantes totalmente automatizada com capacidade de grande volume baseada em lab-on-a-disc.

Autores:

Anal Chem 2014, abril 3186 (8): 3735-42. Epub 2014, 31 de março.

Samsung Biomedical Research Institute, Samsung Advanced Institute of Technology, Samsung Electronics Company, Ltd., 81 Irwon-Ro, Gangnam-Gu, Seoul 135-710, República da Coreia.

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YrhB é uma pequena proteína altamente estável com atividade única semelhante a uma chaperona em Escherichia coli BL21 (DE3).

Autores:

FEBS Lett 2012, abril 8586 (7): 1044-8. Epub 2012, 8 de março.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Gu, Seul 136-713, República da Coreia.

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Uma nova proteína intensificadora de solubilidade de Escherichia coli para expressão de fusão de proteínas heterólogas com tendência à agregação.

Autores:

Enzyme Microb Technol 2011 Jul 2249 (2): 124-30. Epub 2011, 22 de abril.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Seongbuk-Gu, Seul 136-713, República da Coreia.

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Detecção sensível e simultânea de marcadores cardíacos em soro humano usando imunossensor de onda acústica de superfície.

Autores:

Anal Chem, novembro de 2011, 2683 (22): 8629-35. Epub, 26 de outubro de 2011.

Bio Laboratory, Samsung Advanced Institute of Technology, Samsung Electronics Co., Ltd., Yongin-si, Gyeonggi-do, República da Coreia.

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O domínio N da fosfoglicerato quinase de Escherichia coli é um novo parceiro de fusão para expressar proteínas heterólogas com tendência à agregação.

Autores:

Biotechnol Bioeng 2012 Fev 9109 (2): 325-35. Epub 2011, 9 de setembro.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, 136-713 Anam-Dong 5-1, Seul, República da Coreia.

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Síntese de G-CSF humano usando proteínas bacterianas responsivas ao estresse.

Autores:

FEMS Microbiol Lett 2009 Jul 5296 (1): 60-6. Epub, 5 de maio de 2009.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Seul, Coreia do Sul.

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Mutante de fusão funcional de Candida antarctica lipase B (CalB) expressa em Escherichia coli.

Autores:

Biochim Biophys Acta 2009 março 241794 (3): 519-25. Epub 2008, 24 de dezembro.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Gu, Seul 136-713, Coreia do Sul.

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Análise e caracterização de partículas de vacina contra hepatite B sintetizadas a partir de Hansenula polymorpha.

Autores:

Vaccine, agosto de 2008 1326 (33): 4138-44. Epub, 13 de junho de 2008.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul 136-713, Coreia do Sul.

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Múltiplas respostas de proteoma induzidas por estressor de Escherichia coli BL21 (DE3).

Autores:

J Proteome Res, maio de 2008, 267 (5): 1891-903. Epub, 26 de março de 2008.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Seul, Coreia do Sul.

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Aumento da solubilidade de proteínas heterólogas com tendência à agregação por expressão de fusão usando a proteína Escherichia coli responsiva ao estresse, RpoS.

Autores:

BMC Biotechnol 2008 fev 198: 15. Epub, 19 de fevereiro de 2008.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul 136-713, Coreia do Sul.

Fundo: O método mais eficiente para aumentar a solubilidade de proteínas recombinantes parece usar os parceiros de expressão de fusão. Embora os parceiros de fusão comerciais, incluindo a proteína de ligação à maltose e a glutationa-S-transferase, tenham mostrado bom desempenho no aumento da solubilidade, eles não podem ser usados ​​para a produção proprietária de proteínas de valor agregado comercialmente e provavelmente não podem servir como ajudantes universais para resolver toda a solubilidade de proteínas e questões dobráveis. Assim, novos parceiros de fusão continuarão a ser desenvolvidos por meio de investigações sistemáticas, incluindo a mineração de proteoma apresentada neste estudo.

Resultados: Analisamos a resposta do proteoma de Escherichia coli ao estresse exógeno do cloridrato de guanidina usando eletroforese em gel bidimensional e descobrimos que RpoS (fator sigma de RNA polimerase) foi significativamente responsivo ao estresse. Durante a condição de estresse, o número total de proteínas solúveis diminuiu cerca de 7%, mas foi observado um aumento de 6 vezes no nível de RpoS, indicando que a RpoS é uma proteína induzida por estresse. Como um parceiro de expressão de fusão N-terminal, RpoS aumentou significativamente a solubilidade de muitas proteínas heterólogas com tendência à agregação no citoplasma de E. coli, indicando que RpoS é um intensificador de solubilidade muito eficaz para a síntese de muitas proteínas recombinantes. O RpoS também foi adequado para a produção de um mutante de fusão biologicamente ativo da cutinase de Pseudomonas putida.

Conclusão: RpoS é altamente eficaz como um forte intensificador de solubilidade para proteínas heterólogas com tendência à agregação quando é usado como um parceiro de expressão de fusão em um sistema de expressão de E. coli. Os resultados dessas descobertas podem, portanto, ser úteis na produção de outras enzimas industriais biologicamente ativas, como demonstrado com sucesso pela cutinase.

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Proteínas de transporte PotD e Crr de Escherichia coli, novos parceiros de fusão para expressão de proteínas heterólogas.

Autores:

Biochim Biophys Acta 2007 dez. 41774 (12): 1536-43. Epub 2007, 4 de outubro.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul 136-713, Coreia do Sul.

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Solubilização de proteínas heterólogas com tendência à agregação por fusão covalente da proteína Escherichia coli responsiva ao estresse, SlyD.

Autores:

Protein Eng Des Sel 2007 Nov 3020 (11): 543-9. Epub 2007, 30 de outubro.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul 136-713, Coreia do Sul.

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Solubilidade aumentada de proteínas heterólogas por expressão de fusão usando proteína de Escherichia coli induzida por estresse, Tsf.

Autores:

FEMS Microbiol Lett 2007 Set 3274 (1): 132-8. Epub 2007, 3 de julho.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Seul, Coreia do Sul.

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Escherichia coli malate desidrogenase, um novo intensificador de solubilidade para proteínas heterólogas sintetizadas em Escherichia coli.

Autores:

Biotechnol Lett 2007 Out 529 (10): 1513-8. Epub 2007, 5 de junho.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul, 136-713, Coreia do Sul.

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Estabilidade aprimorada de proteínas heterólogas por auto-montagem supramolecular.

Autores:

Appl Microbiol Biotechnol, maio de 2007, 1475 (2): 347-55. Epub, 14 de fevereiro de 2007.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Faculdade de Engenharia, Universidade da Coreia, Seul, 136-713, Coreia do Sul.

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Uma nova abordagem para o diagnóstico ultrassensível usando nanopartículas de proteínas supramoleculares.

Autores:

FASEB J maio de 2007 521 (7): 1324-34. Epub, 5 de fevereiro de 2007.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Seul, Coreia do Sul.

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Expressão gênica heteróloga usando supramoléculas automontadas com alta afinidade para a chaperona HSP70.

Autores:

Nucleic Acids Res 2005 833 (12): 3751-62. Epub, 8 de julho de 2005.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul 136-713, Coreia do Sul.

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Resposta do proteoma de cultura em batelada alimentada de Escherichia coli à redução da temperatura.

Autores:

Appl Microbiol Biotechnol 2005 Out 1368 (6): 786-93. Epub 13 de outubro de 2005.

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul, 136-713, Coreia do Sul.

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Análise comparativa do proteoma de Hansenula polymorpha DL1 e A16.

Autores:

Proteomics 2004 Jul4 (7): 2005-13

Departamento de Engenharia Química e Biológica, Universidade da Coreia, Anam-Dong 5-1, Sungbuk-Ku, Seul 136-701, Coreia do Sul.


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