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Por que é desejável acoplar a produção química ao crescimento?

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Tenho a seguinte pergunta em biologia de sistemas: a) Desenhe um gráfico mostrando a relação de crescimento (Vbio) e Vefni para o sistema aqui. (Deixe o eixo horizontal representar Vbio e o eixo vertical representar Vefni)

Meu primeiro pensamento foi que seria simplesmente uma linha reta de (0,5,0,5) a (1,0). Mas agora estou pensando que devo levar em conta o V4 também.

b) Determine uma ou mais reações que são tais que, se forem retiradas, a produção de M4 é acoplada ao crescimento (acoplamento de crescimento). Desenhe um gráfico mostrando a relação Vbio e Vefni para o mutante.

Aqui eu pensei que seria V1 e V4. Não tenho certeza, porém, porque não encontrei uma boa explicação para o que exatamente é acoplamento de crescimento.

c) Por que é desejável acoplar a produção química ao crescimento? ou seja, quais vantagens esses sistemas têm sobre aqueles em que esse tipo de acoplamento não está presente?

Aqui eu não tenho ideia.


Por que é desejável acoplar a produção química ao crescimento?

Ao projetar novas vias metabólicas para a produção de produtos químicos, é preciso ter em mente que o objetivo é aumentar a escala (ou seja para atingir o tamanho industrial).

Do ponto de vista industrial, quanto mais rápido / simples for um processo, melhor. A produção química acoplada ao crescimento significa que apenas uma etapa é necessária para produzir o produto desejado (antes dos processos a jusante). Caso contrário, seria necessário produzir a biomassa primeiro (etapa de crescimento) e depois prosseguir para a etapa de produção química. Uma etapa é mais barata e rápida que duas, sem contar as etapas intermediárias que podem ser necessárias (lavagem das células, centrifugação, filtração ...).

A principal desvantagem do crescimento da produção química acoplada é que o rendimento final ($ mol_ {produto final} / mol_ {substrato} $) é prejudicado pela produção de biomassa. Isso pode ser um problema real se o substrato for caro.


32.3: Reprodução Assexuada

  • Contribuição de OpenStax
  • Biologia Geral no OpenStax CNX
  • Compare os mecanismos e métodos de reprodução assexuada natural e artificial
  • Descreva as vantagens e desvantagens da reprodução assexuada natural e artificial
  • Discuta a duração da vida das plantas

Muitas plantas são capazes de se propagar usando a reprodução assexuada. Este método não requer o investimento necessário para produzir uma flor, atrair polinizadores ou encontrar um meio de dispersão de sementes. A reprodução assexuada produz plantas que são geneticamente idênticas à planta-mãe porque nenhuma mistura de gametas masculinos e femininos ocorre. Tradicionalmente, essas plantas sobrevivem bem em condições ambientais estáveis ​​quando comparadas com plantas produzidas a partir da reprodução sexuada porque carregam genes idênticos aos de seus pais.

Muitos tipos diferentes de raízes exibem reprodução assexuada Figura ( PageIndex <1> ). O cormo é usado com gladíolo e alho. Bulbos, como um bulbo escamoso em lírios e um bulbo tunicado em narcisos, são outros exemplos comuns. Uma batata é um tubérculo do caule, enquanto a pastinaga se propaga a partir de uma raiz principal. O gengibre e a íris produzem rizomas, enquanto a hera usa uma raiz adventícia (uma raiz que surge de uma parte da planta que não a raiz principal ou primária), e o morangueiro tem um estolão, também chamado de runner.

Figura ( PageIndex <1> ): Diferentes tipos de hastes permitem a reprodução assexuada. (a) O cormo de uma planta de alho é semelhante a (b) um bulbo de tulipa, mas o cormo é um tecido sólido, enquanto o bulbo consiste em camadas de folhas modificadas que circundam um caule subterrâneo. Tanto os rebentos quanto os bulbos podem se autopropagar, dando origem a novas plantas. (c) O gengibre forma massas de caules chamados rizomas que podem dar origem a várias plantas. (d) As plantas de batata formam tubérculos de caule carnudos. Cada olho no tubérculo do caule pode dar origem a uma nova planta. (e) Os pés de morango formam estolhos: caules que crescem na superfície do solo ou logo abaixo do solo e podem dar origem a novas plantas. (crédito a: modificação da obra por Dwight Sipler crédito c: modificação da obra por Albert Cahalan, USDA ARS crédito d: modificação da obra por Richard North crédito e: modificação da obra por Julie Magro)

Algumas plantas podem produzir sementes sem fertilização. O óvulo ou parte do ovário, de natureza diplóide, dá origem a uma nova semente. Este método de reprodução é conhecido como apomixia.

Uma vantagem da reprodução assexuada é que a planta resultante atingirá a maturidade mais rapidamente. Como a nova planta surge de uma planta adulta ou de partes de uma planta, ela também será mais resistente do que uma muda. A reprodução assexuada pode ocorrer por meios naturais ou artificiais (assistidos por humanos).


2 Bioenergética do Desenvolvimento do Ecossistema

Os atributos 1 a 5 na Tabela 1 representam a bioenergética do ecossistema. Nos estágios iniciais da sucessão ecológica, ou em natureza jovem, por assim dizer, a taxa de produção primária ou fotossíntese total (bruta) (P) excede a taxa de respiração da comunidade (R), de modo que a relação P / R seja maior que 1. No caso especial da poluição orgânica, a relação P / R é tipicamente menor que 1. Em ambos os casos, no entanto, a teoria é que P / R se aproxima de 1 conforme a sucessão ocorre. Em outras palavras, a energia fixa tende a ser equilibrada pelo custo da energia de manutenção (ou seja, a respiração total da comunidade) no adulto ou clímax ecossistema. A relação P / R, portanto, deve ser um excelente índice funcional da maturidade relativa do sistema.

Enquanto P exceder R, matéria orgânica e biomassa (B) irão se acumular no sistema (Tabela 1, item 6), com o resultado que a relação P / B tenderá a diminuir ou, inversamente, o B / P, B / As relações R ou B / E (onde E = P / R) aumentarão (Tabela 1, itens 2 e 3). Teoricamente, então, a quantidade de biomassa da cultura em pé suportada pelo fluxo de energia disponível (E) aumenta ao máximo nos estágios de maturidade ou clímax (Tabela 1, item 3). Como consequência, a produção líquida da comunidade, ou rendimento, em um ciclo anual é grande na natureza jovem e pequena ou nula na natureza madura (Tabela 1, item 4).


Ciclo de vida e adaptabilidade

Johnsongrass é um perene agressivo. Novos brotos de rizomas ou novas mudas brotarão durante o início até meados da primavera. As sementes começam a germinar quando as temperaturas do solo atingem 70 F, no entanto, novos brotos de rizomas brotarão quando as temperaturas do solo forem 60 F. Os brotos dos rizomas se desenvolvem mais rápido do que as mudas, aproveitando os carboidratos do rizoma acumulados durante o inverno. As plantas começam a produzir novos rizomas após o desenvolvimento de cinco a sete folhas verdadeiras. Isso ocorre aproximadamente três a seis semanas após a emergência. A floração começará seis a nove semanas após a emergência e as sementes viáveis ​​serão produzidas duas a três semanas após a floração. Durante o outono, o crescimento de Johnsongrass cessa quando as temperaturas do solo voltam a 60 F, tornando a planta dormente. Em Oklahoma, Johnsongrass começará a crescer no final de março, e novos rizomas começarão a se desenvolver no final de abril. A floração começará no início de junho e as sementes viáveis ​​aparecerão no final de junho. Além disso, novos rizomas, flores e sementes continuarão a ser produzidos até o início de novembro, quando as plantas ficarão dormentes.

Johnsongrass é adaptado a uma ampla variedade de tipos de solo em uma faixa de pH de 5 a 7,5. Portanto, Johnsongrass é encontrado principalmente em terras aráveis, pomares, terrenos baldios abertos, margens de estradas, pastagens, canais irrigados e valas. Ela cresce melhor em solos férteis de várzea. Não está adaptado a solos argilosos mal drenados, mas pode tolerar curtos períodos de inundação. A produção de rizomas também é afetada pelo tipo de solo. Maior produção e profundidade de rizomas ocorrerão em solos de textura mais clara. Por exemplo, solos argilosos permitirão apenas metade dos rizomas que podem ser produzidos em solos franco-arenosos. Além disso, a maioria dos rizomas em solos argilosos e franco-arenosos atingem profundidades de 3 e 5 polegadas, respectivamente.


Engenharia Metabólica para Produção de Combustíveis Biorrenováveis ​​e Produtos Químicos: Contribuições da Biologia Sintética

A produção de combustíveis e produtos químicos por meio da fermentação microbiana de material vegetal é uma alternativa desejável à produção baseada na petroquímica. A produção fermentativa de combustíveis biorrenováveis ​​e produtos químicos requer a engenharia de biocatalisadores que podem converter açúcares em produtos-alvo de maneira rápida e eficiente, a um custo competitivo com os processos petroquímicos existentes. Também é importante que os biocatalisadores sejam robustos para condições extremas de fermentação, inibidores derivados de biomassa e seus produtos-alvo. A engenharia metabólica tradicional tem feito grandes avanços nesta área, mas a biologia sintética tem contribuído e continuará a contribuir para este campo, particularmente com biocombustíveis de próxima geração. Este trabalho revisa o uso da engenharia metabólica e da biologia sintética na engenharia de biocatalisadores para a produção de combustíveis biorrenováveis ​​e produtos químicos, como etanol, butanol, acetato, lactato, succinato, alanina e xilitol. Também examinamos os desafios existentes nesta área e discutimos estratégias para melhorar a tolerância do biocatalisador a inibidores químicos.

1. Introdução

A sociedade humana sempre dependeu do carbono e da energia derivados da biomassa para nutrição e sobrevivência. Na história recente, também nos tornamos dependentes de carbono e energia derivados do petróleo para produtos químicos e combustíveis de commodities. No entanto, a natureza não renovável do petróleo contrasta fortemente com o carbono e a energia renováveis ​​presentes na biomassa, onde a biomassa é essencialmente uma unidade de armazenamento temporário para o carbono atmosférico e energia derivada da luz solar. Assim, há uma demanda crescente para desenvolver e implementar estratégias para a produção de commodities químicas e combustíveis a partir de biomassa em vez de petróleo. Especificamente, neste trabalho estamos interessados ​​na fermentação microbiana de açúcares derivados de biomassa para combustíveis e produtos químicos.

Para que um processo de fermentação concorra com os processos existentes à base de petróleo, o produto químico alvo deve ser produzido com alto rendimento, título e produtividade. Às vezes, existem restrições adicionais no processo de fermentação, como a presença de inibidores potentes no hidrolisado de biomassa ou a necessidade de operar em um pH ou temperatura extremas [1]. Esses objetivos podem ser difíceis de atingir com micróbios que ocorrem naturalmente. Portanto, microrganismos com essas características desejadas muitas vezes devem ser desenvolvidos, seja pela modificação dos micróbios existentes ou pela de novo concepção de novos micróbios. Embora um progresso significativo tenha sido feito no sentido de de novo design [2, 3], este trabalho enfoca a modificação de micróbios existentes.

A humanidade há muito confia em biocatalisadores microbianos para a produção de alimentos e bebidas fermentados e biocatalisadores eucarióticos para alimentos e têxteis. Nós modificamos lentamente esses biocatalisadores, selecionando as características desejáveis, sem compreender os mecanismos biológicos subjacentes. Mas com a elucidação do código biológico e o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, agora temos as ferramentas para fazer mais do que apenas selecionar características observáveis ​​- agora somos capazes de modificar e projetar racionalmente vias metabólicas, proteínas e até organismos inteiros.

Muitas dessas modificações racionais ocorreram na forma de Engenharia Metabólica. A Engenharia Metabólica foi definida em 1991 [4, 5] e aqui usamos a definição de “a melhoria direcionada da produção, formação ou propriedades celulares por meio da modificação de reações bioquímicas específicas ou a introdução de novas com o uso da tecnologia de DNA recombinante ”[6]. Embora a Engenharia Metabólica tenha permitido avanços extraordinários na produção de commodities químicas e combustíveis a partir da biomassa, alguns dos quais são discutidos neste trabalho, agora chegamos ao ponto em que funções biológicas que não existem na natureza são desejadas. A biologia sintética visa desenvolver e fornecer essas funções biológicas não naturais.

Por muitos anos, o termo Biologia Sintética foi usado para descrever conceitos que seriam classificados hoje como Engenharia Metabólica [7]. No entanto, nos últimos 10 anos, termos como "moléculas orgânicas não naturais" [7], "sistemas químicos não naturais [8]," novos comportamentos "[9]," sistemas artificiais inspirados na biologia "[10] e" funções que não existem na natureza ”[11] têm sido usados ​​para descrever a Biologia Sintética. Para os fins desta revisão, aplicaremos a definição de Biologia Sintética de “o projeto e construção de novos componentes biológicos, como enzimas, circuitos genéticos e células, ou o redesenho de sistemas biológicos existentes” [12].

A biologia sintética tem aplicação em muitos campos, incluindo síntese livre de células [13], engenharia de tecidos e plantas [14] e descoberta de drogas [15], mas aqui estamos interessados ​​na modificação de micróbios para a produção biorrenovável de produtos químicos e combustíveis. . Outras revisões recentes também trataram deste tópico [16–18].

A biologia sintética para a produção de um composto alvo pode ser expressa como uma sequência dos seguintes eventos, cada um dos quais será discutido em mais detalhes e demonstrado abaixo.

Projete as vias metabólicas e as propriedades fenotípicas do sistema desejado. Quais são os substratos e produtos desejados? Quais são os estressores ambientais esperados?

Escolha um organismo hospedeiro apropriado (chassi) com base nos seguintes critérios. Quais organismos apresentam pelo menos algumas das propriedades desejadas? Quão bem caracterizados e anotados são esses organismos? Existem ferramentas de biologia molecular para modificação deste chassi?

Formule uma abordagem de implementação. Quais modificações são necessárias para atingir as vias e propriedades identificadas na etapa? As vias metabólicas precisam ser adicionadas, removidas ou ajustadas? O caminho ou fenótipo desejado existe na natureza ou precisa ser projetado de novo?

Otimize o sistema redesenhado e avalie as propriedades do sistema em relação ao ideal. O chassi pode ser melhorado ainda mais?

Mesmo um biocatalisador simples, como o burro de carga de laboratório Escherichia coli[ 21]. A biologia de sistemas, a padronização dos sistemas biológicos e a evolução metabólica são vitais para a compensação dessa desconexão entre os comportamentos biocatalisadores esperados e reais. Por meio de uma combinação dessas técnicas poderosas, os biocatalisadores foram reprojetados para a produção de uma variedade surpreendente de combustíveis e produtos químicos, naturais e não naturais (Figura 1 e Tabela 1). Aqui, discutimos exemplos de sucesso envolvendo a produção de combustíveis e produtos químicos básicos, com foco em D- e L-lactato, L-alanina, succinato, etanol e butanol.


2. Métodos e ferramentas para o redesenho do biocatalisador

2.1. Chassis

Um chassi robusto e estável permite a produção eficiente e econômica de combustíveis e produtos químicos em nível industrial. Uma vez que estamos especificamente interessados ​​em biocatalisadores que podem utilizar biomassa, um chassi desejável tem as seguintes características: (1) crescimento em meio de sais minerais com fontes de carbono baratas, (2) utilização de açúcares hexose e pentose, de modo que todos os componentes de açúcar em biomassa lignocelulósica pode ser convertida no produto desejado, (3) alta taxa metabólica, essencial para alta taxa de produtividade, (4) processo de fermentação simples para reduzir o custo de manipulação e minimizar riscos de falha na produção em grande escala, (5) organismo robusto (alta temperatura e baixo pH quando possível) para reduzir a necessidade de celulase externa durante a degradação da celulose, bem como para reduzir a quantidade necessária de adição de base, (6) facilidade de manipulação genética e estabilidade genética, (7) resistência aos inibidores produzidos durante o processo de pré-tratamento de biomassa, e (8) tolerância a altas concentrações de substrato e produto, a fim de obter altos títulos de composto alvo.

Bactérias entéricas, especialmente E. coli, têm muitas das características fisiológicas acima mencionadas e são, portanto, um excelente chassis para biologia sintética. A maioria dos exemplos discutidos aqui usam E. coli, mas outros sistemas de modelo microbiano importantes foram redesenhados, incluindo Clostridium acetobutylicum [28], Corynebacterium glutamicum [29], Saccharomyces cerevisiae [30], e Aspergillus niger [31]. E. coli tem sido usado como organismo modelo desde o início da engenharia genética [32]. Enquanto K-12 cepa MG1655 (ATCC # 47076) é um dos mais comumente usados E. coli cepas [33], existem outras linhagens, como B (ATCC # 11303), C (ATCC # 8739) e W (ATCC # 9637), que também são geralmente consideradas seguras, uma vez que são incapazes de colonizar o intestino humano [34]. Embora K-12 seja a cepa mais caracterizada e amplamente utilizada, E. coli W (ATCC # 9637) e C (ATCC # 8739) provaram ser melhores chassis para sintetizar combustíveis e produtos químicos. Por exemplo, as cepas derivadas de K-12 foram incapazes de fermentar completamente 10% (p / v) de glicose em meio complexo ou de sais minerais [1, 35], enquanto os derivados das cepas W ou C podem fermentar completamente mais de 10% ( w / v) de glicose com maior crescimento celular e taxas de utilização de açúcar do que K-12. Adicionalmente, E. coli As cepas W têm a capacidade nativa de fermentar a sacarose [1,36].

Genes estranhos podem ser instáveis ​​em células hospedeiras devido à recombinação facilitada por elementos de DNA móveis e, portanto, os elementos de DNA móveis em E. coli A cepa K-12 foi deletada [37]. Essa estratégia de construção de genoma mínimo é uma abordagem excelente para melhorar esse chassi para a produção de combustíveis e produtos químicos.

2.2. Ferramentas de Biologia de Sistemas
2.2.1. Modelos em escala de genoma e simulação In Silico

Dada a base racional da engenharia metabólica e da biologia sintética, os modelos e simulações são ferramentas e preditivas críticas. O sequenciamento do genoma e as ferramentas de anotação automática permitiram a construção de modelos metabólicos em escala do genoma de quase 20 microrganismos [38]. Esses modelos baseados em restrições e em sílico simulações podem ser usadas para prever a redistribuição do fluxo metabólico após a manipulação genética, ou para prever outras funções celulares, como preferência de substrato, resultados da evolução adaptativa e mudanças nos perfis de expressão [39]. Eles também podem ajudar no projeto de caminhos para obter os fenótipos desejados [40-42]. Por exemplo, o E. coli iO modelo GSM JE660a foi usado para simular com sucesso nocautes de um e vários genes para melhorar a produção de licopeno [42]. A estrutura computacional, Optknock, foi desenvolvida para identificar alvos de exclusão de genes para otimização do sistema [41], e os resultados da simulação para deleções de genes para produção de succinato, lactato e 1,3-propanodiol estavam de acordo com os dados experimentais. Outro programa de simulação, OptStrain, foi desenvolvido para guiar a modificação da via metabólica para a produção do composto alvo, através da adição de reações metabólicas heterólogas e deleção de reações nativas [40]. No entanto, a maioria dos modelos atuais tem apenas informações estequiométricas, enquanto os efeitos cinéticos e regulatórios não estão incluídos [38, 39]. A integração de informações cinéticas e regulatórias melhorará a precisão e o poder preditivo desses modelos.

2.2.2. Análise Omics de alto rendimento

A análise ômica de alto rendimento, como transcriptoma, proteoma, metaboloma e fluxome [43-45], auxilia na caracterização da função celular em vários níveis e, portanto, fornece uma capacidade de "depuração" para otimização do sistema [12, 45].

As manipulações genéticas podem perturbar o equilíbrio metabólico ou prejudicar o crescimento celular devido ao esgotamento de precursores importantes [46, 47], acúmulo de intermediários tóxicos [48] ou desequilíbrio redox [1]. Por exemplo, altos níveis de NADH em E. coli reengenharia para a produção de etanol inibiu a atividade da citrato sintase, limitando assim o crescimento celular ao diminuir a produção do metabólito crítico 2-cetoglutarato [49]. A análise do metaboloma e do fluxoma pode identificar rapidamente os metabólitos limitantes ou a distribuição alterada do fluxo metabólico, fornecendo a base para a resolução de problemas [45, 50]. Por exemplo, medições de metabólitos de Aspergillus terreus foram implementados no redesenho metabólico racional para aumento da produção de lovastatina [45, 50]. Mudanças nos perfis de mRNA e proteínas podem ser identificadas por transcriptoma e análise de proteoma, fornecendo alvos genéticos para engenharia adicional [46, 47]. O trabalho de Choi et al. demonstrar este conceito: análise do transcriptoma de E. coli a produção da proteína de fusão do fator de crescimento semelhante à insulina humana I auxiliou na seleção de alvos para a deleção do gene. A cepa redesenhada resultante mostrou um aumento maior que 2 vezes no título do produto e na produtividade volumétrica [46, 47]. Além disso, a análise comparativa da sequência do genoma facilita a identificação de genes ou reguladores mutantes durante a evolução, e essas mutações podem ser usadas para redesenhar os sistemas para uma melhor capacidade sintética. Por exemplo, em um esforço descrito como "reconstrução de cepas com base no genoma", cepas evoluídas de Corneybacterium glutamicum selecionados para a produção de L-lisina foram comparados com a cepa parental, e foram encontradas mutações que foram propostas como benéficas para a produção de L-lisina. Três dessas mutações foram introduzidas na cepa parental e permitiram a produção de até 3,0 g / L / hr L-lisina [51].

2.3. Ferramentas de manipulação genética
2.3.1. Exclusão do gene

A deleção do gene pode redistribuir o fluxo de carbono em direção ao produto alvo, eliminando genes críticos para as vias metabólicas concorrentes e, portanto, é amplamente utilizada em estratégias de redesenho metabólico. A recombinação homóloga é a estratégia mais frequentemente usada para a deleção do gene (Figura 2). Historicamente, plasmídeos contendo um marcador selecionável flanqueado por fragmentos de DNA homólogos ao gene alvo e tanto sensíveis à temperatura quanto replicons condicionais eram necessários para a deleção de gene eficiente em bactérias [52] (Figura 2 (a)). Em contraste, os genes podem ser interrompidos diretamente na levedura por fragmentos de PCR linear com fragmentos de DNA flanqueadores curtos homólogos ao DNA cromossômico. O DNA linear não é tão fácil de se transformar em E. coli devido ao sistema de exonuclease intracelular e baixa eficiência de recombinação. Sistemas de deleção de genes baseados em bacteriófagos

A recombinase vermelha facilita a deleção do gene cromossômico usando um fragmento de PCR linear [53]. Neste método, o gene cromossômico é substituído pelo marcador selecionável flanqueado por dois fragmentos FRT (alvo de reconhecimento FLP) (Figura 2 (b)) e então o marcador pode ser removido pela recombinase FLP [54]. No entanto, este método deixa uma cicatriz de 68 pb-FRT no cromossomo após cada excisão [52], reduzindo ainda mais a eficiência de exclusão do gene. O uso repetido deste sistema FRT / FLP para deleções de genes específicos tem o potencial de gerar grandes deleções cromossômicas não intencionais.


(uma)
(b)
(c)
(uma)
(b)
(c) Comparação de métodos de deleção de três genes em E. coli. Esses métodos também podem ser usados ​​em outras bactérias entéricas. O primeiro e o terceiro métodos também podem ser usados ​​para a integração do gene no cromossomo e a substituição do promotor para sintonizar a expressão do gene. 2 (a) método baseado em plasmídeo. Etapa

é a construção do plasmídeo de deleção contendo fragmentos de DNA homólogos ao gene alvo (h1 e h2), um marcador selecionável e um replicon sensível à temperatura ou condicional. Etapa

é a recombinação de cruzamento duplo que o plasmídeo não pode replicar na cepa hospedeira, e colônias resistentes a antibióticos são selecionadas. Em passo

, o FRT, o replicon e o marcador de resistência a antibióticos são removidos por FLP. 2 (b) Método baseado em DNA linear. Etapa

é a construção do fragmento linear de DNA por PCR (H1-P1 e H2-P2 como iniciadores). H1 e H2 referem-se a fragmentos curtos de DNA homólogos ao gene alvo. Etapa

é a substituição do gene alvo pelo gene de resistência a antibióticos por meio de recombinação cruzada com a ajuda da Red recombinase. Etapa

é a remoção de FRT e marcador antibiótico por FLP. 2 (c) Método baseado em recombinação de dois estágios desenvolvido em nosso laboratório. Passos

, 2, 3 e 5 descrevem a construção dos plasmídeos e fragmentos lineares de DNA para as recombinações de dois estágios. Etapa

descreve a primeira etapa de recombinação, na qual o gato, sacB cassete é inserido no gene alvo. Etapa

Para facilitar as exclusões de genes sequenciais, nosso laboratório desenvolveu uma estratégia de recombinação em dois estágios (Figura 2 (c)), usando a sensibilidade de E. coli sacarose quando Bacillus subtilis levansucrase (sacB) é expresso [24, 27, 55]. As deleções de genes criadas por este método não deixam DNA estranho, marcadores de resistência a antibióticos ou sequências de cicatrizes no local da exclusão. Na primeira recombinação, parte do gene alvo é substituído por um cassete de DNA contendo um gene de resistência ao cloranfenicol (gato) e gene levansucrase (sacB) Na segunda recombinação, o gato, sacB cassete é removido por seleção de resistência à sacarose. Células contendo o sacB genes acumulam levan durante a incubação com sacarose e são mortos [55]. Os recombinantes sobreviventes são altamente enriquecidos pela perda do gato, sacB cassete [24, 27].

2.3.2. Ajuste de expressão gênica

Assim como as deleções de genes, os sistemas de expressão baseados em plasmídeo são onipresentes no redesenho metabólico. No entanto, os sistemas baseados em plasmídeo têm várias desvantagens. (1) A manutenção do plasmídeo é uma carga metabólica na célula hospedeira, especialmente para plasmídeos de alto número de cópias [56]. Observe que números elevados de cópias não são essenciais, considerando que a maioria das enzimas metabólicas centrais são codificadas por um único gene (2) a expressão baseada em plasmídeo é dependente da estabilidade do plasmídeo, com apenas alguns plasmídeos de cópia unitária natural tendo a estabilidade desejada [12] ( 3) apenas plasmídeos de baixo número de cópias têm replicação que é sincronizada com o ciclo celular e, portanto, manter um número de cópias consistente em todas as células é um desafio [12] (4) o redesenho metabólico pode exigir a construção de uma via heteróloga complexa e, portanto, várias genes, codificados em grandes pedaços de DNA, precisam ser incorporados. A maioria dos plasmídeos comerciais tem dificuldade em transportar grandes fragmentos de DNA.

A integração cromossômica dos genes alvo, seguida pelo ajuste fino de sua expressão, pode eliminar esses problemas associados ao plasmídeo. A estratégia de recombinação em duas etapas acima mencionada para a deleção do gene também pode ser usada para a integração do gene ou substituição do promotor (Figura 2).

A expressão gênica em procariotos é controlada principalmente no nível transcricional e, portanto, o promotor é o elemento mais sintonizável. Enquanto promotores induzíveis, como laca e ara, têm sido tradicionalmente usados ​​para modular a expressão gênica, o uso de indutores em larga escala tem um custo proibitivo para a produção de combustíveis e produtos químicos a granel. No entanto, várias estratégias foram desenvolvidas para construir bibliotecas de promotores constitutivos para o ajuste fino da expressão gênica. Alguns métodos contam com o uso de promotores naturais. Por exemplo, Zymomonas mobilis DNA genômico foi usado para construir uma biblioteca de promotores para a triagem da expressão ideal de Erwinia chrysanthemi genes de endoglucanase (celY e celZ) no Klebsiella oxytoca P2 para melhorar a produção de etanol a partir da celulose [57]. Outros métodos baseiam-se na modificação aleatória de promotores existentes, como a randomização das sequências espaçadoras entre as sequências de consenso [58], ou mutagênese de um promotor constitutivo [59]. Este método de modificação do promotor foi usado para avaliar o impacto dos níveis de fosfoenolpiruvato carboxilase no rendimento celular e nos níveis de desoxi-xilulose-P sintase na produção de licopeno, e os níveis de expressão ideais desses genes foram identificados para o fenótipo desejado máximo [59]. Essas bibliotecas de promotores sintéticos também podem ser integradas diretamente no cromossomo, o que pode facilitar a modulação da expressão de genes cromossômicos [60, 61].

Os métodos de ajuste fino descritos acima dependem da seleção do melhor promotor natural ou da alteração aleatória dos promotores existentes. Um dos objetivos da biologia sintética é a construção de peças padrão, e os processos pós-transcricionais, como a terminação da transcrição, a degradação do mRNA e o início da tradução, foram projetados com esse objetivo em mente. Os exemplos incluem a construção de uma biblioteca sintética de estruturas secundárias 5 'para manipular com sucesso a estabilidade do mRNA [62] e a modulação do sítio de ligação ao ribossomo (RBS), bem como Shine-Dalgarno (SD) e sequências ricas em AU para sintonizar a expressão do gene em o processo de iniciação da tradução [60, 63]. Riborreguladores também foram desenvolvidos para sintonizar a expressão gênica via interações RNA-RNA [64]. Um método final de sintonia fina da expressão gênica é a otimização de códons, que pode melhorar a tradução de genes estranhos [65]. Essas sequências de genes otimizadas muitas vezes não existem na natureza e devem ser geradas usando técnicas de síntese de DNA.

Em muitos casos, mais de um gene precisa ser introduzido no chassi e a expressão desses genes precisa ser coordenada para atingir o desempenho biocatalisador desejado. Um desses métodos é a modulação da expressão de cada gene individual por meio de seu próprio promotor. No entanto, é difícil prever o nível de expressão apropriado de cada gene. Outra opção é combinar vários genes em um operon sintético com um único promotor e sintonizar a expressão de cada gene por meio de processos pós-transcricionais [12] com elementos de controle sintonizáveis ​​(como estrutura secundária de mRNA, locais de clivagem de RNase, locais de ligação de ribossomo e sequências sequestrantes) em regiões intergênicas. Bibliotecas de regiões intergênicas sintonizáveis ​​(TIGRs) foram geradas e selecionadas para sintonizar a expressão de vários genes em um operon [48]. Este método foi usado para coordenar a expressão de três genes em um operon que codifica uma via biossintética de mevalonato heteróloga, melhorando a produção de mevalonato em 7 vezes [48]. Outro método para controlar a expressão de mais de um gene é projetar maquinaria de transcrição global por mutagênese aleatória de fatores de transcrição [66, 67]. Este método foi mostrado para melhorar de forma eficiente a tolerância a compostos tóxicos e produção de metabólitos, e para alterar os fenótipos [66, 67].

2.3.3. Engenharia de Proteínas

As proteínas naturais podem não atender aos critérios necessários para o desempenho específico e eficiente do sistema e, portanto, a alteração para uma aplicação específica pode ser necessária. A evolução direcionada de proteínas oferece uma maneira de otimizar enzimas rapidamente, mesmo na ausência de informações estruturais ou mecanísticas [68]. Para a evolução dirigida, uma biblioteca de proteínas é geralmente gerada por mutagênese aleatória [68], recombinação de um gene alvo [69] ou uma família de genes relacionados [70] e, em seguida, a biblioteca é analisada por triagem de alto rendimento. Este método foi usado para aumentar com sucesso a atividade enzimática [71, 72], aumentar a solubilidade e expressão da proteína, inverter a enantiosseletividade e aumentar a estabilidade e atividade em ambientes incomuns [68]. Por exemplo, uma biblioteca de mutação da geranilgeranil difosfato sintase que codifica o gene de Archaeoglobus fulgidus foi gerado para rastrear mutantes com maior atividade, permitindo a produção de licopeno em E. coli. A triagem de mais de 2.000 variantes identificou oito com atividade aumentada, uma das quais aumentou a produção de licopeno em 100% [71].

De particular relevância para o campo da biologia sintética é a criação de uma nova atividade enzimática por meio da engenharia de proteínas [73, 74]. Por exemplo, a isomerização não natural de α-alanina para β-alanina foi obtida através da evolução de uma lisina 2,3-aminomutase para expandir sua especificidade de substrato para incluir α-alanina [73].

O design racional é outra ferramenta poderosa para aumentar as propriedades da proteína, especialmente com o auxílio de análise computacional [75, 76]. Com base no conhecimento da estrutura e função da proteína, pode-se prever qual (is) aminoácido (s) alterar para obter a função desejada. No redesenho de Lactobacillus brevis para a produção de álcoois secundários, desejava-se alterar a preferência do cofator da álcool desidrogenase R-específico de NADPH para NADH. Um modelo computacional baseado em estrutura foi usado para identificar substituições de aminoácidos potencialmente benéficas e uma dessas mudanças aumentou a atividade dependente de NADH em quatro vezes [77].

Embora esses exemplos demonstrem o poder do (re) design de enzimas racionais, essa abordagem requer informações detalhadas sobre a estrutura e o mecanismo da proteína, enquanto a mutagênese aleatória não. Avanços recentes combinaram evolução dirigida e design racional em uma abordagem chamada "semirracional" para melhorar com sucesso a atividade enzimática quando apenas informações limitadas estão disponíveis [78, 79]. Quando a mutagênese é limitada a resíduos específicos, escolhidos a partir do conhecimento estrutural ou funcional existente, essas bibliotecas "inteligentes" têm maior probabilidade de produzir resultados positivos [79]. Por exemplo, a atividade catalítica da piranose-2-oxidase foi melhorada por mutagênese do sítio ativo conhecido [80].

Embora os 20 aminoácidos naturais forneçam às enzimas uma ampla gama de atividades possíveis, essa gama pode ser expandida ainda mais pelo uso de aminoácidos não naturais (UAAs). Existem mais de 40 UAAs disponíveis neste momento e eles têm sido usados ​​para sondar a função da proteína, fotocage resíduos críticos e alterar as propriedades de metaloproteína [81, 82]. Embora essa tecnologia ainda esteja em estágio de desenvolvimento, pelo menos um estudo mostrou uma melhora na atividade enzimática após a inserção de UAAs. Site 124 de E. coliA nitro-redutase foi substituída por uma variedade de aminoácidos naturais e não naturais e certas variantes de UAA tiveram um aumento maior que 2 vezes na atividade em relação à melhor variante de aminoácido natural [83]. Esta abordagem biomimética foi expandida para outros metabólitos, como carboidratos [84] e lipídios [85].

2.4. Evolução

Conforme descrito acima, um biocatalisador robusto com alto rendimento, título e produtividade é crítico para um processo de fermentação competir com a produção baseada em petroquímica. Os modelos atuais e as ferramentas de simulação fornecem uma estrutura, dadas as restrições das funções conhecidas de proteínas. Mas as muitas reações e enzimas que permanecem não caracterizadas não podem ser incluídas nesta análise teórica. Portanto, os métodos de design racional geralmente resultam em um biocatalisador que tem um desempenho insatisfatório em relação ao modelo. A evolução metabólica fornece uma abordagem complementar para melhorar a produtividade e robustez do biocatalisador, dependendo do projeto de uma pressão de seleção apropriada. Sempre que possível, a síntese do composto alvo pode ser acoplada à produção de ATP, equilíbrio redox ou metabólitos-chave que são essenciais para o crescimento e a seleção para melhorias no crescimento durante a evolução metabólica (transferências em série) pode ser usada para co-selecionar para taxas mais altas ou títulos de compostos alvo (Figura 3). Tanto o balanço redox quanto a produção líquida de ATP em tal sistema sintético são requisitos para uma evolução bem-sucedida.


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(c) Evolução metabólica para melhorar a produção de L-alanina em E. coli [27]. 3 (a) Via metabólica redesenhada para a produção de L-alanina: a produção de ATP e o crescimento celular são acoplados à oxidação de NADH e à produção de L-alanina. 3 (b) A evolução direcionada melhora o crescimento celular. A cepa parental XZ112 atinge uma massa celular máxima de 0,7 gL -1 após 48 horas de fermentação, a cepa evoluída XZ113 atinge 0,7 gL -1 após 24 horas e um máximo de 0,9 gL -1 após 48 horas 3 (c) evolução metabólica para melhorar o crescimento celular também melhora a produção de alanina. A cepa parental XZ112 produz alanina 355 mM após 72 horas de fermentação, a cepa desenvolvida XZ113 produz 484 mM em 48 horas.

Usamos esta estratégia de evolução metabólica para otimizar biocatalisadores reprojetados para a produção de vários produtos de fermentação [1], incluindo etanol, D-lactato, L-lactato, L-alanina (Figura 3) e succinato, conforme descrito em mais detalhes abaixo. Um esquema de projeto frequentemente usado é acoplar a síntese do produto alvo ao crescimento, inativando as vias de consumo de NADH concorrentes. Assim, a única maneira de as células regenerarem NAD + para glicólise é produzir o composto alvo. O aumento do crescimento celular, suportado por uma maior taxa de produção de ATP durante a glicólise, é acoplado a uma maior taxa de oxidação de NADH e, portanto, fortemente acoplado à síntese do produto alvo. Esta estratégia de evolução demonstrou aumentar a produtividade em até duas ordens de magnitude.

Estruturas computacionais baseadas em modelos metabólicos em escala de genoma têm sido usados ​​para construir biocatalisadores que acoplam a formação de biomassa com a produção química [40, 41] e, portanto, fornecem uma base para pressão seletiva para alta produtividade. Por exemplo, Optknock identificou alvos de deleção de genes para a construção de produtos produtores de lactato E. coli, e então a evolução direcionada melhorou a capacidade de produção [86]. Embora o projeto racional de vias metabólicas com base em modelos metabólicos atuais seja um método comum para maximizar o rendimento do composto alvo, este método nem sempre é a melhor estratégia, devido ao nosso conhecimento limitado da complicada rede metabólica e cinética dinâmica de cada reação. A evolução metabólica fornece um excelente método alternativo para melhoria da tensão, através do qual reações que não são atualmente previsíveis seriam selecionadas para melhorar o desempenho do biocatalisador [87]. À medida que nosso conhecimento sobre o comportamento e o metabolismo do biocatalisador melhora, os modelos preditivos se tornarão ainda mais poderosos.

3. Redesenhar por meio da modificação de caminhos existentes

Nesta seção, destacamos projetos que redesenharam um chassi para produzir compostos alvo com alto rendimento e titulação sem a introdução de caminhos estranhos. Na próxima seção, descrevemos os redesenhos do biocatalisador que usaram vias estranhas ou não naturais.

3.1. Succinato

Succinato, um ácido dicarboxílico de quatro carbonos, é atualmente usado como uma especialidade química nas indústrias alimentícia, agrícola e farmacêutica [88], mas também pode servir como um ponto de partida para a síntese de produtos químicos usados ​​em plásticos e solventes, com potencial mercado global de US $ 15 bilhões [89]. O succinato é produzido principalmente a partir do petróleo e há considerável interesse na produção fermentativa de succinato a partir de açúcares [89].

Várias bactérias ruminais podem produzir succinato a partir de açúcares com alto rendimento e produtividade [90-92], mas requerem nutrientes complexos. Alternativamente, cepas nativas de E. coli fermentar a glicose efetivamente em meio de sais minerais simples, mas produzir succinato apenas como um produto secundário [93]. Portanto E. coli cepa C (ATCC 8739) foi redesenhada para a produção de succinato em alto rendimento, título e produtividade [94].

A estratégia de redesenho inicial focou na inativação das vias competitivas, especificamente na deleção da lactato desidrogenase (ldhA), álcool / aldeído desidrogenase (adhE), e acetato quinase (ackA)No entanto, a cepa resultante cresceu pouco em meio de sais minerais sob condições anaeróbicas e acumulou apenas vestígios de succinato. Como a oxidação de NADH está acoplada à síntese de succinato nesta cepa, a evolução metabólica foi usada para melhorar o crescimento celular e a produção de succinato. Após a inativação da piruvato formato-liase e metilglioxal sintase para eliminar a produção de formato e lactato, a cepa final, KJ073, produziu cerca de 670 mM de succinato (80 g / L) em meio de sais minerais com alto rendimento (1,2 mol / mol de glicose) e alta produtividade (0,82 g / L / h) [94]. Inativação da treonina descarboxilase (tdcD), 2-cetobutirato formato-liase (tdcE), e aspartato aminotransferase (aspC) aumentou ainda mais o rendimento de succinato (1,5 mol / mol de glicose), título (700 mM) e produtividade (0,9 g / L / h) [24].

Apesar de seu poder em melhorar o desempenho do biocatalisador, a evolução metabólica tem a propriedade indesejável de ser uma caixa preta. As cepas evoluídas mostram as propriedades desejadas do biocatalisador, mas o processo de evolução metabólica não melhora nossa compreensão do biocatalisador. Portanto, a engenharia reversa de cepas evoluídas pode nos ajudar a identificar as principais mutações que podem ser aplicadas racionalmente a outros biocatalisadores. A engenharia reversa da cepa produtora de succinato revelou duas mudanças significativas no metabolismo celular que aumentaram a eficiência energética [87]. A primeira mudança é que PEP carboxicinase (pck), que normalmente funciona na gliconeogênese durante o metabolismo oxidativo dos ácidos orgânicos [90, 95, 96], tornou-se a principal via de carboxilação para a produção de succinato. Expressão de alto nível de CO dominado por PCK2 fixação e aumento do rendimento de ATP (1 ATP por oxaloacetato produzido). A segunda mudança é que o sistema nativo de fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato- (PEP-) para captação de glicose foi inativado e substituído por uma via alternativa de captação de glicose: GalP permease (galP) e glucoquinase (glk) Essas mudanças aumentaram o pool de PEP disponível para manter o equilíbrio redox, bem como aumentaram a eficiência energética ao eliminar a necessidade de produzir PEP adicional a partir do piruvato, uma reação que requer dois equivalentes de ATP [97].

Embora o design racional baseado na compreensão metabólica atual seja um componente-chave da engenharia metabólica e da biologia sintética, nossa compreensão limitada da complicada rede metabólica e da cinética dinâmica de cada reação pode levar ao fracasso dos modelos preditivos. Neste exemplo, a evolução metabólica foi demonstrada como um excelente método alternativo para melhoria da tensão, através do qual reações atualmente imprevisíveis seriam selecionadas para expandir a capacidade metabólica celular [87]. Ao compreender as mutações que permitiram o desempenho desejável da cepa produtora de succinato, temos mais opções disponíveis para o redesenho de sistemas futuros. Para demonstrar isso, E. coli foi novamente redesenhado com base nas descobertas da cepa evoluída [98]. Desta vez, a estratégia de design mudou da inativação de vias de fermentação competitivas para o recrutamento de vias de conservação de energia para a produção eficiente de succinato (Figura 4 (e)). Depois de aumentar pck expressão gênica e inativação do sistema PTS de glicose nativo, o sistema nativo E. coli sistema metabólico foi convertido em um sistema sintético de succinato eficiente, equivalente à via nativa de bactérias ruminais produtoras de succinato [98].


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(e) Vias sintéticas de E. coli para a produção de combustíveis e produtos químicos em nosso laboratório: 4 (a) Vias metabólicas nativas de fermentação de glicose em E. coli 4 (b) vias sintéticas para produção de D-lactato, etanol, L-lactato e L-alanina 4 (c) vias sintéticas para produção de piruvato e acetato 4 (d) via sintética para produção de xilitol, 4 (e) sintético caminho para a produção de succinato. ★ indica a exclusão do gene. Genes e enzimas: ackA, acetato quinase adhAB, álcool desidrogenase (Z. mobilis) adhE, álcool / aldeído desidrogenase alaD, L-alanina desidrogenase (G. stearothermophilus) crr, componente IIA da enzima fosfotransferase específica da glicose frd, fumarato redutase fum, fumarase galP, simportador de galactose-próton (glicose permease) glk, glucoquinase ldhA, D-lactato desidrogenase ldhL, L-lactato desidrogenase (P. acidilactici) mdh, malato desidrogenase pdc, piruvato descarboxilase pflB, piruvato formato-liase ppc, fosfoenolpiruvato carboxilase pta, fosfato acetiltransferase ptsG, Componente EIICB específico da glicose do sistema PTS ptsH, proteína fosfocarrier HPr ptsI, fosfoenolpiruvato-proteína fosfotransferase (sistema Fosfotransferase, enzima I) pyk, piruvato quinase xrd, xilose redutase (C. boidinii) xylB, xiluloquinase. Metabólitos: G6P, glicose-6-fosfato G3P, glicerol-3-fosfato PEP, fosfoenol piruvato X5P, D-xilulose-5-fosfato.
3.2. D-Lactato

O D-lactato é amplamente utilizado como uma especialidade química na indústria alimentícia e farmacêutica. Também pode ser combinado com L-lactato para a produção de ácido polilático (PLA), um plástico biorrenovável e biodegradável cada vez mais popular [99, 100] cujo sucesso comercial obviamente depende do custo de produção. Embora a glicose seja o substrato atual para a produção fermentativa de lactato, é desejável produzir este produto químico a partir de matéria-prima lignocelulósica, que contém uma mistura de açúcares. Algumas bactérias de ácido láctico têm a capacidade nativa desejável de produzir grande quantidade de D-lactato em condições de pH baixo, onde o pH baixo reduz o custo do processo [101, 102]. No entanto, essas bactérias lácticas requerem nutrientes complexos e muitas delas não têm a capacidade de fermentar os açúcares pentose. As bactérias do ácido láctico que fermentam os açúcares da pentose, infelizmente, produzem uma mistura de lactato e acetato e, portanto, não são um bom chassi para a produção comercial de D-lactato. Enquanto E. coli pode fermentar muitos açúcares efetivamente em um meio simples de sais minerais, a produtividade inerente de D-lactato é baixa e outros metabólitos indesejáveis ​​também são produzidos [103]. Portanto, o E. coli sistema metabólico foi redesenhado para atingir as propriedades desejadas de alto rendimento e produtividade de D-lactato.

E. coli a cepa W3110 foi usada como base para a produção de D-lactato com uma estratégia de redesenho que focou na inativação de vias de fermentação competitivas [104]. Depois de deletar os genes que codificam a fumarato redutase (frdABCD), álcool / aldeído desidrogenase (adhE), piruvato formato liase (pflB), e acetato quinase (ackA), a cepa resultante, SZ63, só pode oxidar NADH por meio da síntese de D-lactato (Figura 4 (b)). Embora esta cepa possa utilizar completamente 5% (p / v) de glicose em um meio de sais minerais com um rendimento próximo ao máximo teórico (96%), a produtividade volumétrica de D-lactato de 0,42 g / L / h foi relativamente baixa em comparação com o ácido láctico bactérias [35]. Além disso, esta cepa não pode utilizar sacarose nem utilizar completamente 10% (p / v) de açúcar [35]. Portanto, um E. coli A cepa derivada W foi escolhida como base para uma produção mais robusta de D-lactato [35, 105]. Após redesenhar o metabolismo central para que a produção de D-lactato fosse o único meio de oxidar NADH, a evolução metabólica foi usada para melhorar ainda mais o crescimento celular e a produtividade de D-lactato. A cepa resultante, SZ194, consumiu eficientemente 12% (p / v) de glicose em meio de sais minerais e produziu 110 g / L de D-lactato [105] com uma produtividade volumétrica de 2,14 g / L / h, um aumento de 5 vezes sobre o derivado W3110. O biocatalisador foi otimizado ainda mais pela exclusão do gene da metilglioxal sintase (mgsA) para eliminar a produção de L-lactato e, por evolução metabólica, para aumentar o rendimento e a produtividade. A cepa final produtora de D-lactato, TG114, pode converter 12% (p / v) de glicose em 118 g / L de D-lactato com excelente rendimento (98%) e produtividade (2,88 g / L / h) [22].

3.3. Acetato

O acetato é uma commodity química com produção mundial em 2001 estimada em 6,8 milhões de toneladas métricas [23]. A produção biológica de acetato representa apenas 10% da produção mundial, principalmente na forma de vinagre, com o restante da produção por meio de rotas petroquímicas [106-108]. A produção biológica de commodities químicas tem historicamente focado na produção anaeróbia de produtos reduzidos, desde a perda de substrato como massa celular e CO2 é mínimo e os rendimentos do produto são altos. Em contraste, o acetato é um produto químico oxidado e a produção biológica tradicional envolve um processo complexo de duas fases: a fermentação de açúcares em etanol por Saccharomyces, seguido por oxidação aeróbia de etanol em acetato por Acetobacter [106–108]. Para permitir a produção microbiana de produtos redox neutros ou oxidados com alto rendimento, o metabolismo do biocatalisador precisa ser redesenhado para combinar atributos dos metabolismos fermentativo e oxidativo.

Redesenho de E. coli O metabolismo do W3110 para a produção de acetato focado em três vias principais: metabolismo fermentativo, metabolismo oxidativo e fornecimento de energia (Figura 4 (c)) [23]. As vias de fermentação competitivas (pflB, ldhA, frd, adhE) foram inativados para evitar o consumo do precursor piruvato comum, e o ciclo do ácido tricarboxílico oxidativo (TCA) foi interrompido para reduzir a perda de carbono como CO2. Finalmente, a fosforilação oxidativa foi interrompida (atpFH) para reduzir a produção de ATP, mantendo a capacidade de oxidar NADH pelo sistema de transporte de elétrons, aumentando assim o fluxo glicolítico para mais produção de ATP por meio de fosforilação em nível de substrato. Embora projetada racionalmente, a cepa resultante, TC32, tinha uma necessidade auxotrófica indesejável de succinato durante o crescimento em meio mínimo de glicose. Evolution foi usado para eliminar esta auxotrofia e a cepa final, TC36, produziu 878 mM de acetato (53 g / L) em meio de sais minerais com 75% do rendimento teórico máximo. Embora este seja um título mais baixo do que o acetato produzido a partir da oxidação do etanol por Acetobacter, TC36 tem uma taxa de produção duas vezes maior, requer apenas meio de sais minerais e pode metabolizar uma ampla gama de fontes de carbono em um processo simples de uma etapa [23].

3.4. Outros

O butanol é um excelente combustível alternativo para transporte com várias vantagens em comparação ao etanol, incluindo maior conteúdo de energia, menor volatilidade, menos hidroscopicidade e menos corrosividade [109]. Redesenho de E. coli para a produção de butanol é discutida abaixo. C. acetobutylicum O ATCC 824 produz butanol naturalmente e foi redesenhado para aumentar a produção de butanol e diminuir o acúmulo de coprodutos. Modificações do tipo de engenharia metabólica, como a superexpressão da via de formação da acetona para aumentar a formação do precursor butanol butiril-CoA, a inativação do repressor transcricional SolR e a superexpressão de álcool / aldeído desidrogenase aumentaram a produção de butanol [110-112]. Em um excelente exemplo de aplicações do tipo biologia sintética, a expressão do gene da butirato quinase foi ajustada por um RNA antisense projetado racionalmente para aumentar a produção de butanol [113].

O 1,2-propanodiol (1,2-PD) é um produto químico importante atualmente derivado do propileno. E. coli naturalmente produz baixas quantidades de 1,2-PD e, portanto, seu metabolismo foi redesenhado para produzir 1,2-PD com alto rendimento e título de glicose, isto foi alcançado pela inativação de vias concorrentes (lactato desidrogenase e glioxalase I) e superexpressão de genes essenciais da via sintética de 1,2-PD (metilglioxal sintase, glicerol desidrogenase e 1,2-PD oxidoredutase) [114]. A evolução também foi usada em combinação com o design racional para aumentar a produção de 1,2-PD [115].

A L-valina, um aminoácido hidrofóbico essencial e de cadeia ramificada, é usada em cosméticos, produtos farmacêuticos e aditivos para rações animais [116]. E. coli foi reprojetado para a produção de L-valina em alto rendimento e título de glicose por meio de uma combinação de engenharia metabólica tradicional e biologia sintética. A engenharia metabólica tradicional foi usada para inativar as vias concorrentes e superexpressar a acetohidroxiácido sintase I (ilvBN), parte da via de biossíntese de valina. Infelizmente, o E. coli O chassi possui elementos regulatórios que controlam rigidamente a biossíntese de L-valina, dificultando a produção de valina com alto rendimento e titulação. A inibição por feedback foi eliminada por mutagênese dirigida ao local racional da acetohidroxiácido sintase III. Em uma excelente demonstração das técnicas de ajuste de expressão gênica discutidas acima, a atenuação transcricional dos genes da biossíntese de valina ilvGMEDA foi eliminado substituindo a região do líder atenuador pelo constitutivo tac promotor. Análise do transcriptoma e em sílico seleção guiada por simulação de genes-alvo adicionais para amplificação e deleção, e o biocatalisador final produziu 0,378 g L-valina por g de glicose, dando um título de 7,55 g / L de valina a partir de 20% (p / v) de glicose [116]. Uma estratégia semelhante também foi usada para a produção de L-treonina [117].

4. Redesenhar por meio da introdução de vias estranhas ou não naturais

4.1. Caminhos Estrangeiros
4.1.1. Etanol

O etanol é um combustível renovável para transporte. A substituição da gasolina pelo etanol reduziria significativamente a dependência do petróleo importado pelos EUA, aumentaria a segurança nacional e reduziria a poluição ambiental [118]. No entanto, apenas 9 bilhões de galões de etanol foram produzidos em 2008, e todos eram provenientes da produção à base de milho. A lignocelulose é geralmente considerada uma excelente fonte de açúcares para conversão em etanol combustível. É, portanto, desejável projetar ou obter biocatalisadores que possam utilizar todos os componentes do açúcar da lignocelulose e convertê-los em etanol com alto rendimento e produtividade em meio de sais minerais. Nativo S. cerevisiae e Z. mobilis cepas podem converter glicose em etanol com eficiência, mas não podem utilizar açúcares pentose. Em contraste, E. coli as cepas podem utilizar todos os componentes do açúcar das lignoceluloses, mas o etanol é apenas um produto de fermentação menor, com ácidos mistos se acumulando como o principal produto de fermentação [103]. Embora avanços recentes tenham sido feitos com a engenharia nativa E. coli vias metabólicas para a produção de etanol [119], o exemplo mais bem sucedido usou uma via metabólica estrangeira para permitir a produção de etanol a partir de E. coli estirpe W (ATCC # 9637) [1].

O redesenho para a produção de etanol foi desacoplado em três partes: construção de uma via metabólica para a produção de etanol como o principal produto de fermentação, eliminação de vias de oxidação competitivas do NADH e interrupção da formação de produtos colaterais. o Z. mobilis A via do homoetanol (piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase) foi introduzida como uma via estranha, permitindo a produção redox balanceada de etanol com alto rendimento [120] (Figura 4 (b)). Então fumarato redutase (frd) foi interrompido para aumentar o rendimento de etanol. A cepa resultante, KO11, produziu etanol com um rendimento de 95% em um meio complexo [121]. Esta cepa foi desenvolvida no início da engenharia metabólica e tem sido usada para produzir etanol a partir de uma variedade de materiais lignocelulósicos, conforme revisado em [1].

Embora a taxa de produção de etanol de KO11 tenha sido tão alta quanto a de levedura, a tolerância ao etanol e o desempenho em meio mínimo não atenderam aos padrões desejados. Portanto a cepa SZ110, um derivado do KO11 modificado para a produção de lactato em meio de sais minerais [35], foi redesenhada para a produção de etanol [122]. Tal como aconteceu com o projeto do KO11, o redesenho do SZ110 foi desacoplado para a construção de uma via sintética do etanol, eliminação das vias de oxidação competitivas do NADH e bloqueio da formação do produto secundário. No entanto, essa estratégia de redesenho também incluiu a aceleração da co-utilização de açúcar misto. A via de produção de lactato foi interrompida e o Z. mobilis A via do homoetanol foi integrada ao cromossomo por inserção aleatória para selecionar a expressão ideal. o Pseudomonas putida esterase de cadeia curta (estZ) [123] foi introduzido para diminuir os níveis de acetato de etila no caldo de fermentação e diminuir o custo de purificação a jusante. Além disso, a metilglioxal sintase (mgsA) foi inativado, resultando no co-metabolismo de glicose e xilose, e acelerou o metabolismo de uma mistura de 5-açúcares (manose, glicose, arabinose, xilose e galactose) em etanol [25]. Depois de usar a evolução para aumentar o crescimento e a produção celular, a cepa final, LY168, pode metabolizar simultaneamente uma combinação complexa dos cinco principais açúcares presentes na biomassa lignocelulósica com alto rendimento e produtividade em meio de sais minerais [25].

4.1.2. L-lactato

Conforme descrito acima, o L-lactato é o principal componente do plástico biodegradável PLA. Embora muitas bactérias de ácido láctico produzam L-lactato com alto rendimento e produtividade [124], geralmente requerem nutrientes complexos. E. coli não tem uma via nativa para a produção de L-lactato e, portanto, a introdução de uma via estranha foi necessária.

A estratégia para redesenhar E. coli W3110 para a produção de L-lactato foi eliminar as vias de oxidação de NADH competitivas e, em seguida, construir a via de síntese de L-lactato desejada (Figura 4 (b)) [125]. A via de produção de L-lactato, L-lactato desidrogenase (ldhL) a partir de Pediococcus acidilactici, foi usado e sua região de codificação e terminador foram integrados ao E. coli cromossomo no ldhA site, para que ldhL poderia ser expressa sob o nativo ldhA promotor. Além disso, desde o ldhL gene contém uma região de ligação ribossômica fraca, esta região foi substituída racionalmente por ldhA'S RBS [125]. Após um período de evolução metabólica, a cepa resultante, SZ85, sintetizou 45 g / L de L-lactato em meio de sais minerais com rendimento próximo ao máximo teórico (94%). No entanto, esta cepa era um derivado K-12 e exibiu os mesmos problemas vistos com a cepa produtora de D-lactato à base de K12 descrita acima, o que significa que ela foi incapaz de fermentar completamente altas concentrações de açúcar e teve uma baixa produtividade (0,65 g / L / h). Portanto, a mesma estratégia de design foi implementada em um E. coli Derivado de W (ATCC # 9637). Após exclusão adicional mgsA gene para melhorar a pureza quiral e usando a evolução metabólica para melhorar o crescimento e a produtividade celular, a cepa produtora de L-lactato final, TG108, poderia converter 12% de glicose em 116 g / L L-lactato com um excelente rendimento (98%) e produtividade (2,29 g / L / h) [22].

4.1.3. Xilitol

O álcool de açúcar pentahidroxi xilitol é comumente usado para substituir a sacarose em alimentos e como um adoçante natural não nutritivo que inibe a cárie dentária [126]. O xilitol também pode ser usado como um bloco de construção para a síntese de novos polímeros [127]. A produção comercial de xilitol atual envolve a hidrogenação da xilose derivada da hemicelulose com um catalisador de metal ativo [127]. Processos de base biológica também foram desenvolvidos recentemente, mas embora um alto título de xilitol tenha sido alcançado por algumas leveduras, o processo requer um meio complexo com vários suplementos vitamínicos caros [128]. Enquanto E. coli não tem a capacidade nativa de sintetizar xilitol, uma estratégia de redesenho para a cepa W3110 foi proposta envolvendo uma via metabólica estranha [26].No redesenho proposto, a glicose apoiaria o crescimento celular e forneceria equivalentes redutores, enquanto a xilose seria usada como substrato para a síntese de xilitol (Figura 4 (d)). A estratégia de projeto consistia em três componentes principais: permitir a co-utilização de glicose e xilose, separação do metabolismo da xilose do metabolismo central e construção de uma via de produção de xilitol (Figura 4 (d)). A fim de permitir a co-utilização de glicose e xilose, a repressão mediada por glicose do metabolismo da xilose foi eliminada pela substituição do nativo crp gene com um mutante independente de cAMP (CRP *). O metabolismo da xilose foi separado do metabolismo central pela exclusão da xilulocinase (xylB), evitando a perda de carbono xilose para o metabolismo central. Finalmente, a xilose redutase e a xilitol desidrogenase de vários microrganismos foram testadas quanto à capacidade de síntese de xilitol, e a xilose redutase dependente de NADPH de C. boidinii (CbXR) foi encontrado para apoiar a produção de xilitol ideal. A cepa final, PC09 (CbXR), pode produzir xilitol 250 mM (38 g / L) em meio de sais minerais. O rendimento foi de 1,7 mol de xilitol por mol de glicose consumido, que foi melhorado para 4,7 mol / mol usando células em repouso. Foi proposto que a produção de xilitol poderia ser melhorada aumentando o fornecimento de equivalentes redutores [129].

4.1.4. L-Alanine

A L-alanina pode ser usada com outros L-aminoácidos como terapia nutricional pré e pós-operatória em aplicações farmacêuticas e veterinárias [130]. Também é usado como aditivo alimentar devido ao seu sabor adocicado. A produção mundial anual de L-alanina é de cerca de 500 toneladas [131], e este mercado é atualmente limitado pelos custos de produção. O atual processo de produção comercial converte aspartato em alanina via aspartato descarboxilase, onde o aspartato é produzido a partir do fumarato por catálise de aspartato amônia-liase [27]. Um processo fermentativo eficiente com uma matéria-prima renovável como a glicose oferece o potencial de reduzir o custo da L-alanina e facilitar uma ampla expansão do mercado de alanina para outros produtos.

SZ194, um derivado de E. coli W (ATCC # 9637) que foi previamente projetado para a produção de D-lactato, foi usado como o chassi para a produção de L-alanina [27] (Figura 4 (b)). A produção de alanina na cepa nativa usa glutamato e NADPH-dependente de glutamato-piruvato aminotransferase. É preferível produzir L-alanina diretamente do piruvato e amônia usando uma enzima dependente de NADH e, portanto, L-alanina desidrogenase (alaD) do Geobacillus stearothermophilus estava empregado. O local de ligação do ribossomo nativo, região de codificação e terminador de alaD gene foram integrados ao E. coli cromossomo no ldhA site, de modo que a expressão de alaD poderia ser controlado pelo promotor nativo de ldhA, um promotor que funcionou bem para a produção de D- e L-lactato, conforme descrito acima. O redesenho posterior focou na eliminação de traços de lactato e no aumento da pureza quiral da L-alanina por meio da exclusão mgsA e o principal gene racemase de alanina (dadX) A evolução metabólica aumentou o título final e a produtividade em 15 e 30 vezes, respectivamente (Figura 3). A última cepa produtora de L-alanina, XZ132, converteu 12% de glicose em 114 g / L L-alanina com um rendimento de 95% e excelente produtividade volumétrica de 2,38 g / L / h [27].

4.1.5. Combinação de múltiplas vias externas em um único chassi

Embora o trabalho descrito acima tenha se baseado na introdução de uma única via estranha, existem outros exemplos excelentes que empregam vias de mais de um organismo em um único hospedeiro.

E. coli foi redesenhado para a produção de 1,3-propanodiol usando S. cerevisiae caminho para converter glicose em glicerol e um K. pneumonia via para converter glicerol em 1,3-propanodiol [132]. E. coli também foi redesenhado para a produção de isopropanol, combinando acetil CoA acetiltransferase (thl) e acetoacetato descarboxilase (adc) a partir de C. acetobutylicum com a segunda álcool desidrogenase (adh) a partir de C. beijerinckii e E. coliDa própria acetoacetil-CoA transferase (atoAD) [133]. O ácido artemisínico, um precursor do medicamento antimalárico artemisina, foi produzido por E. coli seguindo a combinação de uma via de mevalonato de S. cerevisiae e E. coli, amorfadieno sintase e uma nova monooxigenase do citocromo P450 (CYP71AV1) de Artemisia annua [12, 134].

S. cerevisiae foi redesenhado para a produção de flavanona combinando Arabidopsis thaliana cinamato 4-hidroxilase (C4H), Petroselinum crispum 4-coumaroil: CoA-ligase (4CL), e Petúnia chalcona sintase (CHS), Petúnia chalcona isomerase (CHI) [135]. Um sistema sintético semelhante produzindo flavonóis hidroxilados também foi construído em E. coli com amplificação adicional de C. roseus Flavonóide P450

-hidroxilase (F H) fundido com P450 redutase, Malus domestica flavanona 3β-hidroxilase (FHT), e Arabidopsis thaliana flavonol sintase (FLS) [136]. A produção de flavonóides foi significativamente aumentada por meio de um novo redesenho do sistema metabólico central de E. coli para aumentar o precursor (Malonil-CoA) fornecimento [137].

4.2. Modificação das vias naturais para a produção de compostos não naturais

Um dos objetivos da biologia sintética é projetar ou construir novos circuitos genéticos. Nos exemplos dados até agora, as partes biológicas existentes foram remontadas para projetar um biocatalisador que produza com eficiência um produto que já existe na natureza. No entanto, as vias metabólicas também podem ser construídas para produzir compostos não naturais.

Como discutido acima, a evolução direcionada de proteínas pode modificar sua atividade de modo que novos substratos sejam reconhecidos ou novos produtos sejam formados [138]. Por exemplo, novos compostos carotenóides foram gerados pela evolução de duas principais enzimas sintéticas de carotenóides, fitoeno dessaturase e licopeno ciclase [139]. Além disso, a biossíntese combinatória, que combina genes de diferentes organismos em um hospedeiro heterólogo, também pode gerar novos produtos [140]. Por exemplo, quatro carotenóides anteriormente desconhecidos foram produzidos por biossíntese combinatória em E. coli [141].

4.3. Projeto do Caminho De Novo

Para ampliar o espaço de biossíntese disponível, é essencial ir além das vias naturais e projetar vias de novo [142]. Embora essa estratégia de design empolgante ainda tenha muitos desafios, vários exemplos de sucesso foram relatados.

Por exemplo, uma via sintética para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) foi projetada envolvendo a isomerização não natural de α-alanina para β-alanina, conforme mencionado acima. Neste exemplo, os pesquisadores usaram a evolução direcionada para expandir a especificidade do substrato da lisina 2,3-aminomutase para incluir α-alanina [73]. O resultado β-alanina pode então ser convertida em 3-HP através das vias metabólicas existentes.

Caminhos não naturais para maior produção de álcool em E. coli foram concebidos combinando as vias sintéticas de aminoácidos nativos com uma descarboxilase de 2-cetoácido de Lactococcus lactis e álcool desidrogenase de S. cerevisiae [143]. Os intermediários de 2-cetoácidos nas vias de biossíntese de aminoácidos foram redirecionados da produção de aminoácidos para a produção de álcool, permitindo a produção de 3-metil-1-pentanol. Esta via foi então expandida para a produção de álcoois não naturais pelo redesenho racional de duas enzimas, com os biocatalisadores resultantes tendo a capacidade de sintetizar vários álcoois não naturais variando em comprimento de cinco a oito carbonos [144].

4,4. Tolerância de engenharia a compostos inibitórios

À medida que nosso repertório de compostos produzidos biologicamente aumenta, a tolerância a altos títulos de produtos torna-se mais importante. Biocombustíveis, como etanol e butanol, podem inibir o crescimento do biocatalisador e, portanto, a tolerância do biocatalisador precisa ser melhorada [145-147]. Conforme descrito acima, nosso objetivo é usar biomassa lignocelulósica como substrato para a produção de combustíveis e produtos químicos básicos. Infelizmente, os processos usados ​​para converter biomassa em açúcares solúveis também produzem uma mistura de produtos menores, como furfural e ácido acético, que inibem o metabolismo do biocatalisador [148]. Embora a maioria desses inibidores pudesse ser removida por desintoxicação [149], esse processo adicional aumentaria o custo operacional. É, portanto, desejável obter microrganismos que sejam tolerantes a esses inibidores e possam fermentar diretamente o hidrolisado de hemicelulose.

Uma abordagem para aumentar a tolerância é entender o mecanismo de inibição. A análise do transcriptoma foi usada para investigar a resposta ao etanol [145, 150], furfural [151] e butanol [147]. Outra abordagem é usar a evolução direcionada, conforme destacado no exemplo a seguir. Etanologênico E. coli cepa LY180 (um derivado de LY168 com utilização de lactose restaurada e integração de uma endoglucanase e utilização de celobiose) foi usada como o chassi para selecionar a resistência ao furfural através da evolução [148]. A cepa evoluída, EMFR9, aumentou significativamente a resistência ao furfural. Esforços de engenharia reversa, incluindo análise de transcriptoma, atribuíram a resistência furfural à expressão de silenciamento de várias oxidorredutases. Essas oxidorredutases usam NADPH para redução de furfural, esgotando os reservatórios disponíveis para biossíntese. Assim, a inibição do crescimento mediada pelo furfural pode ser atribuída à depleção de NADPH [148], um insight que pode ser aplicado a outros projetos de design de biocatalisadores.

5. Perspectivas

Embora muitos biocatalisadores tenham sido reprojetados com sucesso para a produção de combustíveis e produtos químicos industrialmente importantes por meio da engenharia metabólica tradicional, estamos apenas começando a ver o potencial da biologia sintética nesta área. Um dos principais objetivos de nosso laboratório é o aprimoramento de biocatalisadores para utilização de biomassa. Para atingir esse objetivo, a tolerância aos inibidores derivados de hidrolisados ​​precisa ser melhorada. Para todas as aplicações, a tolerância a altos títulos de substrato e produto também é importante. Este objetivo de redesenhar o fenótipo de um biocatalisador, ou seja, a tolerância, não é tão claro quanto redesenhar o metabolismo e uma estratégia de redesenho racional é particularmente difícil quando o mecanismo de inibição não é conhecido.

À medida que a compreensão de nossos biocatalisadores melhora, particularmente por meio da engenharia reversa de cepas evoluídas, os modelos em escala de genoma podem ser aprimorados. A inclusão de efeitos cinéticos e regulatórios também melhorará a precisão e o poder preditivo desses modelos. Observe que alguns modelos foram desenvolvidos recentemente que contornam a necessidade de dados cinéticos, embora [152]. Uma vez que as enzimas são a principal parte funcional que realiza a síntese metabólica, ferramentas aprimoradas de engenharia de proteínas e nova capacidade catalítica de proteínas ajudarão no avanço desse campo. É importante gerar bibliotecas de mutagênese de proteínas de alta qualidade (bibliotecas relativamente pequenas com uma alta diversidade de enzimas) para facilitar os esforços de triagem eficientes [138]. A triagem direta de bibliotecas metagenômicas de amostras ambientais pode auxiliar no isolamento de enzimas com novas funções, que não podem ser obtidas pelos métodos tradicionais de isolamento de cepas [153]. As enzimas podem até mesmo ser sintetizadas do zero por uma estratégia de projeto racional com auxílio computacional [154]. Finalmente, novas ferramentas para melhor de novo projeto de vias sintéticas precisa ser desenvolvido. Vários bancos de dados, como BNICE (Biochemical Network Integrated Computational Explorer) [155] e ReBiT (Retro-Biosynthesis Tool) [142], já foram estabelecidos para facilitar a identificação de enzimas para construir uma via sintética completa para a produção de compostos alvo. É importante estabelecer diretrizes, como equilíbrio redox, produção de energia e viabilidade termodinâmica, para selecionar entre essas enormes vias as rotas ideais.

Ao incluir ferramentas de biologia sintética em projetos de engenharia metabólica e vice-versa, esses dois campos podem avançar significativamente na substituição de produtos básicos derivados do petróleo por aqueles produzidos a partir de carbono e energia biorrenováveis.

Referências

  1. L. R. Jarboe, T. B. Grabar, L. P. Yomano, K. T. Shanmugan e L. O. Ingram, "Development of ethanologenic bactéria", Avanços em Engenharia Bioquímica / Biotecnologia, vol. 108, pp. 237–261, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  2. D. G. Gibson, G. A. Benders, C. Andrews-Pfannkoch et al., "Complete química síntese, montagem e clonagem de um genoma de Mycoplasma genitalium", Ciência, vol. 319, no. 5867, pp. 1215–1220, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  3. C. Laitigue, S. Vashee, M. A. Algire et al., "Criando cepas bacterianas de genomas que foram clonados e modificados em levedura", Ciência, vol. 325, não. 5948, pp. 1693–1696, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  4. J. E. Bailey, "Toward a science of metabolic engineering," Ciência, vol. 252, nº 5013, pp. 1668–1675, 1991. Ver em: Google Scholar
  5. G. Stephanopoulos e J. J. Vallino, "Network rigidity and metabolic engineering in metabolic overproduction," Ciência, vol. 252, nº 5013, pp. 1675–1681, 1991. Ver em: Google Scholar
  6. G. N. Stephanopoulos, A. A. Aristidou e J. Nielsen, Engenharia Metabólica: Princípios e Metodologias, Academic Press, San Diego, Califórnia, EUA, 1998.
  7. P. Ball, “Synthetic biology: começando do zero,” Natureza, vol. 431, no. 7009, pp. 624–626, 2004. Ver em: Google Scholar
  8. S. A. Benner e A. M. Sismour, "Synthetic biology", Nature Reviews Genetics, vol. 6, não. 7, pp. 533–543, 2005. Ver em: Google Scholar
  9. R. McDaniel e R. Weiss, "Avanços na biologia sintética: no caminho dos protótipos às aplicações", Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 16, não. 4, pp. 476–483, 2005. Ver em: Google Scholar
  10. J. Pleiss, "A promessa da biologia sintética", Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 73, nº 4, pp. 735–739, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  11. L. Serrano, "Biologia sintética: promessas e desafios", Biologia de Sistemas Moleculares, vol. 3, artigo 158, 2007. Ver em: Site da Editora | Google Scholar
  12. J. D. Keasling, "Synthetic biology for Syntheticochemical", Biologia Química ACS, vol. 3, não. 1, pp. 64–76, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  13. A. C. Forster e G. M. Church, "Synthetic biology projects in vitro", Genome Research, vol. 17, não. 1, pp. 1–6, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  14. D. Greber e M. Fussenegger, "Biologia sintética de mamíferos: engenharia de redes de genes sofisticadas", Journal of Biotechnology, vol. 130, não. 4, pp. 329–345, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  15. W. Weber e M. Fussenegger, "O impacto da biologia sintética na descoberta de drogas", Drug Discovery Today, vol. 14, não. 19-20, pp. 956–963, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  16. C. E. French, "Synthetic biology and biomass conversion: a match made in heaven?" Interface do Jornal da Royal Society, vol. 6, suplemento 4, pp. S547 – S558, 2009. Ver em: Google Scholar
  17. S. K. Lee, H. Chou, T. S. Ham, T. S. Lee e J. D. Keasling, "Metabolic engineering of microorganisms for biofuels production: from bugs to synth biology to fuels", Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 19, não. 6, pp. 556–563, 2008. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  18. S. Picataggio, “Potencial impacto da biologia sintética no desenvolvimento de sistemas microbianos para a produção de combustíveis renováveis ​​e produtos químicos,” Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 20, não. 3, pp. 325–329, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  19. A. M. Feist, C. S. Henry, J. L. Reed et al., “A genome-scale metabolic reconstruction for Escherichia coli K-12 MG1655 que responde por 1260 ORFs e informações termodinâmicas, ” Biologia de Sistemas Moleculares, vol. 3, artigo 121, 2007. Ver em: Site da Editora | Google Scholar
  20. I. M. Keseler, C. Bonavides-Martínez, J. Collado-Vides et al., “EcoCyc: uma visão abrangente de Escherichia coli biologia," Pesquisa de ácidos nucléicos, vol. 37, suplemento 1, pp. D464 – D470, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  21. D. Endy, "Foundations for engineering biology", Natureza, vol. 438, no. 7067, pp. 449–453, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  22. T. B. Grabar, S. Zhou, K. T. Shanmugam, L. P. Yomano e L. O. Ingram, "Bypass de metilglioxal identificado como fonte de contaminação quiral em fermentações L (+) e D (-) - lactato por recombinante Escherichia coli,” Cartas de Biotecnologia, vol. 28, não. 19, pp. 1527–1535, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  23. T. B. Causey, S. Zhou, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, "Engineering the metabolism of Escherichia coli W3110 para a conversão de açúcar em produtos redox neutros e oxidados: produção de homoacetato, ” Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, vol. 100, não. 3, pp. 825–832, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  24. K. Jantama, X. Zhang, J. C. Moore, K. T. Shanmugam, S. A. Svoronos e L. O. Ingram, "Eliminando produtos colaterais e aumentando os rendimentos de succinato em cepas projetadas de Escherichia coli C, ” Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 101, não. 5, pp. 881–893, 2008. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  25. L. P. Yomano, S. W. York, K. T. Shanmugam e L. O.Ingram, “A deleção do gene da metilglioxal sintase (mgsA) aumentou o co-metabolismo do açúcar na produção de etanol Escherichia coli,” Cartas de Biotecnologia, vol. 31, nº 9, pp. 1389–1398, 2009. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  26. P. C. Cirino, J. W. Chin e L. O. Ingram, "Engineering Escherichia coli para a produção de xilitol a partir de misturas de glicose-xilose ”, Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 95, não. 6, pp. 1167–1176, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  27. X. Zhang, K. Jantama, J. C. Moore, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, "Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli,” Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 77, não. 2, pp. 355–366, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  28. R. S. Senger e E. T. Papoutsakis, "Modelo em escala de genoma para Clostridium acetobutylicum - parte I: resolução e análise de rede metabólica", Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 101, não. 5, pp. 1036–1052, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  29. K. R. Kjeldsen e J. Nielsen, "reconstrução em escala de genoma in silico e validação da rede metabólica corynebacterium glutamicum", Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 102, no. 2, pp. 583–597, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  30. J. Forster, I. Famili, P. Fu et al., "Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network," Genome Research, vol. 13, não. 2, pp. 244-253, 2003. Ver em: Google Scholar
  31. M. R. Andersen, M. L. Nielsen e J. Nielsen, "Metabolic model integration of the biblioma, genome, metabolome and reactome of Aspergillus niger," Biologia de Sistemas Moleculares, vol. 4, artigo 178, 2008. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  32. F. R. Blattner et al., “The complete genome sequence of Escherichia coli K-12, ” Ciência, vol. 277, no. 5331, pp. 1453–1474, 1997. Ver em: Google Scholar
  33. R. U. Ibarra, J. S. Edwards e B. O. Palsson, “Escherichia coli O K-12 passa por uma evolução adaptativa para atingir o crescimento ideal previsto in silico, ” Natureza, vol. 420, não. 6912, pp. 186–189, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  34. A. P. Bauer, S. M. Dieckmann, W. Ludwig e K.-H. Schleifer, “Identificação rápida de Escherichia coli segurança e linhagens de cepas de laboratório com base em Multiplex-PCR, ” Cartas de Microbiologia FEMS, vol. 269, no. 1, pp. 36–40, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  35. S. Zhou, L. P. Yomano, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, "Fermentação de 10% (p / v) de açúcar em D: (-) -lactato por engenharia Escherichia coli B,” Cartas de Biotecnologia, vol. 27, no. 23-24, pp. 1891–1896, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  36. M. Moniruzzaman, X. Lai, S. W. York, e L. O. Ingram, "Isolamento e caracterização molecular de mutantes espontâneos de fermentação de celobiose de alto desempenho de etanologênico Escherichia coli KO11 contendo o operon Klebsiella oxytoca casAB, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 63, nº 12, pp. 4633–4637, 1997. Ver em: Google Scholar
  37. G. Posfai, G. Plunkett III, T. Fehér et al., “Propriedades emergentes do genoma reduzido Escherichia coli,” Ciência, vol. 312, no. 5776, pp. 1044–1046, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  38. M. Durot, P.-Y. Bourguignon e V. Schachter, "Modelos em escala de genoma de metabolismo bacteriano: reconstrução e aplicações", Avaliações de Microbiologia FEMS, vol. 33, não. 1, pp. 164–190, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  39. N. D. Price, J. A. Papin, C. H. Schilling, e B. O. Palsson, "Genome-scale microbial in silico models: the constraints-based approach," Tendências em Biotecnologia, vol. 21, não. 4, pp. 162–169, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  40. P. Pharkya, A. P. Burgard e C. D. Maranas, "OptStrain: a computational framework for redesign of microbial production systems," Genome Research, vol. 14, não. 11, pp. 2367–2376, 2004. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  41. A. P. Burgard, P. Pharkya e C. D. Maranas, "OptKnock: uma estrutura de programação de dois níveis para identificar estratégias de nocaute de gene para otimização de cepa microbiana", Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 84, nº 6, pp. 647–657, 2003. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  42. H. Alper, Y.-S. Jin, J. F. Moxley e G. Stephanopoulos, "Identifying gene targets for the metabolic engineering of licopene biosynthesis in Escherichia coli,” Engenharia Metabólica, vol. 7, não. 3, pp. 155–164, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  43. C. Bro e J. Nielsen, "Impact of 'ome' analysis on inverse metabolic engineering," Engenharia Metabólica, vol. 6, não. 3, pp. 204–211, 2004. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  44. S. Y. Lee, D. Y. Lee e T. Y. Kim, "Systems biotechnology for strain improvement," Tendências em Biotecnologia, vol. 23, não. 7, pp. 349-358, 2005. Ver em: Google Scholar
  45. T. Hermann, "Usando genômica funcional para melhorar a produtividade na fabricação de bioquímicos industriais", Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 15, não. 5, pp. 444–448, 2004. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  46. J. H. Choi, S. J. Lee e S. Y. Lee, "Enhanced production of insulin-like growth fator I fusion protein in Escherichia coli por coexpressão dos genes regulados negativamente identificados pelo perfil do transcriptoma ”, Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 69, nº 8, pp. 4737–4742, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  47. M.-J. Han, K. J. Jeong, J.-S. Yoo e S. Y. Lee, “Engineering Escherichia coli para maior produtividade de proteínas ricas em serina com base no perfil de proteoma, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 69, nº 10, pp. 5772–5781, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  48. B. F. Pfleger, D. J. Pitera, C. D. Smolke e J. D. Keasling, "Combinatorial engineering of intergenic region in operons tunes expression of multiple genes", Nature Biotechnology, vol. 24, não. 8, pp. 1027–1032, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  49. S. A. Underwood, M. L. Buszko, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, “O fluxo através da citrato sintase limita o crescimento de etanologênico Escherichia coli KO11 durante a fermentação da xilose, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 68, no. 3, pp. 1071–1081, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  50. M. Askenazi, E. M. Driggers, D. A. Holtzman et al., "Integrating transcriptional and metabite profiles to direct the engineering of lovastatin-production fungal strains," Nature Biotechnology, vol. 21, não. 2, pp. 150–156, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  51. J. Ohnishi, S. Mitsuhashi, M. Hayashi et al., "Uma nova metodologia empregando informações do genoma de Corynebacterium glutamicum para gerar um novo mutante produtor de L-lisina", Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 58, não. 2, pp. 217–223, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  52. F. Martinez-Morales, A. C. Borges, A. Martinez, K. T. Shanmugam, e L. O. Ingram, “Chromosomal integration of heterologous DNA in Escherichia coli com a remoção precisa de marcadores e replicons usados ​​durante a construção, ” Journal of Bacteriology, vol. 181, no. 22, pp. 7143-7148, 1999. Ver em: Google Scholar
  53. K. A. Datsenko e B. L. Wanner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 usando produtos de PCR, ” Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, vol. 97, nº 12, pp. 6640–6645, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  54. G. Pósfai, M. D. Koob, H. A. Kirkpatrick e F. R. Blattner, "Plasmídeos de inserção versátil para manipulações de genoma direcionadas em bactérias: isolamento, deleção e resgate da ilha de patogenicidade LEE do Escherichia coli O157: genoma H7, ” Journal of Bacteriology, vol. 179, não. 13, pp. 4426–4428, 1997. Ver em: Google Scholar
  55. P. Gay, D. Le Coq, M. Steinmetz et al., "Procedimento de seleção positiva para aprisionamento de elementos de sequência de inserção em bactérias gram-negativas", Journal of Bacteriology, vol. 164, no. 2, pp. 918–921, 1985. Ver em: Google Scholar
  56. G. de la Cueva-Mendez e B. Pimentel, "Gene and cell survival: Lições from procaryotic plasmid R1," Os Relatórios EMBO, vol. 8, não. 5, pp. 458–464, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  57. S. Zhou, F. C. Davis e L. O. Ingram, "Integração e expressão gênica e secreção extracelular de Erwinia chrysanthemi endoglucanase CelY (celY) e CelZ (celZ) em Klebsiella oxytoca P2 etanologênico," Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 67, nº 1, pp. 6–14, 2001. Ver em: Google Scholar
  58. P. R. Jensen e K. Hammer, "A sequência de espaçadores entre as sequências de consenso modula a força dos promotores procarióticos", Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 64, nº 1, pp. 82-87, 1998. Ver em: Google Scholar
  59. H. Alper, C. Fischer, E. Nevoigt e G. Stephanopoulos, "Tuning genetic control through promoter engineering," Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, vol. 102, no. 36, pp. 12678–12683, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  60. I. Meynial-Salles, M. A. Cervin e P. Soucaille, “New tool for metabolic pathway engineering in Escherichia coli: método de uma etapa para modular a expressão de genes cromossômicos, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 71, no. 4, pp. 2140–2144, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  61. C. Solem e P. R. Jensen, "Modulation of gene expression made easy", Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 68, no. 5, pp. 2397–2403, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  62. T. A. Carrier e J. D. Keasling, "Biblioteca de estruturas secundárias 5 'sintéticas para manipular estabilidade de mRNA em Escherichia coli,” Progresso da biotecnologia, vol. 15, não. 1, pp. 58–64, 1999. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  63. Y. S. Park, S. W. Seo, S. Hwang et al., "Design of 5'-untranslated region variables for tunable expression in Escherichia coli,” Comunicações de pesquisa bioquímicos e biofísicos, vol. 356, no. 1, pp. 136–141, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  64. F. J. Isaacs, D. J. Dwyer, C. Ding, D. D. Pervouchine, C. R. Cantor e J. J. Collins, "Engineered riboregulators enable post-transcriptional control of gene expression", Nature Biotechnology, vol. 22, não. 7, pp. 841–847, 2004. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  65. S. Jana e J. K. Deb, "Estratégias para a produção eficiente de proteínas heterólogas em Escherichia coli,” Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 67, nº 3, pp. 289–298, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  66. H. Alper, J. Moxley, E. Nevoigt, G. R. Fink e G. Stephanopoulos, "Engineering levedura transcrição maquinária para melhoria da tolerância e produção de etanol", Ciência, vol. 314, no. 5805, pp. 1565–1568, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  67. H. Alper e G. Stephanopoulos, "Engenharia de maquinaria de transcrição global: uma nova abordagem para melhorar o fenótipo celular", Engenharia Metabólica, vol. 9, não. 3, pp. 258–267, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  68. I. P. Petrounia e F. H. Arnold, "evolução projetada de propriedades enzimáticas," Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 11, não. 4, pp. 325–330, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  69. H. Zhao, L. Giver, Z. Shao, J. A. Affholter e F. H. Arnold, "Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination", Nature Biotechnology, vol. 16, não. 3, pp. 258–261, 1998. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  70. A. Crameri, S.-A. Raillard, E. Bermudez e W. P. C. Stemmer, "DNA shuffling de uma família de genes de diversas espécies acelera a evolução dirigida", Natureza, vol. 391, no. 6664, pp. 288–291, 1998. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  71. C. Wang, M.-K. Ah, e J. C. Liao, “Directed evolution of metabolically engineered Escherichia coli para a produção de carotenóides, ” Progresso da biotecnologia, vol. 16, não. 6, pp. 922–926, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  72. P. C. Cirino e F. H. Arnold, "Protein engineering of oxygenases for biocatalysis," Opinião Atual em Biologia Química, vol. 6, não. 2, pp. 130–135, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  73. H. H. Liao, “Alanine 2,3-aminomutase,” US Patent 7309597, 2007. Ver em: Google Scholar
  74. M. M. Altamirano, J. M. Blackburn, C. Aguayo e A. R. Fersht, "Directed evolution of new catalytic activity using the α / β -barrel scaffold," Natureza, vol. 403, no. 6770, pp. 617–622, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  75. M. Leisola e O. Turunen, "Engenharia de proteínas: oportunidades e desafios", Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 75, não. 6, pp. 1225–1232, 2007. Ver em: Google Scholar
  76. A. Korkegian, M. E. Black, D. Baker e B. L. Stoddard, "Computational termostabilização de uma enzima", Ciência, vol. 308, nº 5723, pp. 857–860, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  77. R. Machielsen, L. L. Looger, J. Raedts et al., "Cofactor engineering of Lactobacillus brevis alcohol deshydrogenase by computational design", Engenharia em Ciências da Vida, vol. 9, não. 1, pp. 38–44, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  78. J. D. Bloom, M. M. Meyer, P. Meinhold, C. R. Otey, D. MacMillan e F. H. Arnold, "Evolving strategy for enzima engineering," Opinião Atual em Biologia Estrutural, vol. 15, não. 4, pp. 447–452, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  79. R. A. Chica, N. Doucet e J. N. Pelletier, "abordagens semi-racionais para a atividade de enzimas de engenharia: combinando os benefícios da evolução dirigida e design racional", Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 16, não. 4, pp. 378–384, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  80. O. Spadiut, I. Pisanelli, T. Maischberger et al., "Engenharia de piranose 2-oxidase: melhoria para células de biocombustível e aplicações em alimentos por meio de projeto de proteína semi-racional", Journal of Biotechnology, vol. 139, não. 3, pp. 250–257, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  81. Q. Wang, A. R. Parrish e L. Wang, "Expandindo o código genético para estudos biológicos", Química e Biologia, vol. 16, não. 3, pp. 323–336, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  82. Y. Lu, "Projeto e engenharia de metaloproteínas contendo aminoácidos não naturais ou cofatores contendo metais não nativos", Opinião Atual em Biologia Química, vol. 9, não. 2, pp. 118–126, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  83. J. C. Jackson, S. P. Duffy, K. R. Hess e R. A. Mehl, "Improving nature's enzima active site with genetically codificado unnatural aminoacid", Jornal da American Chemical Society, vol. 128, não. 34, pp. 11124–11127, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  84. D. B. Walker, G. Joshi e A. P. Davis, "Progresso no reconhecimento de carboidratos biomiméticos", Ciências da Vida Celular e Molecular, vol. 66, no. 19, pp. 3177–3191, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  85. M. P. Cashion e T. E. Long, "Biomimetic design and performance of polimerizable lipids", Contas de pesquisa química, vol. 42, não. 8, pp. 1016–1025, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  86. S. S. Fong, A. P. Burgard, C. D. Herring et al., “In silico design and adaptive evolution of Escherichia coli para a produção de ácido láctico, ” Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 91, no. 5, pp. 643-648, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  87. X. Zhang, K. Jantama, J. C. Moore, L. R. Jarboe, K. T. Shanmugam, e L. O. Ingram, "Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production in Escherichia coli,” Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, vol. 106, nº 48, pp. 20180–20185, 2010. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  88. J. G. Zeikus, M. K. Jain e P. Elankovan, "Biotechnology of succinic acid production and markets for derivados industrial products", Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 51, nº 5, pp. 545–552, 1999. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  89. J. B. McKinlay, C. Vieille e J. G. Zeikus, "Prospects for a bio-based succinate industry," Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 76, no. 4, pp. 727–740, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  90. N. S. Samuelov, R. Lamed, S. Lowe e I. G. Zeikus, "Influência de CO 2 - HCO 3 - níveis e ph no crescimento, produção de succinato e atividades enzimáticas de Anaerobiospirillum succiniciproducens,” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 57, no. 10, pp. 3013–3019, 1991. Ver em: Google Scholar
  91. M. J. Vander Werf, M. V. Guettler, M. K. Jain e J. G. Zeikus, “Fatores ambientais e fisiológicos que afetam a proporção do produto succinato durante a fermentação de carboidratos por Actinobacillus sp. 130Z, ” Arquivos de Microbiologia, vol. 167, no. 6, pp. 332–342, 1997. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  92. P. Lee, S. Lee, S. Hong e H. Chang, "Isolamento e caracterização de uma nova bactéria produtora de ácido succínico, Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, do rúmen bovino," Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 58, não. 5, pp. 663–668, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  93. D. G. Fraenkel, "Glycolysis", em Escherichia coli e Salmonella: Cellular and Molecular Biology, F. C.Neidhardt, Ed., ASM Press, Washington, DC, EUA, 1996. Ver em: Google Scholar
  94. K. Jantama, M. J. Haupt, S. A. Svoronos et al., “Combining metabolic engineering and metabolic evolution to development nonrecombinant strains of Escherichia coli C que produzem succinato e malato, ” Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 99, não. 5, pp. 1140–1153, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  95. M.-K. Oh, L. Rohlin, K. C. Kao e J. C. Liao, "Global expression profiling of acetate-grow Escherichia coli,” Journal of Biological Chemistry, vol. 277, no. 15, pp. 13175–13183, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  96. K. C. Kao, L. M. Tran e J. C. Liao, “A global Regulation role of gluconeogenic genes in Escherichia coli revelado pela análise da rede do transcriptoma ”, Journal of Biological Chemistry, vol. 280, no. 43, pp. 36079–36087, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  97. R. Patnaik, W. D. Roof, R. F. Young e J. C. Liao, "Stimulation of glucose catabolism in Escherichia coli por um ciclo potencial fútil, ” Journal of Bacteriology, vol. 174, no. 23, pp. 7527–7532, 1992. Ver em: Google Scholar
  98. X. Zhang, K. Jantama, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, "Reengenharia Escherichia coli para a produção de succinato em meio de sais minerais, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 75, não. 24, pp. 7807–7813, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  99. S. S. Ray e M. Bousmina, "Polímeros biodegradáveis ​​e seus nano compostos de silicato em camadas: no esverdeamento do mundo dos materiais do século 21," Progresso em Ciência de Materiais, vol. 50, não. 8, pp. 962–1079, 2005. Ver em: Google Scholar
  100. A. K. Agrawal e R. Bhalla, “Advances in the production of poly (lactic acid) fibres. Uma revisão," Journal of Macromolecular Science-Polymer Reviews C, vol. 43, não. 4, pp. 479–503, 2003. Ver em: Google Scholar
  101. S. Benthin e J. Villadsen, "Produção de D-lactato opticamente puro por lactobacillus bulgaricus e purificação por cristalização e extração líquido / líquido", Microbiologia e Biotecnologia Aplicada, vol. 42, não. 6, pp. 826–829, 1995. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  102. A. Demirci e A. L. Pometto, "Enhanced production of D (-) - ácido láctico por mutantes de lactobacillus-delbrueckii ATCC-9649," Journal of Industrial Microbiology, vol. 11, não. 1, pp. 23-28, 1992. Ver em: Google Scholar
  103. D. G. Fraenkel, "Glycolysis," em Escherichia coli e Salmonella: Biologia Celular e Molecular, F. C. Neidhardt, Ed., Vol. 1, capítulo 14, ASM Press, Washington DC, EUA, 2ª edição, 1996. Ver em: Google Scholar
  104. S. Zhou, T. B. Causey, A. Hasona, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, "Produção de ácido D-láctico opticamente puro em meio de sais minerais por engenharia metabólica Escherichia coli W3110, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 69, nº 1, pp. 399–407, 2003. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  105. S. Zhou, K. T. Shanmugam, L. P. Yomano, T. B. Grabar, e L. O. Ingram, “Fermentation of 12% (w / v) glucose to 1,2 M lactate by Escherichia coli cepa SZ194 usando meio de sais minerais, ” Cartas de Biotecnologia, vol. 28, não. 9, pp. 663–670, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  106. M. Cheryan, S. Parekh, M. Shah e K. Witjitra, "Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum", Avanços na Microbiologia Aplicada, vol. 43, pp. 1-33, 1997. Ver em: Google Scholar
  107. C. Berraud, "Produção de vinagre altamente concentrado em cultura descontínua", Cartas de Biotecnologia, vol. 22, não. 6, pp. 451–454, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  108. S. N. Freer, "Acetic acid production by Dekkera / Brettanomyces yeasts," World Journal of Microbiology and Biotechnology, vol. 18, não. 3, pp. 271–275, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  109. S. Y. Lee, J. H. Park, S. H. Jang, L. K. Nielsen, J. Kim e K. S. Jung, "Fermentative butanol production by clostridia", Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 101, não. 2, pp. 209–228, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  110. L. D. Mermelstein, E. T. Papoutsakis, D. J. Petersen e G. N. Bennett, "Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 para o aumento da produção de solvente pelo aumento das atividades da enzima de formação de acetona usando um operon de acetona sintético", Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 42, não. 9, pp. 1053–1060, 1993. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  111. L. Harris, L. Blank, R. P. Desai, N. E. Welker e E. T. Papoutsakis, "Fermentation characterization and flux analysis of recombinant strains of Clostridium acetobutylicum with an inactivated soIR gene," Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, vol. 27, no. 5, pp. 322–328, 2001. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  112. R. V. Nair, E. M. Green, D. E. Watson, G. N. Bennett e E. T. Papoutsakis, "Regulamento dos genes locus sol para butanol e formação de acetona em Clostridium acetobutylicum ATCC 824 por um repressor transcricional putativo", Journal of Bacteriology, vol. 181, no. 1, pp. 319–330, 1999. Ver em: Google Scholar
  113. R. P. Desai e E. T. Papoutsakis, "Antisense RNA strategy for metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum," Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 65, não. 3, pp. 936–945, 1999. Ver em: Google Scholar
  114. N. E. Altaras e D. C. Cameron, "Enhanced production of (R) -1,2-propanodiol by metabolically engineered Escherichia coli,” Progresso da biotecnologia, vol. 16, não. 6, pp. 940–946, 2000. Ver em: Google Scholar
  115. P. Soucaille, I. Meynial-Salles, F. Voelker e R. Figge, "Microorganisms and methods for prodcution of 1,2-propanediol and acetol," WO, 2008, 2008/116853. Veja em: Google Scholar
  116. J. H. Park, K. H. Lee, T. Y. Kim e S. Y. Lee, "Metabolic engineering of Escherichia coli para a produção de L-valina com base na análise do transcriptoma e simulação de nocaute do gene in silico, ” Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, vol. 104, não. 19, pp. 7797–7802, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  117. K. H. Lee, J. H. Park, T. Y. Kim, H. U. Kim e S. Y. Lee, "Systems metabolic engineering of Escherichia coli para a produção de L-treonina, ” Biologia de Sistemas Moleculares, vol. 3, artigo 149, 2007. Ver em: Site da Editora | Google Scholar
  118. L. O. Ingram, P. F. Gomez, X. Lai et al., "Metabolic engineering of bactéria forhanol production," Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 58, não. 2-3, pp. 204–214, 1998. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  119. Y. Kim, L. O. Ingram e K. T. Shanmugam, "Construction of an Escherichia coli Mutante K-12 para fermentação homoetanologênica de glicose ou xilose sem genes estranhos, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 73, nº 6, pp. 1766–1771, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  120. L. O. Ingram, T. Conway, D. P. Clark, G. W. Sewell e J. F. Preston, "Genetic engineering ofhanol production in Escherichia coli," Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 53, não. 10, pp. 2420–2425, 1987. Ver em: Google Scholar
  121. K. Ohta, D. S. Beall, J. P. Mejia, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, "Genetic improvement of Escherichia coli para a produção de etanol: integração cromossômica de genes de Zymomonas mobilis que codificam piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase II, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 57, no. 4, pp. 893–900, 1991. Ver em: Google Scholar
  122. L. P. Yomano, S. W. York, S. Zhou, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, “Reengenharia Escherichia coli para a produção de etanol, ” Cartas de Biotecnologia, vol. 30, não. 12, pp. 2097–2103, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  123. A. Hasona, S. W. York, L. P. Yomano, L. O. Ingram, e K. T. Shanmugam, “Diminuindo o nível de acetato de etila em caldos de fermentação etanólica de Escherichia coli KO11 por expressão de Pseudomonas putida estZ esterase, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 68, no. 6, pp. 2651–2659, 2002. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  124. K. Hofvendahl e B. Hahn-Hagerdal, "Fatores que afetam a produção de ácido láctico fermentativo a partir de recursos renováveis", Enzima e tecnologia microbiana, vol. 26, no. 2–4, pp. 87–107, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  125. S. D. Zhou, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, "Substituição funcional do Escherichia coli D - (-) - gene da lactato desidrogenase (ldhA) com o gene da L - (+) - lactato desidrogenase (ldhL) de Pediococcus acidilactici, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 69, nº 4, pp. 2237–2244, 2003. Ver em: Google Scholar
  126. J. C. Parajó, H. Domínguez, e J. M. Domínguez, "Biotechnological production of xylitol - part 1: interest of xylitol and the basic of your biosynthesis", Tecnologia Bioresource, vol. 65, não. 3, pp. 191–201, 1998. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  127. T. Werpy e G. Petersen, Eds., Produtos químicos de maior valor agregado a partir da biomassa: Volume I - Resultados da triagem para candidatos potenciais de açúcares e gás de síntese, Pacific Northwest National Laboratory e National Renewable Energy Laboratory, 2004.
  128. T. B. Kim e D. K. Oh, "produção de xilitol por Candida tropicalis em um meio quimicamente definido", Cartas de Biotecnologia, vol. 25, não. 24, pp. 2085–2088, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  129. J. W. Chin, R. Khankal, C. A. Monroe, C. D. Maranas e P. C. Cirino, "Analysis of NADPH supply during xylitol production by engineered Escherichia coli,” Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 102, no. 1, pp. 209–220, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  130. P. Hols, M. Kleerebezem, A. N. Schanck et al., "Conversion of Lactococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering," Nature Biotechnology, vol. 17, não. 6, pp. 588–592, 1999. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  131. M. Ikeda, "Processos de produção de aminoácidos", Avanços em Engenharia Bioquímica / Biotecnologia, vol. 79, pp. 1-35, 2003. Ver em: Google Scholar
  132. C. E. Nakamura e G. M. Whited, "Engenharia metabólica para a produção microbiana de 1,3-propanodiol", Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 14, não. 5, pp. 454–459, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  133. T. Hanai, S. Atsumi e J. C. Liao, "Engineered Synthway for isopropanol production in Escherichia coli,” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 73, nº 24, pp. 7814–7818, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  134. D.-K. Ro, E. M. Paradise, M. Quellet et al., "Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast", Natureza, vol. 440, nº 7086, pp. 940–943, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  135. Y. Yan, A. Kohli e M. A. G. Koffas, "Biosynthesis of natural flavanones in Saccharomyces cerevisiae", Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 71, no. 9, pp. 5610–5613, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  136. E. Leonard, Y. Yan e M. A. G. Koffas, "Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli,” Engenharia Metabólica, vol. 8, não. 2, pp. 172–181, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  137. E. Leonard, K. H. Lim, P.-N. Saw e M. A. G. Koffas, "Engineering central metabolic pathways for high-level flavonoid production in Escherichia coli,” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 73, nº 12, pp. 3877–3886, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  138. A. L. de Boer e C. Schmidt-Dannert, "Recentes esforços na engenharia de células microbianas para produzir novos compostos químicos", Opinião Atual em Biologia Química, vol. 7, não. 2, pp. 273–278, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  139. C. Schmidt-Dannert, D. Umeno e F. H. Arnold, "Molecular breeding of carotenoid biosynthetic pathways," Nature Biotechnology, vol. 18, não. 7, pp. 750–753, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  140. G. Sandmann, "Combinatorial biosynthesis of carotenoids in a heterologous host: a poderosa abordagem para a biossíntese de novas estruturas," ChemBioChem, vol. 3, não. 7, pp. 629–635, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  141. M. Albrecht, S. Takaichi, S. Steiger, Z.-Y. Wang e G. Sandmann, “Novos hidroxicarotenóides com propriedades antioxidantes melhoradas produzidas por combinação de genes em Escherichia coli,” Nature Biotechnology, vol. 18, não. 8, pp. 843–846, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  142. K. L. J. Prather e C. H. Martin, "De novo biosynthetic pathways: rational design of microbial chemical factories," Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 19, não. 5, pp. 468–474, 2008. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  143. S. Atsumi, T. Hanai e J. C. Liao, "Vias não fermentativas para a síntese de álcoois superiores de cadeia ramificada como biocombustíveis", Natureza, vol. 451, nº 7174, pp. 86–89, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  144. K. Zhang, M. R. Sawaya, D. S. Eisenberg e J. C. Liao, "Expanding metabolism for biosynthesis of nonnatural alcohols", Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, vol. 105, não. 52, pp. 20653–20658, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  145. R. Gonzalez, H. Tao, J. E. Purvis, S. W. York, K. T. Shanmugam e L. O. Ingram, “Gene array-based identification of changes that contrib tohanol tolerance in ethanologenic Escherichia coli: comparação de KO11 (pai) com LY01 (mutante resistente), ” Progresso da biotecnologia, vol. 19, não. 2, pp. 612–623, 2003. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  146. L. P. Yomano, S. W. York, e L. O. Ingram, "Isolation and characterization of etanol-tolerant mutants of Escherichia coli KO11 para a produção de etanol combustível, ” Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, vol. 20, não. 2, pp. 132–138, 1998. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  147. M. P. Brynildsen e J. C. Liao, "Uma abordagem de rede integrada identifica a rede de resposta de isobutanol de Escherichia coli,” Biologia de Sistemas Moleculares, vol. 5, artigo 277, 2009. Ver em: Site da Editora | Google Scholar
  148. E. N. Miller et al., “Silenciamento de genes de oxidorredutase dependentes de NADPH (yqhD e dkgA) em furfural-resistente etanologênico Escherichia coli,” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 75, não. 13, pp. 4315–4323, 2009. Ver em: Google Scholar
  149. A. Martinez, M. E. Rodriguez, M. L. Wells, S. W. York, J. F. Preston e L. O. Ingram, "Detoxification of dilute acid hydrolysates of lignocellulose with lime," Progresso da biotecnologia, vol. 17, não. 2, pp. 287–293, 2001. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  150. R. Gonzalez, H. Tao, K. T. Shanmugam, S.W. York e L. O. Ingram, “Transcriptome analysis of ethanologenic Escherichia coli cepas: tolerância ao etanol ”, em Anais do 225º Encontro Nacional ACS, p. U200, New Orleans, La, USA, março de 2003. Veja em: Google Scholar
  151. E. N. Miller, L. R. Jarboe, P. C. Turner et al., "Furfural inibe o crescimento por limitação da assimilação de enxofre em etanologenic Escherichia coli cepa LY180, ” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 75, não. 19, pp. 6132–6141, 2009. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  152. L. M. Tran, M. L. Rizk e J. C. Liao, "Ensemble model of metabolic networks," Biophysical Journal, vol. 95, não. 12, pp. 5606–5617, 2008. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  153. P. D. Schloss e J. Handelsman, "Biotechnological prospects from metagenomics", Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 14, não. 3, pp. 303–310, 2003. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  154. L. Jiang, E. A. Althoff, F. R. Clemente et al., "De novo computational design of retro-aldol enzmes", Ciência, vol. 319, no. 5868, pp. 1387–1391, 2008. Visualizar em: Publisher Site | Google Scholar
  155. V. Hatzimanikatis, C. Li, J. A. Ionita, C. S. Henry, M. D. Jankowski e L. Broadbelt, "Explorando a diversidade de redes metabólicas complexas", Bioinformática, vol. 21, não. 8, pp. 1603–1609, 2005.Veja em: Site da Editora | Google Scholar

Direito autoral

Copyright & # x00A9 2010 Laura R. Jarboe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


Técnicas de controle de altura futura

Condicionamento mecânico. Há muito tempo se sabe que tensões mecânicas, como escovar repetidamente, sacudir ou dobrar, causadas pelo movimento do ar ou pelo contato com objetos animados ou inanimados, podem reduzir o crescimento das plantas. Uma pesquisa recente conduzida pelo Dr. Joyce Latimer na Universidade da Geórgia demonstrou o potencial comercial desta técnica para controlar a altura de transplantes de vegetais, particularmente tomate. Este trabalho foi estimulado, em parte, pelo fato de que o B-Nine não está mais registrado para uso em culturas comestíveis. Um sistema de condicionamento mecânico adaptado para estufas comerciais envolve puxar uma barra através do

Figura 2. O crescimento do calêndula é afetado quando o fertilizante é retido por curtos períodos em diferentes momentos durante a safra.

topos das plantas uma ou duas vezes por dia. A barra é baixa o suficiente para entrar em contato com as plantas, mas não tão baixa que as plantas sejam danificadas ou arrancadas. Reduções de 30 a 40% na altura foram relatadas com este sistema. Outros sistemas envolvem agitação periódica, tratamentos de sopro de ar ou sprays de água. Para que isso seja útil para os produtores de flores, é necessária uma pesquisa para determinar a resposta das plantações de flores.

Filtros de luz. Os fisiologistas de plantas descobriram que mudar a proporção da luz vermelha para a luz vermelha extrema pode influenciar o alongamento e a ramificação do caule. A luz vermelha inibe o alongamento da haste em comparação com a luz vermelha distante, que promove o alongamento da haste. A luz vermelha também promove a ramificação, estimulando o crescimento dos botões laterais. Na natureza, há mudanças diárias e sazonais na proporção vermelho: vermelho distante. A luz natural no meio do dia e no verão tem maior proporção de vermelho do que o nascer e o pôr do sol e o inverno. O efeito de sombreamento das copas das plantas também altera a proporção, aumentando a proporção de luz vermelha distante. Esse é um fator importante para explicar por que as plantas se alongam quando estão muito próximas. A pesquisa atual está sendo direcionada para o desenvolvimento de coberturas de estufas que alteram o equilíbrio vermelho: vermelho distante para controlar a altura e ramificação das plantas.


Por que é desejável acoplar a produção química ao crescimento? - Biologia

Os seres vivos crescem e se reproduzem. O crescimento é uma forma de gerar os materiais para reprodução. A reprodução é uma forma de fazer novos organismos que podem crescer. Assim, o aparente "objetivo" de todo organismo é preencher o mundo disponível com sua descendência, ou seja, com "eu". Foi sugerido que cada unidade de herança em si, cada gene, é egoísta dessa maneira. Atua de forma a aumentar suas chances de se espalhar para todos os indivíduos disponíveis de uma população. Se outros genes são úteis nisso, ótimo. Se não, não colabore.

O impulso irracional em direção à expansão que é a marca registrada dos seres vivos é um programa inventado no início da história da vida. Provou ser um grande sucesso. (Ele foi reinventado pelo mercado livre como um programa de sucesso para organizações que vivem no mundo econômico.) O objetivo do programa nunca pode ser alcançado, porque os organismos dependem uns dos outros para sua existência. Assim, há um "feedback negativo" no crescimento de cada organismo que mantém as coisas em equilíbrio, mais ou menos. Os humanos, ultimamente, têm sido especialmente bem-sucedidos em evitar ou neutralizar feedback negativo sobre o crescimento populacional (como doenças ou falta de comida). Como resultado, eles descobriram que o ambiente perde propriedades desejáveis ​​à medida que é preenchido com pessoas, e que os recursos se tornam escassos. Essa descoberta deu origem à noção de “desenvolvimento sustentável”, que pode ser traduzido como “crescimento sem consequências negativas”. Resta saber se o impulso irracional em direção à expansão que compartilhamos com todos os outros organismos pode ser verificado por feedback interno inteligente antes de ser interrompido por falta de recursos.

Todo crescimento depende da apropriação de matéria externa, ou seja, de "comer" de alguma forma. Os ecologistas classificaram as várias maneiras pelas quais os organismos comem (todas em grego, para o estilo):

Organismos que comem outros (comedores de outros) são chamados de "heterotrofos". Se isso acontecer em um ambiente oxigenado e o oxigênio for usado para "queimar" a comida, falamos em "respiração aeróbica". Nós, humanos, somos heterótrofos e usamos a respiração aeróbica para manter nossos corpos. (Respiramos oxigênio e expelimos dióxido de carbono.) Outros heterótrofos podem usar respiração anaeróbica para processar alimentos (eles retiram o oxigênio de moléculas como nitrato ou sulfato) ou podem usar fermentação (eles picam as moléculas orgânicas e reorganizam as partes, assim como o fermento). Organismos que se alimentam usando a luz do sol para construir nova matéria orgânica (autoalimentadores) são chamados de foto-auto-troféus. Normalmente, o oxigênio é produzido ao fazer isso ("fotossíntese oxigenada"), conforme descrito pela equação fotossintética. Uma terceira maneira de ganhar a vida, além de comer outras pessoas ou alimentar-se usando a luz solar, é usando gradientes químicos como fonte de energia para a síntese (em vez da luz solar). Esses organismos são chamados de "quimio-auto-troféus". Eles são todos micróbios de uma classe especial de bactérias no sentido amplo ("archea") e têm adaptações especiais para lidar com ambientes quimicamente incomuns (altamente ácidos, ricos em enxofre, etc.). Existem aqueles que são "anaeróbios" (ou seja, não há oxigênio molecular disponível) e aqueles que são "aeróbios" (ou seja, eles usam o oxigênio molecular disponível para alterar a química local e produzir energia). Entre as formas anaeróbias estão produtores de metano e sulfeto, por exemplo. (O metano é formado nas vísceras do sulfeto de gado e produz o cheiro de ovo podre). Entre as formas aeróbias estão oxidantes de sulfeto e oxidantes de ferro. (Os primeiros produzem o escoamento ácido das minas. Os últimos produzem ferrugem nas rochas úmidas.)


Cansado de ver Buttercup em seu pasto?

Cansado de olhar através de suas pastagens / campos de feno e ver aquele “mar amarelo” a cada primavera? Um dos sinais de que a primavera chegou é quando as flores amarelas do botão de ouro começam a aparecer, mas é durante os meses de inverno que ocorre o crescimento vegetativo do botão de ouro. Como uma erva daninha de estação fria, esta planta freqüentemente floresce em campos de pastagem com áreas pobres de forragens desejáveis. Na verdade, muitos campos com densas populações de botões-de-ouro são campos fortemente pastados por animais durante o outono até o início da primavera. Buttercups às vezes são classificados como perenes de vida curta, mas muitas vezes crescem como anuais de inverno.

Buttercup é tóxico para todas as espécies de gado. A toxina protanemonina é liberada quando a planta é mastigada ou ferida e está presente em todas as partes da planta. Animais que comem botão de ouro podem sofrer de bolhas na boca e partes internas do trato gastrointestinal, diarréia, cólicas e, em casos graves, morte. Felizmente, a maioria dos animais não come botão de ouro porque é intragável. A toxina se torna inativada quando seca, então o botão de ouro não é uma preocupação no feno.

A maioria das plantas de botão-de-ouro emerge da semente durante o outono ou no final do inverno. Portanto, as práticas de manejo da pastagem que melhoram e promovem o crescimento das plantas desejáveis ​​durante esses meses é um dos melhores métodos para ajudar a competir contra o surgimento e o crescimento dessa planta. Cortar os campos ou cortar as plantas perto do solo no início da primavera, antes que as plantas do ranúnculo possam produzir flores, pode ajudar a reduzir a quantidade de novas sementes produzidas, mas o corte por si só não eliminará totalmente a produção de sementes.

Para controle químico, os herbicidas registrados para uso em pastagens de gramíneas que contêm 2,4-D controlarão efetivamente o botão-de-ouro. Dependendo de outras ervas daninhas presentes, produtos que contêm dicamba + 2,4-D (por exemplo, Weedmaster), aminopiralide (por exemplo, ForeFront, Milestone), triclopir (por exemplo, PastureGard, Crossbow) ou metsulfuron (por exemplo, Cimarron) também podem ser usados . No entanto, leguminosas como os trevos semeados com pastagens podem ser gravemente feridas ou mortas por esses produtos herbicidas. Para melhores resultados, aplique um herbicida no início da primavera (fevereiro & # 8211 abril) antes que as flores sejam observadas, quando as plantas de botão-de-ouro ainda são pequenas e estão crescendo ativamente. Para obter a melhor atividade de herbicida, espere até que as temperaturas do ar durante o dia sejam superiores a 50 F por dois a três dias consecutivos. Ao determinar qual produto é melhor para sua operação, certifique-se de ler os rótulos dos produtos para descobrir os detalhes sobre as restrições de pastejo e feno, pois variam amplamente entre esses produtos

Um programa eficaz de controle de ervas daninhas é essencial para estabelecer e manter pastagens altamente produtivas e desempenho animal. Precisamos lembrar que & # 8220Um grama de prevenção vale um quilo de cura. & # 8221 Selecione espécies de gramíneas e / ou leguminosas bem adaptadas que crescerão e se estabelecerão rapidamente. Isso irá minimizar o tempo para que as ervas daninhas invadam facilmente. Limpe e fertilize de acordo com as recomendações do teste de solo. O pH adequado e o estado nutricional ajudam a garantir que a forragem cresça rapidamente e seja mais competitiva com as ervas daninhas. Administre o pastejo de maneira adequada. O sobrepastoreio é uma causa comum de problemas com ervas daninhas. A forte pressão do pastejo pode favorecer o crescimento de ervas daninhas em relação à grama. Identifique os problemas e a localização das ervas daninhas e selecione a opção ou combinação de opções que planeja usar para o controle de ervas daninhas (manejo mecânico, químico ou de pastagem), mas o mais importante é colocá-lo em prática e avaliar o resultado.

Extensão Cooperativa do Estado de Mississippi

Extensão Cooperativa de Maryland


Molécula de sacarose

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Figura 1. A sacarose é produzida a partir da reação química entre dois açúcares simples chamados glicose e frutose.

Anthony Fernandez

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Figura 2. Modelo de preenchimento de espaço de uma molécula de sacarose

Shutterstock

Em um cristal de açúcar, as moléculas de sacarose são organizadas em um padrão repetido que se estende em todas as três dimensões, e todas essas moléculas são atraídas umas às outras por forças intermoleculares - um tipo de interação que une as moléculas e é mais fraca do que as ligações entre átomos em uma molécula.

Quando você adiciona açúcar granulado à água, algumas das moléculas de sacarose começam a se separar umas das outras porque são atraídas pelas moléculas de água (Fig. 3). Quando as moléculas de água e sacarose estão próximas umas das outras, elas interagem por meio de forças intermoleculares que são semelhantes às forças intermoleculares entre as moléculas de sacarose.

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Figura 3. Quando o açúcar granulado é adicionado à água, ele se quebra porque as moléculas de água são atraídas para as moléculas de sacarose por meio de forças intermoleculares. Como resultado, cada molécula de sacarose é envolvida por moléculas de água e é transportada para a solução.

O processo de dissolução envolve duas etapas: primeiro, as moléculas de água se ligam às moléculas de sacarose e, segundo, as moléculas de água puxam as moléculas de sacarose do cristal para a solução.

Em geral, apenas uma certa quantidade de um sólido pode ser dissolvido em água a um determinado volume e temperatura. Se adicionarmos mais do que essa quantidade, não mais daquele sólido se dissolverá. Nesta fase, dizemos que a solução é saturado. O sólido adicional simplesmente cai para o fundo do recipiente.

Por que? Se você pudesse ver as moléculas de sacarose e água, notaria que, no início, ao adicionar uma pequena quantidade de açúcar granulado à água, a maioria das moléculas de sacarose está deixando os cristais de açúcar, puxados pelo moléculas de água. Você também notaria que algumas das moléculas de sacarose dissolvidas também estão se cristalizando, ou seja, não apenas as moléculas de sacarose estão deixando os cristais de açúcar, mas outras moléculas de sacarose estão se juntando aos cristais de açúcar também (Fig. 4). A razão é que as moléculas de sacarose estão em constante movimento na solução, então nada impede que algumas delas se liguem novamente às moléculas de sacarose nos cristais de açúcar. No entanto, a taxa de dissolução é maior do que a taxa de cristalização - pelo menos até que a solução esteja saturada - então, no geral, os cristais de açúcar permanecem dissolvidos na água.

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Figura 4. Quando um cristal de açúcar é adicionado a uma xícara de água, algumas moléculas de sacarose se separam do cristal, enquanto outras se juntam ao cristal. Se o cristal se dissolve em água ou aumenta de tamanho, é determinado comparando o número relativo de moléculas de sacarose que se dissolvem e saem do cristal com o número de moléculas de sacarose que saem da solução e se unem ao cristal.

À medida que adicionamos mais açúcar granulado à solução, a taxa de dissolução diminui e a taxa de cristalização aumenta, portanto, em algum ponto, as duas taxas são iguais. Em outras palavras, o número de moléculas de sacarose deixando os cristais são iguais ao número de moléculas de sacarose juntando os cristais. É o que acontece quando a solução está saturada.

Como resultado, após esse ponto, se adicionarmos mais cristais de açúcar, o processo de dissolução continuará, mas será exatamente equilibrado pelo processo de recristalização. Portanto, os cristais de açúcar não podem mais se dissolver na água. Neste caso, os cristais e a solução estão em equilíbrio dinâmico. Isso significa que o tamanho dos cristais permanece o mesmo, embora as moléculas de sacarose estejam constantemente trocando de lugar entre a solução e os cristais.

Para fazer balas de rocha, inicialmente usamos mais açúcar do que poderia dissolver em água em temperatura ambiente (três xícaras de açúcar para uma xícara de água). A única maneira de fazer com que todo esse açúcar se dissolva é aquecendo a água, porque o aumento da temperatura faz com que mais açúcar se dissolva na água. Em outras palavras, o equilíbrio dinâmico é afetado por uma mudança na temperatura. Se aumentarmos a temperatura, aumentamos o processo de dissolução, e se reduzirmos a temperatura, diminuímos o processo de dissolução.

O processo de cristalização é explicado pelo princípio de Le Châtelier, que afirma que um sistema que é desviado do equilíbrio atua para restaurar o equilíbrio, reagindo em oposição à mudança. Portanto, um aumento na temperatura faz com que o sistema diminua a energia, em uma tentativa de baixar a temperatura. Como a quebra das ligações químicas sempre absorve energia, ela resfria o sistema, de modo que mais moléculas de sacarose se separam e se dissolvem na solução.

O que acontece quando a solução esfria? Neste ponto, vemos a formação de cristais de açúcar. Isso também é explicado pelo princípio de Le Châtelier: uma diminuição da temperatura faz com que um sistema gere energia, na tentativa de elevar a temperatura. Como a formação de ligações químicas sempre libera energia, mais moléculas de sacarose se juntam ao cristal na tentativa de aumentar a temperatura. Isso explica por que os cristais se formam quando a temperatura diminui.

Assim que a solução saturada começa a esfriar, ela se torna supersaturada. Uma solução supersaturada é instável - ela contém mais soluto (neste caso, açúcar) do que pode permanecer na solução - então, à medida que a temperatura diminui, o açúcar sai da solução, formando cristais. Quanto mais baixa a temperatura, mais moléculas se juntam aos cristais de açúcar, e é assim que o doce de pedra é criado.


O que isso significa para os investidores?

Se você der um passo para trás e avaliar cada afirmação que a Intrexon fez sobre sua plataforma de fermentação de gás, o status prometido de mudança de jogo da tecnologia começa a perder seu brilho. A empresa faz comparações ruins com as tecnologias existentes e não parece ter nenhuma vantagem real para fazer pelo menos três dos quatro produtos químicos que está desenvolvendo atualmente.

No momento em que a empresa estiver em escala de produção para 1,4-BDO e 2,3-BDO - daqui a alguns anos - é provável que os processos existentes usando a fermentação tradicional já tenham ganhado participação de mercado significativa e reduzido seus custos de processo abaixo a dos processos petroquímicos convencionais. Outros produtos químicos na mira já são produzidos em massa com margens saudáveis ​​e não apresentam o risco técnico de um novo processo de fermentação de gás. Portanto, embora a visão da Intrexon pareça ótima no papel, existem alguns obstáculos que investidores, administração e analistas de Wall Street parecem estar negligenciando.