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Quanto tempo leva para a célula T ingênua ser ativada?

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Suponha que uma célula T ingênua entre em contato com um APC. Quanto tempo leva para a célula T ser ativada e em quanto tempo a célula T se afasta do APC devido à incompatibilidade em sua estrutura de receptor? Qual é a probabilidade de que haverá ativação de uma célula T ingênua por um APC (quero dizer que quantas células T devem entrar em contato com APC antes de uma célula T ser ativada, algum número como digamos 1 em cada 1000 t a célula é ativada por um APC em um determinado momento)?
Qualquer recurso que você possa fornecer que forneça um valor quantitativo da interação da célula T com o APC, faça-o, se possível.


Fronteiras em Imunologia

As afiliações do editor e dos revisores são as mais recentes fornecidas em seus perfis de pesquisa do Loop e podem não refletir sua situação no momento da revisão.



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Células B e T

Os linfócitos, que são glóbulos brancos, são formados com outras células sanguíneas na medula óssea vermelha, encontradas em muitos ossos achatados, como o ombro ou os ossos pélvicos. Os dois tipos de linfócitos da resposta imune adaptativa são as células B e T (Figura 12.12). Se um linfócito imaturo se torna uma célula B ou uma célula T, depende de onde no corpo ele amadurece. As células B permanecem na medula óssea para amadurecer (daí o nome “B” para “medula óssea”), enquanto as células T migram para o timo, onde amadurecem (daí o nome “T” para “timo”).

A maturação de uma célula B ou T envolve se tornar imunocompetente, o que significa que ela pode reconhecer, por ligação, uma molécula ou antígeno específico (discutido abaixo). Durante o processo de maturação, as células B e T que se ligam muito fortemente às células do próprio corpo são eliminadas a fim de minimizar uma resposta imunológica contra os próprios tecidos do corpo. As células que reagem fracamente às células do próprio corpo, mas têm receptores altamente específicos em suas superfícies celulares que lhes permitem reconhecer uma molécula estranha, ou antígeno, permanecem. Este processo ocorre durante o desenvolvimento fetal e continua ao longo da vida. A especificidade deste receptor é determinada pela genética do indivíduo e está presente antes de uma molécula estranha ser introduzida no corpo ou encontrada. Assim, é a genética e não a experiência que fornece inicialmente uma vasta gama de células, cada uma capaz de se ligar a uma molécula estranha específica diferente. Uma vez imunocompetentes, as células T e B migram para o baço e os gânglios linfáticos, onde permanecerão até serem acionadas durante uma infecção. As células B estão envolvidas na resposta imune humoral, que tem como alvo os patógenos soltos no sangue e na linfa, e as células T estão envolvidas na resposta imune mediada por células, que tem como alvo as células infectadas.

Figura 12.12: Esta micrografia eletrônica de varredura mostra um linfócito T. As células T e B são indistinguíveis à microscopia de luz, mas podem ser diferenciadas experimentalmente pela sondagem de seus receptores de superfície. (crédito: modificação do trabalho pelos dados da barra de escala do NCI de Matt Russell)


Resultados

Apesar da distribuição unimodal, os níveis de CD4 em células T CD4 naïve estão correlacionados com a capacidade de resposta

As células NCD4 mostram distribuição unimodal dos níveis de CD4. Para examinar se esta população aparentemente homogênea tem quaisquer consequências funcionais, classificamos as células NCD4 esplênicas de camundongo (CD4 + CD25-CD44-CD62L +) nos decis mais brilhantes (NCD4hi) e mais maçantes (NCD4lo) dos níveis de CD4 (Figura 1A). Não houve sobreposição nos níveis de CD4 dessas populações classificadas, que normalmente diferiam em aproximadamente duas vezes (Figura 1A). Em seguida, caracterizamos essas células NCD4hi e NCD4lo classificadas em termos funcionais. As células purificadas foram ativadas com anticorpos monoclonais anti-CD3 + anti-CD28 revestidos com placa (mAbs) por 18 horas e a frequência de células mostrando indução de CD69 como um marcador de ativação precoce foi estimada. Proporções menores de células NCD4lo do que de células NCD4hi expressaram CD69 em múltiplas concentrações de anti-CD3 (Figuras 1B e C). Além disso, as células NCD4lo produziram menos IL-2 em 48 horas (Figura 1D) e incorporaram menos (3H) -timidina em 60 horas após a ativação (Figura 1E). A proliferação deficiente de células NCD4lo ativadas também foi confirmada em um ensaio de diluição de éster de succinimidila de carboxifluoresceína (CFSE) (consulte Arquivo adicional 1: Figura S1A-B). Nós examinamos a possibilidade de que o anticorpo anti-CD4 se ligasse durante a classificação aos sinais de forma diferencial para as células NCD4hi e NCD4lo, deixando as células classificadas em repouso por 24 horas em IL-2 antes de estimulá-las com anti-CD3 + anti-CD28 por 48 horas. A diferença em suas respostas proliferativas persistiu, indicando que não estava relacionada a nenhum artefato de sinalização mediado por anti-CD4 (Figura 1F).

Apesar da distribuição unimodal, os níveis de CD4 nas células T CD4 naïve estão correlacionados com a responsividade. UMA. Estratégia de controle usada para classificar células NCD4lo e NCD4hi de camundongos de seis a oito semanas de idade. O painel direito mostra o perfil de classificação para células NCD4hi e NCD4lo. B. A expressão de CD69 em anti-CD3 + anti-CD28 (3 μg / ml cada) estimulou as células NCD4lo e NCD4hi 16 horas após a ativação. Os números indicam proporções representativas de células CD69 + em células NCD4hi (pretas) e NCD4lo (cinza). C. Proporções de células CD69 + em uma curva dose-resposta com 3 μg / ml de anti-CD28 e titulação das concentrações de anti-CD3, conforme mostrado. (Média ± SE, n = 4 n.s .: não significativo). D. Quantidade de IL-2 detectada 48 horas após a estimulação com anti-CD3 + anti-CD28 em sobrenadantes de cultura. (Média ± SE, n = 3 Valores de fundo mostrados como uma linha). E. Ensaio de incorporação de 3H-timidina para medir a proliferação 60 horas após a estimulação com anti-CD3 + anti-CD28. (Média ± SE de culturas em triplicado, 1 de & gt7 experimentos). F. Ensaio de incorporação de 3H-timidina em células classificadas NCD4hi e NCD4lo cultivadas em vitro com IL-2 por 24 horas antes da estimulação com anti-CD3 + anti-CD28 por 60 horas. (Média ± SE de culturas em triplicado, um de três experimentos). G. Proporção de células positivas para azul de tripano 16 horas após a ativação (Média ± SE, n = 6, dados representativos de quatro experimentos). H. Níveis de citocinas em sobrenadantes de em vitro células NCD4hi e NCD4lo preparadas e recuperadas. eu. Razões IFNγ / IL-4 e média ± SE calculada com base nos valores de absorbância. SE, erro padrão.

Como a indução de IL-2 foi diferente entre as células NCD4lo e NCD4hi, testamos se a suplementação exógena de IL-2 poderia abolir a diferença. Quando a IL-2 exógena (10 U / ml) foi adicionada durante a ativação, as células NCD4lo mostraram alguma melhora nas respostas proliferativas em concentrações mais baixas de anti-CD3, mas em nenhum ponto suas respostas alcançaram os níveis alcançados pelas células NCD4hi (ver arquivo adicional 1: Figura S1C), sugerindo que, embora a produção diferencial de IL-2 possa contribuir para a diferença, era improvável que representasse a única explicação. Houve morte celular induzida por ativação mais proeminente em células NCD4lo em 24 horas após a ativação, conforme classificado pela coloração com azul de tripano, do que em células NCD4hi (Figura 1G).

Também testamos a capacidade das células NCD4hi e NCD4lo classificadas para diferenciar em vitro em resposta a condições de ativação não polarizantes (descritas em detalhes em Métodos). Sobrenadantes de culturas de células NCD4hi e NCD4lo iniciadas em vitro com anti-CD3 + anti-CD28 por três dias e então reestimulados com doses tituladas de anti-CD3 foram analisados ​​para IFNγ e IL-4. As células efetoras geradas a partir de células NCD4lo produziram mais IL-4 em comparação com as células NCD4hi (Figura 1H). A dominância Th1 / Th2 relativa, indicada pela razão IFNγ / IL-4, foi significativamente menor em células NCD4lo diferenciadas (Figura 1I).

As células NCD4lo mostram modificações fenotípicas complexas, mas nenhuma diferença nos eventos de sinalização proximal

O CD5 é um regulador negativo da sinalização de TCR [10] e a expressão de CD5 foi inversamente correlacionada com a responsividade das células T [37]. Portanto, testamos a possibilidade de que níveis mais baixos de CD4 possam se correlacionar com uma expressão de CD5 mais alta. As células NCD4hi e NCD4lo de camundongos B6 jovens (Figura 2A) foram testadas para os níveis de CD5. Quando as células NCD4hi e NCD4lo bloqueadas foram analisadas quanto à expressão de CD5, ficou aparente que as células NCD4lo tinham níveis de CD5 mais elevados (Figura 2B, gráfico log à esquerda, linear à direita) em vários camundongos analisados ​​(Figura 2C). Isso ocorreu apesar da descoberta de que as células NCD4hi eram um pouco maiores do que as células NCD4lo (Figuras 2D e E). Também examinamos os níveis de vários outros marcadores moleculares nessas populações. As células NCD4lo mostraram níveis de TCRβ mais baixos (Figura 2F, gráficos log e lineares e 2G) que as células NCD4hi, embora ambas as células NCD4lo e NCD4hi tenham sido confirmadas como células T CD4 convencionais que expressam TCRα / β. As células NCD4lo também expressaram níveis um pouco mais baixos de MHC classe I e CD2, mas níveis mais altos de CD54 (consulte o arquivo adicional 2: Figura S2A e S2B) em vários camundongos examinados. Outra característica testada com base nas diferenças no tamanho das células entre as células NCD4lo e NCD4hi foi a massa mitocondrial e o potencial usando corantes indicadores, Mitotracker Green (MG) e Mitotracker Red (MR) [38], [39]. No entanto, as células NCD4lo não mostraram quaisquer diferenças marcantes das células NCD4hi no conteúdo mitocondrial ou potencial (consulte o arquivo adicional 2: Figura S2C a S2E). Esses dados indicaram que as diferenças fenotípicas entre as células NCD4lo e NCD4hi eram provavelmente reguladas de forma complexa.

As células NCD4lo mostram níveis de CD5 mais elevados, mas nenhuma diferença na sinalização proximal. UMA. Ex vivo análise de células esplênicas coradas para mostrar células NCD4lo e NCD4hi bloqueadas. B. Comparação dos níveis de CD5 como gráficos log (à esquerda) e lineares (à direita) entre as células NCD4hi e NCD4lo. C. Valores de CD5 MFI para células NCD4hi e NCD4lo (média ± SE, um de três experimentos). D. Comparação de dispersão direta entre células NCD4hi e NCD4lo. E. Valores de dispersão direta em células NCD4hi e NCD4lo (média ± SE, um dos cinco experimentos). F. Comparação dos níveis de TCRβ como gráficos log (à esquerda) e lineares (à direita) entre as células NCD4hi e NCD4lo. G. Valores de TCRβ MFI para células NCD4hi e NCD4lo (média ± SE, um de três experimentos). H. Perfil representativo da razão Fluo-3 / Fura-Red em células NCD4hi e NCD4lo em repouso e pós-ativação. eu. Dados agrupados de baços de camundongos independentes mostrando aumento na razão Fluo-3 / Fura-Red com tratamento anti-CD3 (10 μg / ml) + anti-CD28 (3 μg / ml) J. Dados agrupados para aumento de vezes sobre o fundo em MFI de coloração com pZap-70 em células NCD4hi e NCD4lo ativadas com anti-CD3 + anti-CD28, média ± SE. MFI, intensidade média de fluorescência NCD4, células T CD4 virgens SE, erro padrão TCR, receptor de células T.

Uma vez que os resultados proliferativos a jusante da ativação de TCR diferiram entre as células NCD4lo e NCD4hi, examinamos os eventos de sinalização proximal após a ligação com anti-CD3 + anti-CD28. O fluxo de cálcio induzido pela ativação (conforme medido por um aumento nas razões Fluo-3 / Fura-Red) era indistinguível entre as células NCD4hi e NCD4lo (Figura 2H, 2I e arquivo adicional 2: Figura S2F). Da mesma forma, os níveis totais de Zap-70 foram comparáveis ​​entre as células NCD4hi e NCD4lo (consulte o arquivo adicional 2: Figura S2G, painel esquerdo), e a indução de fosforilação de Zap-70 após a ativação por cinco minutos não diferiu entre as células NCD4lo e NCD4hi (Figura 2J e arquivo adicional 2: Figura S2G, painéis do meio e direito como log e gráficos lineares). Da mesma forma, os níveis totais de Lck foram comparáveis ​​em células NCD4lo e NCD4hi, e a extensão da indução de p-Lck em cinco minutos após a ativação foi semelhante entre eles (ver arquivo adicional 2: Figura S2H). Juntos, esses dados sugerem que a sinalização proximal não é diferente entre as células NCD4hi e NCD4lo, e que as diferenças entre elas podem estar mais abaixo.

A hipo-responsividade associada às células NCD4lo se desenvolve exclusivamente na periferia e também é observada em células T monoclonais

A fim de verificar se essas propriedades das células NCD4hi e NCD4lo são uma característica intrínseca no desenvolvimento de populações NCD4, testamos células CD8-CD4 + CD24-Qa2 + NCD4 maduras tímicas positivas simples (SP). Quando essas células foram bloqueadas para identificar células CD4lo e CD4hi (Figura 3A, gráficos log e linear), ficou aparente que elas não mostram diferenças no tamanho da célula (Figura 3A, painel direito) ou nos níveis de CD5 (Figura 3B, log e linear parcelas). Quando esses timócitos CD4lo e CD4hi CD4SP foram classificados e ativados com anti-CD3 + anti-CD28 revestido com placa, eles responderam de forma comparável (Figura 3C), ao contrário das células NCD4lo e NCD4hi da periferia (Figura 1). Esses dados indicam que as diferenças funcionais e fenotípicas observadas entre as células periféricas NCD4lo e NCD4hi não são de origem tímica.

A hipo-responsividade associada às células NCD4lo se desenvolve exclusivamente na periferia e também é observada em células T monoclonais. UMA. Ex vivo análise de células tímicas coradas para mostrar células CD4lo e CD4hi maduras positivas únicas (gráficos log e linear) e dispersão direta correspondente (direita) (um de três experimentos). B. Níveis de CD5 na escala log (esquerda) e linear (direita) do mesmo experimento que em A. C. Ensaio de incorporação de 3H-timidina para medir a proliferação de células CD4lo e CD4hi maduras positivas simples tímicas classificadas 60 horas após a ativação com anti-CD3 (1 μg / ml) e anti-CD28 (3 μg / ml) (média ± SE de culturas em triplicado , um dos três experimentos). D. Incorporação de 3H-timidina em 60 horas de células NCD4lo e NCD4hi classificadas de camundongos OT-II transgênicos TCR para titulação de concentrações de peptídeo OVA-II com DCs B6 irradiados como APCs (média ± SE de culturas em triplicata, um de quatro experimentos). E. Quantidade de IL-2 estimada a partir dos sobrenadantes 48 horas após a estimulação. Dados de um dos quatro experimentos. APCs, células apresentadoras de antígeno, DCs, células dendríticas NCD4, células T CD4 virgens SE, erro padrão TCR, receptor de células T.

A fim de examinar se a hiporresponsividade de células NCD4lo poderia ser plausivelmente atribuída a diferenças no repertório de TCR policlonal normal [40], classificamos células NCD4hi e NCD4lo esplênicas de camundongos transgênicos para um TCR restrito a MHCII (OT-II) e as estimulamos células classificadas com concentrações de titulação do peptídeo de ovalbumina cognato (OVA-II) apresentado por células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) como células apresentadoras de antígeno (APCs). As células NCD4lo OT-II responderam mal ao peptídeo cognato e produziram menos IL-2 do que as células NCD4hi OT-II (Figura 3D e E), mostrando que mesmo em células T virgens com um único TCR, os níveis de CD4 estavam correlacionados com a responsividade.

Células humanas NCD4lo e NCD4hi mostram propriedades semelhantes às de camundongos

Testamos se as distinções observadas entre células de camundongo NCD4lo e NCD4hi também foram encontradas em células CD4 humanas. Para isso, examinamos células NCD4 (CD4 + CD45RA + CD25-) de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) de doadores saudáveis. Quando as populações de NCD4hi e NCD4lo bloqueadas (Figura 4A, painel esquerdo) foram examinadas, as células NCD4lo eram menores em tamanho em vários doadores (Figura 4A, painel direito, Figura 4B), consistente com os dados do camundongo. As células NCD4hi e NCD4lo humanas classificadas mostraram uma diferença de cerca de duas vezes nos valores de intensidade média de fluorescência (MFI) de CD4 (Figura 4A, painel do meio) semelhantes às células de camundongo. Após a ativação com mAbs anti-CD3 + anti-CD28 revestidos com placa, as células NCD4hi proliferaram muito mais do que as células NCD4lo (Figura 4C). A massa mitocondrial e o potencial de membrana também foram avaliados nessas células usando MG e MR (Figura 4D e F, respectivamente, gráficos à esquerda, gráficos lineares à direita) como para células de camundongo. Semelhante às células NCD4lo de camundongo, as células NCD4lo humanas também não mostraram diferenças marcantes das células NCD4hi na massa e potencial mitocondrial (Figura 4E a G).

As células NCD4lo e NCD4hi de PBMCs humanos mostram propriedades semelhantes às células de camundongo. UMA. Uma estratégia de passagem representativa para células NCD4lo e NCD4hi (esquerda), sobreposição de histograma de células NCD4lo e NCD4hi classificadas (meio) e análise das mesmas células quanto ao tamanho (direita). B. Dispersão direta para células NCD4hi e NCD4lo de doadores individuais (Média ± SE). C. Incorporação de 3H-timidina em resposta a doses de titulação de anti-CD3 e 3 μg / ml de anti-CD28 60 horas após a ativação (média + SE de culturas em triplicado de um de quatro doadores independentes). D. Sobreposições de histograma para coloração de MG em escala log (esquerda) e linear (direita) em NCD4lo e NCD4hi. E. MFI para MG em células NCD4hi e NCD4lo de seis doadores individuais (média ± SE). F. Sobreposições de histograma para coloração de MR em log (esquerda) e escala linear (direita) em NCD4lo e NCD4hi. G. MFI para MR em células NCD4hi e NCD4lo de seis doadores individuais (média ± SE). MFI, intensidade média de fluorescência MG, Mitotracker Green MR, Mitotracker Red NCD4, células T CD4 naïve PBMC, células mononucleares de sangue periférico SE, erro padrão.

Consequências da residência periférica nas células T NCD4

Os dados até agora sugerem que a associação entre os níveis de CD4 e o fenótipo funcional foi uma característica induzida perifericamente. Para investigar isso ainda mais, começamos classificando as células NCD4lo e NCD4hi esplênicas. Rotulamos essas células com corantes verdes e violetas para identificação, misturamos na proporção de 1: 1 e as transferimos por via intravenosa (i.v.) para recipientes do tipo selvagem (WT). No dia 4 pós-transferência, as células NCD4 do doador foram identificadas nos baços do receptor e analisadas quanto aos seus níveis de CD4. A comparação dos níveis de CD4 nas células NCD4hi e NCD4lo antes (d0) e após a transferência (d4), feita em paralelo, mostrou que as células NCD4lo transferidas de forma adotiva continuaram a mostrar níveis de CD4 quase inalterados que eram mais baixos do que as células NCD4hi transferidas (Figura 5A, esquerda e plotagem de log dos painéis do meio, plotagem linear do painel direito). Os níveis de CD4 nas células NCD4hi diminuíram dos níveis d0 para o dia 4 após a transferência, indicando que as células T CD4 naïve perdem os níveis de CD4 ao longo do tempo na periferia. No entanto, apesar desse declínio, as células NCD4hi continuaram a ter níveis de CD4 mais elevados do que as células NCD4lo até o dia 7 após a transferência (Figura 5B). Notavelmente, não houve diferença apreciável na capacidade das células transferidas de sobreviver na Vivo, pelo menos por um período de uma semana (Figura 5C). Esses dados sugerem que os níveis de CD4 não mudam aleatoriamente na Vivo mas provavelmente serão reduzidos com o tempo, talvez com residência mais longa.

Consequências da residência periférica em células T NCD4. UMA. Os níveis de CD4 em células NCD4lo (esquerda e direita) e NCD4hi (meio e direita) classificadas e diferencialmente marcadas antes (dia 0) e quatro dias após a transferência. Painel esquerdo e do meio - gráficos de registro, painel direito - uma sobreposição em escala linear (um dos três experimentos). B. Valores de CD4 MFI para células NCD4lo e NCD4hi sete dias após a transferência. Cada círculo representa um mouse receptor individual e a linha horizontal indica a média ± SE. C. Número de células NCD4hi e NCD4lo transferidas recuperadas de baços de camundongos receptores individuais sete dias após a transferência, mostrado como média ± SE (um de dois experimentos). D. Incorporação de 3H-timidina em células OT-II estacionadas em camundongos WT por uma ou cinco semanas em resposta à titulação das concentrações de peptídeo OVA-II. Dados normalizados para 200 células OT-II (média ± SE de culturas em triplicado 1 de experimentos & gt7). A linha horizontal indica cpm de fundo. E. Os níveis de IL-2 em sobrenadantes de cultura de uma experiência representativa como no painel D. A linha horizontal indica os níveis de fundo de IL-2 (uma de cinco experiências). F. Sobreposições de histograma mostrando os níveis de CD4 como gráficos log e linear de células OT-II estacionadas em uma semana ou estacionadas em oito semanas. G. Níveis de CD4 MFI de células OT-II estacionadas há muito tempo (& gt4 semanas) e curtas (& lt2 semanas) (Média ± SE, um de seis experimentos). MFI, intensidade média de fluorescência NCD4, células T CD4 virgens SE, erro padrão WT, tipo selvagem.

Também usamos o ambiente linforepleto de camundongos congênicos WT para analisar as consequências da residência periférica prolongada na função das células T NCD4. Camundongos B6.SJL receberam 5 × 10 6 células OT-II e as respostas proliferativas dessas células doadoras em vitro foram analisados ​​uma a oito semanas depois. Células OT-II estacionadas por cinco semanas na Vivo respondeu mal em termos de proliferação e produção de IL-2 do que aqueles estacionados por uma semana (Figura 5D e E). Quando os níveis de CD4 nessas células estacionadas OT-II foram analisados, as células OT-II estacionadas por uma semana mostraram níveis mais altos de CD4 em comparação com as células estacionadas por oito semanas (Figura 5F, log e gráfico linear). Quando as células OT-II estacionadas por menos de duas semanas foram comparadas com aquelas estacionadas por mais de quatro semanas usando dados de vários experimentos, diferenças significativas foram encontradas em seus níveis relativos de CD4 (Figura 5G). Células DO11.10 estacionadas em camundongos Balb.c por seis meses mostraram níveis de CD4 mais baixos em comparação com aquelas estacionadas por duas semanas (ver arquivo adicional 3: Figura S3A e S3B).

Consequências da sinalização tônica prolongada e ausência de sinalização tônica em células T virgens

Os dados até agora sugeriram a hipótese de que os níveis de CD4 e a capacidade de resposta das células NCD4 foram reduzidos com o aumento da duração da residência periférica. Durante a residência periférica, os sinais tônicos mediados por MHCII são recebidos pelas células NCD4. Para testar se a redução nos níveis de CD4 e a perda de capacidade de resposta estavam relacionadas à sinalização tônica mediada por MHCII, "estacionamos" células NCD4 OT-II purificadas por transferência adotiva para ratos WT ou receptores nulos para MHCII. Quando os receptores foram sacrificados no dia 3 pós-transferência, o número de células OT-II recuperadas por baço de receptores WT e MHCII nulos eram comparáveis ​​(Figura 6A), sugerindo que é improvável que haja uma diferença importante na sobrevivência celular ou proliferação homeostática nos dois grupos neste momento pós-transferência. No entanto, as células NCD4 OT-II recuperadas de recipientes WT tinham níveis de CD4 mais baixos (Figura 6B, gráfico log e linear e 6C) e níveis mais altos de CD5 (Figura 6D log e gráficos lineares e 6E) do que as células recuperadas de recipientes MHCII nulos. Quando essas células foram estimuladas com o peptídeo cognato OVA-II, as células OT-II estacionadas em receptores MHCII nulos responderam melhor do que as células correspondentes estacionadas em receptores WT (Figura 6F).

Consequências da sinalização tônica prolongada e ausência de sinalização tônica em células T virgens. UMA. Números de células NCD4 OT-II transferidas adotivamente recuperadas de baços três dias após a transferência para camundongos WT e MHCII nulos (um de três experimentos independentes). B. Comparação dos níveis de CD4 (plotados em log na escala esquerda e linear à direita) de células doadoras NCD4 OT-II após três dias em camundongos WT e MHCII nulos. C. Dados agrupados, de amostras emparelhadas mostrando CD4 MFI e média ± SE (uma de três experiências). D. Comparação dos níveis de CD5 (plotados em log na escala esquerda e linear à direita) de células doadoras NCD4 OT-II após três dias em camundongos WT e MHCII nulos. E. Dados agrupados, de amostras emparelhadas mostrando CD5 MFI e média ± SE (um de três experimentos). F. Ensaio de proliferação de células doadoras NCD4 OT-II de camundongos receptores WT ou MHCII nulos quatro dias após a transferência em resposta ao peptídeo OVA-II na presença de DCs irradiadas de camundongos WT. Os dados foram normalizados para 1.000 células doadoras NCD4 OT-II (média ± SE de dados de culturas em triplicado representativos de dois experimentos, três camundongos receptores por grupo por experimento). G. Coloração DCFDA representativa (plotado em log na escala esquerda e linear à direita) para células doador OT-II de células do baço WT ou MHCII nulas sete dias após a transferência. H. Dados agrupados, de amostras emparelhadas que mostram valores de DCFDA MFI (Média ± SE, uma das três experiências) em recipientes WT ou MHCII nulos sete dias após a transferência. DCs, células dendríticas DCFDA, diacetato de 2-7-diclorofluorescina MFI, intensidade média de fluorescência NCD4, células T CD4 virgens SE, erro padrão WT, tipo selvagem.

Uma vez que o acúmulo de ROS é uma marca registrada comum de células senescentes [21] - [23], examinamos a possibilidade de que o estacionamento mais longo de células OT-II NCD4 em receptores WT versus MHCII nulos também pode levar a diferenças nos níveis de ROS neles. Quando as células NCD4 OT-II foram estacionadas por dez dias em recipientes WT ou MHCII nulos, e seus níveis de intensidade de coloração para o corante indicador ROS 2-7-diclorofluorescina diacetato (DCFDA) examinados, as células estacionadas em camundongos WT mostraram níveis de ROS mais elevados do que as células estacionadas em recipientes MHCII nulos (Figura 6G log e gráficos lineares e 6H).

Residência prolongada na Vivoleva à perda de funcionalidade e acúmulo de ROS em células NCD4

Em seguida, examinamos se os níveis de ROS diferiam em células estacionadas em camundongos linforepletos normais, dependendo da duração do estacionamento. As células OT-II estacionadas por oito semanas em camundongos linforepletos congênicos WT mostraram intensidades mais altas de coloração de DCFDA em comparação com as células estacionadas por uma semana (Figura 7A, gráficos log e linear). Em vários experimentos, quando as células OT-II estacionadas por menos de duas semanas foram comparadas com aquelas estacionadas por mais de quatro semanas, foram encontradas diferenças significativas em suas intensidades de coloração DCFDA relativas (Figura 7B).

Residência prolongada na Vivo leva à perda de funcionalidade e acúmulo de ROS nas células NCD4. UMA. Sobreposições de histograma (plotadas em log na escala esquerda e linear à direita) para DCFDA de células OT-II estacionadas por uma ou oito semanas em camundongos WT. B. Valores de DCFDA MFI de células OT-II estacionadas longas (& gt4 semanas) e estacionadas curtas (& lt2 semanas) (média ± SE, um de três experimentos). C. Incorporação de 3H-timidina em resposta à titulação das concentrações do peptídeo OVA-II em células OT-II estacionadas por uma ou seis semanas em camundongos WT (com ou sem tratamento com Euk-134). Os dados foram normalizados para 200 células OT-II (média ± SE de culturas em triplicado um de três experimentos). A linha horizontal indica cpm de fundo. DCFDA, diacetato de 2-7-diclorofluorescina MFI, intensidade média de fluorescência NCD4, células T CD4 virgens ROS, espécies reativas de oxigênio SE, erro padrão WT, tipo selvagem.

Em seguida, testamos se a eliminação de ROS poderia melhorar a hiporresponsividade relativa induzida em células OT-II por estacionamento prolongado. As células OT-II foram transferidas de forma adotiva para recipientes WT que receberam tratamento em dias alternados com veículo sozinho ou um superóxido dismutase (SOD) / mimetizador de catalase, Euk-134 [41], por cinco semanas após a transferência adotiva. Destinatários WT que receberam células OT-II uma semana antes também foram usados ​​como grupo de controle. Células OT-II de receptores tratados com Euk-134 mostraram uma melhor resposta proliferativa no final de seis semanas de estacionamento em comparação com células de receptores tratados com veículo, embora suas respostas ainda permanecessem mais pobres do que as de células OT-II estacionadas por apenas um semana (Figura 7C).

Uma vez que as diferenças de nível de ROS tornaram-se evidentes em cerca de 10 dias, testamos se um período mais curto de tratamento com Euk-134 era suficiente para melhorar a reatividade das células OT-II estacionadas. No entanto, o tratamento de 15 dias com Euk-134 não resultou em nenhuma melhora da reatividade (consulte o arquivo adicional 3: Figura S3C). Esses dados sugerem que a contribuição mediada por ROS para a hiporreatividade requer exposição a ROS bastante prolongada e, portanto, ROS claramente não é o principal fator que impõe hiporreatividade em células NCD4 após residência periférica prolongada.

O eixo Erk-DUSP6-miR-181a contribui para a hiporresponsividade das células T NCD4 durante a residência periférica

A fosforilação da proteína tirosina quinase Erk da família da proteína ativada por mitogênio (MAP) demonstrou ser pobre em muitas células envelhecidas, incluindo células T [6], [8], [42], [43] sugerindo que a idade das células T também pode ser correlacionado com a fosforilação de Erk. Examinamos os níveis de p-Erk da linha de base ex vivo em células NCD4hi e NCD4lo. As células NCD4lo mostram níveis significativamente mais baixos em comparação com as células NCD4hi (Figura 8A log e gráfico linear e 8B). A fosforilação defeituosa de Erk em células T humanas é regulada pela atividade de DUSP6, que por sua vez é controlada por miR-181a [8]. As células NCD4 de pessoas mais velhas expressam níveis mais baixos de miR-181a (em relação a um miRNA de controle, miR-142) do que as células NCD4 de pessoas jovens [8]. Portanto, estimamos os níveis de transcritos de miR-181a e miR-142 em células T de camundongo usando ensaios de RT-PCR em tempo real. Os níveis de transcritos de miR-181a (normalizados para níveis de transcrição de miR-142) foram mais baixos nas células NCD4lo em comparação com as células NCD4hi (Figura 8C), sugerindo ainda que, devido à residência periférica mais longa, as células NCD4lo mostram um padrão semelhante ao relatado nas células T NCD4 de indivíduos mais velhos [8]. Consistente com o papel do miRNA-181a na supressão da expressão de DUSP6 [8], quando as células NCD4lo e NCD4hi foram tratadas com um inibidor farmacológico de DUSP, (E) -2-benzilideno-3- (ciclohexilamino) -2,3-diidro- 1H-inden-1-ona (BCI) antes da ativação, as células NCD4lo responderam melhor após o tratamento com BCI (Figura 8D), enquanto as células NCD4hi não mostraram efeito de BCI. Além disso, a análise de citocinas secretadas por células NCD4lo e NCD4hi tratadas com BCI e diferenciadas em vitro mostraram que a tendência Th2 relativa das células NCD4lo foi parcialmente revertida pelo tratamento com BCI (Figura 8E).

O eixo Erk-DUSP6-miR181a contribui para a hiporresponsividade das células T NCD4lo. UMA. Sobreposições de histograma da linha de base ex vivo p-Erk (plotado em log na escala esquerda e linear à direita) em células NCD4lo e NCD4hi. B. Dados agrupados de amostras emparelhadas mostrando valores de MFI p-Erk de linha de base (Média ± SE) em células NCD4lo e NCD4hi. C. Valores ΔΔCt de RT-PCR em tempo real para miR-181a normalizado para miR-142 em células NCD4hi e NCD4lo (média ± SE de quatro conjuntos de células classificadas independentemente). D. Incorporação de 3H-timidina de células NCD4lo e NCD4hi tratadas ou não com BCI antes da ativação (média ± SE de culturas em triplicado). Dados representativos de cinco camundongos, um dos três experimentos. E. Razões IFNγ / IL-4 e IFNγ / IL-13 relativas para células NCD4lo tratadas ou não tratadas com BCI durante a resposta de recall. Os dados de três experimentos independentes mostrados normalizados para as respectivas proporções para células NCD4hi como 100%, mostrados como uma linha pontilhada. BCI, (E) -2-benzilideno-3- (ciclohexilamino) -2,3-di-hidro-1H-inden-1-ona DUSP6, fosfatase 6 específica dupla MFI, intensidade média de fluorescência NCD4, células T CD4 virgens SE, padrão erro.

As características fenotípicas e funcionais das células NCD4 de camundongos jovens com residência periférica mais longa são semelhantes às células NCD4 de camundongos idosos

O tempo médio de residência periférica de células T ingênuas em camundongos idosos e pessoas mais velhas é relatado como sendo mais longo do que suas contrapartes mais jovens devido à diminuição da produção do timo com a idade [16], [17]. Uma vez que nossos dados acima sugerem que as células NCD4lo de camundongos jovens são provavelmente aquelas com residência periférica mais longa, comparamos as células NCD4 de camundongos jovens (YNCD4) e idosos (ANCD4) para características funcionais e fenotípicas. Já mostramos que as células ANCD4 respondem mal e morrem mais facilmente após a ativação [34]. Observamos que as células ANCD4 tinham níveis de CD4 modestos, mas consistentemente mais baixos do que as células YNCD4 (Figura 9A log e gráfico linear e 9C). As células ANCD4 também eram consistentemente menores do que as células YNCD4 (Figura 9B e D). Também observamos a capacidade das células ANCD4 e YNCD4 classificadas para diferenciar em vitro em resposta a condições de ativação não polarizantes. Sobrenadantes de culturas de células ANCD4 e YNCD4 iniciadas em vitro com anti-CD3 + anti-CD28 por três dias e então reestimulado com doses tituladas de anti-CD3 foram analisados ​​para IFNγ, IL-4 e IL-13. As células ANCD4 assim diferenciadas em células efetoras produziram mais IL-4 e IL-13 em comparação com as células YNCD4 (Figura 9E). A dominância Th1 relativa, indicada pela razão IFNγ / IL-13, foi significativamente menor em células ANCD4 diferenciadas (Figura 9F). Também examinamos os níveis total e p-Erk. Enquanto os níveis totais de Erk (Figura 9G log e escala linear, gráfico inferior) não foram diferentes entre as células ANCD4 e YNCD4 ex vivo, os níveis de p-Erk no estado de repouso foram mais baixos nas células ANCD4 (Figura 9G log e escala linear, gráfico superior). As diferenças nos níveis de pErk foram significativas (Figura 9H). Em vários experimentos independentes, os níveis relativos de miR-181a foram menores em células ANCD4 em comparação com células YNCD4 (Figura 9I), estendendo as observações relatadas em células humanas [8]. Consistente com o papel do miRNA-181a na supressão da expressão de DUSP6 [8], as células ANCD4 responderam melhor quando tratadas com um inibidor farmacológico de DUSP, BCI, antes da ativação (Figura 9J). É digno de nota que não houve efeito aparente de BCI nas células YNCD4, apesar do fato de que algumas das células YNCD4 seriam CD4lo e, portanto, teriam mostrado um efeito de BCI. É provável que a contribuição das células NCD4lo nas células YNCD4 em massa pode não ser estatisticamente aparente. Além disso, a análise de citocinas secretadas por células ANCD4 e YNCD4 tratadas com BCI e diferenciadas em vitro mostraram que a tendência Th2 relativa das células ANCD4 foi parcialmente revertida pelo tratamento com BCI (Figura 9K).

As células NCD4lo se assemelham às células T CD4 virgens de camundongos idosos em seus atributos fenotípicos e funcionais. UMA. Níveis de CD4 em células ANCD4 e YNCD4 (plotados em log na escala esquerda e linear à direita) corados como uma mistura em um único poço. B. Histogramas de dispersão direta representativos para células ANCD4 e YNCD4. C. Comparação dos valores de CD4 MFI de células ANCD4 e YNCD4 (média ± dados SE representativos de três experiências). D. Dados para dispersão direta de camundongos individuais (dados de média ± SE representativos de três experimentos). E. Dados representativos mostrando os níveis de citocinas em sobrenadantes de em vitro células YNCD4 e ANCD4 preparadas e recuperadas. F. Razões IFNγ / IL-13 e média ± SE calculada com base nos valores de absorbância. G. Sobreposições de histograma da linha de base ex vivo p-Erk (em cima) e Erk total (em baixo) em células ANCD4 e YNCD4 (plotado em log na escala esquerda e linear à direita). H. Dados agrupados, de amostras emparelhadas mostrando valores de linha de base de p-Erk MFI (Média ± SE) em células ANCD4 e YNCD4. eu. Valores ΔΔCt de RT-PCR em tempo real para miR-181a normalizado para miR-142 em células ANCD4 e YNCD4 (média ± SE de cinco conjuntos de células classificadas independentemente). J. Incorporação de 3H-timidina de células ANCD4 e YNCD4 tratadas ou não com BCI antes da ativação (média ± SE de culturas em triplicado). Dados representativos de seis camundongos, um dos três experimentos. K. IFNγ / IL-13 e razão IFNγ / IL-4 para YNCD4, células ANCD4 tratadas com BCI ou células ANCD4 não tratadas com BCI durante a resposta de recall. Dados que representam um dos quatro experimentos independentes. ANCD4, células T CD4 naïve de camundongos idosos BCI, (E) -2-benzilideno-3- (ciclohexilamino) -2,3-dihidro-1H-inden-1-ona MFI, intensidade média de fluorescência SE, erro padrão YNCD4, naïve Células T CD4 de camundongos jovens.


Envelhecimento e o sistema imunológico - foco nas células T virgens

O sistema imunológico humano fornece nossas defesas contra patógenos. Esta entrada de blog se concentra na pesquisa sobre células-T. uma família de células do sistema imunológico. A pesquisa é relevante para o envelhecimento porque desafia a visão tradicional de que o número de células T e a potência diminuem com o envelhecimento avançado, tornando o corpo cada vez mais suscetível a doenças, e que essencialmente nada pode ser feito a respeito.

Visão geral & # 8211 os sistemas imunológicos e células T

Como os Departamentos de Defesa e Segurança Interna dos Estados Unidos, nosso sistema imunológico envolve muitos subsistemas e componentes complexos que interagem. Na verdade, os humanos têm dois sistemas imunológicos interagindo, o sistema imunológico inato, que é mais antigo e comum às espécies mais primitivas, um sistema que oferece respostas fixas aos patógenos e um sistema imunológico adaptativo que não apenas defende contra os patógenos, mas aprende sobre eles para melhor para proteger o corpo no futuro. " O sistema imunológico inato compreende as células e os mecanismos que defendem o hospedeiro da infecção por outros organismos de forma não específica. Isso significa que as células do sistema inato reconhecem e respondem aos patógenos de maneira genérica, mas, ao contrário do sistema imunológico adaptativo, não confere imunidade protetora ou duradoura ao hospedeiro. [1] Os sistemas imunológicos inatos fornecem defesa imediata contra a infecção e são encontrados em todas as classes de plantas e animais (ref). ” "O sistema imunológico adaptativo é composto por células e processos sistêmicos altamente especializados que eliminam ou previnem o crescimento patogênico. Acredita-se que tenha surgido nos primeiros vertebrados com mandíbula, o sistema imunológico adaptativo ou & # 8220 específico & # 8221 é ativado pelo sistema imunológico inato "não específico" e evolutivamente mais antigo (que é o principal sistema de defesa do hospedeiro contra patógenos em quase todos os outros seres vivos). A resposta imune adaptativa fornece ao sistema imune dos vertebrados a capacidade de reconhecer e lembrar patógenos específicos (para gerar imunidade) e de montar ataques mais fortes cada vez que o patógeno é encontrado. É imunidade adaptativa porque o sistema imunológico do corpo se prepara para os desafios futuros (ref). ”

As células T juntamente com as células B são componentes do sistema imunológico adaptativo. “ Células T ou Linfócitos T pertencem a um grupo de glóbulos brancos conhecidos como linfócitos e desempenham um papel central na imunidade mediada por células. Eles podem ser distinguidos de outros tipos de linfócitos, como células B e células natural killer (células NK) pela presença de um receptor especial em sua superfície celular chamado Receptores de células T (TCR). A abreviatura T , no Célula T , significa timo, uma vez que este é o principal órgão responsável pela maturação das células T & # 8217s. Vários subconjuntos diferentes de células T foram descobertos, cada um com uma função distinta (ref). ” Os subconjuntos são: 1,1 auxiliar, 1,2 citotóxico, 1,3 memória, 1,4 regulador, 1,5 assassino natural, 1,6 γδ. Cada um desempenha seu próprio papel especializado no sistema imunológico adaptativo.

“As células do sistema imunológico adaptativo são um tipo de leucócito, chamado linfócito. As células B e as células T são os principais tipos de linfócitos. O corpo humano tem cerca de 2 trilhões de linfócitos, constituindo 20-40% dos glóbulos brancos (leucócitos), sua massa total é quase igual à do cérebro ou fígado. [2] O sangue periférico contém 20–50% dos linfócitos circulantes, o restante move-se dentro do sistema linfático. [2] As células B e T são derivadas das mesmas células-tronco hematopoiéticas multipotentes e são morfologicamente indistinguíveis umas das outras até serem ativadas. [3] As células B desempenham um grande papel na resposta imune humoral, enquanto as células T estão intimamente envolvidas nas respostas imunes mediadas por células. No entanto, em quase todos os outros vertebrados, as células B (e células T) são produzidas por células-tronco na medula óssea. [3] As células T viajam e se desenvolvem no timo, de onde derivam seu nome. Em humanos, aproximadamente 1-2% do pool de linfócitos recircula a cada hora para otimizar as oportunidades para os linfócitos específicos do antígeno encontrarem seu antígeno específico dentro dos tecidos linfoides secundários [4] (ref). ”

“Em um animal adulto, os órgãos linfóides periféricos contêm uma mistura de células B e T em pelo menos três estágios de diferenciação:

· Células ingênuas que amadureceram, deixaram a medula óssea ou timo, entraram no sistema linfático, mas que ainda não encontraram seu antígeno cognato,

· Células efetoras que foram ativadas por seu antígeno cognato e estão ativamente envolvidas na eliminação de um patógeno.

· Células de memória - os sobreviventes de longa duração de infecções anteriores (ref). ”

Timócitos são células progenitoras hematopoéticas presentes no timo. Timopoiese é o processo no timo pelo qual os timócitos se diferenciam em linfócitos T maduros (células T) (ref). ” O timo fornece uma série de microambientes especializados necessários para a maturação adequada das células T. Fatores de transcrição complexos e miRNAs estão envolvidos na seleção de células T do tipo destino (ref) (ref). “Os timócitos devem completar um elaborado programa de desenvolvimento no timo para, em última instância, gerar células T que expressem TCRs funcionais, mas não prejudiciais ou inúteis. Cada etapa do desenvolvimento coincide com a realocação dinâmica dos timócitos entre microambientes tímicos anatomicamente distintos, sugerindo que a migração dos timócitos & # 8217 é estritamente regulada por seu estado de desenvolvimento. As quimiocinas produzidas por células do estroma tímico e receptores de quimiocinas nos timócitos desempenham um papel indispensável na orientação dos timócitos em desenvolvimento para os diferentes microambientes (ref). ”

Envelhecimento e o sistema imunológico

Uma das marcas do envelhecimento avançado é o enfraquecimento do sistema imunológico adaptativo, geralmente conhecido como imunosenescência. “Essas disfunções imunológicas associadas à idade são consequência de declínios tanto na geração de novos linfócitos T e B virgens quanto na competência funcional das populações de memória (ref).” Esse declínio parece ser devido a uma variedade de causas. Por um lado, a involução tímica começa em uma idade precoce. “O timo começa a encolher (atrofia) após a adolescência. Na meia-idade, tem apenas cerca de 15% de seu tamanho máximo (ref). Existem fortes mudanças relacionadas à idade na produção de hormônios (ref). Os idosos podem tomar medicamentos antiinflamatórios como a prednisona, que inibem a função imunológica. E as mudanças nos padrões dos marcadores epigenéticos alteram a ativação do gene de modo a reduzir a capacidade de resposta das células T com a idade.

Em particular, os mecanismos homeostáticos relacionados às células T virgens tendem a se tornar desregulados com o avanço da idade em primatas e humanos. Um relatório de 2011 Desregulação relacionada à idade da homeostase de células T ingênuas em humanos idosos conclui “Nossos resultados mostram que números menores de células T naive foram associados a uma função tímica mais baixa e maior ativação e proliferação de níveis de células T naive. Em seguida, analisamos os números sjTREC e o comprimento relativo dos telômeros de células T ingênuas classificadas. Nossos resultados mostram que a ativação aberrante e o status de proliferação foram relacionados a menores números de sjTREC (um marcador de proliferação periférica) e ambos, maiores níveis de expressão de CD57 e telômeros encurtados (marcadores replicativos relacionados à senescência). Idosos apresentam maior contração do número de células T virgens de CD8 e todas as alterações homeostáticas são mais graves neste compartimento. Além disso, descobrimos que o timo funcional baixo mostra uma produção de timócitos desviada para CD4. Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem uma desregulação homeostática, afetando principalmente o subconjunto de células T CD8 ingênuas, levando ao acúmulo de defeitos associados à idade em, de outra forma, células T fenotipicamente ingênuas ”.

O timo também é extremamente suscetível a doenças. Desnutrição, desequilíbrios nutricionais e outros gatilhos de involução tímica. Ver O timo é um órgão alvo comum em doenças infecciosas (2006) e O timo é um alvo comum na desnutrição e infecção (2007). A publicação de 2010 Desequilíbrios nutricionais e infecções afetam o timo: consequências nas respostas imunológicas mediadas por células T relata “O timo, onde ocorre o desenvolvimento de linfócitos T, é alvo de desnutrição secundária à deficiência de energia protéica. Há uma atrofia tímica grave, resultante da apoptose maciça dos timócitos (afetando particularmente o subconjunto de células imaturas CD4 + CD8 +) e diminuição da proliferação celular. O microambiente tímico (o compartimento não linfóide que impulsiona o desenvolvimento de células T intratímicas) também é afetado na desnutrição: foram encontradas alterações morfológicas nas células epiteliais do timo, juntamente com uma diminuição da produção de hormônio tímico, bem como um aumento do conteúdo intratímico de proteínas extracelulares. Mudanças profundas no timo também podem ser vistas em deficiências de vitaminas e oligoelementos. Tomando a deficiência de Zn como exemplo, há uma atrofia tímica substancial. É importante ressaltar que a deficiência marginal de Zn em indivíduos com AIDS, crianças com diarréia e idosos, prejudica significativamente a imunidade do hospedeiro, resultando em um risco aumentado de infecções oportunistas e efeitos de mortalidade que são revertidos pela suplementação de Zn. Alterações tímicas também ocorrem em doenças infecciosas agudas, incluindo uma atrofia tímica grave, principalmente devido à depleção de timócitos CD4 + CD8 +, diminuição da proliferação de timócitos, em paralelo à densificação da rede epitelial e aumento do conteúdo da matriz extracelular, com consequentes distúrbios na migração e exportação de timócitos. Em conclusão, o timo é direcionado em várias condições de desnutrição, bem como em infecções agudas. Essas alterações estão relacionadas ao comprometimento da resposta imune periférica observada em indivíduos desnutridos e infectados. Assim, as estratégias que induzem a reposição do timo devem ser consideradas como terapêutica adjuvante para melhorar a imunidade na desnutrição e / ou doenças infecciosas agudas. ”

Entre os gatilhos adicionais para a involução tímica estão a presença de beta catenina, um oncogene (ref) e a presença de linfoma de células T (ref) (ref).

Pesquisa recente

Pode ser possível descobrir maneiras seguras de interromper ou reverter a involução do timo e, portanto, manter a glândula timo ativa na produção de células T em pessoas que estão envelhecendo. Por vários anos, os pesquisadores têm buscado abordagens para preservar a funcionalidade das células T relacionadas à idade por meio de desaceleração, parada ou reversão da involução tímica.

A publicação de 2005 Insights sobre envelhecimento e regeneração do timo relata “Acredita-se que a deterioração do sistema imunológico com o envelhecimento progressivo contribui para a morbidade e mortalidade em humanos idosos devido ao aumento da incidência de infecção, autoimunidade e câncer. Pensa-se que a desregulação da função das células T desempenha um papel crítico nestes processos. Uma das consequências do envelhecimento do sistema imunológico é o processo denominado involução do timo, em que o timo sofre uma redução progressiva de tamanho devido a mudanças profundas em sua anatomia associadas à perda de células epiteliais do timo e diminuição da timopoiese. Este declínio na produção de células T recentemente desenvolvidas resulta em números diminuídos de células T naive circulantes e imunidade mediada por células prejudicada. Uma série de teorias foram apresentadas para explicar esta & # 8216 menopausa tímica & # 8217, incluindo a possível perda de progenitores tímicos ou células epiteliais, uma capacidade diminuída de reorganizar os genes dos receptores das células T e alterações na produção de fatores de crescimento e hormônios. Embora até o momento nenhuma intervenção restaure totalmente a função tímica no envelhecimento do hospedeiro, a administração sistêmica de várias citocinas e hormônios ou o transplante de medula óssea resultaram em aumento da atividade tímica e produção de células T com a idade ”.

Um corpo substancial de pesquisas subsequentes tem se concentrado em estratégias para restaurar a função tímica. A publicação de revisão de 2010 Estratégias emergentes para aumentar a função tímica relatos sobre alguns desses “Nos últimos anos, estratégias estimuladoras, regenerativas e protetoras do timo foram desenvolvidas para melhorar e reparar a função do timo em idosos e em indivíduos submetidos a transplante de células-tronco hematopoéticas. Essas estratégias incluem o uso de ablação de esteróides sexuais, a administração de fatores de crescimento e diferenciação, a inibição de p53 e a transferência de progenitores de células T para aliviar os efeitos da disfunção do timo e consequente deficiência de células T ”.

Bloqueio de hormônio masculino

Uma das abordagens para a renovação do timo tem sido baseada no bloqueio do hormônio masculino, uma vez que esses hormônios parecem estar implicados no processo de involução do timo. Os tratamentos que bloqueiam o hormônio sexual masculino, em algumas circunstâncias, demonstraram reverter a involução tímica relacionada à idade, mas com efeitos colaterais. De acordo com a publicação eletrônica de dezembro de 2010 Os glicocorticóides derivados do timo medeiam os efeitos dos androgênios na homeostase dos timócitos , “Os andrógenos contribuem para o processo de involução do envelhecimento da glândula timo. & # 8211. Investigamos a influência da testosterona na síntese ectópica de glicocorticóides (GCs) em timócitos, atividade recentemente demonstrada por nós como importante para a regulação homeostática dessas células. & # 8212 Fornecemos aqui um mecanismo não reconhecido de como os andrógenos contribuem para a involução do timo, estimulando a síntese local e a liberação de GCs no timo. ”

A relação dos glicocorticóides com a função tímica é complexa e tem sido muito estudada. Parece que os glicocorticóides podem desempenhar papéis diferentes. “Aqui, resumimos esses dados e sugerimos que os GCs podem mediar os efeitos positivos e negativos no órgão, dependendo da concentração hormonal local. Os níveis basais de GC podem promover o crescimento de timócitos iniciais em camundongos jovens e aumentar os níveis, gerados por meio de uma reação de estresse, apoptose nessas células. Uma perda gradual da síntese de GC em TECs durante o envelhecimento pode contribuir para a involução tímica, um processo até agora inexplicado (ref). ” Veja também Os glicocorticóides sintetizados por timócitos desempenham um papel na homeostase dos timócitos e são regulados negativamente pelo hormônio adrenocorticotrópico, Diferentes papéis dos glicocorticóides na homeostase dos timócitos? , Os glicocorticóides retardam a involução tímica associada à idade ao afetar diretamente os timócitos e Síntese relacionada à idade de glicocorticóides em timócitos.

Em relação à reversão do envelhecimento do sistema imunológico, a senescência funcional das células do sistema imunológico pode não estar associada ao encurtamento dos telômeros e pode ser reversível.

A publicação de agosto de 2011 Senescência reversível em células T de memória humanas CD4 + CD45RA + CD27 relata: “Infecções virais persistentes e síndromes inflamatórias induzem o acúmulo de células T com características de diferenciação terminal ou senescência. No entanto, o mecanismo que regula a diferenciação em estágio final dessas células não é claro. Células T CD4 + efetoras (EM) humanas (CD27 - CD45RA -) e também células T que re-expressam CD45RA (CD27 - CD45RA + EMRA) têm muitas características de diferenciação de estágio final. Estes incluem a expressão de superfície KLRG1 e CD57, capacidade replicativa reduzida, sobrevivência diminuída e alta expressão de γH2AX nuclear após a ativação de TCR. Uma observação paradoxal foi que, embora as células T CD4 + EMRA exibam atividade telomerase defeituosa após a ativação, elas têm telômeros significativamente mais longos do que as células T semelhantes à memória central (CM) (CD27 + CD45RA -) e EM (CD27 - CD45RA -) CD4 +. Isso sugeriu que a atividade da telomerase foi ativamente inibida nessa população. Como as citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, inibiram a atividade da telomerase em células T por meio de uma via de p38 MAPK, investigamos o envolvimento da sinalização de p38 em células T CD4 + EMRA. Descobrimos que a expressão de p38 total e fosforilada foi mais alta no EM e EMRA em comparação com a de outros subconjuntos de células T CD4 +. Além disso, a inibição da sinalização de p38, especialmente em células T CD4 + EMRA, aumentou significativamente sua atividade telomerase e sobrevivência após a ativação de TCR. Assim, a ativação da via p38 MAPK está diretamente envolvida em certas características de senescência de células T CD4 + altamente diferenciadas. Em particular, as células T CD4 + EMRA têm características de senescência independente dos telômeros que são reguladas por vias de sinalização de células ativas que são reversíveis. ”

Sobre esta pesquisa, um artigo do Science Daily de agosto de 2011 Possibilidade de reverter temporariamente o envelhecimento no sistema imunológico relata: “Os pesquisadores descobriram um novo mecanismo de controle do envelhecimento nas células brancas do sangue. A pesquisa, publicada na edição de setembro do Journal of Immunology, abre a possibilidade de reverter temporariamente os efeitos do envelhecimento sobre a imunidade e pode, no futuro, permitir o reforço de curto prazo do sistema imunológico de pessoas mais velhas. & # 8212 Imunidade enfraquecida é um problema sério para pessoas mais velhas. Como nosso sistema imunológico se torna menos eficaz à medida que envelhecemos, sofremos de mais infecções, que costumam ser mais graves. Isso tem um impacto sério na saúde e na qualidade de vida. & # 8212 O professor Arne Akbar da UCL (University College London), que liderou esta pesquisa, explica & # 8220Nossos sistemas imunológicos ficam progressivamente mais fracos à medida que envelhecemos, porque cada vez que nos recuperamos de uma infecção, uma proporção de nossos glóbulos brancos se torna desativada. & # 8212 Este é um processo importante que provavelmente evoluiu para prevenir certos tipos de câncer, mas à medida que a proporção de células inativas aumenta com o tempo, nossas defesas ficam enfraquecidas. O que essa pesquisa mostra é que algumas dessas células estão sendo ativamente desativadas em nossos corpos por um mecanismo que não havia sido identificado antes como importante no envelhecimento do sistema imunológico. Embora não desejemos reativar essas células permanentemente, temos uma ideia agora de como acordá-las temporariamente de seu sono, apenas para dar um pequeno impulso ao sistema imunológico. & # 8221

o Artigo do Science Daily continua a relacionar-se com a hipótese de encurtamento dos telômeros da senescência das células imunes: “Até agora, pensava-se que o envelhecimento das células do sistema imunológico era em grande parte determinado pelo comprimento de capas especiais nas extremidades do nosso DNA. Essas tampas, chamadas telômeros, ficam mais curtas a cada vez que um glóbulo branco se multiplica até que, quando ficam muito curtas, a célula fica permanentemente desativada. Isso significa que nossas células imunológicas têm uma vida útil embutida e, à medida que vivemos mais, isso não é mais o suficiente para nos fornecer proteção na velhice. & # 8212 No entanto, quando a equipe do Professor Akbar & # 8217s coletou algumas amostras de sangue e olhou atentamente para os glóbulos brancos, eles viram que alguns estavam inativos e ainda assim tinham telômeros longos. Isso disse aos pesquisadores que deve haver outro mecanismo no sistema imunológico que faz com que as células sejam desativadas, independente do comprimento dos telômeros. & # 8212 O professor Akbar continua & # 8220A descoberta de que essas células inativas tinham telômeros longos foi realmente empolgante, pois significava que eles poderiam não ser permanentemente desativados. Foi como um gerente de futebol descobrir que alguns jogadores famosos que todos pensavam que haviam se aposentado para sempre puderam ser persuadidos a voltar a jogar em um último jogo importante. & # 8221 & # 8212 Quando os pesquisadores bloquearam essa via recém-identificada no laboratório que encontraram que os glóbulos brancos pareciam ter sido reativados. Os medicamentos que bloqueiam essa via já estão sendo desenvolvidos e testados para uso em outros tratamentos, portanto, a próxima etapa desta pesquisa é explorar mais se os glóbulos brancos podem ser reativados em pessoas mais velhas e quais os benefícios que isso pode trazer. & # 8212 Professor Akbar continua & # 8220Esta pesquisa abre a possibilidade empolgante de dar aos idosos & # 8217s sistema imunológico um impulso temporário para ajudá-los a combater infecções, mas esta não é uma fonte de juventude eterna. É perfeitamente normal que nosso sistema imunológico se torne menos eficaz e há boas razões evolutivas para isso. Estamos muito longe de ter uma compreensão suficiente do envelhecimento para considerar o rejuvenescimento permanente dos glóbulos brancos, se é que isso é possível. # 8220Este é um exemplo fantástico do valor de aprofundar nossa compreensão da biologia celular fundamental. Este trabalho descobriu um processo novo e imprevisto que controla como nosso sistema imunológico muda à medida que envelhecemos. Além disso, ao explorar em detalhes como nossas células funcionam, ele abriu a perspectiva de ajudar os sistemas imunológicos de pessoas idosas usando medicamentos que já estão sendo testados e desenvolvidos.Ao aumentar a incidência e a gravidade da infecção, a imunidade enfraquecida prejudica seriamente a saúde e a qualidade de vida dos idosos, portanto, esta pesquisa é muito valiosa. & # 8221

Com o envelhecimento, certas células T ingênuas sobrevivem seletivamente por mais tempo do que outras e são mais protetoras.

Também publicada em agosto de 2011, a publicação Atrito não aleatório do pool de células T CD8 + naïve com o envelhecimento governado por interações de TCR: pMHC relata “A imunidade contra novas infecções diminui no último quartil da vida, assim como o número de células T ingênuas. A manutenção periférica de células T ingênuas ao longo da vida é necessária porque sua produção diminui drasticamente na puberdade, um resultado da involução tímica. Relatamos que essa manutenção não é aleatória no envelhecimento avançado. Como os números e a diversidade de células T CD8 + ingênuas diminuíram com o envelhecimento, as células sobreviventes sofreram taxas mais rápidas de proliferação homeostática, foram selecionadas para receptor de células T alto: avidez de pMHC e fenótipo "semelhante à memória" preferencialmente adquirido. Esses precursores de alta avidez responderam preferencialmente à infecção e exibiram forte função antimicrobiana. Assim, a avidez do receptor de células T para auto-pMHC fornece um mecanismo de revisão para manter algumas das células T mais aptas no repertório ingênuo de outra forma em desintegração, fornecendo um grau de compensação para defeitos numéricos e de diversidade em células T antigas. ”

Em agosto de 2011 Science Daily artigo Envelhecimento: células T que sobrevivem por mais tempo podem proteger melhor contra infecções como a gripe relatórios sobre a mesma pesquisa : “ O envelhecimento provoca um declínio seletivo no número e na função das células T & # 8212 um tipo de glóbulo branco envolvido na resposta do sistema imunológico & # 8217s à infecção & # 8212 e as células T que sobrevivem por mais tempo podem proteger melhor contra infecções como a gripe, de acordo com um estudo conduzido por pesquisadores da University of Arizona College of Medicine & # 8212 Tucson. A descoberta pode levar a direcionar essas células com vacinas que aumentem seu número e melhorem a proteção contra doenças em adultos mais velhos. O declínio da função imunológica com a idade é visto como o fator contribuinte mais importante para o aumento da suscetibilidade a infecções e diminuição das respostas às vacinações. Melhorar a função das células T pode resultar em imunidade melhorada. & # 8211 & # 8220Nós descobrimos que o envelhecimento provoca o desgaste seletivo das células T que nos defendem contra novas infecções que não havíamos encontrado antes. Nem todas as células T envelhecem da mesma maneira e as que sobreviverão por mais tempo têm características especiais que podem permitir uma melhor proteção contra infecções como a gripe & # 8221 diz o autor sênior do estudo Janko Nikolich-Žugich, MD, PhD, presidente do Departamento de Imunobiologia, codiretor do Arizona Center on Aging e Elizabeth Bowman Professora de Pesquisa Médica na UA College of Medicine e membro do UA BIO5 Institute. & # 8220Agora sabemos que existem algumas células boas que podem ser visadas pela vacinação para expandir seu número e alcançar proteção ”.

Transplante autólogo de medula óssea

O transplante autólogo de medula óssea é outra estratégia para restauração da função tímica e prolongamento da produção de células T virgens. Ver Restauração do tímico microambiente celular após transplante autólogo de medula óssea .

Parece que a involução tímica, como tantas outras alterações relacionadas ao envelhecimento, é em grande parte dependente de fatores epigenéticos; portanto, as alterações relacionadas à idade são potencialmente paráveis ​​ou reversíveis por intervenções epigenéticas.

Parece haver uma quantidade significativa de pesquisas atuais relacionadas a mecanismos epigenéticos e vias de ativação de genes relacionadas à gênese e homeostase das células T. Por exemplo, várias publicações têm se preocupado com a expressão de Foxp3 e NF-kappaB em células T regulatórias. A partir de A metilação do DNA controla a expressão do gene Foxp3 : “Juntos, nossos dados sugerem que TSDR é um importante elemento sensível à metilação que regula a expressão de Foxp3 e demonstra que a impressão epigenética nesta região é crítica para o estabelecimento de uma linhagem Treg (célula T reguladora) estável.” Outras publicações relacionadas incluem Mecanismos epigenéticos de regulação da expressão de Foxp3 , O desenvolvimento de células t reguladoras Foxp3 (+) é conduzido pelo realceossomo c-Rel , Fator Nuclear - kappa B modula o desenvolvimento de células T regulatórias por meio da regulação direta da expressão do fator de transcrição Foxp3 , e as publicações de 2011 Notch3 e as vias de sinalização canônica de NF-kappaB regulam cooperativamente a transcrição de Foxp3 . A ativação de NF-κB intrínseca celular é crítica para o desenvolvimento de células T reguladoras naturais em camundongos .

Certos suplementos dietéticos parecem ser protetores contra a involução do timo e facilitar timopoiese em indivíduos idosos

Um desses suplementos é o zink, conforme sugerido na publicação de 2006 Correlação entre o status do zinco e a função imunológica em idosos . A publicação de 2009 A suplementação de zinco aumenta o status de zinco e a timopoiese em ratos idosos relata “Nosso objetivo neste estudo foi entender como a suplementação de zinco na dieta afeta a timopoiese em ratos idosos. Nossa hipótese é que o estado de zinco prejudicado associado ao envelhecimento mediaria o declínio na função e produção tímica e que a restauração das concentrações plasmáticas de zinco por meio da suplementação de zinco melhoraria a timopoiese e as funções tímicas. & # 8212 Tomados em conjunto, nossos resultados mostraram que em camundongos, a suplementação de zinco pode reverter alguns defeitos tímicos relacionados à idade e pode ser um benefício considerável na melhoria da função imunológica e da saúde geral em populações idosas. ” A publicação de 2009 O sistema imunológico e o impacto do zinco durante o envelhecimento relataram “O oligoelemento zinco é essencial para o sistema imunológico e a deficiência de zinco afeta vários aspectos da imunidade inata e adaptativa. Existem paralelos notáveis ​​nas mudanças imunológicas durante o envelhecimento e deficiência de zinco, incluindo uma redução na atividade do timo e dos hormônios tímicos, uma mudança no equilíbrio das células T auxiliares em direção às células T auxiliares do tipo 2, diminuição da resposta à vacinação e funções prejudicadas de células imunes inatas. Muitos estudos confirmam um declínio dos níveis de zinco com a idade. A maioria desses estudos não classifica a maioria dos idosos como deficientes em zinco, mas mesmo a privação marginal de zinco pode afetar a função imunológica. Conseqüentemente, a suplementação oral de zinco demonstra o potencial de melhorar a imunidade e diminui com eficiência as respostas inflamatórias crônicas em idosos. Esses dados indicam que uma ampla prevalência de deficiência marginal de zinco em idosos pode contribuir para a imunossenescência. ”

Outro suplemento alimentar possivelmente capaz de proteger contra a involução tímica induzida por glutocortocóides é DHEA. Isso foi sugerido em estudos in vitro há algum tempo. A publicação de 1990 Proteção contra involução tímica induzida por glicocorticóides por desidroepiandrosterona relata: “A desidroepiandrosterona (DHEA), o esteróide adrenal humano mais abundantemente secretado, não tem função específica conhecida. Apesar deste fato, há uma abundância de dados que associam DHEA com & # 8220health & # 8221 em homens e animais experimentais. Pesquisas em nosso laboratório demonstraram evidências de uma interação antagônica entre DHEA e glicocorticóides (GC) no fígado e no tecido adiposo marrom. Nossa hipótese é que o DHEA também antagonizou os efeitos do GC no sistema imunológico e que este & # 8220 efeito protetor imunológico & # 8221 pode explicar os efeitos positivos difusos do DHEA relatados na literatura. Os efeitos do GC no sistema imunológico incluem involução do timo quando administrado em animais in vivo e morte de linfócitos tímicos in vivo com exposição a esses esteróides. Nossa hipótese é que DHEA bloquearia esta destruição de timócitos mediada por GC in vivo e in vitro. O pré-tratamento com DHEA por três dias bloqueou aproximadamente 50% da involução tímica observada com a dexametasona. Os resultados dos experimentos in vitro confirmaram os efeitos protetores do DHEA em animais pré-tratados. (menos de 50% da morte celular em linfócitos de camundongos pré-tratados em comparação com linfócitos de camundongos de controle.) Concluímos desses estudos que o DHEA protege contra pelo menos um efeito anti-imune GC, a lise de linfócitos tímicos. ” Também relevante para os efeitos tímicos do DHEA são a publicação de 2010 DHEA e terapias de testosterona em ratos infectados com Trypanosoma cruzi estão associadas com tímico alterar

A melatonina é outro suplemento hormonal que pode exercer um efeito positivo sobre o envelhecimento do sistema imunológico. A publicação de 2008 Melatonina e a imune sistema no envelhecimento relata: “doenças. As imunidades inata, celular e humoral exibem deterioração aumentada com a idade. A melatonina circulante diminui com a idade e, nos últimos anos, muito interesse tem se concentrado em seu efeito imunomodulador. A melatonina estimula a produção de células progenitoras de granulócitos e macrófagos. Também estimula a produção de células assassinas naturais e células CD4 + e inibe as células CD8 +. A produção e liberação de várias citocinas de células assassinas naturais e linfócitos T auxiliares são aumentadas pela melatonina. A melatonina tem o valor terapêutico potencial para melhorar a função imunológica em indivíduos idosos. ”

Walter Pierpaoli, escritor de vários livros populares sobre melatonina, há muitos anos apoia a teoria de que o envelhecimento é governado por um programa circadiano de expressão da melatonina operando na glândula pineal que também rege a imunidade. De sua publicação de 1998 Neuroimunomodulação do envelhecimento. Um programa na glândula pineal : “Há 35 anos investigamos a relação entre o sistema imunológico neuroendócrino e timo-linfático. Na última década, mostramos que a glândula pineal é um adaptador principal e um sincronizador fino de variáveis ​​ambientais e mensagens endógenas em modificações fisiológicas de funções básicas. Em particular, a própria glândula pineal parece regular, via circadiana, a secreção noturna de melatonina, todas as funções hormonais básicas e também a imunidade. Mostramos com vários modelos in vivo que esse papel fundamental da glândula pineal decai durante o envelhecimento. O envelhecimento em si parece ser um evento estritamente programado pela pineal, semelhante ao crescimento e à puberdade. ” Embora essa teoria e os trabalhos populares de Pierpaoli não tenham sido levados a sério por muitos pesquisadores da longevidade, agora parece claro que existe algum tipo de ciclo de resposta imune circadiana operativa e que a melatonina tem um efeito na produção ou expressão de células T.

Diz-se que alguns coquetéis comerciais de substâncias à base de plantas têm poderes para fortalecer o timo e aumentar a imunidade. Até agora, não me comprometi a investigá-los. No momento, tendo a ser cético sobre essas misturas sempre assumindo a posição “ Mostre-me a pesquisa . ” Eu sei que algumas substâncias naturais à base de plantas têm impactos tímicos. Por exemplo, a publicação O estresse oxidativo induzido por tumor perturba a morte de células T mediada por fator de necrose tumoral de aumento de atividade de fator nuclear kappaB: proteção por curcumina sugere ”A curcumina pode prevenir a atrofia tímica induzida por tumor, restaurando a atividade de NF-kappaB. Outras investigações sugerem que a neutralização do estresse oxidativo induzido pelo tumor e a restauração da atividade do NF-kappaB, juntamente com a reeducação da via de sinalização do TNF-alfa, podem ser o mecanismo por trás da proteção tímica mediada pela curcumina. Assim, nossos resultados sugerem que, ao contrário de muitos outros agentes anticâncer, a curcumina não é apenas desprovida de efeitos imunossupressores, mas também atua como imunorestor em hospedeiros com tumor ”.

Embrulhando-o

Um grande esforço de pesquisa tem sido dedicado a compreender o desenvolvimento e a homeostase das células T e abordagens para preservar a competência das células T com o avanço do envelhecimento. Houve progresso limitado com abordagens hormonais e de transplante para a renovação do timo e muito se aprendeu. No entanto, parece que ainda não chegamos lá em termos de intervenções avançadas de extensão da competência imunológica. No entanto, nosso conhecimento dos fatores epigenéticos que afetam a gênese e a homeostase das células T está aumentando rapidamente e isso pode levar a novas abordagens ou ajustes mais precisos das mais antigas. Por enquanto, parece que a melhor abordagem para manter uma forte imunidade com o envelhecimento é a manutenção da saúde geral. Além disso, a suplementação dietética com zink, DHEA e melatonina pode ser benéfica.


RESULTADOS

Trabalhos anteriores mostraram que clones de células T humanas estabelecidas, cultivadas em 2% de oxigênio, manifestaram várias mudanças mensuráveis ​​em comparação com a cultura contínua no ar: elas cresceram por mais tempo (10-15 duplicações populacionais) e expressão da proteína de choque térmico regulada para cima [16 , 17]. O mesmo parece se aplicar ao MSC [13]. Aqui, começamos a testar em nossas condições experimentais se PhysO2 (2% de oxigênio) também foi mais favorável para a ativação primária e diferenciação de células T dentro de PBMC. De acordo com as recomendações [8], a área / volume de superfície nas placas de 24 poços que usamos (1,9 cm 2 / 0,4–1 ml) foi comparável com o frasco T75 (75 cm 2/125 ml) e, portanto, nós considerou que o O desejado2 foi alcançado após menos de 24 horas [8]. O pH não foi afetado pelas diferentes concentrações de oxigênio.

Redução da proliferação de células T mediada por grânulos TCR / CD28 em PhysO2

PBMC foram cultivados por 5 dias com esferas revestidas com αCD3αCD28 a 20% (AtmO2) e 2% (PhysO2) pO2 (Fig. 1A, painéis esquerdo e direito, respectivamente). O perfil de CFSE de células T ligadas a CD3 + em PhysO2 indica menos rodadas de divisão celular do que no ar durante o mesmo tempo. A frequência de células que se dividiram uma vez ou não (1 e 0) é maior no PhysO2, e a frequência de células que se dividiram mais de uma vez (2, 3 e 4 vezes) é menor (Fig. 1A, painel esquerdo vs. direito). Os dados somados para a proliferação de células T CD3 + após 2, 5 e 7 dias obtidos usando PBMC de cinco indivíduos diferentes estimulados com grânulos revestidos com anticorpo CD3 / CD28 são mostrados na Figura 1B. Na PhysO2, uma frequência significativamente menor de células se dividiu pelo menos uma vez após 2 e 5 dias (P& lt0,05), embora a diferença em termos absolutos não fosse muito acentuada. No entanto, no Dia 7, a frequência de células que não se dividem não era mais diferente em 20% ou 2% de O2. Devido a diferenças putativas na capacidade tampão dos meios de cultura, placas de cultura de tamanhos diferentes foram usadas, mas nenhuma influência dessas variáveis ​​foi observada (dados não mostrados).

Expansão de células T sob PhysO2 versus AtmO2. PBMC (1 × 10 6 células / ml) foram estimulados com esferas revestidas com αCD3αCD28 por 5 dias para testar suas capacidades proliferativas sob diferentes pO2. Observe que as amostras neste estudo incluíram o corante RedVid para excluir células mortas e evitar sinais falso-positivos. (A) células CD3 + foram analisadas para intensidades de fluorescência CFSE, e os números de divisões celulares são indicados em AtmO2 (painel esquerdo) e PhysO2 (painel direito). (B) Análise estatística da frequência de proliferação de células estimuladas ou não estimuladas por αCD3αCD28 após estimulação de 2, 5 e 7 dias. Barras sólidas representam AtmO2, e as barras abertas representam o PhysO2. Houve uma diferença significativa após a estimulação de 2 e 5 dias (∗, P& lt0,05 n= 8). (C) O CtxB conjugado com Alexa 488 foi usado para quantificar a expressão de GM1 nas amostras estudadas em B. Os níveis de expressão são dados como intensidades médias de fluorescência (MFI). Houve uma diferença significativa entre AtmO2 e PhysO2 somente após 7 dias de estimulação (∗, P& lt0.01 n= 3) com uma tendência anterior não significativa.

Em seguida, procuramos investigar por que as células se dividem mais rapidamente em AtmO2 em comparação com PhysO2. Após a estimulação, as células T realizam intensa síntese de novo de GM1, um componente das jangadas de membrana usadas como um marcador para o status de ativação celular [18]. Usamos o CTxB para avaliar o nível de expressão de GM1. A intensidade associada a CTxB foi medida por citometria de fluxo e não revelou nenhuma diferença em células não estimuladas em PhysO2 ou AtmO2 a qualquer momento (Fig. 1C). A estimulação αCD3αCD28 induziu um aumento nos níveis de GM1, que se tornou significativamente diferente entre AtmO2 e PhysO2 somente após 7 dias. No entanto, houve uma diferença na regulação positiva de GM1 dependente do tempo, que atingiu o pico após 2 ou 5 dias em AtmO2 e diminuiu posteriormente, e seu pico foi alcançado após 7 dias em PhysO2, consistente com a proliferação retardada observada em resposta à estimulação αCD3αCD28 (Fig. 1C). Embora as células não estimuladas não tenham mostrado qualquer mudança significativa durante 7 dias de cultura em 2% ou 20% de oxigênio, houve diferenças significativas na síntese de novo de GM1 dentro de subconjuntos de memória e CD4 + CD8 + estimulados naïve (Fig. 1 Suplementar). Isso sugeriu que diferentes subconjuntos de células T reagiram de maneira diferente em PhysO2 em comparação com AtmO2.

Efeito do PhysO2 na distribuição do subconjunto CD4 + e CD8 + após a ativação

As diferenças entre subconjuntos observadas nos perfis de ativação de células T podem sugerir algumas diferenças na expansão e diferenciação do subconjunto de células T em AtmO2 ou PhysO2. Para testar isto, PBMC não estimulados e estimulados por αCD3αCD28 foram analisados ​​quanto à distribuição do subconjunto de células T durante o curso da estimulação. Para a população CD4 +, nenhuma diferença na distribuição de subconjunto de células não estimuladas em AtmO2 versus PhysO2 ao longo de 2, 4 e 7 dias foram observados (Fig. 2A) O mesmo se aplica às células T CD8 + (Fig. 2 suplementar). No entanto, na estimulação, várias diferenças significativas surgiram. Aqueles com uma diferença significativa (P& lt0.01) entre os resultados somados para os cinco diferentes doadores são descritos aqui. A análise a cada 24 horas após a estimulação mostrou que a razão naïve: células de memória na população CD4 + se alterou gradualmente (Fig. 2B). Em AtmO2, As células CM se expandiram até o dia 4 e contraíram depois disso, isso está relacionado inversamente à contração e expansão das células EM (Fig. 2B, painel superior). A fração de células naive CD4 + diminuiu continuamente nas culturas. Esses resultados são consistentes com o modelo, em que as células ingênuas se diferenciam sequencialmente em células CM e, em seguida, em células EM, e TEMRA não se expandem, provavelmente como resultado da falta de expressão de CD28 neste subconjunto e, portanto, coestimulação ausente. No entanto, na PhysO2, A expansão do CM não é tão acentuada, o que parece ser resultado de uma contração celular ingênua alterada. Esses dois fenômenos podem explicar a expansão retardada de EM em PhysO2. Não apenas as células CD4, mas também as células T CD8 + exibiram tais diferenças na distribuição de subconjuntos (Fig. 3 suplementar).

Efeito de pO reduzido2 na distribuição do subconjunto de células T. As células em repouso e estimuladas foram coradas para análise de citometria de fluxo. As células T foram divididas em naïve (N CD45RA + CCR7 +), CM (CD45RA – CCR7 +), EM (CD45RA – CCR7–) e TEMRA (CD45RA + CCR7–). (A) A distribuição de células T em repouso CD4 + não foi influenciada por PhysO2. (B) A proporção do subconjunto de células T CD4 + na cultura a cada 24 h é mostrada em PhysO2 (gráficos inferiores) em comparação com AtmO2 (gráficos superiores). Os dados apresentados representam os valores médios de experiências realizadas usando PBMC de cinco indivíduos diferentes.

Aumento da suscetibilidade à apoptose em PhysO2

Testamos a hipótese de que as diferenças descritas acima foram causadas pela susceptibilidade alterada dos diferentes subconjuntos à apoptose. Usando o ensaio baseado em citometria de fluxo de anexina-V, descobrimos que as células ativadas sob PhysO2 eram mais suscetíveis à apoptose (Fig. 3A) A diferença no perfil apoptótico das células T foi explicada por uma maior frequência de células apoptóticas precoces no PhysO2 (painel inferior) em comparação com AtmO2 (painel superior). A análise estatística da frequência geral de apoptose para células em repouso e ativadas realizada em oito experimentos independentes é mostrada na Figura 3B. Uma análise cinética foi realizada para células T CD4 + (Fig. 3C), mostrando que níveis mais elevados de apoptose em PhysO2 são reduzidos com o tempo. Como o perfil de ativação dependente do tempo é diferente nos subconjuntos ingênuos e de memória (Fig. 1 Suplementar), testamos a possibilidade de que também exista uma suscetibilidade diferencial à apoptose. Não houve diferença na suscetibilidade de subconjuntos de células T em repouso à apoptose (Suplementar Fig. 3), sugerindo novamente nenhum efeito de baixo oxigênio na apoptose espontânea. No entanto, conforme mostrado em Figura 4, a frequência de células apoptóticas CD4 durante o curso de estimulação dentro de cada subconjunto revela um resultado diferente: neste caso, houve uma frequência significativamente maior de células apoptóticas com um fenótipo virgem e CM em células T CD4 + em PhysO2 (barras abertas) nos primeiros dias. Embora a proporção de células apoptóticas virgens tenha diminuído com o tempo, o inverso foi verdadeiro para as células TEMRA. As células T CD8 + se comportam de maneira diferente, pois apenas as células naïve e as CM exibiram níveis apoptóticos aumentados em PhysO2, e mais células diferenciadas não foram afetadas significativamente (Fig. 4 Suplementar).

Suscetibilidade de células T à apoptose sob PhysO2. Usando as mesmas condições experimentais da Figura 2, a apoptose espontânea foi inferior a 10% para todas as amostras testadas. (A) Um exemplo para o perfil apoptótico de células tratadas com αCD3αCD28 mostrando uma taxa significativamente aumentada de apoptose, que também foi maior sob PhysO2 (menor) do que AtmO2 (superior). (B) Análise estatística da frequência de células apoptóticas após 5 dias (∗, P& lt0.01 n= 8). (C) A frequência dependente do tempo de células T CD4 + apoptóticas na cultura é mostrada. Houve uma frequência significativamente maior de células T CD4 + apoptóticas a partir do Dia 2 em PhysO2 em comparação com AtmO2, barras brancas e pretas, respectivamente. A significância é representada por ∗, P & lt 0,05 n = 8.

Suscetibilidade à apoptose para o período de estimulação em subconjuntos de células T virgens / de memória. A distribuição de subconjunto de células apoptóticas no final do tempo de estimulação é mostrada para células T CD4 + (N4, CM4, EM4 e TEMRA4). Não houve diferença significativa na distribuição do subconjunto de células apoptóticas espontâneas em células T CD4 + em AtmO2 versus PhysO2 (n= 5). Houve níveis significativamente aumentados de células apoptóticas CM e células T CD4 + ingênuas sob PhysO2 em comparação com AtmO2. A significância é representada por ∗, P & lt 0,05 n = 5.

Mudanças no metabolismo celular explicam em parte a capacidade proliferativa reduzida em PhysO2

Buscamos um mecanismo para o aumento concomitante de apoptose e resposta proliferativa retardada de células T sob PhysO2. Para tanto, analisamos o metabolismo celular nessas condições. O gasto de energia para atingir a divisão celular é muito alto, para o qual as células podem produzir ATP potencialmente usando duas vias independentes diferentes. Mais comumente, as células usam a via de fosforilação oxidativa dependente da mitocôndria, mas sob certas condições, elas podem mudar para a glicólise para produzir ATP. A fosforilação oxidativa não pôde ser medida, mas testamos o turnover da glicose em nossas culturas e encontramos um consumo significativamente aumentado sob PhysO2 após 5 dias, mesmo em condições de repouso (Fig. 5A) As diferenças no nível de glicose medido não podem ser provenientes de células necróticas, pois estas estavam presentes em números igualmente baixos em todas as condições (Fig. 3A). Para testar uma dependência supostamente maior da glicólise, comparamos as respostas proliferativas de células T cultivadas em níveis crescentes de glicose em AtmO2 versus PhysO2. Proliferação de células T em AtmO2 permaneceu alto em todas as concentrações de glicose testadas, incluindo a mais baixa, mas as mesmas culturas em PhysO2 mostrou uma frequência significativamente reduzida de células em proliferação em baixos níveis de glicose (Fig. 5B). Um dos primeiros eventos em resposta ao baixo oxigênio é a regulação positiva do HIF-1α, que regula a expressão de um transportador de glicose como o GLUT-1. Dados recentes também sugerem seu papel inibidor na ativação de células T. Na Figura 5C, apresentamos a superexpressão esperada de HIF-1α sob PhysO2, mas destacamos sua rápida degradação quando as células são transferidas para o ar. Isso sugere que os eventos de sinalização iniciais requerem uma análise cuidadosa. Assim, os lisados ​​celulares dos seguintes experimentos de Western-blotting foram preparados exclusivamente sob PhysO2 condições para reduzir quaisquer mudanças no status da proteína como resultado da alteração de O2 tensão. As enzimas glicolíticas, entre elas a GLUT-1, são controladas pelo HIF-1α e desempenham um papel importante no metabolismo, proliferação e função celular [19]. A expressão de GLUT-1 é aumentada com baixo teor de oxigênio e aumentada ainda mais após a estimulação (Fig. 5D). A expressão de GLUT-1 correlaciona-se com a de HIF-1α.

Consumo de glicose e capacidades proliferativas em PhysO2 versus AtmO2. (A) O nível de glicose no meio (X-Vivo 15) de PBMC em repouso e ativado por αCD3αCD28 foi avaliado após 5 dias. As culturas ativadas mostraram um aumento significativo no consumo de glicose em comparação com as culturas não tratadas e também sob PhysO2 em comparação com AtmO2. As diferenças significativas são representadas por um, comparando células não tratadas em PhysO2 e AtmO2 com P & lt 0,05 b, comparando células estimuladas e não tratadas em AtmO2 com P & lt 0,05 c, comparando células estimuladas e não tratadas em PhysO2 com P & lt 0,05 e d, comparando células estimuladas em PhysO2 e AtmO2 com P & lt 0,001 (n= 5). (B) Capacidades proliferativas dependentes de glicose sob PhysO2 e AtmO2 mostrando uma redução significativa nas amostras cultivadas sob PhysO2 (∗, P& lt0.01 n= 5). (C) PBMC foram cultivados por 48 h sob PhysO2 e AtmO2e, em seguida, parte da cultura foi trocada para a outra concentração de oxigênio por 5 e 30 min. As células foram lisadas e analisadas por Western blotting para o sensor de oxigênio HIF-1α. (D) Usando a mesma abordagem experimental que em C, testamos a expressão de HIF-1α e GLUT-1. Akt foi usado como controle de carregamento. Um experimento representativo é mostrado.

Sinalização de Akt, biodisponibilidade de glicose e resposta proliferativa

A serina / treonina quinase Akt é uma molécula sinalizadora comum envolvida na glicólise de células normais e cancerosas [20]. Em células T, Akt é fosforilado após a ligação de CD28, mas por causa de seu envolvimento na glicólise, testamos a hipótese de que sua expressão ou estado de fosforilação refletia a resposta das células T ao baixo oxigênio. Validamos nossa hipótese mostrando aumento da fosforilação de pAkt serina 473 de células em repouso sob PhysO2 mas nenhuma diferença na expressão total de Akt em PBMC de diferentes indivíduos (Fig. 6A) Devido à sua importância na regulação do ciclo celular via glicólise, testamos a hipótese de que a alteração dos níveis de glicose influenciaria a proliferação de células T sob PhysO2. Em primeiro lugar, a manipulação dos níveis de glicose (Fig. 6B) revelou que a proliferação de células T induzida por CD3 / CD28 é muito dependente da glicose. A frequência das células em cada rodada de divisão celular em culturas estimuladas suplementadas com 0,5-2,5 g / L de glicose no PhysO2 é mostrado na Figura 6B. A restrição de glicose mostrou que o número de células que atingem várias divisões celulares é menor quando a glicose é tão baixa quanto 0,5 g / L sob PhysO2. A adição de glicose restaurou a capacidade de proliferação de células T. Em contraste, a entrada de glicose limitada não tem um efeito tão marcante na proliferação de células T sob AtmO2, confirmando que uma mudança no metabolismo celular provavelmente desempenha um papel na função e no comportamento das células T sob pO reduzido2 (Fig. 6B).

Ativação de Akt e restauração da capacidade proliferativa. (A) Experimentos de Western-blotting mostrando o estado de fosforilação de Akt para PBMC em repouso cultivados sob PhysO2 e AtmO2. Blots para três doadores diferentes (M, D e E) testados são mostrados. (B) Determinamos com precisão o número de divisões celulares que as células T podem atingir com o aumento dos níveis de glicose [escala de cinza do branco (não dividido) ao preto (dividido sete vezes)] no PhysO2. A mesma análise foi realizada para amostras cultivadas em AtmO2.


A síndrome de Di George resulta de uma deleção heterozigótica no cromossomo 22. Os indivíduos afetados apresentam anormalidades cardíacas, disfunção da paratireoide e hipoplasia tímica.

O desenvolvimento defeituoso do timo leva à redução do número de células T e à imunodeficiência.

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As células T (também chamadas de linfócitos T) são os principais componentes da sistema imunológico adaptativo. Suas funções incluem matar diretamente as células hospedeiras infectadas, ativar outras células do sistema imunológico, produzir citocinas e regular a resposta imunológica.

Este artigo discute a produção de células T, os diferentes tipos de células T e as condições clínicas relevantes.


Mecanismos por trás da maturação de avidez funcional em células T

Durante uma resposta imune, as células B iniciadas com antígeno aumentam sua capacidade de resposta ao antígeno por maturação de afinidade mediada por hipermutação somática dos genes que codificam o receptor de célula B específico para o antígeno (BCR) e por seleção de clones de células B de afinidade mais alta. Ao contrário do BCR, o receptor de células T (TCR) não pode sofrer maturação de afinidade. No entanto, as células T iniciadas com antígeno aumentam significativamente sua capacidade de resposta ao antígeno em comparação com as células T inexperientes com o antígeno (naïve) em um processo denominado maturação de avidez funcional. Este artigo cobre estudos que descrevem diferenças na capacidade de resposta do antígeno de células T durante a diferenciação de células T, juntamente com exemplos dos mecanismos por trás da maturação de avidez funcional em células T.

1. Introdução

Os linfócitos T são células muito potentes que desempenham papéis importantes em nosso sistema imunológico. Sem as células T, morreríamos rapidamente devido à infecção. As células T patrulham nosso organismo para nos proteger contra microorganismos patogênicos como parte da imunidade adaptativa. Em órgãos linfoides secundários, como os nódulos linfáticos e o baço, pequenos fragmentos de peptídeos (antígenos) dos patógenos são apresentados às células T inexperientes com antígenos (virgens) por células apresentadoras de antígenos profissionais (APC). Este encontro induz a proliferação e diferenciação da célula T naive em uma população de células T armadas que migra para o local da infecção. Aqui, o reencontro com o mesmo patógeno ativa rapidamente a função efetora das células T armadas, resultando na eliminação do patógeno. Após a eliminação do antígeno, a maioria das células T efetoras morre, deixando apenas uma pequena população de células T de memória. No caso de reinfecção com o mesmo patógeno, as células T de memória irão montar uma resposta imediata, produzindo imediatamente citocinas efetoras e proliferando rapidamente em um grande número de efetores secundários [1-4]. Este aumento substancial na capacidade de resposta ao antígeno das células T efetoras e de memória após o reencontro com o patógeno é uma propriedade fundamental da imunidade adaptativa.

2. O Conceito de Maturação de Avidez Funcional

Os linfócitos reconhecem antígenos por meio de receptores de antígenos especializados. Estes incluem o receptor de células B (BCR) nas células B e os receptores de células T (TCR) nas células T. Durante a causa de uma resposta imune, um grande número de mutações pontuais ocorre nos genes BCR das células B em divisão. Isso resulta em um painel de células B que expressam BCR com afinidades variadas contra o antígeno, e as células B que transportam BCR com a maior afinidade são seletivamente expandidas. Como consequência, células B de alta eficiência são selecionadas durante a resposta imune em um processo conhecido como maturação de afinidade [5]. Ao contrário das células B, as células T não têm a capacidade de transformar seus genes TCR após a ativação das células T e, portanto, a maturação de afinidade clássica não ocorre nas células T. Ainda assim, a sensibilidade das células T aos antígenos pode ser amplamente aumentada em células T experimentadas com antígenos (iniciadas) em comparação com células T virgens em um processo denominado “maturação de avidez funcional” [6–13].

3. Sinais de ativação de células T: a base da maturação de avidez funcional

3.1. Estudos iniciais que indicaram a existência de maturação de avidez funcional

A observação de que existem diferenças fundamentais na sensibilidade ao antígeno entre células T virgens e iniciadas foi descrita pela primeira vez no final dos anos 80 por Cooper e colaboradores. Eles descobriram que apenas células T iniciadas produziram IL-2 e proliferaram em vitro em resposta ao desencadeamento de TCR induzido por anticorpos anti-CD3 e monócitos [14]. Observações semelhantes foram relatadas posteriormente por outros [7, 9–13, 15]. Cooper e colaboradores também introduziram a ideia de que sinais além dos sinais de TCR, aqui exemplificados pelos sinais do receptor de IL-2, eram necessários para a ativação de células T virgens [14]. Ao longo desta linha, o grupo de Mark Davis demonstrou que, além dos sinais de TCR, as células T naïve requerem sinais coestimuladores através de CD28 para se tornarem totalmente ativadas [16]. Esse achado foi apoiado em um estudo subsequente, onde Croft et al. mostraram que a ativação de células T efetoras e de memória eram consideravelmente menos dependentes de sinais coestimuladores do que células T virgens [9]. Diversos na Vivo e ex vivo estudos confirmaram as observações iniciais de que as células T efetoras e de memória têm um limite inferior de ativação e respondem de forma mais robusta do que as células T virgens [12, 13, 17]. Como exemplo, Slifka e Whitton demonstraram um aumento de 50 vezes na capacidade de resposta das células T ao antígeno durante uma infecção por LCMV. Além disso, eles descobriram que o coengagement do co-receptor CD8 com o TCR era necessário para a ativação de células T virgens, enquanto a ativação de células T efetoras era relativamente independente de CD8 [17]. Em um estudo equivalente também examinando as respostas das células T à infecção, Pihlgren et al. demonstraram um aumento semelhante de 50 vezes na responsividade ao antígeno de ambas as populações de células efetoras e de memória, em comparação com as células virgens [12]. Curiosamente, um estudo de Mescher e colaboradores sugeriu que as células T de memória eram intrinsecamente mais sensíveis à estimulação de TCR do que suas contrapartes ingênuas [13], adicionando a sinalização de TCR à lista crescente de diferenças entre células T ingênuas e iniciadas. Uma visão geral dos estudos que indicam a existência de maturação da avidez funcional é apresentada na Tabela 1.

Hoje, é amplamente aceito que a ativação de células T não deve ser considerada como um processo de sinal único, mas como uma soma de sinais interdependentes. O modelo atual para a ativação de células T, referido como o modelo de 3 sinais, prevê que, além do desencadeamento de TCR induzido por antígeno, a ativação ideal de células T virgens requer pelo menos dois sinais adicionais. Esses sinais são entregues por meio de receptores coestimuladores predominantemente CD28 [18, 19] e receptores para citocinas como IL-2, IL-12, IFN-αe IL-1 [20-25].

3.2. Iniciação de sinal de TCR em células T ingênuas versus iniciadas: a sinapse imunológica e CD28

A sinalização de TCR ocorre na interface entre a célula T e a célula apresentadora de antígeno. Nessa zona de contato, frequentemente chamada de sinapse imunológica (SI), os componentes de sinalização do TCR, incluindo o próprio TCR, bem como as moléculas de sinalização intracelular, são continuamente acumulados durante o contato do antígeno [26]. Embora um tanto controverso [26, 27], a formação de um IS se correlaciona com a geração de uma resposta imune robusta e é considerada um pré-requisito para a ativação de células T [28, 29]. Mesmo assim, uma nova visão sobre a biologia das sinapses imunológicas revelou que a sinalização de TCR já foi iniciada em microclusters de TCR antes da formação de IS. De uma maneira dependente do ligante, o CD28 localiza-se em microclusters de TCR pré-formados, contando 11-17 TCRs [30] junto com moléculas de sinalização chave [31]. A formação do IS maduro inclui o acúmulo de centenas de tais microclusters de TCR [31]. No IS, a sinalização de CD28 induz tanto a estabilização estrutural quanto o aumento da própria área [32, 33]. A formação do IS é um mecanismo compartilhado por células T virgens e iniciadas, no entanto, um IS maduro é formado mais rapidamente em células T iniciadas e apenas células T virgens requerem sinais co-estimuladores de CD28 para formar o IS [34, 35]. Essas observações são consistentes com relatórios que indicam que as células T iniciadas são menos dependentes da co-estimulação de CD28 do que as células T virgens [9, 36-38]. Embora a implicação exata da sinalização de CD28 na ativação de células T ainda seja indescritível, é geralmente aceito que CD28 amplifica a sinalização intracelular induzida pelo desencadeamento de antígeno do TCR por meio da modulação de características morfológicas e sinais de TCR [32, 33]. Além de CD28, a sinalização de outras diferenças entre células T virgens e iniciadas existe no IS. Um estudo de Watson e Lee ilustrou que a fosfatase CD45 é um componente mais integral do IS nas células T iniciadas em comparação com as células virgens [35].O CD45 é uma tirosina fosfatase transmembrana que mantém a atividade de Lck ao promover a desfosforilação de um resíduo de tirosina do terminal carboxi inibitório de Lck. A atividade Lck é uma necessidade para o início da transdução do sinal TCR [39]. Curiosamente, Watson e Lee também mostraram que o CD45 já está associado a microdomínios de TCR na membrana plasmática antes da formação de sinapses em células T de memória em repouso, em contraste com suas contrapartes ingênuas [35]. Esse achado é paralelo ao estudo de Kersh et al. que mostrou que um nível basal mais alto de fosforilação (ativação) foi visto em moléculas de sinalização associadas à membrana em células T iniciadas em repouso [40]. Portanto, parece que as células T iniciadas estão em um maior "estado de alerta" antes do encontro com o antígeno, correlacionando-se com a maior sensibilidade das células T iniciadas à estimulação do antígeno.

3.3. Sinalização TCR em células T Naïve versus Primed

Além das diferenças na organização das moléculas de sinalização, os eventos reais de sinalização de TCR induzidos em células T virgens e iniciadas após o desencadeamento de TCR são diferentes. O modelo atual para a sinalização de TCR postula que após o TCR, o desencadeamento da tirosina quinase Lck é ativado, resultando na fosforilação das cadeias CD3 e zeta do TCR, além da ativação de Zap70 [41, 42]. O Zap70 ativado fosforila LAT que, posteriormente, recruta e ativa várias proteínas, incluindo PLC-γ1. Ativação do PLC-γ1 resulta na hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em inositol 3,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). IP3 regula a mobilização de cálcio intracelular e DAG regula a ativação de PKC e contribui para Ras e ativação da cascata de proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK) [41, 42]. A grande maioria dos estudos que contribuem para o modelo atual de sinalização de TCR foram realizados usando linhas de células T imortais ou células T iniciadas propagadas em vitro. No entanto, como diferenças significativas na expressão de genes e proteínas existem entre células T virgens e iniciadas [43], diferenças significativas na sinalização de TCR em células T iniciadas e virgens podem ser imaginadas. Ao estudar células T humanas virgens isoladas de amostras de sangue recém-colhidas, mostramos recentemente que o modelo clássico para a sinalização de TCR deve ser revisado, já que células T virgens apenas expressam PLC-γ1 em níveis muito baixos em comparação com células T iniciadas (efetoras). Seguindo em vitro priming, PLC-γ1 foi regulado positivamente aproximadamente 75 vezes, um aumento que se correlacionou com uma maior responsividade do TCR [44]. Uma das diferenças de sinalização marcantes que nós e outros observamos entre células T virgens e iniciadas é uma capacidade fortemente diminuída das células T virgens de fluxo de cálcio em resposta ao desencadeamento de TCR [10, 44, 45]. A expressão muito baixa de PLC-γ1 em células T virgens pode explicar o fluxo de cálcio prejudicado nessas células [44]. Com base em estudos anteriores que demonstram que a vitamina D pode regular PLC-γ1 em outros tipos de células [46, 47], investigamos se a vitamina D através do receptor de vitamina D (VDR) foi responsável pelo PLC-γ1 regulação positiva durante o priming de células T. Na verdade, descobrimos que o VDR foi rapidamente regulado para cima após o acionamento do TCR e que a indução do VDR foi necessária para o PLC-γ1 regulação para cima. Como PLC-γ1 é uma molécula central na via de sinalização de TCR clássica e é fracamente expressa em células T humanas virgens, nos perguntamos quais eventos de sinalização poderiam ser responsáveis ​​pela regulação positiva de VDR induzida por ativação. Descobrimos que a via de sinalização de TCR não clássica em que Zap70 ativa diretamente a expressão de VDR induzida por p38. Descobrimos ainda que, enquanto a ativação de Zap70 e p38 foi pelo menos tão eficiente em células T virgens quanto em células T iniciadas após o desencadeamento de TCR, a ativação de Erk foi significativamente reduzida em células T virgens. Assim, nosso estudo demonstrou que existem diferenças fundamentais nas vias de sinalização entre células T virgens e iniciadas.

Adachi e Davis também compararam a sinalização de TCR em células T humanas virgens e iniciadas (memória). Em contraste com nós, eles encontraram uma ativação Erk mais forte, juntamente com uma ativação mais baixa de Zap70 e p38 em células T virgens em comparação com as células iniciadas. Eles propuseram que a forte ativação de Erk observada em células T naïve interrompeu eventos de sinalização de TCR iniciais como parte de um mecanismo de feedback negativo [48]. A discrepância entre os dois estudos em humanos pode ser devido a duas populações diferentes de células T iniciadas estudadas (células efetoras e de memória, respectivamente), no entanto, também pode ser explicado pelos diferentes modos de ativação de TCR usados. Em nosso estudo, células T humanas naïve purificadas foram estimuladas usando grânulos revestidos com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. Adachi e Davis usaram altas concentrações de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 solúveis reticulados por anticorpos secundários para estimular as células T. Usando anticorpos reticulados para estimulação, uma sinalização de receptor muito forte é alcançada. Conforme ilustrado em uma série de estudos de vírus em camundongos, a força da sinalização de TCR determina a necessidade de sinais de ativação adicionais como a sinalização de CD28 e também resulta em respostas um tanto diferentes [19]. Em consonância com isso, Adachi e Davis descobriram que as células T CD4 ingênuas podiam fluir o cálcio quando seu protocolo de estimulação era usado, o que implica uma sinalização muito forte e a necessidade de um mecanismo de feedback negativo rápido. Ambos os cenários podem ser relevantes para a imunidade humana, onde uma ampla gama de patógenos com diferentes origens é encontrada.

Alguns estudos que investigam eventos de sinalização de TCR em células T virgens versus células T iniciadas também foram conduzidos em camundongos [40]. Infelizmente, camundongo e homem parecem diferir quando se trata de algumas das moléculas de sinalização envolvidas na sinalização de TCR. Em contraste com as células T humanas, as células T de camundongos naïve e iniciadas parecem expressar níveis semelhantes de VDR e PLC-γ1 [45, 49]. Mesmo assim, estudos em células T de camundongos descobriram que é apenas em células T iniciadas que o desencadeamento de TCR induz a fosforilação de PLC-γ1 e fluxo de cálcio subsequente [45] conforme encontrado para células T humanas. É, portanto, provável que, apesar de uma “rota de ação” diferente, o resultado seja o mesmo no que diz respeito à capacidade de fluxo de cálcio nas células T do homem e dos camundongos.

Coletivamente, esses estudos ilustram diferenças fundamentais nas vias de sinalização de TCR entre células T virgens e iniciadas, diferenças baseadas em particular na falta de moléculas de sinalização de células T virgens usadas pelas células T iniciadas. Uma visão geral detalhada das diferenças publicadas na maquinaria de sinalização em células T ingênuas versus efetoras e de memória é fornecida na Tabela 2.

3.4. Citocinas como o "terceiro" sinal de ativação em células T naïve versus células T iniciadas

Nos últimos anos, foi reconhecida a importância da sinalização do receptor de citocinas como um “terceiro sinal” na ativação de células T virgens. O requisito de um “sinal 3” mediado por citocinas inflamatórias é considerado um meio para as células T determinarem se o “perigo” está presente [50]. Embora as células T CD4 e CD8 naïve sejam dependentes desses "sinais de perigo" para a ativação completa, elas diferem em sua necessidade de citocinas específicas. Os primeiros estudos que descrevem a necessidade de uma citocina de terceiro sinal vieram de uma série de em vitro e na Vivo experimentos realizados por Mesher e colegas de trabalho. Eles descobriram que IL-12 e IFN-α forneceu um sinal que, juntamente com o antígeno e a sinalização de CD28, foi crucial para a expansão e diferenciação de células T CD8 naïve [51-53], descobertas que foram validadas por outros grupos [23, 54-57]. Embora a IL-12 tenha um papel na distorção da resposta das células T CD4, ela não tem efeito na proliferação e diferenciação das células T CD4 em resposta ao antígeno. Em contraste, IL-1 aumenta na Vivo expansão e diferenciação de células T CD4 naïve [58], tanto por ação direta nas células T CD4 [24] quanto por meio de modificações de APC [25]. Nenhum estudo descreveu a necessidade de "o terceiro sinal" na ativação de células T iniciadas, mas um papel para IFN-α na proliferação homeostática e na manutenção de células T CD8 de memória foi demonstrada [59]. Assim, embora as células T iniciadas, em certa medida, dependam de ambos os IFN-α [59] e CD28 [19] por sua sobrevivência contínua e reconhecimento de antígeno, as células T iniciadas claramente não têm o mesmo pré-requisito para a sinalização de citocinas e CD28 que as células T virgens a serem ativadas. A presente literatura, portanto, afirma claramente que a demanda pelos “3 sinais” na ativação de células T difere muito entre células T virgens e iniciadas.

4. Mecanismos moleculares de maturação de avidez funcional

Conforme discutido neste artigo e resumido na Figura 1, existem diferenças fundamentais na ativação de células T virgens e iniciadas. Isso inclui a necessidade de três sinais induzidos por antígenos, bem como diferenças intrínsecas na maquinaria de sinalização. O CD28 e a sinalização do receptor de citocinas são componentes centrais da ativação de células T virgens, pois ajudam a induzir e estabilizar as estruturas de membrana e as moléculas de sinalização intracelular cruciais para a ativação de células T. Desta forma, a maquinaria de sinalização já está otimizada para a transdução de sinal em células T iniciadas antes do reencontro com o antígeno. Como resultado, as células T iniciadas respondem muito mais rápido e mais forte quando um antígeno é eventualmente ativado. Portanto, parece que as células T retêm uma impressão permanente de uma resposta anterior ao antígeno. Mas como essa impressão é formada? O acúmulo de evidências sugere que as alterações epigenéticas provavelmente são um fator contribuinte. Por exemplo, Northrop et al. demonstraram que a desmetilação estável da região reguladora do gene IL-2 ocorre durante a iniciação de células T virgens, resultando em um ganho de expressão de IL-2 nas células T iniciadas [60], uma descoberta validada por Murayama e colaboradores [ 61]. Além disso, Thomas et al. publicaram a observação de que a coestimulação de CD28 durante o priming de células T induz uma acetilação e desmetilação estável de histonas no promotor de IL-2, sugerindo que CD28 em parte funciona por meio de mecanismos epigenéticos [62]. Uma observação pessoal nossa mostra que a sinalização de CD28 aumenta muito a suprarregulação induzida por TCR de VDR em células T virgens. Paralelamente a isso, Kim et al. publicou recentemente que a transcrição do gene CYP27B1 é controlada pela metilação de seu promotor [63]. O produto do gene CYP27B1 controla a síntese de vitamina D ativa, que é um pré-requisito para a atividade de VDR e, portanto, para a regulação positiva de PLC-γ1 em células T virgens. Além disso, tem sido especulado que as citocinas IL-12 e IFN- "terceiro sinal"α conduzir os eventos de remodelação da cromatina durante a preparação inicial de células T virgens [50]. Portanto, parece provável que as respostas mais rápidas e robustas das células T iniciadas em comparação com as células naïve são em parte um resultado de mudanças epigenéticas em genes cruciais e, além disso, essas mudanças podem ser impulsionadas pela co-estimulação de CD28 e citocinas de "terceiro sinal" durante a fase de preparação inicial. Apesar do progresso feito nos últimos anos, ainda não temos uma compreensão clara de alguns dos principais aspectos da maturação da avidez funcional. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na melhoria das respostas das células T específicas do antígeno seria de grande valor terapêutico, por exemplo, para avançar a eficiência da vacina.


Modelo simplificado que ilustra as diferenças na sinalização de células T entre células T virgens e iniciadas. Em células T humanas ingênuas, o envolvimento de TCR leva à ativação de p38 por meio de Zap70, resultando em regulação positiva de VDR e, em seguida, PLC-γ1 obrigatório para que as células T virgens sejam ativadas. Para ativação, as células T virgens também requerem sinais de receptor de CD28 e citocina para induzir e estabilizar estruturas de membrana e moléculas de sinalização intracelular. Em contraste, as células T iniciadas já expressam PLC-γ1, têm um nível basal de DAG e fosfoproteína (P) mais alto em estruturas de membrana especializadas com uma alta associação da molécula de CD45. Além disso, a sinalização em células T iniciadas é bastante independente dos sinais coestimuladores de CD28, bem como das citocinas inflamatórias de "terceiro sinal", em geral levando a uma resposta antigênica muito mais rápida.

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Direito autoral

Copyright & # xa9 2012 Marina Rode von Essen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


Resultados e discussão

DCs apresentam antígenos exógenos no contexto de moléculas MHC classe II para a ativação de células T CD4 +. As DCs também são capazes de apresentar antígenos exógenos de forma cruzada no contexto de moléculas MHC-I para ativar células T CD8 +. Foi determinado se a apresentação do antígeno MHC-II e MHC-I foi afetada durante a infecção com P. yoelii. Para este propósito, foram usados ​​anticorpos específicos, que reconhecem epítopos peptídicos definidos ligados a moléculas de MHC particulares. Estes anticorpos não reconhecem o antígeno ou as moléculas de MHC por si só e podem ser usados ​​para determinar a presença de complexos de MHC-epítopo ligados na superfície de células apresentadoras de antígeno. Para determinar a apresentação do antígeno MHC-I e MHC-II, anticorpos anti-epítopo OVA 257-264 / H-2 b (25-D1.16) e anti-epítopo LACK 156-173 / I-A d (2C44) foram usados, respectivamente. DCs derivadas de medula óssea foram incubadas sozinhas, com não infectadas ou P. yoelii-eritrócitos infectados por 24 h antes da adição de proteínas OVA ou LACK purificadas por 5 h, seguido por estimulação com LPS para induzir a apresentação de antígeno. Foi observado que a incubação com P. yoeliieritrócitos infectados inibe a apresentação de antígenos exógenos em MHC-I (Figuras 1A e 1B), mas não em moléculas de MHC-II (Figuras 1C e 1D).

Plasmodium yoelii -eritrócitos infectados inibem MHC-I, mas não a apresentação do antígeno MHC-II. (A-D) DCs diferenciados em vitro foram incubados sozinhos (DC), com não infectados (DC + RBC), P. yoeliieritrócitos infectados (DC + iRBC) por 24 h antes da adição ou não de OVA purificado (5 mg / ml A, B) ou proteínas LACK (50 μg / ml C, D) por 5 h, seguido por estimulação com LPS para aumentar apresentação de antígenos. As células foram coradas com anticorpos que reconhecem (A, B) epítopo OVA 257-264 ligado a H-2 b (anticorpo 25-D1) ou (C, D) epítopo LACK 156-173 ligado a I-A d (anticorpo 2C44). (A, C) Exemplos representativos de histogramas de FACs de DCs incubados com proteínas de proteína OVA (A) ou LACK (C) (linhas grossas) ou DCs de controle (linhas finas). (B, D) Os resultados são expressos como a diferença na intensidade fluorescente média (MFI) das DCs incubadas com proteína menos as DCs de controle em determinações triplicadas. *, diferença significativa (P & lt 0,01) na intensidade em comparação com DCs incubadas sozinhas.

A ativação de hibridomas de células T que reconhecem peptídeos OVA específicos no contexto de moléculas MHC-I e II foi usada como um método alternativo para determinar a apresentação de antígenos. Os hibridomas de células T B3Z [9] e DO.11.10 [10] reconhecem peptídeos OVA específicos no MHC de classe I (H-2 b ) e II (I A d ), respectivamente. As células de hibridoma T são menos dependentes do que as células T naive primárias de moléculas coestimulatórias e podem ser ativadas por células apresentadoras de antígenos fixos. O reconhecimento de complexos peptídeo-MHC pelas células T do hibridoma resulta em aumento da secreção de IL-2. DCs foram incubados com não infectados ou P. yoelii-eritrócitos infectados por 24 h antes da adição de proteínas OVA purificadas por 5 h. As DCs foram então fixadas para prevenir a secreção de citocinas e incubadas com os diferentes hibridomas por 24 h. A ativação de hibridomas foi determinada pela detecção de IL-2 no meio de incubação. Verificou-se que as DCs pré-incubadas com P. yoeliiOs eritrócitos infectados ativam o hibridoma de células T reconhecendo OVA-MHC-II, mas a ativação do hibridoma que reconhece OVA-MHC-I foi significativamente reduzida. A ativação dos hibridomas foi dependente da dose (Figuras 2A e 2B).

DCs de P. yoelii camundongos infectados podem processar antígeno exógeno para apresentação de MHC classe II, mas não para MHC classe I. (A, B) DCs pré-incubados com não infectados (círculos pretos) ou P. yoeliieritrócitos infectados (círculos brancos) por 24 h, foram incubados com OVA nas concentrações indicadas por 5 h. As DCs foram então fixadas e incubadas com o hibridoma B3Z específico para o epítopo OVA 257-264 /H-2 b (MHC-I) (A) ou hibridoma DO11.10 específico para o epítopo OVA 323-339 /I A d (MHC-II) (B). (C, D) DCs foram incubados com BSA (5 mg / ml barras balck) como controle negativo ou OVA (5 mg / ml barras brancas) por 5 h antes da adição ou não de LPS por 16 h. As DCs foram então incubadas com hibridomas B3Z (C) ou DO11.10 (D) por 24 h. (E-H) DCs sozinho, pré-incubado com não infectado ou P. yoelii-eritrócitos infectados (E, F) ou CD11c + DCs isolados de camundongos infectados em diferentes momentos durante a infecção no sangue (G, H) foram incubados com OVA 5 mg / ml (barras brancas) ou BSA 5 mg / ml como controle negativo (barras pretas) por 5 h antes da adição de LPS por 16 h. As DCs foram fixadas e incubadas com hibridoma B3Z (E, G) ou hibridoma DO11.10 (F, H). Após 24 h, a secreção de IL-2 por hibridomas no meio de cultura foi detectada por ELISA.

A maturação das DCs aumenta sua capacidade de apresentação de antígenos, pois aumenta a expressão de moléculas de MHC na superfície celular [1]. Como esperado, verificou-se que a adição de LPS para induzir a maturação das DCs 5 h após a incubação com OVA, resultou no aumento da ativação de ambos os hibridomas que reconhecem OVA-MHC-I e II (Figuras 2C e 2D). O efeito da pré-incubação de DCs com P. yoeliiforam analisados ​​eritrócitos infectados ou não infectados na apresentação de antígeno de OVA por MHC-I e MHC-II após induzir a maturação com LPS. Foi novamente observado que P. yoeliieritrócitos infectados inibem a ativação do hibridoma reconhecendo OVA-MHC-I, mas não OVA-MHC-II (Figuras 2E e 2F).

A capacidade de CD11c + DCs isolados de P. yoeliicamundongos infectados para apresentar antígenos por MHC-II foram analisados. Verificou-se que a apresentação do antígeno MHC-II é mantida durante o curso da infecção, mas a apresentação cruzada do MHC-I de antígenos exógenos é inibida ao longo do curso da doença (Figuras 2G e 2H). Esses resultados confirmam observações anteriores [11] de que a apresentação do antígeno MHC-I é inibida durante Plasmodium infecções e indicam que as DCs são capazes de processar e apresentar antígenos exógenos por MHC-II durante P. yoelii infecções.

Os encontros iniciais entre as DCs apresentadoras de antígenos e as células T virgens específicas incluem a projeção direcional de extensões de membrana abundantes das DCs em direção às células T virgens e interações prolongadas entre ambas [2]. Para analisar se Plasmodium interfere neste processo, as interações entre DCs derivadas da medula óssea pré-incubadas com eritrócitos infectados e células T CD4 + virgens foram estudadas pela primeira vez usando microscopia de vídeo de lapso de tempo. DCs foram pré-incubados com não infectados ou P. yoelii-ritrócitos infectados e incubados com células T CD4 + anti-OVA virgens isoladas de camundongos transgênicos (DO11.10) que reconhecem um epítopo OVA específico. DCs foram carregados com o mesmo epítopo de peptídeo (OVA 323-339) antes da adição de células T. As DCs que apresentam antígenos normalmente interagem com as células T naïve específicas do antígeno por longos períodos de tempo (mais de 5 min) com extensões de membrana abundantes projetadas na direção da célula T [8]. A pré-incubação de DCs com eritrócitos não infectados não afetou as interações de células DC-T, uma vez que interações prolongadas com extensões de membrana foram freqüentemente encontradas nas coculturas (Figura 3A e arquivo adicional 1). Em contraste, a pré-incubação com P. yoelii-eritrócitos infectados inibem a capacidade das DCs de manter interações prolongadas com extensões de membrana com células T virgens (Figura 3B e arquivo adicional 2). Apenas curtas interações sem projeção de extensões de membrana foram observadas.

Análise microscópica de lapso de tempo da interação entre DCs e células T após a pré-incubação com P. yoelii -eritrócitos infectados. DCs foram diferenciados em vitro e pré-incubado com não infectado (A) ou P. yoeliieritrócitos infectados (B) antes de carregar com o peptídeo OVA 323–339. Células T DO11.10 ingênuas que são específicas para este epítopo OVA foram isoladas de camundongos transgênicos e adicionadas a DCs.Quadros de fotos individuais de filmes (arquivo adicional 1 e arquivo adicional 2) mostrando interações de células DC-T. As setas indicam contatos entre DCs e células T. O tempo em min é indicado em cada quadro. Resultados representativos de um dos cinco experimentos independentes são mostrados.

Para realizar uma análise quantitativa desse fenômeno, foi observada a formação de conjugados estáveis ​​entre DCs apresentadoras de antígeno e células T específicas. Cada população de tipo de célula foi marcada com um corante fluorescente diferente para permitir a determinação de positivos duplos para ambos os marcadores que correspondem a conjugados estáveis ​​[8]. Após uma co-incubação de 30 min de números iguais de DCs apresentando o epítopo de ovalbumina e as células T CD4 + anti-OVA específicas formaram conjugados estáveis ​​onde as DCs 'engolfam' células T (Figura 4A, painéis superiores), que são diferentes de soltas contatos entre essas células (Figura 4A, painel inferior). Consulte o arquivo adicional 3.

Capacidade prejudicada das DCs para interagir e preparar CD4 ingênuo + Células T. (A) O painel superior esquerdo mostra uma célula T (verde) 'engolfada' por uma DC (vermelha). O painel esquerdo inferior mostra uma célula T em contato com uma DC, mas não 'engolfada'. Os painéis direitos mostram os mesmos campos microscópicos na luz transmitida. (A-C) DCs foram diferenciados em vitro e pré-incubado com não infectado (DC + RBC) ou P. yoeliieritrócitos infectados (DC + iRBC), seguido ou não de incubação com LPS. As DCs foram carregadas com o peptídeo OVA 323-339 (barras pretas) ou não (barras brancas) e incubadas por 30 min com células T DO11.10 naïve marcadas com CFSE (verde). (D, E) CD11c + DCs foram isolados a partir de P. yoeliicamundongos infectados em diferentes momentos de infecção e incubados isoladamente (barras brancas), com o peptídeo OVA 323-339 (barras cinza) ou com LPS e o peptídeo OVA 323-339 (barras pretas). As DCs foram incubadas por 30 min com células T DO11.10 naive marcadas com CFSE (verde). Para a análise de microscopia (A, B, D), as DCs foram fixadas e a actina foi corada (vermelho), para a análise de FACs (C, E), as DCs foram marcadas com rastreador de células (vermelho) antes da incubação com células T. (B, D) Número de células T 'engolfadas' por 100 DCs analisadas por microscopia. (C, E) Porcentagem de conjugados de células DC-T analisados ​​por FACS. (F, G) Regulação positiva de CD69 em células T CD4 + naïve após uma incubação de 12 h com peptídeo OVA 323-339 carregado não estimulado (barras brancas) ou DCs estimuladas por LPS (barras pretas). (F) DCs foram diferenciados em vitro e pré-incubado ou não com não infectado ou P. yoelii-eritrócitos infectados. (G) As DCs foram isoladas de camundongos infectados em diferentes momentos durante a infecção no estágio sanguíneo. Os resultados são expressos como média ± DP de amostras em triplicado. A análise de FACs para dados (F) e (G) é mostrada no Arquivo Adicional 3.

A quantificação do número de positivos duplos por microscopia de fluorescência revelou que os conjugados de células DC-T são formados quando as DCs de controle carregadas com o epítopo de peptídeo específico são incubadas com células T específicas e o número de conjugados é aumentado quando as DCs foram ativadas por adição de LPS . Pré-incubação de DCs com P. yoeliiOs eritrócitos infectados inibiram significativamente a formação de conjugados de células DC-T estáveis ​​(Figura 4B). A análise de positivos duplos para cada marcador fluorescente por FACs forneceu resultados semelhantes (Figura 4C). A adição de LPS como um sinal de maturação aumentou o número de conjugados de células DC-T nas DCs de controle pré-incubadas com eritrócitos não infectados, mas não melhorou as interações de células DC-T prejudicadas por P. yoelii-eritrócitos infectados (Figuras 4B e 4C).

Quando uma análise semelhante foi realizada usando CD11c + DCs isoladas de P. yoeliianimais infectados em diferentes momentos após a infecção, também encontramos uma diminuição significativa no número de conjugados estáveis ​​de células DC-T em comparação com camundongos não infectados (dia 0). Mesmo se mais baixos, níveis detectáveis ​​de conjugados estáveis ​​formados por DCs de camundongos infectados e células T específicas foram encontrados por microscopia e FACs (Figuras 4D e 4E), sugerindo que as interações de células DC-T são prejudicadas, mas não completamente inibidas por P. yoelii infecção. Esses níveis foram minimamente aumentados pela adição de LPS às DCs (Figuras 4D e 4E).

Para determinar o nível de ativação de células T nas co-culturas de DC e células T, as DCs foram ativadas por adição de LPS e a expressão de superfície do marcador de ativação precoce CD69 em células T foi analisada. Nas co-culturas de DCs incubadas com P. yoeliieritrócitos infectados ou isolados de camundongos infectados, o nível de células T que expressam CD69 foi grandemente diminuído em comparação com co-culturas com DCs de controle (Figuras 4F e 4G).

Para estudar a ativação das células T CD4 + durante P. yoelii infecção na Vivo, células T CD4 + naïve foram transferidas de camundongos transgênicos DO11.10 que são específicos para o epítopo OVA 323-339 para P. yoeliicamundongos infectados (dia 10 p.i.) ou não infectados. Os camundongos foram imunizados com OVA 24 h após a transferência e a ativação das células T CD4 + foi medida 72 h após a injeção de OVA. As células T CD4 + ingênuas foram marcadas com fluorescência antes da transferência para permitir a identificação. O número de células T CD4 + transferidas no baço após 72 h foi semelhante em animais não infectados e não infectados (Figura 5A), mas após a imunização com antígeno, camundongos infectados iniciaram células T CD4 + virgens transferidas com menor eficiência do que camundongos não infectados. A ativação de células T foi menor em camundongos infectados, conforme determinado pela proliferação (diminuição na marcação CFSE, Figura 5B), regulação positiva de CD11a (Figura 5C), regulação negativa de CD62L (Figura 5D) e aumento de IL-2 intracelular (Figura 5E). O efeito da transferência de células T CD4 + virgens de camundongos transgênicos DO11.10 para P. yoeliicamundongos infectados no início da infecção (dia 5), ​​também foi analisado. Nessas condições, apenas a proliferação (diminuição na marcação de CFSE) e a expressão de CD11a diminuíram significativamente nos animais infectados. Nenhuma mudança significativa foi encontrada na secreção de IL-2 e na expressão de CD62L (ver arquivo adicional 4).

Ativação de CD4 ingênuo + As células T são prejudicadas durante o final Plasmodium infecção de estágio sanguíneo. Células T CD4 + virgens de DO11.10 isoladas de baços de camundongos transgênicos foram marcadas com CFSE e transferidas para células não infectadas ou P. yoeliicamundongos infectados (10 dias após a infecção). Os camundongos foram imunizados ou não com OVA 24 h após a transferência das células T. Três dias após a imunização, as células T CD4 + transferidas de baços de camundongos receptores foram analisadas por FACs para (A) número total no baço, (B) proliferação (determinada como diminuição na fluorescência de CFSE), (C) regulação positiva de Expressão de superfície de CD11a, (D) regulação negativa da expressão de superfície de CD62L e (E) aumento na produção de IL-2 intracelular. Os resultados são expressos como a diferença entre os valores obtidos com camundongos não imunizados e camundongos imunizados com OVA. Os resultados são expressos como média ± DP de amostras em triplicado. A análise de FACs com as portas para células transferidas é mostrada no arquivo adicional 4.

A capacidade das DCs de fornecerem apresentação de antígeno adequada para células T no contexto de P. yoelii infecção foi analisada em detalhes. Os resultados sugerem que durante P. yoelii infecções DCs mantêm a capacidade de processar e apresentar antígenos exógenos, formando o complexo MHC-II-epítopo na superfície das DCs, no entanto, como mostrado antes para P. berghei [11], foi encontrada apresentação cruzada prejudicada de antígenos exógenos por MHC-I.

A apresentação eficiente de antígenos não é suficiente para a ativação de células T CD4 + e CD8 + virgens, que também requerem sinais coestimulatórios de DCs e citocinas específicas [12]. As interações de células T virgens com DCs indutoras de priming maduras são mais estáveis ​​do que os contatos com DCs indutoras de tolerância em repouso. Foi proposto que as interações de células DC-T estáveis ​​participam da indução da ativação de células T específicas para o antígeno por meio da entrega de um sinal ativador pelas DCs. Em contraste, contatos instáveis ​​com DCs em repouso podem induzir a ativação de curto prazo e sinais de proliferação em células T [2], o que pode explicar a falta de ativação de células T que observamos durante a infecção final da malária. Na ausência de DCs maduras, os contatos instáveis ​​em série entre as células T e as DCs em repouso resultariam na deleção clonal das células T [2], um fenômeno que também foi observado durante infecções por malária, onde há deleção específica de células T que reconhecem Plasmodium antígenos [13].

A maturação das DCs aumenta a duração das interações DC-células T e permite a formação de uma rede complexa de extensões de membrana na qual as DCs prendem as células T [8]. A capacidade das DCs de estabelecer essas interações eficazes com células T CD4 + virgens foi inibida durante a infecção. Como a reorganização da morfologia das DC mediada pela actina é necessária para formar as interações fortes e duradouras com as células T [8], é possível que o parasita possa interferir no citoesqueleto das DCs. Na verdade, vários genes no citoesqueleto de DC são modulados durante P. yoelii infecção [14].

Estudos anteriores demonstraram que as DCs podem processar e apresentar antígenos associados ao MHC de classe II durante infecções em estágio sanguíneo, sugerindo que a ativação eficiente de células T CD4 + poderia ocorrer durante a infecção murina [15], no entanto, ativação defeituosa e depleção específica de CD4 + Células T reconhecendo Plasmodium antígenos é observada durante infecções de malária murina [13, 16]. A supressão da proliferação de células T CD4 + específicas de OVA também foi observada em P. chaubaudicamundongos infectados, mas neste modelo a inibição foi evidente desde o início da infecção [17]. Além disso, esses autores também descobriram que as interações de células T CD4 + e DC são inibidas por P. chaubaudi infecção em vitro e na Vivo, enquanto a apresentação do antígeno pelo MHC-II não é afetada [18].

Recentemente, duas subpopulações de CD11c + DCs com habilidades diferenciais para ativar células T específicas do antígeno foram identificadas em P. chaubaudi camundongos infectados [19], sugerindo que pode haver um equilíbrio de forças opostas na resposta do hospedeiro. Uma vez que as interações entre DCs e células T diminuem, mas ainda são detectáveis, é possível que tenhamos observado a soma dos diferentes efeitos contribuídos por diferentes subpopulações de DCs. Atualmente, acredita-se que a tolerância das DCs, induzida pela exposição a ligantes de TLR, é induzida durante a infecção por malária [20]. Nesse contexto, é provável que as DCs toleradas que são encontradas cada vez mais durante a infecção tardia teriam interações prejudicadas com as células T, levando à diminuição da ativação.


As células T assumem a liderança no controle da SARS-CoV-2 e na redução da gravidade da doença COVID-19

Uma resposta imune específica do vírus em várias camadas é importante para controlar o vírus durante a fase aguda da infecção e reduzir a gravidade da doença COVID-19. Crédito: Crotty Lab / Cell Press.

Desde que o SARS-CoV-2 apareceu pela primeira vez, os pesquisadores têm tentado entender se às vezes o sistema imunológico faz mais mal do que bem durante a fase aguda do COVID-19. O último estudo realizado por pesquisadores do Instituto La Jolla de Imunologia argumenta claramente a favor do sistema imunológico.

Seu trabalho, publicado na edição online de 16 de setembro de 2020 Célula, confirma que uma resposta imune específica do vírus em várias camadas é importante para controlar o vírus durante a fase aguda da infecção e reduzir a gravidade da doença COVID-19, com a maior parte das evidências apontando para um papel muito maior para as células T do que anticorpos. Uma resposta imunológica fraca ou descoordenada, por outro lado, prevê um desfecho ruim da doença. As descobertas sugerem que as vacinas candidatas devem ter como objetivo eliciar uma ampla resposta imunológica que inclui anticorpos, células T auxiliares e assassinas para garantir imunidade protetora.

"Nossas observações também podem explicar por que os pacientes mais velhos do COVID-19 são muito mais vulneráveis ​​à doença", disse o autor sênior Shane Crotty, Ph.D., que co-liderou o estudo com Alessandro Sette, Dr. Biol.Sci., Ambos professores do Centro de Pesquisa de Doenças Infecciosas e Vacinas do LJI. "Com o aumento da idade, o reservatório de células T que podem ser ativadas contra um vírus específico diminui e a resposta imunológica do corpo torna-se menos coordenada, o que parece ser um fator que torna os idosos drasticamente mais suscetíveis a COVID-19 grave ou fatal."

Sette acrescenta: "O que não vimos foi nenhuma evidência de que as células T contribuem para uma tempestade de citocinas, que é mais provavelmente mediada pelo sistema imunológico inato."

Quando o SARS-CoV-2 (ou qualquer outro vírus) se infiltra no corpo, o sistema imunológico inato é o primeiro a entrar em cena e lança um ataque amplo e inespecífico contra o intruso. Ele libera ondas de moléculas sinalizadoras que incitam a inflamação e alertam as forças de precisão do sistema imunológico para a presença de um patógeno.

Em poucos dias, o chamado sistema imunológico adaptativo se levanta e se move com extrema precisão contra o vírus, interceptando partículas virais e matando células infectadas.

O sistema imune adaptativo consiste em três ramos: anticorpos células T auxiliares (Th), que auxiliam a célula B a produzir anticorpos protetores e células T assassinas (CTL), que procuram células infectadas por vírus e as eliminam.

Para seu último estudo, os pesquisadores coletaram amostras de sangue de 50 pacientes COVID-19 e analisaram todos os três ramos do sistema imunológico adaptativo - anticorpos específicos para SARS-CoV-2, células T auxiliares e assassinas - em grande detalhe.

"Foi particularmente importante para nós capturar toda a gama de manifestações da doença de leve a gravemente doente para que pudéssemos identificar fatores imunológicos diferenciadores", disse o co-primeiro autor e especialista em doenças infecciosas Sydney Ramirez, MD, Ph.D., que liderou a coleta de amostra.

O que a equipe descobriu foi que, semelhante ao estudo anterior, todos os indivíduos totalmente recuperados tinham respostas mensuráveis ​​de células T de anticorpos, auxiliares e assassinos, enquanto a resposta imune adaptativa em pacientes com COVID-19 aguda variou mais amplamente com alguns anticorpos neutralizantes sem, outros auxiliares ou assassinos Células T ou qualquer combinação das mesmas.

"Quando olhamos para uma combinação de todos os nossos dados em todos os 111 parâmetros medidos, descobrimos que, em geral, as pessoas que montaram uma resposta adaptativa mais ampla e bem coordenada tenderam a se sair melhor. Uma resposta forte de células T específicas para SARS-CoV-2 , em particular, foi preditivo de doença mais branda ", diz a co-primeira autora e pesquisa de pós-doutorado Carolyn Moderbacher, Ph.D. "Indivíduos cuja resposta imunológica era menos coordenada tendiam a ter resultados piores."

O efeito foi ampliado quando os pesquisadores dividiram o conjunto de dados por idade. "Pessoas com mais de 65 anos de idade eram muito mais propensas a ter respostas pobres de células T e uma resposta imunológica mal coordenada e, portanto, ter COVID-19 muito mais grave ou fatal", disse Crotty. "Assim, parte da grande suscetibilidade dos idosos ao COVID-19 parece ser uma resposta imune adaptativa fraca, que pode ser devido a menos células T virgens nos idosos."

As células T naive são células T inexperientes que ainda não encontraram sua correspondência viral e estão esperando para serem chamadas. À medida que envelhecemos, o suprimento de células T ingênuas implantáveis ​​do sistema imunológico diminui e menos células ficam disponíveis para serem ativadas para responder a um novo vírus. "Isso pode levar a uma resposta imune adaptativa retardada que é incapaz de controlar um vírus até que seja tarde demais para limitar a gravidade da doença ou a magnitude da resposta é insuficiente", disse Moderbacher.

Em linha com o que outras equipes de pesquisa descobriram antes, os anticorpos não parecem desempenhar um papel importante no controle de COVID-19 agudo. Em vez disso, as células T e as células T auxiliares, em particular, estão associadas a respostas imunes protetoras. "Isso foi desconcertante para muitas pessoas", diz Crotty, "mas controlar uma infecção primária não é o mesmo que imunidade induzida por vacina, em que o sistema imunológico adaptativo está pronto para atacar no momento zero."

Se a vacinação for bem-sucedida, os anticorpos induzidos pela vacina estarão prontos para interceptar o vírus quando ele aparecer na porta. Em contraste, em uma infecção normal, o vírus sai na frente porque o sistema imunológico nunca viu nada parecido. No momento em que o sistema imunológico adaptativo está pronto para entrar em ação durante uma infecção primária, o vírus já se replicou dentro das células e os anticorpos não podem alcançá-lo.

"Assim, essas descobertas indicam que as células T plausíveis são mais importantes na infecção natural por SARS-CoV-2, e os anticorpos mais importantes em uma vacina COVID-19", diz Crotty, "embora também seja plausível que as células T respondam contra isso vírus são importantes em ambos os casos. "


Assista o vídeo: Educación en el Timo delas células T (Agosto 2022).