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Um gene pode ser inativado usando CRISPR se não estiver no interespaço de repetições palindrômicas curtas?

Um gene pode ser inativado usando CRISPR se não estiver no interespaço de repetições palindrômicas curtas?



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Recentemente, estudei como funciona o CRISPR, mas há algo que não entendo de todo. Já ouvi muita gente afirmar que, com esse método, é possível modificar qualquer genoma inativando, ativando, removendo ou adicionando genes. No entanto, até onde entendi, as regiões de DNA só podem ser modificadas se estiverem nos interespaços de curtas repetições palindrômicas. Então, minha pergunta é se um gene que não está no interespaço de repetições palindrômicas curtas pode ser modificado ou removido? E se for possível, como?


Quando as pessoas falam sobre edição de genoma com CRISPR, elas estão realmente falando sobre o uso de nucleases associadas a CRISPR, como Cas9 e Cpf1. Essas nucleases são úteis uma vez que sua especificidade de sequência é determinada por um RNA guia e, portanto, podem ser usadas para cortar em locais específicos no genoma. Na verdade, isso não tem nada a ver com as próprias repetições.

Veja esta resposta para uma breve visão geral de como a edição do genoma com Cas9 funciona.


Tecnologia CRISPR que busca inativar genes mutantes no câncer de pulmão

Os pesquisadores acadêmicos esperam que seus esforços na tecnologia de edição de genes do CRISPR (repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas) levem à capacidade de desligar genes mutantes em pacientes com uma variedade de doenças malignas, incluindo câncer de pulmão.

A tecnologia CRISPR permite a edição ou alteração do genoma de uma célula e inativar ou reparar genes conforme necessário, alterando as sequências de DNA.

No laboratório, os pesquisadores estão explorando a diversidade de vários genótipos de tumor em modelos de camundongos para aprender mais sobre a biologia do câncer e exatamente como os genes mutantes afetam a progressão do câncer de pulmão, de acordo com Monte Winslow, PhD, professor assistente, Departamento de Genética e Departamento de Patologia em Stanford Medicine. Além disso, acrescenta, eles estão explorando genes mutantes para determinar quais estão associados à sensibilidade a medicamentos.

OncLive: O que você destacou em relação à tecnologia CRISPR em sua apresentação?

Em uma entrevista com Winslow durante o 2017 OncLive ® State of the Science Summit on Advanced Non — Small Cell Lung Cancer, ele compartilhou o trabalho sobre CRISPR que está sendo desenvolvido em seu laboratório, e como esta tecnologia pode ajudar a avançar no tratamento para a população de NSCLC não motoristas.Winslow: A principal coisa que estamos interessados ​​em fazer é desenvolver sistemas de modelos onde podemos gerar muitos tipos diferentes de tumores em modelos de camundongos. Esses são genes de câncer muito importantes. Podemos criar modelos de câncer humano em camundongos? Temos uma diversidade de genes diferentes mutados. Estamos observando a diversidade de diferentes genótipos de tumores em camundongos individuais para que possamos primeiro aprender sobre a biologia de como esses genes sendo mutados impactam o desenvolvimento do câncer, ou progressão do câncer, no pulmão.

Qual é a história do CRISPR?

Em segundo lugar, queremos usar esses modelos para entender se existem certos genes, quando mutados, na doença humana que podem levar à sensibilidade a diferentes terapias. Estas podem ser terapias que já foram aprovadas pela FDA para outros tipos de câncer, mas não sabemos se existem alguns genótipos raros de tumores que serão respondentes excepcionais a esses tipos de drogas. Ajuda o fato de que essas plataformas que estamos desenvolvendo podem ajudar a priorizar a obtenção de pacientes com os genótipos certos de tumores. É uma história muito interessante do CRISPR, pois é originário de vários sistemas de órgãos modelo onde eles o descobriram. Então, é aplicado agora a esta engenharia do genoma, onde é muito fácil projetar esses componentes para criar quebras no DNA. Essas quebras podem ser reparadas de forma que o gene agora esteja inativado.

Portanto, no que diz respeito à modelagem de câncer, estamos envolvidos em tentar aproveitar esse sistema CRISPR para ser capaz de inativar genes nesse tipo de modelo de câncer. Outras pessoas também contribuíram para esse campo, então isso tem sido um verdadeiro avanço. Antes de ser capaz de fazer essas coisas, realmente demoraria anos ou mais para observar a função de qualquer gene individual em um modelo de câncer. Agora, podemos olhar para dezenas de genes no mesmo período de tempo, e isso foi realmente um grande avanço. Nossa esperança agora é fazer mais disso - maneiras mais eficientes e quantitativas e, então, começar a aplicar essa questão de procurar diferentes sensibilidades aos medicamentos, o que é uma questão em aberto. Muitas pessoas estão interessadas nisso.

Em algum momento, você imagina que isso funcione mais em modelos humanos?

Isso pode ser aplicado à prática clínica para oncologistas comunitários?

Para nós, com esses tipos de sistemas, queremos abordar isso em tumores que crescem in vivo, não em linhas celulares que estão crescendo em placas de Petri no laboratório, mas em um animal ou tipo de hospedeiro. É aqui que reconheceremos que o que estamos vendo é como eles crescem nesses sistemas de modelos de mouse, mas é muito próximo das pessoas. Portanto, esperamos obter alguns insights sobre esse tipo de terapia. Certamente, as pessoas estão usando o CRISPR para inativar genes de interesse em linhagens de células cancerígenas ou diferentes tipos de modelos. Haverá algum benefício em fazer esses sistemas de camundongo porque esse é o único sistema em que você pode iniciar tumores a partir de uma única célula - neste caso, o pulmão do camundongo - e ele se desenvolverá até se tornar um adenocarcinoma pulmonar metastático. Com muitos desses outros sistemas, cada sistema tem suas próprias vantagens e desvantagens, então pensamos que essa é uma grande vantagem aqui - que tudo isso acontece naturalmente in vivo. Considerando que, todos os sistemas humanos serão transplantados para camundongos ou crescerão in vitro. Eles têm a vantagem de serem humanos, mas existem algumas desvantagens relacionadas a isso. Não acho que haja muito do nosso trabalho que será rapidamente aplicado à prática clínica, a menos que eles percebam a quantidade de esforço acadêmico que está sendo feito para entender esta doença e pensar em novas terapias. Nem tudo vem das empresas farmacêuticas; realmente há um grande interesse acadêmico nisso.

Não existem muitas mutações que levam à sensibilidade ao medicamento e, embora tenha havido esforços incríveis, há muitos pacientes que não têm nenhuma mutação acionável até hoje. Mas, como você os torna acionáveis? Como você faz as coisas para ajudar esses pacientes? Estamos trabalhando muito para torná-los melhores e em terapias baseadas no conhecimento. Vamos ver como isso funciona.

Há muito a ser dito sobre isso, especialmente porque os pacientes sem mutações de driver constituem a maioria da população com câncer de pulmão.

Não sabemos realmente o que o futuro reserva. Vamos descobrir que existe uma fração de tamanho razoável da população pulmonar que pode ser alvo dessas drogas que talvez já sejam aprovadas pela FDA para outros tipos de câncer? isso poderia muito bem ser. Sinto que estou um pouco atrasado para essa ideia de terapia personalizada, mas é nisso que estamos nos metendo agora.

Há mais alguma coisa em que você esteja trabalhando em seu laboratório e que gostaria de compartilhar?

Podemos pelo menos categorizar as pessoas? Por exemplo, talvez 1% dos pacientes se pareça com isso? E agora, talvez você descubra como tratar aquele 1% dos pacientes. Anos atrás, teríamos pensado que era muito complicado - como um problema. Agora, eu sinto que, do lado acadêmico, essa complexidade é administrável e não precisamos ter medo de que seja complicado. Podemos lidar com isso. Se for 1% dos pacientes que estão respondendo às terapias, tudo bem para nós. Essa é a direção que estamos seguindo. A maior parte do meu laboratório está interessada em entender os mecanismos que geram metástases. Não o crescimento do tumor e seu tamanho, mas se eles adquirem essas características que os permitem deixar o tumor primário, se espalhar e formar essas metástases em órgãos distantes. O que estamos fazendo lá é uma ciência bastante básica. Como as células mudaram para poder fazer isso? Quais são os requisitos para crescer em locais distantes? É algo que achamos interessante se isso se torna segmentável é outra questão.

Se você pode bloquear a metástase com uma pequena molécula, existem populações de pacientes que se beneficiarão com isso? É sobre isso que estamos falando com nossos colegas clínicos da Stanford Medicine porque achamos que é realmente interessante. Novamente, pode ser uma pequena fração dos pacientes, mas a metástase é uma parte realmente terrível da doença, então esse é o nosso outro interesse principal.


CRISPR / Cas9: a natureza e o presente do # x02019s

O CRISPR é principalmente um presente da Mãe Natureza, onde os cientistas o descobriram como sistema imunológico procariótico em bactérias e arquéias. O trabalho no CRISPR começa no final dos anos 1980 com vários marcos nesta longa jornada (Tabela & # x000a0 1), no entanto, as publicações fundamentais vieram em 2012 para demonstrar que um sistema CRISPR em Streptococcus pyogenes poderia ser usado para a edição do genoma, abrindo uma nova porta para a engenharia do genoma. Nessas bactérias, Cas9 é responsável pela clivagem do DNA invasor & # x02019. Guiado por crRNA (RNA CRISPR) e tracrRNA (crRNA transativador que será combinado para fins de edição in vitro para produzir gRNA), Cas9 pode ter como alvo um local específico no genoma e, em seguida, produzir quebras de fita dupla (DSBs) [32, 33 ] O complexo composto de Cas9 e gRNA ataca a sequência específica de DNA logo a montante da sequência do motivo protoespaçador adjacente (PAM), NGG (N representa qualquer nucleotídeo) [34, 35]. Quase 60 e 40% das arquéias e bactérias, respectivamente, usaram CRISPR da mesma maneira, com pequenas diferenças [36]. A localização do CRISPR, nesse sentido, serve como depósito de memória onde a bactéria pode armazenar ataques virais ou plasmídeos anteriores, e então usar essas informações para se defender contra esses invasores nos próximos ataques.

Tabela 1

A linha do tempo das conquistas inovadoras de edição de genoma

AnoContribuinteContribuição
1987Yoshizumi Ishino et al.Descobriu algumas repetições no IAP gene em Escherichia coli. Eles não conseguiram identificar a função principal dessas repetições [11].
1993Francisco Mojica et al.Caracterizou o que agora é chamado de locus CRISPR como uma genética molecular & # x02019 de memória de MGE (elemento genético móvel) que anteriormente atacava a célula da bactéria. Eles também descobriram repetições em tandem (TREPs) em Haloarchaea [12].
1996Yang-Gyun Kim et al.As primeiras enzimas de modificação de restrição foram geneticamente modificadas com a capacidade de cortar em sequências alvo específicas. Esta enzima pode ser usada na edição de genomas [13].
2000Jeff Smith et al.Vários experimentos conduzidos para mostrar que as nucleases de dedo de zinco (ZFN) podem gerar quebras de DNA de fita dupla e, portanto, poderiam ser usadas como uma ferramenta de edição de genoma [14].
2002Marina Bibikova et al.Dedos de zinco usados ​​pela primeira vez para interromper genes na mosca da fruta Drosophila melanogaster [15].
2002Ruud Jansen et al.Cunhou o termo CRISPR que significa Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats [16].
2004Alan Lloyd et al.Anunciado o primeiro genoma de planta modificado com a Zinc Finger Nuclease, que é a ferramenta que poderia ser usada na edição de genomas. Essa ferramenta também pode ser usada para criar modelos de doenças genéticas humanas [17].
2005Alexander Bolotin et al.Descobriu um novo locus CRISPR em streptococcus thermophilus. Ele também observou que os espaçadores, que têm homologia com genes virais, compartilham uma sequência comum em uma extremidade. Esta sequência seria mais tarde conhecida como protoespacer adjacente motif (PAM) [18].
2006Eugene Koonin et al.Sugeriu que o CRISPR é um sistema imunológico que atua por interferência com o RNA em bactérias. Ele também classificou cerca de 25 famílias distintas de Cas e previu suas novas funções [19].
2008John van der Oost et al.Mostrou que as sequências espaçadoras são transcritas em RNAs CRISPR (crRNAs), que guiam a nuclease de Cas para o DNA alvo do invasor [20].
2010Sylvain Moineau et al.Indicado que CRISPR / Cas9 gera DSBs 3 nucleotídeos a montante da sequência PAM no DNA alvo [21].
2011Emmanuelle Charpentier et al.Descobriu outro tipo de RNA encontrado nos componentes do sistema CRISPR e # x02019s chamado RNA transativador (tracrRNA). Ela indicou que o tracrRNA trabalha simultaneamente com o crRNA no direcionamento da proteína Cas9 para cortar a sequência alvo [22].
2012Virginijus Siksnys et al.Indicou que Cas9 consiste em dois domínios, que são RuvC e HNH, e que o primeiro domínio corta na fita distante de DNA, enquanto o segundo corta na fita onde ocorre a integração entre crRNA e DNA [23].
2012Jennifer Doudna e Emmanuelle CharpentierProjetou o dual-tracrRNA: crRNA como uma única quimera de RNA chamada gRNA [24].
2013Feng Zhang et al.Anunciava o uso do CRISPR / Cas9 na edição de genes humanos, questão que abriu as portas para o uso do CRISPR na área médica [25].
2015Feng Zhang et al.Introduziu o Cpf1 como uma nova nuclease que funciona de maneira mais eficiente do que o Cas9 [26].
2015Junjiu Huang et al.Relatou a primeira aplicação de CRISPR a embriões humanos inviáveis ​​[27].
2016Kamel Khalili et al.Usei CRISPR / Cas9 para editar o HIV fora do DNA de uma célula imunológica humana e, portanto, evitar a reinfecção de células não editadas também [28].
2016Kevin Esvelt et al.Desenvolveu o gene drive CRISPR / Cas9 [29].
2017Jennifer Doudna et al.Desenvolveram um CRISPR-Gold, que é uma nova versão da edição de genes CRISPR / Cas9, nessa nova tecnologia, eles usaram nanopartículas de ouro para entregar o sistema de edição de genes CRISPR / Cas9 nas células [30].
2018Norbert Reich et al.Introduzida a abordagem de edição de genoma acionada por luz usando nanoesferas ocas de ouro. Esta abordagem é 100 a 1000 vezes mais eficiente do que os métodos atuais de edição de genoma [31].

Modelagem de tumor baseada em CRISPR / Cas9

O método clássico para transformar uma célula normal em maligna requer um processo de várias etapas que envolve uma série de mutações para adquirir essas células as marcas que caracterizam o fenótipo maligno [37 & # x0201339]. Com a exploração do poder do CRISPR / Cas9, muitos grupos de pesquisa foram capazes de criar tais modelos de câncer (Tabela & # x000a0 2). Truncando APC O gene supressor de tumor nas células intestinais foi bem-sucedido como representante de um evento inicial bem desenvolvido no desenvolvimento do câncer colorretal. o Wnt ativadores de sinalização foram removidos do meio de cultura para selecionar APC- ausência de células-tronco intestinais humanas, levando a & # x003b2estabilização de catenina e regulação positiva de Wnt via [48] e [49]. Outras abordagens envolvem a criação de células com KRAS oncogene juntamente com mutação de perda de função. Além disso, P53 também foi inativado usando CRISPR / Cas9 [50, 51]. Usando essas abordagens, uma combinação de mutações também pode ser gerada e, em seguida, testada inoculando essas células editadas em camundongos imunodeficientes. Este modelo de câncer responde a uma questão imensa, se a mutação causadora do câncer ocorre aleatoriamente ou em uma ordem de tempo precisa.

Mesa 2

Modelos de camundongos com câncer baseados em CRISPR / Cas9 (revisado em [40])

Tipo de câncerLinhagem de camundongoVetorGene (s) alvoReferência
Adenocarcinoma de pulmãoKras lsl-G12D / + LentivirusNKX, PTEN, APC[41]
Adenocarcinoma de pulmãoCD1AdenovírusEML4[42]
Linfoma de burkittArf / & # x02212 E & # x003bcMycRetrovírusp53[43]
GlioblastomaCrl: camundongos CD1TransfecçãoTRP53, PTEN, NF1[10]
Leucemia mielóide agudaCamundongos C57Bl / 6LentivirusDNMT3A, EZH2, RUNX1[1]
Linfoma de burkittE & # x003bc - ratos MycLentivirusp53[44]
Adenocarcinoma pancreáticoKrasLSL-G12D / +LentivirusLKB1[45]
Metástases pulmonaresKras G12D / + p53 & # x02212 / & # x02212 LentiviralMúltiplos acertos[46]
Regressão do tumorFoxn1 ratos nuTransfecçãoPKC & # x003b2 A509T[47]

Estratégias semelhantes foram usadas para transduzir uma linha celular de câncer de pulmão de camundongo não metastático com CRISPR / Cas9 que tem como alvo vários genes codificadores de proteínas juntamente com precursores de miRNA. Chen, Peng [52] registrou um crescimento maciço de tumor e metástase pulmonar ao inocular as células modificadas em camundongos imunodeficientes. Por sequenciamento profundo, a equipe descobriu vários novos genes cuja ativação foi crucial para o crescimento do tumor e metástase. Esta abordagem permite a recapitulação do processo de evolução tumoral e metástase, que por sua vez, pode ajudar na concepção de terapias específicas visando o (s) gene (s) defeituoso (s) [53].

Reprogramação de transcriptoma baseada em CRISPR / Cas9

Os programas transcricionais controlam quase todos os aspectos da vida do organismo, desde os primeiros estágios de desenvolvimento até a morte [54]. O câncer, como um estado anormal das células, tem seu próprio programa de transcrição específico, que foi validado pelo CRISPR em vários tipos de câncer, incluindo carcinomas de ovário e de mama, onde as células cancerosas foram encontradas para exibir um padrão de regulação da transcrição específico da célula, com epigenética as modulações são os principais fatores que afetam [55, 56]. Este programa pode ser interrompido pela inibição CDK7, que representa uma opção terapêutica potencial para o câncer de mama, especialmente o tipo de resistência endócrina mediada por mutação do receptor de estrogênio (ER). A característica mais impressionante é que CDK7 a inibição não prejudica apenas o crescimento celular do câncer de mama, mas também a resistência das células do câncer de mama MCF7 responsivas ao estrogênio [57].

Antes do CRISPR, ZFNs (nucleases de dedo de zinco) e TALENs (nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição) foram usados ​​para ativar e suprimir genes como uma estratégia para a terapia do câncer. Uma breve comparação entre as três principais ferramentas de edição do genoma é destacada na (Tabela & # x200B (Tabela 3). 3). A estrutura de ambas as ferramentas as torna adequadas para segurar ativadores e supressores [58, 59]. Por enquanto, esses ativadores e supressores são facilmente fundidos a dCas9, uma mutação de Cas9 sem atividade de endonuclease. Recentemente, mais ativadores / supressores de transcrição baseados em dCas9 foram disponibilizados [60]. Os aptâmeros têm sido usados ​​para reprogramar o epigenoma com o objetivo de reativar os genes supressores de tumor hipermetilados (TSGs) para recuperar a atividade supressora de crescimento exercida por esses TSGs [61, 62]. Essa estratégia funciona nos cânceres de fígado, cólon, mama e pulmão. Esta abordagem é uma alternativa às pequenas moléculas / drogas modificadas epigeneticamente, que podem ter efeitos colaterais indesejáveis. Além disso, o dCas9 foi usado de forma eficiente para a desmetilação direcionada de BRCA1 promotor usando o domínio de desmetilação de TET1& # x02014 a enzima que converte 5-mC (5-metilcitosina) em 5-hmC (5-hidroximetilcitosina) & # x02014 em células de câncer cervical e de mama. A edição de epigenoma baseada em CRISPR / Cas9 também foi usada para reprimir os receptores de interleucina (IL1R1) e fator de necrose tumoral & # x003b1 receptor (TNFR1) em células-tronco derivadas de tecido adiposo humano. Isso pode abrir a porta para controlar vários tipos de inflamações que aceleram o crescimento de diferentes tipos de cânceres [63 & # x0201365].

Tabela 3

Comparação entre as três principais ferramentas de edição de genoma

ZFNTALENCRISPR
NaturezaProteína projetada para direcionar sequências de DNA específicasProteína projetada para direcionar sequências de DNA específicasSequência curta de RNA que pode ter como alvo sequências de DNA específicas
Alvo / sensibilidadeProteína & # x02013 interação de DNA, menos sensívelProteína e # x02013 interação de DNA, menos sensívelInterações de RNA & # x02013DNA, altamente sensíveis
Tamanho do alvo reconhecido18 e # x0201336 e # x02009nt30 e # x0201340 e # x02009nt22 e # x02009nt
Fora da segmentaçãoAltoModeradoBaixo
EficiênciaModeradoModeradoAlto
Nuclease & # x02013 D / MDímero FokI & # x02013Dímero FokI & # x02013Cas9 & # x02013 monômero
Modo de açãoPara que o ZFN funcione, são necessários dois conjuntos para hibridizar cada um com cada fita de DNA em torno da sequência alvoPara que o TALEN funcione, são necessários dois conjuntos para hibridizar cada um com cada fita de DNA em torno da sequência alvoNa presença de gRNA, Cas9 pode atingir a sequência de DNA alvo e gerar quebras de fita dupla.
CitotoxicidadeModeradoBaixoBaixo
Múltiplos alvosDifícilDifícilFactível
Custo / benefíciosAlto custo e demoradoAlto custo e demoradoBaixo custo e menos tempo necessário

No entanto, uma série de modificadores epigenéticos baseados em dCas9 é introduzida para modificar as marcas epigenéticas como uma nova forma de tratar várias doenças, incluindo câncer.

Editando DNA para terapia de câncer

Embora a tecnologia CRISPR tenha sido usada na modelagem e rastreamento do câncer, ela também oferece uma maneira direta de terapia de câncer específica para um alvo. Muitos ensaios foram conduzidos usando CRISPR para combater esta doença fatal. E6 e E7 no HPV foram desafiados com CRISPR / Cas9 para induzir a maquinaria apoptótica e inibir o crescimento na linhagem de células de câncer cervical in vitro [66]. Enquanto isso, a deleção mediada por CRISPR / Cas9 do sítio de ligação de miRNA localizado na UTR (região não traduzida) de F1H1& # x02014 o gene que regula a angiogênese em células NSCLC & # x02014 resultou na recuperação das anormalidades vasculares que caracterizam o câncer de pulmão [67].

O oncogene HER2 exons também são um alvo para intervenção CRISPR, onde uma mutação no exon 12 de HER2 resultou em um fenótipo mutante negativo dominante [68]. O mutante HER2 foi encontrado para inibir o MAPK/ERK eixo de HER2 via de sinalização necessária para a proliferação de células de câncer de mama. Controle do câncer de mama por meio da edição mediada por CRISPR de HER2 é aprimorado na presença de PARP inibidores que estão envolvidos no reparo do DNA e morte celular [69]. Esta abordagem combinatória representa uma opção terapêutica potencial para o câncer de mama.

Rastreios CRISPR letais sintéticos em todo o genoma foram realizados para determinar uma nova opção terapêutica para o tratamento do cancro da mama resistente ao endócrino. Os rastreios CRISPR identificaram um gene que está associado à resposta à terapia endócrina em muitos estudos clínicos [70].

Para este fim, eles tentaram combinar dois componentes terapêuticos da terapia endócrina comum e um inibidor do gene identificado pelas telas CRISPR para controlar a resistência endócrina tanto em linha celular quanto em modelos de xenoenxertos derivados de pacientes.

Degradação de proteínas no câncer de mama

Uma das formas importantes de aumentar a proliferação de células tumorais é o aumento da atividade de degradação de proteínas. Destas enzimas de degradação de proteínas, vem o proteassoma 26S, uma enzima multicatalítica que é responsável pela degradação de proteínas, incluindo a regulação do ciclo celular e proteínas relacionadas à apoptose [71, 72]. Em modelos de câncer, foi indicado que os inibidores de proteassoma têm propriedades anticâncer e de aumento de apoptose. Além disso, sensibiliza as células tumorais aos sinais pró-apoptóticos extrínsecos e intrínsecos. Portanto, o proteassoma se tornou um alvo para tratamentos antitumorais. Foi indicado que a proliferação do câncer de mama é controlada por um processo de fosforilação do proteassoma específico do local [24], e a interferência e a interrupção desse processo podem ser valiosas no controle da doença.

Usando CRISPR / Cas9, o nocaute da quinase 2 regulada por tirosina de especificidade dupla (DYRK2) (as enzimas que fosforilam os componentes do proteassoma) foi estabelecido para interromper a tumorigênese das células de carcinoma de mama humano dependentes de proteassoma em camundongos [73].

O câncer de mama ER-positivo pode ser tratado por meio da inibição da síntese de estrogênio usando inibidores de aromatase (AI) ou por meio de tamoxifeno e fulvestrant que competem com o estrogênio no ER& # x003b1. Mutações em ER& # x003b1 como ER& # x003b1Y537S e ER& # x003b1O D538G resulta em tornar o câncer de mama metastático avançado insensível a AI e tamoxifeno [74]. Para validar o efeito dessas mutações, ER positivo para câncer de mama& # x003b1 modelo foi criado usando CRISPR / Cas9 em que a versão de tipo selvagem de ER& # x003b1 foi substituído por ER& # x003b1Y537S ou ER& # x003b1D538G. Estas células mutantes são parcialmente resistentes ao antiestrogênio, isto é, ele se manifesta independente do estrogênio. A resistência antiestrogênica das células mutantes foi encontrada para estar associada com a suprarregulação da resposta da proteína que reduz o ER& # x003b1 degradação [75].

Potenciador de migração e invasão (MIEN1) estão envolvidos na progressão do câncer e na metástase do câncer de mama. Verificou-se que o aumento da expressão de MIEN1 pode aumentar a migração e metástase do tumor. Usando CRISPR / Cas9, uma deleção direcionada neste gene efetivamente levou a revogar sua expressão e, portanto, controlar a disseminação da doença. Essa abordagem nos permite entender profundamente a função MIEN1 atua na carcinogênese e progressão tumoral, que pode ser transformada no futuro como uma opção terapêutica para o câncer de mama [76].

Mutações em PTEN (fosfatase e homólogo de tensina) gene, são etapa fundamental no processo de carcinogênese. PTEN é um gene supressor de tumor, envolvido na regulação do ciclo celular e no controle da taxa de proliferação. Usando CRISPR / Cas9, células iniciadoras de carcinoma lobular de mama invasivo (ILC) foram direcionadas para interromper PTEN em camundongos, perda específica da glândula mamária de E-caderina. Esta abordagem pode ser usada para testes rápidos in vivo de genes supressores de tumor putativos subjacentes à ILC [77].

Imunoterapia mediada por CRISPR

Os subtipos moleculares de câncer de mama têm características diferentes com base nas quais as células cancerosas respondem aos estímulos intrínsecos (sistema imunológico) ou extrínsecos (ambiente) (Fig. & # X000a0 3). Uma abordagem única para combater as células do câncer de mama é usar macrófagos editados por CRISPR / Cas9 nos quais a proteína reguladora de sinal alfa (SIRP-& # x003b1) é eliminado. Os macrófagos editados não serão capazes de receber o sinal & # x0201cdo not eat me & # x0201d de CD47-SIRP& # x003b1 das células cancerosas levando a destruí-lo. Por outro lado, as células T podem ser projetadas para expressar um receptor de células T específico do câncer (TCR). Levando em consideração que os TCRs endógenos podem competir com um TCR endógeno projetado& # x003b2 foi eliminado nas células receptoras via CRISPR / Cas9. As células T editadas por CRISPR resultantes eram 1000 vezes mais sensíveis ao antígeno de câncer do que as células T transduzidas por TCR normais [78]. Enquanto isso, as células CAR T foram editadas por CRISPR / Cas9 para gerar células CAR T universais resistentes à inibição [79].


História e origem

Os humanos têm arquitetado a vida há milhares de anos. Desde os tempos antigos, a humanidade mudou o curso da evolução por meio de uma seleção artificial, cultivando as cicatrizes de plantas e animais obtidas por meio de mutações aleatórias que são mais úteis e significativas. Por meio da reprodução seletiva, fortalecemos características úteis em plantas e animais. Esse processo, entretanto, leva muito tempo. Tornamo-nos muito bons nisso, mas nunca entendemos totalmente como funcionava até descobrirmos o DNA. No século 20, a estrutura do DNA foi descoberta e muitas oportunidades de exploração foram descobertas. Na década de 1970, foram feitas tentativas para acelerar essas mutações, tratando culturas de plantas com vários fatores mutagênicos como radiação ou produtos químicos e examinando os úteis. Na década de 1970, cientistas inseriram fragmentos de DNA em bactérias, plantas e animais para modificá-los para pesquisa, medicina, agricultura e até mesmo para diversão. Isso marca o início da engenharia genética. Hoje, produzimos muitas substâncias por engenharia genética como fatores de coagulação que salvam vidas, hormônios como a insulina e o hormônio do crescimento, fatores de crescimento e outros. Todas as coisas que tínhamos que colher dos órgãos dos animais antes disso.

Durante sua evolução, as bactérias desenvolveram um conjunto de barreiras para se protegerem contra invasores, como fagos e ácidos nucléicos de plasmídeo. Existem diferentes sistemas de defesa procariótica e pelo menos dois deles visam diretamente o DNA de entrada: sistemas de modificação de restrição (RM) e CRISPR-Cas. Ambos os sistemas são compatíveis e atuam juntos para aumentar a resistência bacteriana aos fagos por clivagem de seus respectivos locais-alvo e para diminuir as contaminações por fagos.

Sequência específica de genes recorrentes em E. coli foi identificada, mostrando cinco sequências altamente homólogas de 29 nucleotídeos, arranjadas como repetições diretas com 32 nucleotídeos como espaçamento [1].

Haloferax Mediterranei é um organismo arqueobacteriano com extrema tolerância ao sal e a alta concentração de sal afeta a maneira como as enzimas de restrição cortam o genoma do micróbio. Nos fragmentos de DNA examinados, várias cópias de uma sequência quase perfeita, aproximadamente palíndrômica, repetida de 30 bases foram encontradas, separadas por espaçadores de aproximadamente 36 bases & mdasht que não se assemelhavam a nenhuma família de repetições conhecidas em micróbios [2].

O nome CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats foi proposto por Jansen, et al. [3]. Em 2005, verificou-se que as repetições na sequência eram genomas de bacteriófagos ou outra origem extracromossômica [4]. Em 2007, foi relatado que o CRISPR fornece resistência contra vírus em procariotos [5,6].

O sistema CRISPR-Cas é um "sistema imunológico" bacteriano contra bacteriófagos. É uma sequência do genoma bacteriano que consiste em regiões curtas de DNA palindrômico repetíveis de 30-40 pares de nucleotídeos de comprimento. Eles são separados por seções de DNA chamadas & quotspacers & quot. Essas regiões são diferentes e combinam perfeitamente com o DNA do bacteriófago que a bactéria já encontrou. Associadas à sequência CRISPR estão regiões dos genes DNA-Cas (sequências associadas a CRISPR) que codificam a informação da proteína CAS. Eles são principalmente helicases e nucleases. Por causa disso, o CRISPR é chamado de & ldquoimmune system of bactéria & rdquo [7,8]. Em 2009 Hale, et al. evidências publicadas de que o sistema CRISPR-Cas protege procariotos de vírus e outros invasores potenciais do genoma por meio de um sistema de silenciamento de RNA único que funciona por clivagem dependente de homologia de RNAs invasores [9]. Em 2010, Maraffini e Sontheimer definiram o mecanismo de auto / não auto-reconhecimento CRISPR por meio de pequenos RNAs CRISPR (crRNAs) que contêm um espaçador completo flanqueado por sequências repetidas parciais [10-12].

O CRISPR / Cas & ldquoime system & rdquo é notavelmente adaptado para clivar DNA invasor rapidamente e tem o potencial de gerar cepas microbianas mais seguras [13].


Como o CRISPR-Cas9 é usado na pesquisa do câncer?

Desde o seu início, a técnica CRISPR-Cas9 de edição do genoma tem sido usada em uma miríade de estudos básicos de pesquisa do câncer. Ao excluir, inativar ou modificar genes específicos em células cultivadas ou em modelos animais, os pesquisadores foram capazes de estudar o papel desses genes no desenvolvimento e progressão do câncer, fornecendo informações sobre como prevenir ou tratar certos tipos de câncer.

Em alguns casos, o CRISPR-Cas9 foi usado para estudar o papel de um gene específico de interesse, como em um estudo publicado no mês passado na revista AACR Câncer Pesquisar. Neste estudo, os pesquisadores usaram a técnica para entender como a inativação do gene BRG1, que é comumente mutado no câncer de pulmão de células não pequenas, contribui para a progressão do câncer. Eles utilizaram a edição CRISPR-Cas9 para excluir BRG1 em linhas de células de câncer de pulmão e descobriram que as células deficientes em BRG1 aumentaram o estresse de replicação e eram sensíveis à inibição farmacológica da proteína de checkpoint ATR, revelando um mecanismo de progressão do câncer e uma potencial oportunidade terapêutica para o tratamento do câncer de pulmão.

Uma aplicação adicional de CRISPR-Cas9 é em triagens genéticas, onde centenas de genes são deletados individualmente para identificar proteínas regulatórias importantes, alvos de drogas em potencial e / ou para testar respostas a drogas experimentais de uma maneira relativamente rápida. Esta abordagem foi exemplificada por outro estudo publicado no mês passado em Pesquisa sobre câncer, que utilizou uma triagem genética CRISPR-Cas9 para identificar potenciais alvos terapêuticos para câncer de pulmão. Ao deletar individualmente mais de 500 genes diferentes que interagem com ou modificam a cromatina, os pesquisadores determinaram que a deleção da nucleofosmina 1 da chaperona histona reduziu significativamente a progressão do tumor in vitro e in vivo, identificando assim um potencial alvo de droga.


Aplicações Biomédicas

Considere a fibrose cística, por exemplo. Cystic fibrosis is characterized by an excessive accumulation of mucus, notably in the respiratory tract. The problem ultimately stems from a genetic error. The CFTR gene, which encodes a protein used to transport ions across the cell membrane, is faulty. As such, chloride ions are not successfully transported, which leads to the formation of thick heavy mucus, chronic respiratory disability, and reduced life expectancy. CRISPR could potentially be used to correct this genetic mistake.

Scientists could create a CRISPR-Cas9 complex to target and cut the CFTR gene. This alone would not solve the problem, as the gene was already not functioning correctly. But if a piece of donor DNA containing the correct version of the CFTR gene were also provided, then this new correct version would be edited into the chromosome via HDR. In 2013, Hans Clevers used this exact approach to correct the cystic fibrosis mutation in human cells cultured in the laboratory (Schwank et al., 2013).

Although Clevers's experiment was groundbreaking, there is one obvious problem. Every cell in an adult cystic fibrosis patient possesses the faulty CFTR gene. As such, researchers would have to find a way to introduce the CRISPR repair mechanism into every adult cell, or at least into those of the respiratory tract. This would be extremely difficult to do. The ideal scenario would be to introduce CRISPR-Cas9 into the fertilized egg or early embryonic stage of someone with cystic fibrosis so that all future body cells of the adult organism would contain the corrected gene.

Many scientists, however, have expressed concern with performing such an experiment. It is one thing to treat the existing cells of an adult. It is quite another to genetically alter a human embryo, as this opens up additional ethical concerns. Indeed, CRISPR was opening a veritable Pandora's box of bioethical questions. In January 2015, Jennifer Doudna organized an international meeting of scientists and policymakers to discuss the pros and cons of the potential uses of CRISPR, including the editing of human embryos. The attendees agreed that editing human embryos crossed a bioethical line and began authoring a self-imposed ban on such a procedure. Little did they know that Chinese scientist Junjiu Huang had already crossed that line.

Huang had injected 86 embryos with CRISPR-Cas9 (Liang et al., 2015). His goal was to correct a gene associated with a blood disorder called beta thalassemia. Only four embryos were edited successfully, and many were found to have unintended (off-target) mutations. The experiment was so controversial and arguably unsuccessful that Huang's paper was rejected by both Ciência e Natureza, the world's premier scientific journals.

In 2016, Chinese scientist Lu You reported the first use of CRISPR to treat an adulto patient (Cyranoski, 2016). The patient had a form of lung cancer and, unfortunately, the patient's T-cells were unable to recognize and destroy the tumor. Lu removed the patient's T-cells and then used CRISPR to disable the PD-1 gene. This alteration would allow the T-cells to attack the cancer cells. The T-cells were then injected back into the patient with the hope that they would fight off the tumor. Lu has treated additional patients with the CRISPR-based therapy and the results appear promising. Similar trials are now under way in the United States.

The potential biomedical applications of CRISPR are far-reaching. Thousands of individuals die each year in need of an organ transplant (heart, lung, liver, kidney, etc.). Patients must wait until an appropriate donor is available, often the result of a tragic accident. Even then, the donated organ must be a very close genetic match to ensure that the organ is not rejected. Jun Wu, a research scientist now at the University of Texas Southwestern Medical Center, is pioneering a solution.

Wu's goal is to develop interspecies organ donation. As part of his research, he and colleagues at the Salk Institute used CRISPR to grow rat organs inside the body of a mouse (Wu et al., 2017). First, they used CRISPR to turn off the organ-producing genes inside a mouse blastocyst. This step alone demonstrates the power of CRISPR technology, as it required the simultaneous modification of multiple genes, a nearly impossible task with existing methods of gene editing. They then inserted rat stem cells into the mouse blastocyst in hopes that the rat cells would generate the missing organs. The experiment worked, resulting in a hybrid organism called a chimera (Figure 7A). Wu and his colleagues managed to produce a mouse with rat organs (heart, eyes, pancreas, etc.). These organs could theoretically be harvested from the chimeric mouse and donated to a normal rat without risk of rejection.

Creation of a chimera using CRISPR-edited blastocyst and stem cells (Wu et al., 2017). (UMA) CRISPR was used on a mouse blastocyst to knock-out the genes associated with organ development. The blastocyst was then injected with rat stem cells capable of producing organs. The procedure resulted in the formation of a mouse/rat chimera. (B) A procedure similar to that described in A was used to create a pig/human chimera.

Creation of a chimera using CRISPR-edited blastocyst and stem cells (Wu et al., 2017). (UMA) CRISPR was used on a mouse blastocyst to knock-out the genes associated with organ development. The blastocyst was then injected with rat stem cells capable of producing organs. The procedure resulted in the formation of a mouse/rat chimera. (B) A procedure similar to that described in A was used to create a pig/human chimera.

Wu would like to use this technology to produce human organs inside another species of animal. Obviously rats and mice are too small, but it turns out that pig organs are remarkably similar in size and structure to human organs. Using the same approach, Wu inserted human stem cells into a pig blastocyst and the experiment worked. Figure 7B is a picture of the first pig/human embryo – a chimera. The embryo was removed for study after 28 days (first trimester of pig pregnancy), which allowed enough time for sufficient cell growth without raising ethical concerns.

The potential applications of CRISPR are limitless. Table 1 provides a partial list of CRISPR applications along with a reference to jump-start a student's interest in the topic.

Various applications of CRISPR technology.

Application . Reference to Explore .
Biomedical
Diabetes https://www.healthline.com/diabetesmine/could-gene-editing-be-used-cure-diabetes#1
Câncer https://www.statnews.com/2019/05/02/crispr-targeting-cancer-seeking-go-ahead/
HIV https://www.sciencemag.org/news/2019/03/curing-hiv-just-got-more-complicated-can-crispr-help
Food biotechnology
Mushrooms https://www.foodsafetynews.com/2018/12/the-little-mushroom-that-could-with-a-little-help-from-its-friends/
Soybean oil https://www.the-scientist.com/news-opinion/gene-edited-soybean-oil-makes-restaurant-debut-65590
Gado https://www.wired.com/story/crispr-gene-editing-humane-livestock/
Basic research
Gene drives https://www.synthego.com/blog/gene-drive-crispr
Cellular barcoding https://www.nature.com/articles/d41586-018-05934-z
Gene targeting with deactivated Cas9 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4922510/
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Learning lessons from anti-CRISPR architecture

Anti-CRISPRs are a recent discovery utilized by phages to fight against CRISPR-Cas-acquired resistance in prokaryotes. A striking feature of anti-CRISPRs is that these proteins are diverse and lack sequence similarity. To probe the origin and evolution of these anti-CRISPRs, a comprehensive and careful analysis of anti-CRISPR proteins has been performed. Here we have reviewed the structural and functional similarities and differences between anti-CRISPRs. Especially, we propose that scientists should not be spectators of this bacteria–phage arms race. The human species lives through wars and suffers from diseases, the invasion of pathogenic bacteria and viruses, and natural disasters. We should make more effort to study this microbial evolutionary war and draw a lot of lessons from it. For example, through investigating the phage–bacteria interaction, we can better understand the molecular mechanism of the arms race between viruses and their hosts. To date, by utilizing the CRISPR-Cas adaptive immune system from bacteria, scientists have made great progress in developing effective gene editing tools, with CRISPR-Cas9 technologies now being the most commonly used and powerful genome engineering tools [71,72,73,74,75,76,77]. However, side effects resulting from alternative cleavage still occur [78,79,80,81,82]. The discovery of anti-CRISPRs provides a lamp, highlighting the way to regulate the genome editing activities of CRISPR-Cas9. By utilizing the anti-CRISPRs from phages, we hope to develop a braking system for gene editing, to make sure that therapies based on gene editing can be fully controlled.


CRISPR/Cas9 resources

Hundreds of online methods are available for CRISPR/Cas9 gene editing, construct designing with double stranded breaks, single stranded breaks, functional knockouts, plasmid with active gene expression, repress gene expression, tagging protein, finding target sequences and many others. A large number of resources have been developed which are being used for application in genome engineering, for identification of CRISPR target site and for selection of gRNA. Multiple online resources are available forcommercially available kits/ plasmids and CRISPR/Cas9 construction, as few are mentioned in Table 2.

Numerous vectors are used for Cas9 according to the desired gene modification to be performed. The desired modifications include single strand break (SSB), double strand break (DSB), activation of gene expression, repression of gene expression and tagging of proteins knockout genes, these tools working so that any user can design construct with selectable marker, and different gene to be inserted according to their own demands. Many of them are freely accesible, but some are paid as well, depicted in Table 3.

In addition, miscellaneous online resources are available for the designing of sgRNAs which provide information about OTs without limiting the PAM or number of mismatch bases, for finding potential off targets in any genome, identification and ranking all sgRNA targets sites according to off target quality, help in inquiry of guide sequences [32], and few of them are described in Table 4 with pros and corns.


CRISPR’s Potential and Dangers: Is CRISPR Worth the Risk?

The gene editing technology CRISPR has prompted both breathless predictions of medical breakthroughs and warnings of apocalypse. Yale Insights asked Dr. Greg Licholai, a biotech entrepreneur and a lecturer at Yale SOM, to explain CRISPR’s potential and dangers.

Recently, HBO’s John Oliver opened a Last Week Tonight segment with a series of video clips about gene editing—some of them news reports promising amazing breakthroughs, others movie scenes depicting genetic engineering gone terribly wrong.

“It seems gene editing is going to eliminate all disease,” he concluded. “Or kill every last one of us.”

For decades, advances in generic engineering have prompted both breathless predictions of a wondrous future and warnings of apocalypse. Both have gotten louder in the five years since the development of CRISPR, which allows for much more precise editing of genes than previously existing tools.

In 2017, for the first time, scientists used CRISPR to repair a genetic mutation—one that could cause a heart defect—in an embryo. Reporting the breakthrough, the New York Times said that “it raises the prospect that gene editing may one day protect babies from a variety of hereditary conditions.” But in the article’s third paragraph, the newspaper added that the successful experiment “is sure to renew ethical concerns that some might try to design babies with certain traits, like greater intelligence or athleticism.”

In the last few months, more immediate concerns have arisen about CRISPR. A series of studies have suggested that CRISPR may cause cells to lose their cancer-fighting ability, and that it may do more damage to genes than previously understood. “It is important that anyone thinking of using this technology for gene therapy proceeds with caution, and looks very carefully to check for possible harmful effects,” said researcher Allan Bradley in a release from the Wellcome Sanger Institute.

Do CRISPR’s benefits outweigh the risks? Yale Insights asked Dr. Gregory Licholai, a biotech entrepreneur who serves as a lecturer at Yale SOM and chief medical and information officer at PRA Health Sciences, to explain the technology’s potential and dangers.

What is CRISPR and how is it different from the methods that have been used to manipulate genetics before?

CRISPR is this fascinating, powerful technology. It’s got a very clunky name. It’s called Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats. Now what does that mean? The name actually refers to the way it interacts with DNA. It’s a way to manipulate DNA, to edit DNA, in a way that is much more powerful than previous methods, much simpler, much cheaper. And the important part is it’s exceptionally precise.

So as you probably know, our book of life is made of DNA. DNA itself is many millions of base-pairs, which is like a language. And within that language, there are certain regions which code for genes, and those genes are incredibly important because those genes go on to make up everything about us. There’s 40,000 proteins that become outputs of those genes and they are involved in our health, our wellbeing, and any defect in those genes becomes problematic and causes disease.

What was previously attempted with gene editing was to manipulate genetic information in blocks, basically in big pieces. It’s kind of like trying to edit a book by only being able to rip out a page at a time and transfer a page at a time, without really being able to control the actual words. The power of this technology: it literally comes down to the individual letters. So the precision is far better than anything that has happened before. The excitement in the scientific community is being able to go in and very precisely make changes in DNA of actual genes that you can actually turn off bad genes or you can potentially repair genes that have got mutations in them where the code is written incorrectly.

There had been previous gene-editing technologies, such as viral gene editing, gene replacement, and those have developed over several decades. One of the most fascinating things about CRISPR is how quickly everything is developed, so in less than 10 years since the initial descriptions and initial papers were written, this technology has just exploded. It’s been less than five years since the initial patents were written, and since then at least a half-dozen companies have been formed, all of them are racing forward to try to get a leg up on each other to try to proceed with using CRISPR for various applications.

What are some of the applications, in the somewhat reasonable, predictable future?

There are three main applications for CRISPR. One is in manipulating genes to turn them on or off within people. Another is to create medications that can be infused, or in some cases, self-therapy—taking blood and certain cells out of a body, manipulating them with CRISPR, and then putting them back in. The third, which sometimes is overlooked, is actually in farming. Both farming with animals as well as farming with crops. And in fact, the application of CRISPR to foods has already been done. There are companies that have already been using CRISPR to create enhanced foods to resist bacteria or viruses. To create even better-tasting foods. And that’s already being done.

Similarly, the application of CRISPR to animals has already been done. They actually call them CRISPR mice, and they are already being used in the research community. The ability to apply it to larger animals such as food animals is in the very near future.

In terms of human health, we can divide that into two different categories. One is taking cells out of the body, manipulating them in the laboratory—either removing a defective gene or adding and enhancing an ability to do something by turning on a gene or fixing a gene—and then putting those cells back in the body. That’s one category. The other category would be actually injecting something into the body which can edit people’s genes so that within their own tissues those genes can either be turned on or off. And all of these have got some pretty profound complications and risks.

Can you give an example of a disease that could be treated?

There are over 7,000 monogenetic diseases that we can trace back to a single gene that has a defect. Often those genes have multiple mutations. But at least a single gene has been identified. The most promising application of CRISPR would be to modify those monogenetic diseases. And those monogenetic diseases, they broadly fall into two categories, curiously named toxic gain of function and toxic loss of function.

Toxic loss of function is kind of intuitive. That means the gene has got a defect in it the person loses the function of that protein and that causes the disease. So a well-known, well-studied example would be sickle-cell anemia. A single base-pair mutation actually causes a change in the structure of hemoglobin that then creates this unique sickle-cell shape for red blood cells.

An example of toxic gain of function is disease called transthyretin in which a mutation causes a clumping up of different proteins. And that leads to a disease called amyloidosis, where these proteins, which normally don’t stick together, because of this kink in them due to the mutation, they become very sticky. They form aggregates and those aggregates can build up in various cells in the body. Sometimes the brain, sometimes the heart.

CRISPR could potentially be useful in either one of those, and in fact there are companies that are looking at those diseases, as well as a number of others. Other monogenetic diseases would be cystic fibrosis, beta thalassemia, glycogen storage disease, Behçet’s disease, Fabry disease. Some of these are quite rare, like Fabry disease, but some are more common, like cystic fibrosis, which is the most common genetic disease in Caucasians.

So genetic diseases is one category. Another category is oncology. It’s been well known now for some years that our own immune system has the ability to fight cancer cells and essentially dissolve micro-tumors. But cancer is a clever entity—it evades the body’s internal immune system. So what that means is that the cancer becomes invisible to our immune cells, and that invisibility is due to certain proteins that are created as checkpoints to interfere with the immune system attacking ourselves. Cancers, essentially, mimic our own cells by taking advantage of these checkpoints.

So one of the applications of CRISPR would be to remove immune cells from the body, apply the CRISPR technology, and then turn off these checkpoints and put those immune cells back in the body with the hope that then those immune cells would clear the tumor away.

What are the risks of this? Are the risks to the patient? Or to all of us?

One of the biggest risks of CRISPR is what’s called gene drive, or genetic drive. What that means is that because you’re actually manipulating genes and those genes get incorporated into the genome, into the encyclopedia, basically, that sits within cells, potentially those genes can then be transferred on to other organisms. And once they’re transferred on to other organisms, once they become part of the cycle, then those genes are in the environment.

That’s probably the biggest fear of CRISPR. Humans manipulating the genetic code, and those manipulations get passed on generation to generation to generation. We think we know what we’re doing, we think we’re measuring exactly what changes we’re doing to the genes, but there’s always the possibility that either we miss something or our technology can’t pick up on other changes that have been made that haven’t been directed by us. And the fear then is that those changes lead to antibiotic resistance or other mutations that go out into the population and would be very difficult to control. Basically creating incurable diseases or other potential mutations that we wouldn’t really have control over.

Is there consensus on how to proceed?

There’s been discussion in the scientific community in the United States and globally about how to proceed with CRISPR. And particularly some very high-placed scientists, in the United States, for example, the former director of the National Institute of Health, have called for a self-imposed ethical moratorium on CRISPR until more is known. Not on all types of CRISPR research, but for certain types of CRISPR research. Particularly on these germline mutations that could potentially be passed on through generations. Some of the inventors of the patent-holders of CRISPR technologies who are now the inventors of the various companies in biotechnology, they’ve also imposed their own moratoria on working in germ lines until more is understood. So there are parts of the scientific community that are very concerned and are trying to be very thoughtful about how to proceed and how to proceed safely.

In the United States, there have been some regulations against moving forward in areas that aren’t safely understood. That doesn’t exist in other parts of the world, in particular in China. So there’s been several examples now of where China has leaped ahead of what’s going on in Europe or the United States but, the concern is, without the kind of regulatory and ethical safeguards that are in place in other countries.

You mentioned that there’s, in the U.S. at least, there’s a moratorium on germline mutations. Do the kinds of treatments that you’ve talked about before, do those require the germline modification, or can they be done within the stricture of that moratorium?

No, the treatment of most of those diseases, monogenetic diseases—things like cystic fibrosis, sickle-cell, beta thalassemia—those are not germline mutations. So theoretically, it would be safe to be able to treat those patients without the theoretical concern of affecting germ lines and affecting gene drive. The same thing with oncology. Theoretically you’re just taking cells out. You’re only treating immune cells and they’re not going replicate. On the other hand, as soon as people start talking about stem cells and then manipulating stem cells and then reusing those, then those stem cells can potentially affect other cells that replicate. The risk is low, but there’s definitely a risk there.

One of the other places that this is being actively worked on is, again, in animals. The idea would be to introduce mutations into, say, malaria-bearing mosquitoes, and let them in the wild and eradicate mosquitoes. Or eradicate certain types of invasive plants by introducing some kind of genetic manipulation that gets passed on and, again, you take out that one particular species. Again, it raises concerns. We think we know what we’re affecting if we manipulate one gene for that particular species. We think we know what we’re affecting if we just affect one particular species in an ecosystem. The truth is we probably don’t, and there’s always some surprises.

You mentioned that Chinese researchers are operating in different structure. Can you expand on that, on what regulations they have and what that means in terms of their competition with companies in the U.S.?

One of the dramatic examples happened in 2016. There had been a self-imposed moratorium in the United States and Europe to work on germ cells, germ lines. And that would include human embryos. Now, at the same time, reports came out of China that researchers had begun working on human embryos. Initially in 2015 and ’16, the reports were that the experiments were negative, and at least the Chinese researchers had claimed that they were working with nonviable human embryos anyway. In the short time since then, in the year and a half since then, those experiments have been repeated, apparently with scientific success, whatever that means. But without the kind of self-imposed regulation or even organizationally imposed regulation that we would have by the NIH or the scientific community in the United States and Europe.

Another example is that researchers in China have actually proceeded to human clinical trials using CRISPR much faster than has been possible in the United States. Normally, the clinical trial process to test any new therapy requires several very well studied stages. The first stage is to test in animals to make sure that there’s complete safety. Then it goes into very limited testing in human beings, just for safety, and then proceeds from there. Apparently in China, they took the animal data and they went right into therapeutic trials in human beings. And the most recent reports that are that somewhere between 80 and 100 people are already being tried, or already being tested using CRISPR.

We know that in China, they’re using CRISPR for cancer therapy. That’s the example where cells are taken out of the body, their immune cells are manipulated with CRISPR and then they’re re-infused. It’s too early to tell if it’s successful or not. But there is a lot of concern that the regulatory authorities in China have been extremely permissive with allowing these technologies to move forward. And that has a lot of profound implications.

How fast is this technology changing? Given that it’s moved as far as it has in 10 years, where do you expect it to move in another 5 or 10 years?

It’s changing pretty fast. Just in the last few months, there’s new developments in the field in CRISPR. Some is around competition, with new companies being formed. In fact, one of the original developers of CRISPR science that comes out of the Broad Institute at Harvard/MIT just set up a new company. Another scientific development is that there’s now scientific evidence that perhaps in some people, they have naturally occurring immunity, if you will, to CRISPR. They have naturally occurring substances that actually will turn off any kind of CRISPR that’s put into them.

All of these things are brand new, and they’re all being sorted out by scientific community, by these biotech companies. So it is changing very quickly. And the other thing that’s changing is the effect of this international competition. I don’t think anybody could have predicted that other countries, and China in particular, would be so quick to embrace this technology and really leap forward ahead of everybody else.

Are there any other safety concerns with CRISPR?

As with any new technology, there could be scientific bumps in the road. The safety concern is that in this field is moving so quickly and some researchers want to get into human clinical trials right away, even before the CRISPR technology paradigm has been fully validated. There are some recent reports in the scientific literature that this approach is not as precise as advertised. In other words, we think we are editing one letter of the book of life, but it actually entire pages might be getting altered in unintended areas. The long-term danger is unintended changes to the genome of an organism that go on and get carried through to the next generation. The safety risk is unknown changes in genes that get transferred to the population that could have no consequence or could be harmful.

How can we ensure that the field progresses in a safe way?

The drug development process is tightly regulated across the world. In the United States the FDA closely monitors safety of any investigational drug, and all CRISPR drugs intended to go into people would have to meet the same rigorous testing standards. The same situation exists for Europe and the rest of the world where regulatory authorities largely work in harmony. However, there are exceptions, as with some of the human embryo testing that has been reported in China. We should make sure that the level of international scientific regulation and cooperation continues so the scientific developments can continue but also ensure safety.


Assista o vídeo: Gene Editing Inside the Body Using CRISPR (Agosto 2022).