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Resoluções laterais, axionais e temporais para imagens in vivo

Resoluções laterais, axionais e temporais para imagens in vivo



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Quais são as resoluções espaciais (lateral e axional) e temporais que se espera obter com as seguintes técnicas de imagem óptica?

  • Imagem Ótica de Bioluminiscência (BLI)
  • Imagem de fluorescência óptica (FLI)
  • Microscopia multifotônica (por exemplo, microscopia de 2 fótons)

Eles são melhores do que os outros no fornecimento de resoluções mais altas?


A resolução lateral e axial depende da abertura numérica de sua objetiva (lateral = lambda / 2NA; axial = 2lambda / NA ^ 2). Você pode melhorar a resolução axial com FLI usando uma abordagem confocal ou com microscopia de 2 fótons (2PM). No 2PM você precisa da absorção de dois fótons infravermelhos para obter a emissão. A probabilidade de absorção de infravermelho 2 depende quadraticamente da intensidade de excitação. Portanto, a fluorescência é restrita onde o feixe de iluminação é focalizado, o que proporciona um melhor seccionamento. Uma vantagem do 2PM é a maior profundidade de penetração e a redução da fototoxicidade. Na verdade, você pode usar 2 fótons infravermelhos para excitar o fluoróforo que exigia excitação visível.

A resolução temporal depende da área que você deseja medir e do tempo de integração.

A resolução é limitada pela difração. No melhor caso, com as 3 técnicas de imagem que você mencionou, você pode obter ~ 200-300 nm em resolução lateral e 500 - 800 nm em resolução axial Uma resolução mais alta pode ser alcançada usando técnicas de super resolução. Eles são separados em dois grupos. O primeiro explora as propriedades fotofísicas do fluoróforo para excitá-lo e desexcitá-lo. Isso permite resolver áreas de sub-difração. É o caso da microscopia STED (depleção de emissão estimulada) ou SSIM (microscopia de iliminação estruturada saturada). O segundo grupo usa a flutuação da emissão do fluoróforo para localizá-lo melhor. Inclui técnicas como STORM (Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica, PALM (Microscopia de Localização Foto-ativada) e SOFI (imagem de flutuação óptica de super-resolução).


Resoluções laterais, axionais e temporais para imagens in vivo - Biologia

Na Vivo imagem do transporte axonal no nervo ciático de camundongos anestesiados vivos.

Os endossomos de sinalização são monitorados usando sondas fluorescentes e microscopia confocal.

O transporte axonal em neurônios motores e sensoriais pode ser diferenciado.

Este método pode ser facilmente adaptado para estudar o transporte axonal de outras cargas.

Uso potencial deste na Vivo abordagem de imagem no rastreamento de drogas.


Introdução

Neste protocolo, descrevemos uma técnica de imagem para estudar axônios motores ao longo do tempo em um nervo agudo & # x02013 explante muscular do músculo triangular esterni (o & # x02018 explante triangular esternal & # x02019). O músculo triangular do esterno se origina na parte interna do esterno e se insere na caixa torácica interna. É inervado por ramos dos nervos intercostais superiores, que se estendem superficialmente através do músculo e formam uma faixa de placa terminal que normalmente está localizada ao longo do eixo craniocaudal paralelo à borda do esterno (fig. 1) 1. O explante triangularis sterni contém, portanto, axônios motores distais, suas arborizações intramusculares, sinapses neuromusculares e as fibras musculares inervadas. Uma variante do explante triangularis sterni foi descrita pela primeira vez por McArdle et al. 1 e foi usado anteriormente para estudar a fisiologia e fisiopatologia neuromuscular 2 & # x02013 5. Descrevemos uma preparação simplificada aqui, com base nos métodos publicados por nosso laboratório 6, 7. Este músculo oferece uma série de vantagens para experimentos de imagem. Primeiro, é um músculo particularmente fino que consiste apenas em algumas (& # x0003c5) camadas de fibras musculares. Como consequência, os axônios motores inervadores e seus ramos correm superficialmente e podem ser acompanhados ao longo de todo o seu curso até seus terminais pré-sinápticos nas placas terminais neuromusculares. Em segundo lugar, o triangular esterni basicamente não tem inervação sensorial, portanto, todos os neuritos que se ramificam para o músculo são axônios motores 8. Terceiro, como o músculo se origina e se insere nos componentes ósseos da caixa torácica, ele pode ser facilmente dissecado sem danificar o músculo. Isso permite que o músculo seja isolado em idades muito jovens (já no dia embrionário 13, quando as junções neuromusculares se formam pela primeira vez). Quarto, o explante triangularis sterni contém todas as arborizações e todas as placas terminais dos axônios motores intercostais que entram no músculo. Isso permite a reconstrução de unidades motoras, por exemplo, usando linhas de camundongos transgênicos, que expressam proteínas fluorescentes em um subconjunto de axônios motores 9 ou que mostram expressão combinatória de proteínas fluorescentes espectralmente diferentes em neurônios individuais 10. Por fim, o músculo é multissegmentar e, como consequência, é inervado por axônios derivados de diferentes nervos intercostais, que se anastomosam apenas quando atingem a faixa da placa terminal. Esse padrão anatômico permite experimentos de estimulação seletiva ou desnervação parcial, nos quais algumas entradas são estimuladas ou seccionadas e a resposta compensatória dos axônios restantes é analisada.

Padrão de inervação do músculo triangular esterno. (a & # x02013c) Músculo triangular esterni e sua inervação em um thy1& # x02013 Mouse YFP16 com axônios 18 marcados com YFP. (uma) Marcação combinada de axônios (verde), sinapses (vermelho) e músculo (escala de cinza). (b) Rotulagem axonal. (c) Mancha muscular. A linha violeta em b e c delineia o músculo triangular do esterno entre a superfície interna do esterno e a caixa torácica proximal. (d) Reconstrução confocal da área encaixada em uma, mostrando a inervação multissegmentar do músculo triangular do esterno. (e) Reconstrução confocal de alta potência de uma parte da banda da placa terminal (área em caixa em d). (f) Imagem confocal mostrando duas junções neuromusculares individuais encaixotadas em e. Acúmulos de mitocôndrias podem ser encontrados em terminais pré-sinápticos. YFP (citoplasma axonal), BTX verde (receptores de acetilcolina), faloidina vermelha (músculo), escala de cinza. Barras de escala, 500 e # x003bcm pol. d e 10 & # x003bcm em f.

Claramente, existem também certas limitações deste sistema de explante, que precisam ser consideradas (para detalhes, consulte a tabela RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS). Uma limitação óbvia é que, durante a preparação do explante, os nervos intercostais, que inervam o músculo triangular do esterno, são separados de seus corpos celulares neuronais. Como resultado, os axônios axotomizados começam a sofrer degeneração Walleriana entre 12 e # x0201324 h após a preparação. Isso limita a vida útil do explante e, portanto, o período de tempo durante o qual as alterações axonais podem ser visualizadas. Nossos estudos indicam, no entanto, que a morfologia axonal e até mesmo processos intracelulares como a taxa de mitocôndrias transportadas (ou seja, o número de mitocôndrias que cruzam uma marca fiduciária) permanecem inalterados em comparação com o na Vivo situação pelo menos nas primeiras 2 horas após a preparação 6, 7. Outros estudos utilizando músculos derivados de camundongos mutantes (camundongos WLD S), nos quais a degeneração Walleriana é retardada, indicam uma maneira pela qual o tempo de vida da preparação pode ser estendido em alguns paradigmas experimentais que não são impactados pela mutação WLD S 11. Obviamente, podem ocorrer alterações relacionadas à ausência de atividade neural (como a internalização de receptores de acetilcolina, ver Fig. 2f), mas a introdução de estimulação externa é fácil. Embora o sistema triangular possa fornecer informações valiosas sobre a fisiologia ou patologia axonal aguda, ele não pode substituir na Vivo abordagens para o estudo de alterações axonais crônicas que requerem monitoramento repetitivo ao longo de vários dias, como na Vivo imagem do músculo esternomastóideo 12 & # x02013 14. Para na Vivo por imagem, a localização anatômica do músculo triangular esternal na parte interna do tórax é proibitiva, impedindo um efeito direto na Vivo& # x02013ex vivo comparação usando este músculo.

Imagens de alta resolução de explantes vivos de triangularis esterni preparados conforme descrito neste protocolo. (uma) Desenvolvimento de junção neuromuscular com duas entradas axonais (setas) durante a eliminação da sinapse no dia pós-natal (P) 9. BTX marcada fluorescentemente (vermelho) destaca os receptores pós-sinápticos de acetilcolina, os axônios são transgenicamente marcados com YFP (verde thy1-YFP-16 mouse), e o músculo é revelado por iluminação oblíqua (escala de cinza). #, mionúcleo *, axônio motor que sai do plano focal para inervar uma sinapse mais profunda à esquerda. (b) Axônios superficiais no nervo intercostal. As bainhas de mielina são visualizadas por iluminação oblíqua (escala de cinza), enquanto as mitocôndrias axonais são transgenicamente marcadas com CFP (azul) em um thy1-mitoCFP-S mouse 7. Setas, Schmidt & # x02013 incisuras de Lantermann *, nó de Ranvier. (c) Desenvolvimento de junção neuromuscular (c1 fundir c3, BTX, vermelho) inervado por três axônios (setas) (c2, CFP, verde) revestido por células de Schwann (c4, GFP, ciano) em um P10 thy1-CFP5 e # x000d7 s100-GFP Kosmos duplo camundongo transgênico 21. *, Núcleo da célula de Schwann. A área encaixotada em c3 é mostrado em maior ampliação em f. (d & # x02013f) Séries de lapso de tempo da dinâmica axonal celular e subcelular em explantes. (d) Filopódios axonais marcados transgenicamente (YFP, verde) que se estendem (pontas de seta azuis) e retraem (asteriscos laranja) de uma junção neuromuscular em desenvolvimento (P11) fotografada por aproximadamente 20 min. (e) Mitocôndria transgenicamente marcada (CFP, azul) que é transportada dentro de um axônio (taxa de quadros, 1 & # x020132 Hz). (f) Receptores de acetilcolina pós-sinápticos (BTX, vermelho) que são endocitados pela fibra muscular durante um período de & # x0223c1 h (observe que essa renovação rápida provavelmente resulta da ausência de neurotransmissão neste explante não estimulado). Barras de escala, 10 e # x003bcm pol. uma e b 5 e # x003bcm pol. c 2,5 e # x003bcm pol. d 0,5 & # x003bcm pol. e.

A principal aplicação do explante triangularis sterni é, portanto, imagens de curto prazo e alta resolução dos axônios motores periféricos, suas sinapses e células gliais circundantes. Os axônios motores são ideais para estudos de imagem porque seu grande diâmetro permite a visualização de processos intra-axonais. Além disso, as junções neuromusculares entre os axônios motores e as fibras musculares estão entre as maiores e mais facilmente acessíveis sinapses no sistema nervoso dos mamíferos 15. Finalmente, excelentes sondas fluorescentes e animais transgênicos que destacam os componentes do sistema neuromuscular estão disponíveis 16, que podem ser facilmente usados ​​em combinação com este sistema de explante (ver Desenho experimental). Muitos aspectos da fisiologia e patologia do axônio motor que foram previamente tratados em tecido fixo podem agora ser analisados ​​de uma forma resolvida no tempo. Um exemplo é fornecido por nosso estudo recente de transporte axonal, que fez uso de novos camundongos transgênicos com mitocôndrias neuronais marcadas 7. Neste estudo, mostramos que as taxas de transporte axonal nos explantes agudos estavam em uma faixa semelhante às medidas nos nervos ciáticos de camundongos vivos. No entanto, 2 h após a excisão de músculos e nervos, as taxas de transporte axonal começaram a diminuir, possivelmente porque nenhuma nova mitocôndria foi fornecida pelos corpos celulares desconectados.

Outra aplicação do explante triangularis sterni é o estudo do desenvolvimento neuromuscular. A junção neuromuscular tem sido usada há muito tempo como modelo para estudar a eliminação de sinapses no sistema nervoso em desenvolvimento 17. Os principais aspectos da eliminação de sinapses podem ser seguidos ex vivo em explantes triangularis sterni derivados de camundongos pós-natais iniciais. Em um estudo, usamos uma combinação de na Vivo microscopia, ex vivo imagem e microscopia eletrônica serial para entender como os axônios são perdidos durante a eliminação da sinapse 6. A imagem de lapso de tempo revelou que os axônios se retraem das sinapses, liberando parte de seu material como pequenos & # x02018axossomos & # x02019. As características dinâmicas da liberação de axossomos tornaram-se aparentes apenas porque fomos capazes de retratar axônios em retrocesso com alta resolução temporal e espacial no explante.

Finalmente, estudos de imagem usando o explante triangularis sterni podem ajudar a explorar a patogênese de doenças neurológicas importantes. Os axônios motores são afetados em uma série de doenças humanas, que incluem condições degenerativas, como esclerose lateral amiotrófica ou polineuropatias hereditárias, mas também lesões traumáticas e doenças inflamatórias do nervo periférico (como a síndrome de Guillian-Barr & # x000e9). Em muitos casos, neurônios motores isolados em cultura de células fornecem um modelo insatisfatório, já que as interações dos axônios motores com as células gliais circundantes e células imunes invasoras são aspectos cruciais do processo da doença. No entanto, tais interações podem ser seguidas em explantes musculares de nervo agudo, que preservam o meio local de nervo e músculo. Além dos axônios motores, as junções neuromusculares, bem como as fibras musculares pós-sinápticas são alvo de doenças, como miastenia gravis ou as várias miopatias inflamatórias, metabólicas e degenerativas, que também podem ser estudadas usando o explante triangularis esterni, dependendo da disponibilidade de camundongo modelos.

Em resumo, nós fornecemos um protocolo que permite imagens de axônios motores em um explante vivo do músculo triangular esterni. Devido às vantagens particulares desta preparação, uma série de aspectos da morfologia e fisiologia axonal podem ser estudados com alta resolução temporal e espacial. Estudos iniciais já ilustram como essa abordagem pode fornecer novos insights sobre o comportamento dinâmico dos axônios motores no desenvolvimento, saúde e doença 6, 7.

Design experimental

Sistema de imagem

Para obter imagens dos axônios motores e suas sinapses no explante triangularis sterni, usamos um sistema de microscopia de epifluorescência de campo amplo. O músculo triangular do esterno é um músculo plano e superficial com a maioria dos axônios correndo paralelamente à superfície e muitas sinapses localizadas diretamente abaixo da pleura parietal que cobre a preparação (Fig. 1). Essas características anatômicas permitem a utilização da microscopia de epifluorescência de campo amplo (fig. 3) sem a necessidade de recorrer a técnicas mais caras que permitem a penetração em tecidos profundos, como a microscopia de dois fótons. No entanto, se o projeto experimental requer imagens mais sofisticadas, um sistema de microscopia confocal ou de dois fótons pode ser usado.

A preparação do explante triangularis sterni. (uma) Duas imagens à esquerda mostram o tórax intacto que é dissecado após matar o mouse (primeira imagem da esquerda, segunda imagem de vista frontal, vista lateral do lado direito após rotação de 90 & # x000b0). A terceira imagem mostra uma visão interna da parede do tórax após a remoção das vísceras torácicas (pequenas setas azuis, remanescente do diafragma *, cartilagem xifóide). A linha tracejada na segunda imagem mostra o corte paravertebral (um corte simétrico é feito no lado esquerdo). Na quarta imagem, a parede do tórax é mostrada dobrada e aberta e presa em um prato. As posições adequadas para pinos minuten são indicadas por círculos azuis. A seta azul aponta para a parte óssea das pontas de seta do esterno indicam os vasos mamários internos direitos. (b) Configuração de microscopia de epifluorescência usada para imagens de explantes triangularis esterni. (c) Visão de close-up do estágio do microscópio com câmara de imagem (caixa em b).

Linhagens de camundongos transgênicos

A imagem dos axônios motores e suas sinapses é baseada no uso de camundongos transgênicos, nos quais todos ou um subconjunto dos neurônios motores são marcados com proteínas fluorescentes 18. Muitas dessas linhas de camundongos estão agora disponíveis que diferem nas densidades de marcação (isto é, a porcentagem de axônios marcados), características espectrais das proteínas fluorescentes expressas ou os locais para os quais essas proteínas são direcionadas (Fig. 2) 7, 10, 19. Uma visão geral das linhas de camundongos transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em diferentes tipos de células neurais pode ser encontrada em nosso recente artigo de revisão 20. A marcação transgênica de outras estruturas do sistema nervoso periférico (SNP), como células de Schwann (Fig. 2) 10, 21, células musculares 22 ou macrófagos 23, também foi relatada e pode ser facilmente combinada com a marcação de corante vital (como marcados com fluorescência & # x003b1-bungarotoxina (BTX), Invitrogen Fig. 2).

Análise de imagem

Os parâmetros analisados ​​dependem do experimento. Em muitos de nossos experimentos, o conjunto principal de dados é um filme de uma série de imagens gravadas. Duas condições são críticas para a obtenção de bons filmes: estabilidade de foco (ausência de z-deslocamento) e ausência de deriva (x & # x02013y deslocamento). Considerando que o primeiro só pode ser assegurado pelo ajuste cuidadoso das linhas de superfusão e sucção e focagem meticulosa durante o experimento, o último pode, em certo grau, ser corrigido pelo pós-processamento usando x & # x02013y software de alinhamento (por exemplo, Autoquant, Molecular Devices ou o software de código aberto ImageJ com o plug-in & # x02018stackreg & # x02019, http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). O resultado x & # x02013y séries de imagens alinhadas podem ser cortadas e armazenadas como um formato tiff empilhado ou, alternativamente, visualizadas usando um formato de filme padrão, como .avi ou .mov (o software Metamorph oferece esses recursos, mas recursos cada vez mais semelhantes podem ser encontrados no ImageJ de código aberto, especialmente ao adicionar alguns dos muitos plug-ins http://rsb.info.nih.gov/ij/).


Resultados

Imagem de RM in vivo da medula espinhal intacta

A imagem de ressonância magnética gradiente-eco com disparo de ECG e bloqueio respiratório produziu imagens de alta resolução da medula espinhal de rato torácico intacta in vivo sem artefatos de movimento significativos (Fig. 1). A típica matéria cinzenta em forma de borboleta pode ser claramente distinguida dos tratos axonais de matéria branca circundantes, menos intensos. O LCR ao redor da medula espinhal apareceu como uma pequena borda hiperintensa adjacente à medula espinhal devido aos seus tempos de relaxamento T2 e T2 * mais longos. Com a sequência aplicada, os corpos vertebrais pareceram completamente escuros, enquanto os discos vertebrais ficaram brilhantes.

Imagem de RM in vivo da medula espinhal intacta em 17.6T. Painéis UMA e B mostram varreduras sagitais através da medula espinhal torácica (espessura do corte, 239 μm FOV, 40 × 30 mm de resolução no plano, 156 × 117 μm TR, ∼200 milissegundos, dependendo da frequência cardíaca TE, 4,4 milissegundos). Painéis C e D exibir varreduras axiais através da medula espinhal torácica (espessura de corte, 500 μm FOV, 17,7 × 35,5 mm de resolução no plano, 69 × 69 μm TR e TE, como acima). Barra de escala, 2 mm. UMA, Uma varredura sagital mais lateral descreve principalmente a substância branca (menor intensidade de sinal) com alguma estrutura mais hiperintensa orientada longitudinalmente, refletindo a substância cinzenta do corno ventral lateral. O LCR parece hiperintenso, os corpos vertebrais são hipointensos. B, A maior parte do parênquima da medula espinhal exibido aqui representa a substância cinzenta (hiperintensa) circundada por tratos de substância branca (hipointensa) em uma varredura sagital paramediana através da medula espinhal. C, Uma varredura axial através da medula espinhal torácica permite a distinção clara entre a aparência típica de borboleta da substância cinzenta da medula espinhal e a substância branca hipointensa circundante. Também digno de nota, as raízes espinhais podem ser claramente identificadas neste nível. D, Uma varredura subsequente mais caudalmente mostra a medula espinhal em corte transversal longe da zona de entrada da raiz espinhal.

Ex Vivo MR Imaging de medula espinhal contundida

Imagens spin-eco da medula espinhal excisada 4 semanas após uma lesão de contusão torácica revelaram um padrão de intensidade de sinal longe do epicentro da lesão em cortes axiais (Fig. 2), que era quase idêntico às imagens de gradiente-eco in vivo em animais não lesionados (Fig. 1C, -D) A substância cinzenta era hiperintensa em comparação com a substância branca. O canal central pôde ser claramente identificado. A diferenciação de substância cinzenta / branca desapareceu completamente no centro de contusão (Fig. 2G, -H) A intensidade de sinal hiperintensa homogênea, que era pronunciada no centro da medula espinhal e diminuída em direção à superfície da medula em todas as direções, só foi interrompida por áreas de perda de intensidade de sinal no centro da medula, que estavam confinadas principalmente à substância cinzenta (Figura 2G) Hemorragia induzida por trauma e depósitos consecutivos de hemossiderina são os prováveis ​​correlatos patológicos para essa área livre de intensidade de sinal, que foi descrita como ocorrendo com frequência na substância cinzenta da medula espinhal após a lesão. 17 Hipointensidades dentro do centro da lesão (em particular em imagens de RM sagitais) - não tão pronunciadas quanto as alterações associadas à hemossiderina descritas - corresponderam à imunorreatividade para o colágeno tipo III, mas não GFAP, em cortes histológicos sagitais (Fig. 3B, -J, -N), representando, assim, componentes da cicatriz fibrosa em vez da cicatriz gliótica. O diâmetro total da corda foi reduzido. Em particular, as colunas dorsolaterais foram simetricamente diminuídas em volume (Fig. 2G, -H), refletindo atrofia irreversível substancial logo 4 semanas após a lesão. Em algumas seções coradas com Nissl (Fig 3G) todos os tipos de tecido organizado estavam ausentes, o que sugere uma cavidade cheia de fluido em desenvolvimento; no entanto, as imagens de RM correspondentes não exibiram uma hiperintensidade homogênea (Fig. 3C), que seria o equivalente em RM de um defeito de lesão cística. Em vez disso, apenas uma pequena faixa hiperintensa - o correlato do verdadeiro defeito da lesão cística - circundou um núcleo hipointenso. Assim, é provável que essa área hipointensa contenha material não organizado (células inflamatórias e restos celulares misturados a depósitos de hemossiderina), que se perde regularmente durante o processo de análise histológica.

Imagens axiais de RM ex vivo de medula espinhal de rato contundida. Cortes axiais de imagens de RM ex vivo mostram a visualização de grau de microscopia de mudanças morfológicas na medula espinhal de rato ferido 4 semanas após a lesão de contusão no nível torácico médio (seção de spin-eco de multissecção 2D, 300 μm FOV, resolução no plano de 6 × 6 mm, 23 × 23 μm TE, 7,5 milissegundos TR, 2 segundos). Barra de escala, 1 mm. Painéis A – L mostram seções consecutivas na direção rostral-caudal. Em ratos, as colunas dorsais contêm não apenas projeções proprioceptivas ascendentes, que estão localizadas na metade dorsal da coluna dorsal. O trato corticoespinhal cruzado projeta-se na metade ventral das colunas dorsais, ao contrário dos humanos, onde a maioria dos axônios corticospinais estão localizados nas colunas laterais. UMAF, Em cortes rostrais ao local da contusão, a morfologia da medula espinhal ainda é mantida com uma clara diferenciação de substância branca e cinzenta. Observe a hipointensidade na parte dorsal das colunas dorsais (pontas de flecha) idênticas às projeções proprioceptivas ascendentes. Geu, No centro da lesão, o diâmetro da medula espinhal é reduzido e a substância cinzenta e branca não podem mais ser separadas. Hipointensidades localizadas no centro (G) refletem depósitos de hemossiderina. Jeu, Caudal à lesão, o contraste da substância branco-acinzentada é preservado. Tanto em varreduras rostral quanto caudal (BD e Jeu) sinais hiperintensos são encontrados nas colunas dorsais consistentes com defeitos císticos (ver também a Fig. 3). As hipointensidades nas varreduras axiais rostrais à lesão correspondem às projeções sensoriais ascendentes, enquanto nas varreduras caudais representam a área do trato corticoespinhal (JL, pontas de flecha).

Varreduras sagitais de imagem por RM ex vivo de medula espinhal de rato contundida e histologia correspondente. Lesão de contusão torácica 4 semanas após a lesão do mesmo espécime que a Fig 2 (espessura de seção spin-eco multissecção 2D, 208 μm FOV, resolução no plano de 20 × 6 mm, 23 × 78 μm TE, 7,5 milissegundos TR, 2 segundos). Barra de escala, 2 mm. DE ANÚNCIOS, Ex vivo RM varreduras de imagem lateral para medial. EH, Seções coradas de Nissl correspondentes. I – L, Seções imunocoradas com GFAP correspondentes. M – P, Seções imunocoradas de colágeno tipo III correspondentes. Hiperintensidades homogêneas no centro de lesão (UMA) correspondem a defeitos de lesão cística em cortes histológicos (E eu, e M) Em outras seções. hipo / hiperintensidades mistas no centro da lesão (B e C, setas) estão associados a defeitos de lesão cística, depósitos de hemossiderina ou formação de cicatriz fibrótica (F, N, G, e O, setas) Uma hipointensidade seguindo o caminho do trato corticospinal dorsal caudal à lesão - correspondendo a hipointensidades nas colunas dorsais em imagens de RM axiais (Fig 2) - é destacada por pontas de flecha (B).

Remoto do centro da lesão, algumas alterações de intensidade de sinal neuroanatomicamente restritas puderam ser observadas (Fig. 2UMA, -Jeu Fig 3B) Foram identificadas hipointensidades estritamente confinadas ao antigo trato corticoespinhal dorsal principal caudal à lesão ou às vias proprioceptivas ascendentes (fascículo grácil) rostral à lesão. Regiões hiperintensas dentro das colunas dorsais rostral e caudalmente (Fig. 2BD, -Jeu Fig 3UMA, -B) podem ser atribuídos a zonas necróticas císticas, que foram identificadas nas seções histológicas sagitais correspondentes (Fig. 3F) Não houve diferença nas alterações gerais da intensidade do sinal em comparação com a amostra da medula espinhal, que foi tirada 2 semanas após a lesão de contusão (dados não mostrados).

Imagem de RM in vivo de medula espinhal contundida

Cinco animais com contusões da medula espinhal no nível torácico aplicado pelo IH Impactor e um animal intacto foram analisados ​​com imagens de RM 2, 6 e 8 semanas de pós-operatório. Apenas 2 de 5 animais feridos sobreviveram ao procedimento de imagem por RM e, portanto, estavam disponíveis para avaliação histológica. A maioria das mudanças de intensidade de sinal observadas em imagens de eco-spin ex vivo na medula espinhal contundida eram quase idênticas às imagens de eco-gradiente in vivo da medula espinhal contundida. O diâmetro do cordão estava reduzido no centro da lesão em particular, as faces dorso-laterais estavam atróficas (Figs 4UMAF e 5E, -F), que foi confirmado por achados idênticos em seções histológicas coradas por Nissl correspondentes. Em direção ao epicentro da lesão, a diferenciação de substância cinzenta / branca desapareceu completamente (Fig. 5DG) O padrão de intensidade de sinal da substância cinzenta na medula espinhal intacta (Fig. 1C, -D) foi substituída por áreas hipointensas no centro da medula, circundadas por uma borda hiperintensa dorsal e ventralmente (Fig. 5DG) Conforme descrito na imagem de RM ex vivo (Fig 2F, -G), as hipointensidades no centro da lesão representam depósitos de hemossiderina, que são remanescentes da hemorragia causada pelo trauma correspondente a áreas escuras em seções coradas com Nissl e azul da Prússia (Fig. 4K, -N) Além disso, hipointensidades foram encontradas confinadas às colunas dorsais rostral e caudal à lesão, tanto na varredura sagital quanto axial (Figs 4B, -E, e 5H), que também são comparados aos achados de imagem de RM ex vivo. Essas hipointensidades podem ser correlacionadas com os depósitos de hemossiderina, conforme representado pela coloração com Azul da Prússia de seções da medula espinhal correspondentes (Fig. 4K) Não houve correlação com áreas de infiltração de macrófagos / monócitos (Fig. 4euO), que são - além de estarem localizados adjacentes ao centro da lesão - comumente identificados em tratos de substância branca remotos do local da lesão, destacando áreas de degeneração Walleriana em curso (N. Weidner, observação não publicada).

Varreduras sagitais de imagem por RM in vivo da medula espinhal de rato contundida e histologia correspondente. A imagem de RM in vivo em ratos adultos 2 e 8 semanas após a lesão de contusão torácica exibe mudanças de intensidade de sinal, que são paralelas aos dados de imagem de RM ex vivo (gradiente-eco de multissecção 2D A – C, espessura da seção, 311 μm FOV, 30 × 30 mm de resolução no plano, 117 × 117 μm TE, 4,4 milissegundos TR, ∼200 milissegundos, dependendo da frequência cardíaca D – F, espessura da seção, 300 μm FOV, resolução no plano de 40 × 25 mm, 156 × 98 μm TE, 3,7 milissegundos TR, 200 milissegundos, dependendo da frequência cardíaca). Barra de escala UMAF, 5 mm G – O, 1 mm. Imagens consecutivas de RM sagitais são mostradas em 2 semanas (UMAC) e 8 semanas (DF) pós-lesão com Nissl histológico correspondente (Geu) e azul da Prússia (Jeu) - seções coradas e seções processadas para imuno-histoquímica ED1 (macrófagos, monócitos MO), todos do mesmo animal. Setas; flechas no UMA e B destacar o local do impacto. Hipointensidades ao longo das projeções dos axônios ascendentes e descendentes nas colunas dorsais (B e E) correlacionar com depósitos de hemossiderina (K) em vez de infiltração de macrófagos / monócitos (O respectivas áreas são indicadas por pontas de flecha) Essas mudanças aumentam a partir de 2 semanas (C) até 8 semanas (G) pós-lesão. A clara redução no diâmetro do cordão ao longo do tempo (B vs E e C vs F) corresponde à atrofia observada em cortes histológicos (GO).

Imagens axiais de ressonância magnética in vivo de medula espinhal de rato contundida. Varreduras axiais de RM in vivo em ratos adultos 6 semanas após a lesão (espessura de seção de gradiente-eco multissecção 2D, 370 μm FOV, resolução no plano de 20 × 20 mm, 78 × 78 μm TE, 4,2 milissegundos TR, ∼200 milissegundos, dependendo do coração avaliar). Barra de escala, 2 mm. Varreduras rostrais à contusão (UMAC), no centro da lesão (DG), e caudal à lesão (H) A diferenciação clara entre a matéria branca e cinzenta desaparece nas seções subsequentes. No centro da lesão, hipointensidades são rodeadas por hiperintensidades, que são menos pronunciadas em direção à superfície do cordão (E e F) O aspecto dorsal da medula espinhal no local da lesão parece mais homogeneamente hiperintensivo, provavelmente representando alterações císticas (D e E, pontas de flecha) Sinais de atrofia estão presentes na medula espinhal dorsolateral (E e F).

Em cortes histológicos corados com Nissl (Fig 4H), foram identificadas pequenas áreas císticas em forma de charuto diminuindo de tamanho rostralmente, que representam áreas de início da formação de siringe pós-traumática. A imagem de RM in vivo não produziu intensidades de sinal correspondentemente identificáveis ​​(Fig. 4SER) Provavelmente, os planos de imagem sagitais escolhidos não incluíram a localização do canal central.


RESULTADOS

A diversidade estrutural de árvores periféricas aferentes laterais

Para desvendar os mecanismos responsáveis ​​pela seleção de células ciliadas plano-polarizadas por neurônios aferentes lateralis, realizamos uma reconstrução detalhada de árvores axonais opticamente isoladas in toto em alta resolução espacial. Esta análise é direta porque cada órgão da linha lateral na larva do peixe-zebra é inervado por apenas dois ou três neurônios aferentes (Fig. 1A) (Faucherre et al., 2009). Inicialmente, buscamos investigar a elaboração de árvores axonais usando fotoconversão mediada por UV de aferentes laterais simples em Tg (HuC: Kaede) (HuC também é conhecido como elavl3 - Zebrafish Information Network) peixes transgênicos estáveis, que foram relatados para destacar os neurônios aferentes da linha lateral (Caron et al., 2008). No entanto, descobrimos que em larvas resultantes de um cruzamento entre o marcador eferente Tg (ilhota 1: gfp) e Tg (HuC: Kaede), os neurônios eferentes da linha lateral também foram marcados por Kaede (fig. 1B). Assim, não poderíamos atribuir inequivocamente uma identidade aferente aos neurônios da linha lateral em Tg (HuC: Kaede).

Projeções centrais e periféricas de neurônios aferentes laterais. (UMA) Projeções periféricas GFP-positivas na linha de peixe-zebra transgênica HGn39D. Três neurônios aferentes projetando-se para um neuromast são retratados. (B) Inervação de neuromastos em um HuC: Kaede e islet1: gfp larva duplamente transgênica após fotoconversão de Kaede. Os neurônios verdes são positivos para GFP, os neurônios vermelhos são positivos para Kaede e os neurônios amarelos são positivos para GFP / Kaede. Os neuromastos são inervados por neurônios vermelhos e amarelos. As setas indicam os neuromasts. Linhas tracejadas delimitam a medula espinhal. (C) Soma de um único neurônio aferente TdTomato-positivo em um gânglio posterior GFP-positivo de um peixe transgênico HGn39D. O soma expressando TdTomato está localizado no gânglio da linha lateral posterior. (D) Projeção central de um único neurônio aferente marcado com TdTomato. Anterior está à esquerda e posterior à direita. (E,F) Projeções periféricas de um único neurônio aferente marcado com TdTomato em dois intervalos de tempo diferentes (intervalo de 10 minutos). A seta indica uma extremidade abaulada, enquanto as pontas de seta indicam neurites finas e móveis. (G,H) Imunocoloração anti-Ribeye B. A formação de sinapses em fita entre o neurônio aferente (vermelho) e as células ciliadas (verde) é visualizada pela presença da proteína Ribeye B (ciano). As setas indicam (G) uma neurite fina que não entra em contato com uma célula ciliada, e (H) neurites salientes contendo a proteína B do Ribeye. (eu) O número médio de neurites presentes em cada ponto de tempo para o tipo selvagem (wt) e tmie peixes mutantes. Barras de erro representam o s.e.m. Tipo selvagem, n=6 tmie, n= 6. Barras de escala: 10 μm em A, G, H 20 μm em B-D 5 μm em E, F.

Projeções centrais e periféricas de neurônios aferentes laterais. (UMA) Projeções periféricas GFP-positivas na linha de peixe-zebra transgênica HGn39D. Três neurônios aferentes projetando-se para um neuromast são retratados. (B) Inervação de neuromastos em um HuC: Kaede e islet1: gfp larva duplamente transgênica após fotoconversão de Kaede. Os neurônios verdes são positivos para GFP, os neurônios vermelhos são positivos para Kaede e os neurônios amarelos são positivos para GFP / Kaede. Os neuromastos são inervados por neurônios vermelhos e amarelos. As setas indicam os neuromasts. Linhas tracejadas delimitam a medula espinhal. (C) Soma de um único neurônio aferente TdTomato-positivo em um gânglio posterior GFP-positivo de um peixe transgênico HGn39D. O soma expressando TdTomato está localizado no gânglio da linha lateral posterior. (D) Projeção central de um único neurônio aferente marcado com TdTomato. Anterior está à esquerda e posterior à direita. (E,F) Projeções periféricas de um único neurônio aferente marcado com TdTomato em dois intervalos de tempo diferentes (intervalo de 10 minutos). A seta indica uma extremidade saliente, enquanto as pontas de seta indicam neurites finas e móveis. (G,H) Imunocoloração anti-Ribeye B. A formação de sinapses em fita entre o neurônio aferente (vermelho) e as células ciliadas (verde) é visualizada pela presença da proteína Ribeye B (ciano). As setas indicam (G) uma neurite fina que não entra em contato com uma célula ciliada, e (H) neurites salientes contendo a proteína B do Ribeye. (eu) O número médio de neurites presentes em cada ponto de tempo para o tipo selvagem (wt) e tmie peixes mutantes. Barras de erro representam o s.e.m. Tipo selvagem, n=6 tmie, n= 6. Barras de escala: 10 μm em A, G, H 20 μm em B-D 5 μm em E, F.

Em vez disso, determinamos a morfologia neuronal aferente injetando um plasmídeo que codifica HuC: mem-TdTomato, conforme relatado anteriormente (Faucherre et al., 2009). Selecionamos para análise apenas os espécimes com neurônios fluorescentes vermelhos únicos, cujo soma estava localizado dentro do gânglio aferente lateral, que pode ser marcado usando a linha transgênica HGn39D (Fig. 1C) (Faucherre et al., 2009). As injeções foram realizadas em estábulo Tg (brn3c: gfp) (brn3c também é conhecido como pou4f3 - Zebrafish Information Network) ovos para visualizar todas as células ciliadas com EGFP (Xiao et al., 2005). Para reconstruir árvores axonais, criamos um método simples usando ferramentas comerciais baratas e amplamente acessíveis.

Nossa reconstrução 3D de neurônios opticamente isolados mostrou que os aferentes laterais projetam axônios centrais estereotípicos que entram no rombencéfalo e se bifurcam, formando um ramo anterior e um ramo posterior (Fig. 1D) (Metcalfe et al., 1985). Em contraste, os arbores axonais periféricos eram estruturalmente diversos (Fig. 1E, F), normalmente formando diferentes tipos de neuritos. Neuritos protuberantes foram associados de forma estável com células ciliadas no que provavelmente são conexões sinápticas, já que os protuberâncias continham fitas sinápticas, conforme revelado por imunomarcação com um anticorpo para Ribeye B (Ctbp2l - Rede de Informação Zebrafish) (Fig. 1G, H) (Sidi et al., 2004). Neuritos finos eram mais longos e nem sempre contatavam as células ciliadas (Fig. 1E-G). Uma explicação para a diversidade da estrutura periférica dos axônios é que eles são dinâmicos.

Para examinar seu comportamento, reconstruímos terminais periféricos por imagens ao vivo em alta resolução temporal e espacial. Nós adquirimos z- pilhas de todo o eixo axonal a cada 10 minutos ao longo de um período de 1 hora e posteriormente os renderizou em 3D ao longo do tempo (n= 6). Mandíbulas foram reconstruídas por traçado semi-manual de todos os filamentos em cada momento, o que nos permitiu quantificar o comportamento dos diferentes neuritos (ver Tabela S1 no material complementar). Esta análise mostrou que os neuritos mudam constantemente de comprimento e posição. Em média, os neuritos cresceram ou retraíram a uma taxa de 100 nm por minuto e eram capazes de se estender até 5 μm em 10 minutos (Fig. 1E, F). Apesar dessas mudanças rápidas na forma, a complexidade da árvore não mudou porque o número médio de neuritos foi mantido durante o período registrado (Fig. 1I). Isso é consistente com observações anteriores de imagens ao vivo de que a taxa de germinação de neurita é equivalente à de poda (Faucherre et al., 2009). Também descobrimos que a germinação de neuritos ocorreu por ramificação intersticial e que a poda ocorreu por retração, pois nunca observamos derramamento ou degeneração de neuritos. Concluímos que a diversidade estrutural das árvores periféricas aferentes resulta de um processo muito ativo de produção, extensão e retração de neuritos.

A arborização periférica é modulada pela atividade das células ciliadas

A observação de que a atividade de germinação de neurônios é menor em neuromastos quiescentes do que naqueles em regeneração sugere que as árvores periféricas se reestruturam em resposta a estímulos do epitélio sensorial (Faucherre et al., 2009). Perguntamos se essas pistas se originam da atividade das células ciliadas, tirando proveito de uma cepa de peixe-zebra com uma mutação de perda de função em tmie, o ortólogo do ouvido interno transmembrana do gene da surdez de mamíferos. Homozigoto tmie Os peixes-zebra mutantes são viáveis ​​e férteis, mas profundamente surdos devido a defeitos na mecanorrecepção das células ciliadas (Gleason et al., 2009).

Nós espalhamos aferentes lateralis marcados ao injetar DNA de HuC: mem-TdTomato no tipo selvagem e tmie ovos mutantes que também carregavam o Tg (brn3c: gfp) transgene. Novamente, os axônios foram identificados como aferentes quando puderam ser rastreados até um soma localizado no gânglio pós-ótico. Adquirimos imagens 4D e descobrimos que em todos os casos as árvores periféricas eram significativamente mais complexas em tmiepeixe (n= 6) do que em controles de tipo selvagem (n= 6) a 7 dpf. Quantificamos a complexidade da árvore adotando diferentes estratégias. Atribuímos complexidade numérica contando o número total de terminais de neurite por caramanchão. Para a complexidade dinâmica, geramos uma representação visual das árvores colocando um ponto colorido em cada terminal de neurite. Posteriormente, a posição de cada terminal foi rastreada no espaço 3D a cada 10 minutos por 1 hora. Os terminais receberam uma cor diferente em cada um dos seis pontos no tempo que dividiram todo o período de gravação (Figs 2 e 3, ver Filmes 1-4 no material suplementar). Comparação da complexidade numérica e dinâmica entre tipo selvagem e tmie os animais indicaram que o grupo de mutantes teve, em média, um aumento de 2 vezes no número de neurites em cada ponto de tempo (Fig. 1I e ver Fig. S1A no material suplementar). Por exemplo, o tmie mutante na Fig. 2 tinha 16 neurites no primeiro período de tempo, enquanto os peixes do tipo selvagem exibiam apenas seis ramos ao mesmo tempo.

Reconstrução quadridimensional de um único neurônio aferente rotulado. (A-G) Representações quadridimensionais de um neurônio aferente em tipo selvagem (A-C) e tmie peixes mutantes (E-G). (UMA,E) neurônio marcado com mem-TdTomato em contato com as células ciliadas que expressam GFP. O ponto terminal de cada neurônio foi traçado com uma cor diferente. Para cada ponto terminal (ou seja, para cada cor), as posições foram traçadas ao longo do tempo, a cada 10 minutos durante 1 hora. (B,F) O mesmo que A, E, mas sem as células ciliadas. (C,G) O mesmo que B, F, mas com apenas os pontos representando o ponto terminal. O ponto ciano exclusivo indica o ponto inicial da árvore neuronal. O quadro branco corresponde à reconstrução da árvore neuronal do primeiro quadro de tempo. (D,H) Projeções máximas e reconstrução da árvore neuronal do mesmo neurônio ao longo do tempo. As imagens T1-T6 foram obtidas a cada 10 minutos durante 1 hora. O ponto inicial está em ciano, os pontos terminais estão em verde, os pontos de ramificação estão em vermelho e os pontos de ramificação especiais (bifurcações múltiplas) estão em azul. As setas indicam exemplos de neurites transitórios. Barras de escala: 5 μm.

Reconstrução quadridimensional de um único neurônio aferente rotulado. (A-G) Representações quadridimensionais de um neurônio aferente em tipo selvagem (A-C) e tmie peixes mutantes (E-G). (UMA,E) neurônio marcado com mem-TdTomato em contato com as células ciliadas que expressam GFP. O ponto terminal de cada neurônio foi traçado com uma cor diferente. Para cada ponto terminal (ou seja, para cada cor), as posições foram traçadas ao longo do tempo, a cada 10 minutos durante 1 hora. (B,F) O mesmo que A, E, mas sem as células ciliadas. (C,G) O mesmo que B, F, mas com apenas os pontos representando o ponto terminal. O ponto ciano exclusivo indica o ponto inicial da árvore neuronal. O quadro branco corresponde à reconstrução da árvore neuronal do primeiro quadro de tempo. (D,H) Projeções máximas e reconstrução da árvore neuronal do mesmo neurônio ao longo do tempo. As imagens T1-T6 foram obtidas a cada 10 minutos durante 1 hora. O ponto inicial está em ciano, os pontos terminais estão em verde, os pontos de ramificação estão em vermelho e os pontos de ramificação especiais (bifurcações múltiplas) estão em azul. As setas indicam exemplos de neurites transitórios. Barras de escala: 5 μm.

Representações quadridimensionais de um único neurônio aferente rotulado. Representações quadridimensionais de neurônio aferente rotulado único em seis do tipo selvagem (acima) e tmie peixes mutantes (abaixo). O ponto terminal de cada neurônio foi traçado com uma cor diferente. Para cada ponto terminal (ou seja, para cada cor), as posições foram traçadas ao longo do tempo, a cada 10 minutos durante 1 hora.

Representações quadridimensionais de um único neurônio aferente rotulado. Representações quadridimensionais de neurônio aferente rotulado único em seis do tipo selvagem (acima) e tmie peixes mutantes (abaixo). O ponto terminal de cada neurônio foi traçado com uma cor diferente. Para cada ponto terminal (ou seja, para cada cor), as posições foram traçadas ao longo do tempo, a cada 10 minutos durante 1 hora.

Em seguida, comparamos a estabilidade da árvore contando o número de neuritos presentes ao longo dos seis pontos de tempo capturados (neuritos estáveis) e também aqueles que foram observados em apenas um a cinco dos intervalos de tempo (neuritos transitórios). No tmie mutantes 40% dos neuritos eram transitórios, significativamente maior do que os 12% encontrados em espécimes do tipo selvagem (P& lt0.01) (Fig. 4A e veja a Fig. S1B no material suplementar). Em seguida, contamos o número de neurites que eram visíveis durante um a cinco dos intervalos de tempo e definimos "persistência" como a capacidade de um neurite permanecer presente durante um período definido. Esta análise revelou que a maioria (88%) dos neuritos do tipo selvagem estava presente durante todo o período registrado, enquanto apenas 59% dos neuritos em tmie os peixes estiveram presentes durante todos os seis intervalos de tempo. Descobrimos que 14% de tmie neurites estiveram presentes por apenas um período de tempo, em comparação com 7% no tipo selvagem (Fig. 4B). Portanto, neurites de tmie mutantes eram menos persistentes.

Em seguida, investigamos o tipo selvagem e tmie neurites por sua "consistência". Definimos consistência como a persistência de seu comportamento (Fig. 4C). Por exemplo, neurites que não cresceram nem retraíram durante todo o período registrado foram classificados como altamente consistentes, enquanto aqueles que realizaram uma sequência de comportamentos contrários (por exemplo, crescimento e retração) definiram um grau inferior de consistência. No tmie mutantes, apenas 11% dos neuritos eram absolutamente consistentes, enquanto 42% cresceram ou retraíram e 36%, 9% e 2% realizaram uma sequência de dois, três ou quatro eventos de contagem, respectivamente. Em comparação, em peixes de tipo selvagem, os respectivos valores foram 40%, 37%, 23%, 0% e 0%. Assim, neurites em tmie mutantes são menos consistentes.

Análise quantitativa da dinâmica das neurites. (UMA) Média de neuritos estáveis ​​(presentes ao longo dos seis intervalos de tempo) versus transitórios (presentes em menos de seis intervalos de tempo) em tipo selvagem e tmie peixes mutantes. Barras de erro representam o s.e.m. *, P& lt0.01. (B) Persistência de neurite. A persistência de neurites foi calculada a partir da porcentagem de neurites presentes para apenas um, dois, três, quatro, cinco ou todos os seis intervalos de tempo. (C) Consistência da neurite. "Consistente" refere-se a uma neurite que não cresceu nem retraiu ao longo dos seis intervalos de tempo. "Um evento" refere-se a uma neurite que apenas cresceu ou retraiu ao longo dos seis períodos de tempo. "Dois eventos" refere-se a uma neurite que completou uma sequência de dois movimentos contrários, ou seja, crescimento seguido de retração ou vice-versa. Da mesma forma, "três eventos" se referem a uma sequência de três movimentos contrários. (D-F) Dinâmica das pontas dos neuritos. O valor da posição do ponto terminal no primeiro momento foi normalizado para zero e o mesmo valor foi subtraído dos momentos subsequentes para estabelecer a distância percorrida pela ponta da neurite. À direita de cada gráfico é mostrada a distância média (μm) percorrida por cada tipo de neurite durante um período de tempo. Os neuritos estáveis ​​não têm extremidades salientes, mas estão presentes ao longo dos seis intervalos de tempo. (D) Dinâmica de neurites protuberantes. (E) Dinâmica de neurites não protuberantes estáveis. (F) Dinâmica de neuritos transitórios. Linhas vermelhas, linhas verdes tracejadas de tipo selvagem, tmie. Barras de erro representam s.e.m. *, ***, ****, P& lt0.01 **, P& lt0.1 para pares indicados pelo número de asteriscos do tipo selvagem, n=6 tmie, n=6.

Análise quantitativa da dinâmica das neurites. (UMA) Média de neuritos estáveis ​​(presentes ao longo dos seis intervalos de tempo) versus transitórios (presentes em menos de seis intervalos de tempo) em tipo selvagem e tmie peixes mutantes. Barras de erro representam o s.e.m. *, P& lt0.01. (B) Persistência de neurite. A persistência de neurites foi calculada a partir da porcentagem de neurites presentes para apenas um, dois, três, quatro, cinco ou todos os seis intervalos de tempo. (C) Consistência da neurite. 'Consistente' refere-se a uma neurite que não cresceu nem retraiu ao longo dos seis intervalos de tempo. "Um evento" refere-se a uma neurite que apenas cresceu ou retraiu ao longo dos seis períodos de tempo. "Dois eventos" refere-se a uma neurite que completou uma sequência de dois movimentos contrários, ou seja, crescimento seguido de retração ou vice-versa. Da mesma forma, "três eventos" se referem a uma sequência de três movimentos contrários. (D-F) Dinâmica das pontas dos neuritos. O valor da posição do ponto terminal no primeiro momento foi normalizado para zero e o mesmo valor foi subtraído dos momentos subsequentes para estabelecer a distância percorrida pela ponta da neurite. À direita de cada gráfico é mostrada a distância média (μm) percorrida por cada tipo de neurite durante um período de tempo. Os neuritos estáveis ​​não têm extremidades salientes, mas estão presentes ao longo dos seis intervalos de tempo. (D) Dinâmica de neurites protuberantes. (E) Dinâmica de neurites não protuberantes estáveis. (F) Dinâmica de neuritos transitórios. Linhas vermelhas, linhas verdes tracejadas de tipo selvagem, tmie. Barras de erro representam s.e.m. *, ***, ****, P& lt0.01 **, P& lt0.1 para pares indicados pelo número de asteriscos do tipo selvagem, n=6 tmie, n=6.

Finalmente, medimos a distância percorrida por cada neurite desde o primeiro momento. Para uma análise mais precisa, nós os subdividimos em três categorias: neuritos abaulados que estavam presentes ao longo dos seis intervalos de tempo (abaulados) neuritos que estavam presentes ao longo dos seis intervalos de tempo, mas sem abaulamentos (estáveis) e neuritos de baixa persistência (transitórios). Neuritos transientes do tipo selvagem e mutantes percorreram distâncias significativamente maiores durante um ponto de tempo do que os neuritos estáveis ​​e protuberantes (Fig. 4D-F).

Para confirmar que os efeitos observados foram causados ​​pela perda de atividade das células ciliadas, aplicamos a mesma estratégia aos animais injetados com um morfolino (MO) contra caderina 23 (cdh23) Cdh23 morfa a fenocopia do Sputnik cepa de peixe-zebra, que carrega uma mutação em cdh23 que também causa surdez e falta de mecanorrecepção devido à ausência de links nas pontas (Sollner et al., 2004). O estudo foi conduzido a 4 dpf para eficiência máxima de MO. Igual a tmie mutantes, morfantes Cdh23 mostraram árvores periféricas mais complexas do que peixes de controle. Em média, observamos um aumento de 1,7 vezes no número de neuritos, com 46% dos neuritos sendo transitórios em morfantes contra 17% nos controles. Também descobrimos que os neuritos eram menos persistentes e menos consistentes em morfantes Cdh23 (controles, n=3 cdh23 MO, n= 3) (ver Fig. S2 e Tabela S2 no material suplementar). A partir desses resultados, concluímos que a complexidade das árvores periféricas dos neurônios aferentes é influenciada pelo epitélio sensorial, e que a estabilidade da árvore depende da atividade das células ciliadas evocadas.

Os axônios centrais parecem normais em peixes-zebra profundamente surdos

Em seguida, perguntamos se a surdez profunda também influenciaria os axônios centrais dos neurônios. Avaliamos a somatotopia central aferente lateral e os contatos com a célula de Mauthner, um alvo de segunda ordem característico no rombencéfalo posterior (Kimmel et al., 1982 Metcalfe et al., 1985). O dendrito lateral da célula de Mauthner tem uma projeção dorsal em sua ponta lateral que é o alvo das projeções aferentes laterais (Fig. 5C). Para revelar a célula de Mauthner, injetamos dextrano fluorescente verde na medula espinhal de tmie larva mutante. Esse corante é incorporado ao axônio da célula de Mauthner e se espalha retrogradamente por toda a célula, incluindo seus dois dendritos. Também injetamos magenta (em um neuromastos terminal da linha lateral posterior) e vermelho (em um neuromastal supra-orbital da linha lateral anterior) dextran fluorescente para rotular retrogradamente os neurônios aferentes que inervam esses neuromastos (Sapède et al., 2005) .

Projeções centrais de neurônios sensoriais da linha lateral de primeira ordem em tmie mutantes. A somatotopia central e o direcionamento da célula Mauthner são conservados em tmie mutantes. (Aa-d) Injeções fluorescentes de dextrano em tmie −/− brn3c: gfp peixes transgênicos mostrando somatotopia das projeções dos neurônios sensoriais da linha lateral de primeira ordem provenientes dos neuromastos posterior (b) e anterior (c). As projeções provenientes dos neuromastos P9 (PLL) (b Alexa 647-dextran) e dos neuromastos SO2 (ALL) (c Rodamina-dextrana) projetam-se de maneira dorsoventral (a) no cérebro posterior. (d) Projeções provenientes da orelha (Brn3c: GFP). (Ba-c) Injeções fluorescentes de dextrano em tmie −/− brn3c: gfp peixes transgênicos mostrando direcionamento central do dendrito lateral de Mauthner por projeções da linha lateral posterior e anterior (a). Projeções provenientes do neuromaste P9 (PLL) (b Alexa 647-dextran) conectam (pontas de seta) à porção mais lateral do dendrito lateral da célula de Mauthner (c fluoresceína-dextrana), que se estende ventrodorsalmente. (C) Esquema (fora da escala) que descreve a somatotopia central das projeções dos neurônios sensoriais da linha lateral de primeira ordem e seu direcionamento ao dendrito lateral da célula de Mauthner. No tmie peixes, o eixo ântero-posterior do neuromast da linha lateral projeta-se no eixo ventrodorsal da projeção dorsal do dendrito lateral de Mauthner, como nos peixes do tipo selvagem. ALL, linha lateral anterior PLL, linha lateral posterior.

Projeções centrais de neurônios sensoriais da linha lateral de primeira ordem em tmie mutantes. A somatotopia central e o direcionamento da célula Mauthner são conservados em tmie mutantes. (Aa-d) Injeções fluorescentes de dextrano em tmie −/− brn3c: gfp peixes transgênicos mostrando somatotopia das projeções dos neurônios sensoriais da linha lateral de primeira ordem provenientes dos neuromastos posterior (b) e anterior (c). As projeções provenientes dos neuromastos P9 (PLL) (b Alexa 647-dextran) e dos neuromastos SO2 (ALL) (c Rodamina-dextrana) projetam-se de maneira dorsoventral (a) no cérebro posterior. (d) Projeções vindas da orelha (Brn3c: GFP). (Ba-c) Injeções fluorescentes de dextrano em tmie −/− brn3c: gfp peixes transgênicos mostrando direcionamento central do dendrito lateral de Mauthner por projeções da linha lateral posterior e anterior (a). As projeções provenientes do neuromaste P9 (PLL) (b Alexa 647-dextran) se conectam (pontas de seta) à porção mais lateral do dendrito lateral da célula de Mauthner (c fluoresceína-dextrana), que se estende ventrodorsalmente. (C) Esquema (fora da escala) que descreve a somatotopia central das projeções dos neurônios sensoriais da linha lateral de primeira ordem e seu direcionamento ao dendrito lateral da célula de Mauthner. No tmie peixes, o eixo ântero-posterior do neuromast da linha lateral projeta-se no eixo ventrodorsal da projeção dorsal do dendrito lateral de Mauthner, como nos peixes do tipo selvagem. ALL, linha lateral anterior PLL, linha lateral posterior.

O rastreamento de neurônios aferentes até o cérebro posterior mostrou que sua organização central não foi afetada em tmie mutantes (n= 7) (Fig. 5B e veja o Filme 5 no material suplementar). Além disso, as projeções centrais das aferências dos neuromastos anterior e posterior se estendiam normalmente e foram colocadas corretamente ao longo do eixo somatotópico no rombencéfalo (Fig. 5A). Observamos que os axônios centrais da linha lateral posterior e anterior faziam contato com o dendrito lateral da célula de Mauthner no nível da projeção dorsal (Fig. 5Ba e veja o Filme 5 no material suplementar) como nos controles do tipo selvagem (dados não mostrados ) Além disso, a imagem ao vivo em resoluções idênticas às aplicadas às árvores periféricas não revelou alterações dinâmicas nas árvores centrais dos neurônios (dados não mostrados). Esses resultados mostram que a falta de atividade das células ciliadas evocadas não tem grande impacto na organização axonal central dos neurônios lateralis.

Os neurônios aferentes não conseguem discriminar a orientação do alvo na ausência de mecanorrecepção das células ciliadas

Como a surdez afetou dramaticamente a arborização periférica, perguntamos se a atividade das células ciliadas evocadas desempenha algum papel na seleção de alvos polarizados no plano pelos neurônios aferentes. Nós dispersamos neurônios marcados e revelamos a orientação das células ciliadas, marcando seus estereocílios apicais com faloidina fluorescente (Fig. 6A, B). Homozigoto tmie peixes mutantes desenvolvem células ciliadas com polaridade celular planar normal (Fig. 6B) (Gleason et al., 2009). Em peixes do tipo selvagem, 88% dos neuritos protuberantes associados exclusivamente a células ciliadas de uma única polaridade (n= 17), significativamente maior do que os 38% encontrados em tmie mutantes (n= 21) (Fig. 6C). No tmie mutantes, 62% dos neuritos protuberantes estavam associados a células ciliadas de ambas as polaridades, uma ocorrência observada com muito menos frequência em animais do tipo selvagem (12%). No tmie e espécimes de tipo selvagem, neurites salientes estabeleceram sinapses com células ciliadas, conforme revelado pela concentração localizada de pontos de Ribeye B (Fig. 6D-I) (tipo selvagem, n=6 tmie, n= 7). Além disso, várias neurites finas também pareciam estabelecer sinapses com células ciliadas (Fig. 6J-L).

A mecanotransmissão entre uma célula ciliada e seus neurônios aferentes é mediada pela liberação de glutamato da célula ciliada, que ativa os receptores AMPA nos neurônios (Bailey e Sewell, 2000). Para investigar a discriminação da polaridade das células ciliadas pelos neurônios, tentamos uma abordagem farmacológica usando agonistas e antagonistas do receptor de glutamato. Tratamos peixes com CNQX (um antagonista do receptor de glutamato de AMPA / cainato competitivo), ácido domóico (um agonista potente dos receptores de glutamato de AMPA / cainato), ácido canaico (um agonista do receptor de cainato / glutamato), maleato (um NMDA não competitivo antagonista do receptor) e ciclotiazida (um inibidor alostérico da dessensibilização do receptor AMPA que altera o bloqueio do receptor). Nenhuma dessas drogas produziu um fenótipo em peixes que fosse consistente com a inibição sináptica (dados não mostrados), sugerindo que eles não impactaram efetivamente seu alvo em nossa configuração experimental in vivo. Também tentamos silenciar eletricamente a atividade neuronal, expressando o canal de íon de potássio retificador interno Kir2.1 em aferentes laterais (Hua et al., 2005). Embora a expressão de Kir2.1 em neurônios aferentes não tenha afetado seu desenvolvimento, ela teve um impacto profundo na neuritogênese e também levou à degeneração neuronal de início tardio (dados não mostrados). Portanto, essa abordagem também não teve sucesso. Apesar disso, interpretamos nossos resultados de pessoas com surdez profunda tmie mutantes como uma indicação clara de que a atividade das células ciliadas evocadas é necessária para que os neurônios aferentes selecionem corretamente alvos com orientação idêntica.

Neurônios aferentes de tmie mutantes não são seletores de polaridade estritos. (A-C) Análise da inervação específica da polaridade em HuC: mem-TdTomato-injetado brn3c: gfp tmie mutantes. (A) Projeção máxima e (B) coloração com faloidina de um neuromastado inervado por um único neurônio aferente marcado em um tmie mutante. As setas em A indicam neurites protuberantes que estabelecem contato com as células ciliadas. Os asteriscos em B indicam as células ciliadas inervadas. (C) A porcentagem de contatos estabelecidos entre um neurônio aferente e células ciliadas de polaridade idêntica ou células ciliadas de duas polaridades opostas. Os números entre parênteses indicam o número de neuromasts (tipo selvagem, n=17 tmie, n=21). (D-L) Imunodetecção de sinapses de fita em tipo selvagem (D-F) e tmie (G-L) peixes usando o anticorpo Ribeye B (ciano).Contatos protuberantes de neurônios aferentes que expressam TdTomato (vermelho) com células ciliadas (verdes) estão associados à presença de sinapses no tipo selvagem (D-F) e tmie (G-I) peixes (as setas indicam um exemplo em cada caso). Neuritos finos também podem formar sinapses com células ciliadas, como mostrado pela presença de coloração Ribeye B no neuromast de um tmie mutante (J-L). A área encaixotada em J é ampliada em K, L. Barras de escala: 10 μm em A, D, G, J 5 μm em B.

Neurônios aferentes de tmie mutantes não são seletores de polaridade estritos. (A-C) Análise da inervação específica da polaridade em HuC: mem-TdTomato-injetado brn3c: gfp tmie mutantes. (A) Projeção máxima e (B) coloração com faloidina de um neuromastado inervado por um único neurônio aferente marcado em um tmie mutante. As setas em A indicam neurites protuberantes que estabelecem contato com as células ciliadas. Os asteriscos em B indicam as células ciliadas inervadas. (C) A porcentagem de contatos estabelecidos entre um neurônio aferente e células ciliadas de polaridade idêntica ou células ciliadas de duas polaridades opostas. Os números entre parênteses indicam o número de neuromasts (tipo selvagem, n=17 tmie, n=21). (D-L) Imunodetecção de sinapses de fita em tipo selvagem (D-F) e tmie (G-L) peixes usando o anticorpo Ribeye B (ciano). Contatos protuberantes de neurônios aferentes que expressam TdTomato (vermelho) com células ciliadas (verdes) estão associados à presença de sinapses no tipo selvagem (D-F) e tmie (G-I) peixes (as setas indicam um exemplo em cada caso). Neuritos finos também podem formar sinapses com células ciliadas, como mostrado pela presença de coloração Ribeye B no neuromast de um tmie mutante (J-L). A área encaixotada em J é ampliada em K, L. Barras de escala: 10 μm em A, D, G, J 5 μm em B.


Publicações

A atividade cortical interna contínua desempenha um papel importante na percepção e no comportamento tanto em animais quanto em humanos. Anteriormente, mostramos que padrões espontâneos semelhantes a mapas de orientação aparecem em grandes áreas corticais no córtex visual primário de gatos anestesiados. No entanto, permanece desconhecido 1) se a atividade espontânea no primata também exibe padrões semelhantes e 2) se existe uma diferença significativa entre a atividade cortical contínua no primata anestesiado e acordado. Exploramos essas questões combinando imagens de corante sensível à voltagem com gravações de várias unidades e de potencial de campo local. Orientação emergente espontaneamente e mapas de dominância ocular, abrangendo até 6 x 6 mm (2), foram prontamente observados em macacos anestesiados, mas não em macacos acordados. No entanto, atividade correlacionada espontânea envolvendo domínios de orientação foi observada em macacos acordados. Tanto sob a condição de anestesiado quanto de vigília, a atividade correlacionada espontânea coincidiu com as ondas viajantes. Descobrimos que a atividade espontânea semelhante a mapas de orientação em animais acordados abrange áreas corticais menores em cada instância, mas com o tempo ela aparece em todo V1. Além disso, no macaco acordado, nossos resultados sugerem que a força sináptica foi completamente reorganizada, incluindo conexões entre elementos diferentes da arquitetura funcional. Essas descobertas dão suporte à noção de que a atividade contínua tem muito mais representações de comutação rápida, desempenhando um papel importante na função e no comportamento corticais.

Acredita-se que a dinâmica crítica desempenhe um papel importante no processamento de informações neuronais: redes próximas às críticas exibem avalanches neuronais, cascatas de atividade espaço-temporal que são livres de escala e são consideradas para aumentar a capacidade e transferência de informações. No entanto, a relação exata entre criticidade, consciência e integração de informações permanece obscura. Para caracterizar essa relação, aplicamos análise de avalanche em escala múltipla a dados de imagem de corantes sensíveis à voltagem coletados de animais de várias espécies sob diferentes anestésicos. Descobrimos que a anestesia variou sistematicamente o comportamento de escala da dinâmica neural, uma mudança que se refletiu na complexidade neural reduzida. Essas descobertas foram corroboradas pela aplicação das mesmas análises a um modelo de rede cortical biofisicamente realista, no qual medidas de criticidade em várias escalas foram associadas às propriedades da rede e à capacidade de integração de informações. Nossos resultados implicam que as medidas de criticidade em várias escalas são biomarcadores potenciais para avaliar o nível de consciência.

No córtex visual inicial do gato, padrões de atividade neural semelhantes a mapas de orientação evocados emergem espontaneamente sob anestesia. Para testar se tais padrões estão sincronizados entre os hemisférios, realizamos imagens bilaterais em gatos anestesiados usando um novo corante sensível à voltagem aprimorado. Observamos padrões de atividade semelhantes a mapas abrangendo o córtex visual inicial em ambos os hemisférios simultaneamente. Padrões virtualmente idênticos aos mapas associados às orientações cardinais e oblíquas emergiram como principais componentes principais das flutuações espontâneas, e a intensidade dos estados de orientação transitórios foi correlacionada com sua duração, fornecendo evidências de que esses mapas são estados de atração transitória. Um modelo de massa neural que desenvolvemos reproduziu a dinâmica das transições de estado de orientação suaves e abruptas observadas experimentalmente. O modelo sugere que a atividade semelhante a um mapa surge de modulações lentas no disparo espontâneo em conjunto com a interação entre a excitação e a inibição. Nossos resultados destacam a eficiência e a precisão funcional da conectividade inter-hemisférica.

Objetivo: revisar as aplicações clínicas e o valor diagnóstico do imageador de função retinal (RFI), comparar brevemente o RFI com outros dispositivos de imagem ótica e descrever desenvolvimentos recentes. Métodos: As palavras de pesquisa "Retinal Functional Imager", "imagem óptica", "angiografia de retina", "zona avascular", "zona foveal avascular" e outros termos relacionados foram usados ​​no PubMed para revisar a literatura atual envolvendo o RFI. Resultados: As funções do RFI foram utilizadas em mais de 44 estudos microvasculares, que relataram que a microvasculatura pode alterar a velocidade, morfologia e oximetria quando afetada por uma série de doenças oculares, neurológicas ou sistêmicas. Algoritmos automáticos desenvolvidos recentemente para angiografia não invasiva de grandes regiões retinais, segmentação de vasos, medição do fluxo sanguíneo, velocidade do sangue, diâmetro dos vasos e oximetria podem aprimorar as aplicações clínicas do RFI. Conclusão: O RFI foi usado para caracterizar a microvasculatura retinal sob vários condições de todas as doenças prevalentes da retina, além de algumas doenças do sistema nervoso central (SNC) e sistêmicas. A aplicação do RFI em pesquisas e ambientes clínicos deve ajudar no diagnóstico precoce, apoiar a prevenção de doenças e melhorar o gerenciamento do tratamento.

A atividade interna espontânea desempenha um papel importante nas funções cerebrais superiores. A questão de como ele modula a atividade sensorial evocada e o comportamento tem sido explorada em roedores anestesiados, gatos, macacos e no comportamento de seres humanos. No entanto, a questão complementar de como uma breve entrada sensorial modula a atividade gerada internamente in vivo permanece não resolvida, e o mapeamento de alta resolução dessas interações bidirecionais nunca foi realizado. Integrando metodologias complementares, em nível de população e células isoladas, exploramos essa questão. A imagem com corante sensível à voltagem da atividade da população no córtex somatossensorial de ratos anestesiados revelou que os estados para cima espontâneos foram amplamente diminuídos por um período semelhante a 2 s, mesmo após uma única deflexão fraca do bigode. Este efeito foi máximo no barril estimulado, mas espalhou-se por várias áreas corticais. Uma deflexão de bigode de alta velocidade evocou atividade semelhante a 15Hz. A atividade de imagem de cálcio de dois fótons e as gravações anexadas às células confirmaram os resultados do VSD e revelaram que, por vários segundos, a maioria das células individuais diminuiu seu disparo, mas um pequeno número aumentou o disparo. Comparando a deflexão única com a estimulação de trem longo, encontramos um efeito dominante do primeiro pico populacional. Sugerimos que, no início de uma entrada sensorial, algumas mensagens internas sejam silenciadas para evitar a sobrecarga do processamento de informações sensoriais relevantes recebidas.

Objetivo: Anormalidades circulatórias na retina, nervo óptico e coróide foram detectadas por várias tecnologias em pacientes com glaucoma. No entanto, não há uma compreensão clara do papel do fluxo sanguíneo no glaucoma. O objetivo deste estudo foi comparar as velocidades do fluxo sanguíneo retinal usando o imageador de função retinal (RFI) entre glaucoma e indivíduos saudáveis. Materiais e Métodos: Cinquenta e nove olhos de 46 pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), 51 olhos de 31 indivíduos saudáveis ​​e 28 olhos de 23 pacientes com neuropatia óptica glaucomatosa (NON), mas com perimetria normal, foram recrutados para este estudo. Três olhos de 2 pacientes no grupo de glaucoma e 2 olhos de 1 paciente no grupo NOM tinham pressão normal no momento do diagnóstico. Oitenta e três por cento dos pacientes com glaucoma e 73% dos pacientes no grupo NOM foram tratados com medicamentos anti-glaucoma. Todos os pacientes foram examinados pelo RFI. As diferenças entre os grupos foram avaliadas por modelos lineares mistos. Resultados: A velocidade venosa média no grupo GON (3,8 mm / s) foi significativamente mais rápida do que no glaucoma (3,3 mm / s, p = 0,03) e saudável (3,0 mm / s) , p = 0,005) grupos. A velocidade arterial no grupo GON não foi diferente de nenhum dos outros grupos de estudo (4,7 mm / s). A velocidade arterial e venosa nos olhos do GPAA não foi diferente da dos olhos saudáveis ​​(arterial: 4,3 versus 4,2 mm / s, p = 0,7 venosa: 3,3 versus 3,0 mm / s, p = 0,3). Um subgrupo de 13 pacientes com glaucoma que tinham glaucoma perimétrico em 1 olho e campo visual normal (VF) no outro olho mostrou uma tendência de menor velocidade nos olhos com glaucoma. Conclusões: Mudanças na velocidade do fluxo sanguíneo da retina foram detectadas apenas no período pré -estado perimétrico, mas não no glaucoma perimétrico. Esses achados podem representar desregulação precoce na vasculatura retiniana.

A extração da atividade neuronal de pico de gravações de dois fótons em grande escala permanece um desafio, especialmente em mamíferos in vivo, onde ruídos grandes frequentemente contaminam os sinais. Propomos um método, MLspike, que retorna o trem de pico mais provável subjacente à fluorescência de cálcio medida. Ele se baseia em um modelo fisiológico que inclui flutuações de linha de base e não linearidades distintas para indicadores sintéticos e geneticamente codificados. Os parâmetros do modelo podem ser fornecidos pelo usuário ou estimados a partir dos próprios dados. MLspike é computacionalmente eficiente graças à sua discretização original de representações de probabilidade, além disso, ele também pode retornar probabilidades de pico ou amostras. Comparado com simulações extensivas e dados reais de sete preparações diferentes, superou algoritmos de última geração. Combinado com a descoberta obtida a partir de investigação sistemática de dados (nível de ruído, taxa de spiking e assim por diante) de que o ruído fotônico não é necessariamente o principal fator limitante, nosso método permite a extração de spike de gravações em grande escala, conforme demonstrado em acústico-óptico tridimensional gravações de mais de 1.000 neurônios in vivo.

Os cálculos neurais subjacentes à percepção sensorial, cognição e controle motor são realizados por populações de neurônios em diferentes escalas anatômicas e temporais. Poucas técnicas estão disponíveis atualmente para explorar a dinâmica de populações locais e de grande alcance. A imagem de corante sensível à voltagem (VSDI) revela a atividade da população neural em áreas que variam de algumas dezenas de mícrons a alguns centímetros, ou duas áreas até

10 cm de distância. VSDI fornece uma resolução temporal inferior a um milissegundo e uma resolução espacial de cerca de 50 meses. O sinal do corante enfatiza os potenciais sinápticos subliminares. O VSDI foi aplicado no camundongo, rato, gerbil, furão, musaranho, córtex de gato e macaco, a fim de explorar a propagação lateral da ativação retinotópica ou somatotópica, o padrão espaço-temporal dinâmico resultante da ativação sensorial, incluindo o somatossensorial, olfativo, auditivo e modalidades visuais, bem como a preparação motora e as propriedades da atividade populacional de ocorrência espontânea. Neste capítulo, enfocamos o VSDI in vivo e revisamos os resultados obtidos principalmente no sistema visual em nosso laboratório.

Uma questão central na análise de rede neuronal é como a interação entre neurônios individuais produz comportamento e modificações comportamentais. Esta tarefa depende criticamente de como exatamente os sinais são integrados por células nervosas individuais funcionando como unidades operacionais complexas. As propriedades elétricas regionais dos processos neuronais ramificados que determinam a função de entrada-saída de qualquer neurônio são extraordinariamente complexas, dinâmicas e, no caso geral, impossíveis de prever na ausência de medições detalhadas. Para obter tal medição, seria desejável, idealmente, ser capaz de monitorar, em vários locais, eventos subliminares conforme eles viajam dos locais de origem (contatos sinápticos em dendritos distais) e somam em locais específicos para influenciar a iniciação do potencial de ação. Recentemente, tornou-se possível realizar este tipo de medição usando o registro multisite de alta resolução das alterações do potencial da membrana com corantes sensíveis à voltagem intracelular. Este capítulo analisa o desenvolvimento e a fundação do método de registro de corante sensível à voltagem de neurônios individuais. Atualmente, esta abordagem permite monitorar os transientes do potencial de membrana de todas as partes da árvore dendrítica, bem como de axônios colaterais e espinhas dendríticas individuais.

O desenvolvimento de técnicas de imagem funcional aplicáveis ​​à neurociência e cobrindo uma ampla gama de escalas espaciais e temporais facilitou muito a exploração das relações entre cognição, comportamento e atividade elétrica do cérebro. Para os mamíferos, o neocórtex desempenha um papel particularmente profundo na geração de percepção sensorial, controle do movimento voluntário, funções cognitivas superiores e planejamento de comportamentos direcionados a objetivos. Uma vez que essas funções notáveis ​​do neocórtex não podem ser exploradas em preparações de modelos simples ou em animais anestesiados, a base neural do comportamento deve ser explorada em indivíduos que se comportam despertos. Como a função neocortical é altamente distribuída em muitas regiões de interação rápida, é essencial medir a dinâmica espaço-temporal da atividade cortical em tempo real. Um extenso trabalho em mamíferos anestesiados mostrou que in vivo Voltage-Sensitive Dye Imaging (VSDI) revela a dinâmica do potencial da membrana da população neocortical em resolução temporal de milissegundos e resolução espacial subcolunar. Aqui, descrevemos avanços recentes indicando que o VSDI também já está bem desenvolvido para explorar a função cortical em macacos e camundongos que se comportam. O primeiro modelo animal, o primata não humano, é adequado para a exploração fundamental do comportamento e função cognitiva de nível superior. O segundo modelo animal, o camundongo, se beneficia de um rico arsenal de tecnologias moleculares e genéticas. No macaco, a imagem do mesmo pedaço do córtex, repetidamente, é viável por um longo período de tempo, até um ano. No roedor, o VSDI é aplicável a camundongos com restrição de cabeça em movimento livre e acordados. As interações entre diferentes áreas corticais e diferentes colunas corticais podem, portanto, agora ser mapeadas dinamicamente por meio do VSDI e relacionadas ao comportamento correspondente. Assim, aplicando VSDI a ratos e macacos, pode-se começar a explorar como o comportamento emerge da atividade neuronal em redes neuronais que residem em diferentes áreas corticais.

Objetivo / Objetivo do estudo: Estudar as alterações na velocidade do fluxo sanguíneo da retina em pacientes com degeneração macular relacionada à idade precoce e neovascular (DMRI). Usamos o Retinal Function Imager (RFI, Optical Imaging Ltd., Rehovot, Israel), uma abordagem diagnóstica não invasiva para medir a velocidade do fluxo sanguíneo. Materiais e Métodos: Sessenta olhos de 43 pacientes com DMRI e 53 olhos de 35 indivíduos saudáveis ​​com mais de 50 anos de idade foram recrutados para este estudo. Todos os pacientes foram examinados pelo RFI com análise da velocidade do fluxo sanguíneo dos ramos secundários e terciários das artérias e veias. As diferenças entre os grupos foram avaliadas por modelos lineares mistos. Resultados: A velocidade média em pacientes com DMRI foi significativamente menor em comparação com os controles nas artérias (3,6 +/- 1,4 versus 4,3 +/- 1,0 mm / seg, p = 0,009), mas não nas veias (2,6 +/- 0,9 versus 3,1 + / - 0,6 mm / seg, p = 0,08). Ao comparar a velocidade entre os olhos de DMRI de baixo e alto grau, a velocidade venosa foi mais lenta nos olhos de DMRI de alto grau apenas no grupo "estreito" de vasos. Conclusões: Foi encontrada diminuição da velocidade do fluxo sanguíneo nas artérias retinais em pacientes com DMRI Apesar do fato de que a DMRI é essencialmente uma doença coróide, os vasos retinianos mostram uma anormalidade funcional, o que pode sugerir que a anormalidade vascular nesta doença é mais generalizada.

Medir características microvasculares em tecido cortical e microvasos individuais tem aplicações importantes para imagens funcionais, pesquisa biomédica e diagnósticos clínicos. Abordagens de microscopia de fluorescência multifotônica são mais eficazes e permitem o registro confiável da velocidade dos glóbulos vermelhos (RBC) em vasos individuais, mas requerem a injeção de marcadores fluorescentes. Além disso, apenas um ou poucos vasos em uma pequena área podem ser fotografados por vez. Imagens ópticas baseadas em CCD / CMOS de campo amplo de mudanças intrínsecas de absorção ou reflexão em redes vasculares macroscópicas permitem superar essas deficiências, registrando as trajetórias de RBCs ao longo de vários mm2 de superfície cortical. A velocidade RBC pode então ser extraída desses dados de campo amplo usando algoritmos especializados. Aqui, descrevemos dois deles, que fornecem estimativas de velocidade de RBC robustas que são independentes e podem, portanto, ser usadas como um controle para outro. Embora essa abordagem possa ser usada em qualquer parte do corpo com vasos sanguíneos opticamente acessíveis, aqui mostramos sua aplicação em dois casos: primeiro no córtex cerebral e depois no olho. Nesta última aplicação, vamos entrar em mais detalhes na descrição do imageador de função retinal (RFI): um instrumento de imagem funcional multiparâmetro não invasivo que mede diretamente os parâmetros hemodinâmicos, como velocidade de hemácias retinais, estado oximétrico e respostas metabólicas à ativação fótica. Além disso, permite o mapeamento da perfusão capilar sem nenhum agente de contraste. Esses parâmetros da função retiniana são degradados por anormalidades retinianas. Aqui, nos concentramos, portanto, na caracterização das propriedades dos microvasos. De fato, estudos clínicos sugerem que o conhecimento dessas propriedades deve render múltiplas aplicações clínicas para o diagnóstico precoce de doenças retinais, possível orientação crítica de seu tratamento, bem como implicações para doenças vasculares do córtex e do olho.

A compreensão fundamental das funções cognitivas superiores pode se beneficiar muito da imagem da atividade cortical com alta resolução espaço-temporal no comportamento de primata não humano. Para obter imagens rápidas da dinâmica de alta resolução das representações corticais da atividade espontânea e evocada, criamos um novo protocolo de aquisição de dados para estimulação sensorial intercalando rapidamente vários estímulos em sessões contínuas de imagens ópticas com corantes sensíveis à voltagem.Também testamos um novo algoritmo para a "análise de componentes estruturados temporalmente" (TSCA) de uma série temporal multidimensional que foi desenvolvido para nosso novo protocolo de aquisição de dados, mas foi testado apenas em dados simulados (Blumenfeld, 2010). Além dos dados brutos, o algoritmo incorpora conhecimento prévio sobre a estrutura temporal dos dados, bem como a entrada de outras informações. Aqui, mostramos que o TSCA pode separar com sucesso os componentes do sinal funcional de outros sinais chamados de ruído. A imagem das respostas a múltiplos estímulos visuais, utilizando corantes sensíveis à voltagem, foi realizada no córtex visual de macacos acordados. Múltiplas representações corticais, incluindo mapas de orientação e dominância ocular, bem como a representação retinotópica até então indescritível de estímulos de orientação, foram extraídos em apenas 10 s de imagem, aproximadamente duas ordens de magnitude mais rápido do que realizado por métodos convencionais. Como a abordagem é bastante geral, outras técnicas de imagem também podem se beneficiar do mesmo protocolo de estimulação. Esta metodologia pode, portanto, facilitar explorações de imagens ópticas rápidas em macacos, roedores e outras espécies com uma versatilidade e velocidade que não eram viáveis ​​antes. (C) 2013 publicado pela Elsevier Inc.

JUSTIFICATIVA E OBJETIVO: O Retinal Function Imager (RFI) (Optical Imaging Ltd., Rehovot, Israel) mede a velocidade do fluxo sangüíneo retinal de forma não invasiva. Os autores estudaram a reprodutibilidade dessas medidas e avaliaram o efeito dos componentes fisiológicos sobre elas. PACIENTES E MÉTODOS: Sessenta e sete indivíduos sem patologia retinal foram recrutados. A reprodutibilidade da velocidade foi verificada comparando medições repetidas de RFI. A correlação da velocidade com os parâmetros fisiológicos foi avaliada por modelos lineares e gaussianos mistos. RESULTADOS: A velocidade média foi de 4,2 +/- 0,9 mm / seg arterial e 3,3 +/- 0,8 mm / seg venosa. A variabilidade foi de 7,5% +/- 3,7% e o coeficiente de correlação interclasse foi r = 0,744. A velocidade venosa diminuiu após os 40 anos de idade (0,32 mm / s por década, P & lt,01). A velocidade arterial aumentou com o aumento da pressão arterial média (0,25 mm / seg por 10 mm Hg, P & lt,01). Houve também uma associação positiva entre velocidades e frequência cardíaca (artérias: 0,21 mm / seg por 10 bpm, P & lt.05 veias: 0,22 mm / seg por 10 bpm, P & lt.01). CONCLUSÃO: O RFI fornece uma técnica reprodutível e não invasiva para avaliar as velocidades da retina.

PROPÓSITO. Para estudar os efeitos de curto prazo do bevacizumabe intravítreo (Avastin) na velocidade do fluxo sanguíneo da retina e compará-los aos resultados clínicos avaliados por tomografia de coerência óptica (OCT) e testes de acuidade visual. MÉTODOS. O Retinal Function Imager (RFI) foi usado de forma não invasiva e quantitativa para medir a velocidade do fluxo sanguíneo retinal. Oito pacientes que receberam injeção intravítrea de Avastin para neovascularização coroidal (CNV) foram incluídos neste estudo. Todos foram fotografados pela pré-injeção de RFI e 1 e 7 dias após a injeção. A acuidade visual (VA) e OCT foram registrados antes da injeção e 1 mês após a injeção. As comparações foram realizadas com o teste t de Student pareado e a correlação com o teste de classificação de Spearman. RESULTADOS. Uma boa correlação foi encontrada entre a mudança de 1 mês nas medidas de VA e OCT e a mudança de curto prazo induzida na velocidade do fluxo sanguíneo. As mudanças de velocidade arterial e venosa 1 dia após a injeção se correlacionaram com a mudança VA (p

Informações abrangentes sobre a dinâmica espaço-temporal da resposta vascular são necessárias para sustentar os sinais usados ​​em imagens funcionais baseadas na hemodinâmica. Recentemente, foi demonstrado que a velocidade dos glóbulos vermelhos (RBCs) e suas alterações podem ser extraídas de gravações de imagens ópticas de campo amplo de alterações de absorção intrínseca no córtex. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho de processamento completo para estimativa confiável de velocidade de RBC em redes corticais. Várias etapas de pré-processamento são implementadas: co-registro de imagem, necessário para corrigir pequenos movimentos da vasculatura, segmentação de imagem semiautomática para seleção de vasos rápida e reproduzível, reconstrução de padrões de trajetórias de RBC para cada micro-vaso e espaço-temporal filtragem para aprimorar as características de dados desejadas. A etapa principal da análise é composta por dois algoritmos robustos para estimar o campo de velocidade dos RBCs. O diâmetro do vaso e suas mudanças também são estimados, bem como mudanças locais na intensidade da luz retroespalhada. Essa cadeia de processamento completa é implementada com um pacote de software distribuído gratuitamente. O software usa gerenciamento de dados eficiente para lidar com conjuntos de dados muito grandes obtidos com imagens ópticas in vivo. Ele oferece uma interface gráfica de usuário completa e amigável com ferramentas de visualização para exibir e explorar dados e resultados. Uma estrutura completa de simulação de dados também é fornecida para otimizar o desempenho do algoritmo com relação a várias características dos dados. Ilustramos o desempenho do nosso método em três casos diferentes de dados in vivo. Em primeiro lugar, documentamos a enorme resposta de velocidade de hemácias evocada por uma depressão em expansão no córtex somato-sensorial de rato anestesiado. Em segundo lugar, mostramos a resposta de velocidade provocada por uma estimulação visual no córtex visual de um gato anestesiado. Finalmente, relatamos, pela primeira vez, respostas de velocidade de hemácias visualmente evocadas em uma rede vascular estendida no córtex extra-estriado de macaco acordado. (C) 2011 E

Objetivo: Comparar a velocidade do fluxo sangüíneo retinal em pequenos vasos de pacientes com diabetes mellitus (DM) precoce, sem alterações morfológicas relacionadas à retinopatia diabética, com a de um grupo controle. Métodos: os autores usaram o imageador de função da retina para medir as velocidades do fluxo sanguíneo, de muitos vasos pequenos, simultaneamente. Vinte e três olhos de 14 pacientes com DM precoce e 51 olhos de 31 indivíduos saudáveis ​​foram incluídos. As diferenças entre os pacientes e o grupo controle foram avaliadas por modelos lineares mistos. Resultados: A velocidade venosa média aumentou significativamente no grupo DM (3,8 +/- 1,2 vs. 2,9 +/- 0,5 mm / segundo, P & lt0,0001) do que nos indivíduos saudáveis. A velocidade arterial de pacientes com DM também foi significativamente maior (4,7 +/- 1,7 vs. 4,1 +/- 0,9 mm / segundo, P = 0,03). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos em idade, sexo, frequência cardíaca e pressão arterial sistólica. A pressão arterial diastólica nos pacientes com DM foi menor do que no grupo saudável (P = 0,03). Conclusão: Houve aumento das velocidades do fluxo sanguíneo retiniano arterial e venoso de pacientes com DM precoce sem retinopatia diabética. Esses achados apóiam a noção de que existem anormalidades na função dos vasos em olhos diabéticos antes do desenvolvimento de mudanças estruturais. Essa abordagem não invasiva facilitou a avaliação das anormalidades hemodinâmicas precoces e pode auxiliar na triagem e monitoramento. RETINA 32: 112-119, 2012

As células piramidais nas camadas 2 e 3 do neocórtex de muitas espécies formam coletivamente um sistema agrupado de projeções axonais laterais (o sistema de remendo superficial-Lund JS, Angelucci A, Bressloff PC. 2003. Substratos anatômicos para colunas funcionais no córtex visual primário de macaco macaque . Cereb Cortex. 13: 15-24. Ou arquitetura margarida-Douglas RJ, Martin KAC. 2004. Neuronal circuits of the neocortex. Annu Rev Neurosci. 27: 419-451.), Mas a função desempenhada por esta característica geral do a arquitetura cortical permanece obscura. Comparando a configuração espacial de manchas rotuladas com a configuração de respostas a estímulos de grade flutuantes, descobrimos que as organizações espaciais do sistema de manchas e da resposta cortical são altamente conservadas entre o córtex visual primário de gatos e macacos. Mais importante ainda, a configuração do sistema de remendo superficial reflete-se diretamente no arranjo da função através do córtex visual primário do macaco. Nossos resultados indicam uma relação próxima entre a estrutura do sistema de remendo superficial e respostas corticais que codificam um único valor através da superfície do córtex visual (estados autoconsistentes). Esta relação é consistente com o surgimento espontâneo de padrões de atividade do tipo resposta de orientação durante a atividade cortical em andamento (Kenet T, Bibitchkov D, Tsodyks M, Grinvald A, Arieli A. 2003. Representações corticais emergentes espontaneamente de atributos visuais. Nature. 425: 954 -956.). Concluímos que o sistema de patch superficial é a codificação física de estados corticais autoconsistentes, e que um conjunto de patches rotulados simultaneamente participa de uma rede de representações mutuamente consistentes da entrada cortical.

É apresentado um modelo de campo neural que captura as características essenciais não lineares da dinâmica da atividade em vários milímetros do córtex visual em resposta a estímulos instantâneos e móveis locais. Levamos em consideração os dados fisiológicos obtidos por imagem de corante sensível à voltagem (VSD), que relata a atividade da população mesoscópica em alta resolução espaço-temporal. A estimulação incluiu um único quadrado piscando, uma única barra piscando, o paradigma do movimento de linha - para o qual estudos psicofísicos mostraram que piscar um quadrado brevemente antes de uma barra produz a sensação de movimento ilusório dentro da barra - e controles de quadrados móveis. Consideramos um modelo de campo neural (NF) de duas camadas que descreve uma camada excitatória e uma inibitória de neurônios como um sistema acoplado de equações integro-diferenciais não lineares. Partindo do pressuposto de que a atividade agregada de ambas as camadas é refletida pela imagem VSD, nosso modelo fenomenológico contabiliza quantitativamente os padrões de atividade espaço-temporal observados. Além disso, o modelo generaliza para novos estímulos semelhantes, pois corresponde à atividade evocada por quadrados móveis de velocidades diferentes. Nossos resultados indicam que o feedback de áreas superiores do cérebro não é necessário para produzir padrões de movimento no caso do paradigma de movimento de linha ilusório. A interpretação fisiológica do modelo sugere que uma fração considerável do sinal VSD pode ser devido à atividade inibitória, apoiando a noção de que interações corticais intra-camada equilibradas entre as populações inibitórias e excitatórias desempenham um papel importante na formação de representações de estímulos dinâmicos no córtex visual inicial .

Objetivo: O objetivo deste estudo foi comparar as velocidades do fluxo sangüíneo retinal de pacientes com diabetes e controles saudáveis. Usamos um novo dispositivo que oferece um diagnóstico não invasivo da função retiniana. Métodos: As velocidades de fluxo nas arteríolas e vênulas da retina foram analisadas quantitativamente por imagem de imagem da função da retina em 58 olhos de 42 pacientes com retinopatia diabética não proliferativa e 51 olhos de 32 indivíduos normais. As diferenças de grupo foram avaliadas pelo efeito de modelo misto. Resultados: A velocidade média nos compartimentos arteriais (em mm / s) foi 3,74 +/- 1,09 para o grupo diabético e 4,19 +/- 0,99 para os controles. A velocidade média de todos os segmentos, levando em consideração a frequência cardíaca associada e as larguras dos segmentos individuais, foi 17% mais lenta no grupo de diabéticos (P & lt0,0001). Em ambos os grupos, a velocidade média do compartimento venoso foi menor do que a velocidade arterial (2,61 +/- 0,65 para o grupo diabético 3,03 +/- 0,59 para os indivíduos controle). As velocidades das veias individuais, levando em consideração a frequência cardíaca e a largura dos segmentos, foram 17% mais lentas, em média, no grupo de diabéticos (P & lt0,0001). Conclusão: Nossa medição mostrou velocidades de fluxo significativamente reduzidas nas arteríolas e vênulas da retina de pacientes com diabetes em comparação com controles saudáveis, apoiando a visão da função anormal dos vasos em olhos com retinopatia diabética não proliferativa. RETINA 30: 765-773, 2010

Em áreas visuais primárias, qualquer entrada local é inicialmente transmitida por meio de conexões horizontais, dando origem a um pico transitório de atividade com surround espalhado. Como esse cenário muda quando o estímulo começa a se mover? Experimentos psicofísicos indicam que a localização é diferente para objetos em movimento e flashes estacionários, dependendo da história do estímulo. Demonstramos aqui como estímulos apresentados sucessivamente alteram a dinâmica de ativação cortical. Por uma combinação de gravações eletrofisiológicas e ópticas usando corante sensível à voltagem, chegamos à conclusão de que a atividade de propagação sublimiar pré-ativa regiões corticais muito à frente da entrada talâmica. Tal mecanismo antecipatório pode contribuir em mudanças da posição percebida conforme observado para o efeito flash-lag e ilusão de movimento de linha na psicofísica humana.

A excitação transforma claramente as faculdades de organismos complexos. Embora as mudanças típicas na atividade cortical, como as observadas nas medições de EEG e LFP, estejam associadas à mudança no estado de excitação, ainda não está claro o que, na constituição de tal atividade dependente de estado, permite esse aumento profundo da capacidade. Propusemos a hipótese de que a excitação modula a atividade cortical, tornando-a mais adequada para representar informações. Argumentamos que a capacidade de representação é de natureza dual - requer não apenas que o tecido cortical gere atividade complexa (ou seja, eventos neuronais espaço-temporais), mas também um espaço de atividade cortical complexo (que é composto de tais eventos espaço-temporais). Explicamos que a noção topológica de complexidade - homologia - é a medida pertinente da complexidade dos espaços de atividade neuronal, uma vez que a estrutura homológica indica não apenas o grau em que a atividade subjacente está inerentemente agrupada, mas também registra a dimensionalidade efetiva das configurações formadas por tais clusters. Mudanças desse tipo na estrutura dos espaços de atividade cortical podem servir como base para a capacidade aprimorada de fazer distinções perceptuais / comportamentais ocasionadas pela excitação. Para mostrar a viabilidade dessas idéias, analisamos dados de imagem de corante sensível à voltagem (VSDI) adquiridos do córtex visual de primatas em estados díspares de excitação. Nossos resultados fornecem algum suporte para a teoria: primeiro, à medida que a excitação aumentava, aumentava também a complexidade da atividade (ou seja, a complexidade dos filmes VSDI). Além disso, a complexidade da estrutura do espaço de atividade (que é o espaço do filme VSDI) medida pela homologia persistente - uma medida topológica de complexidade em várias escalas - também aumentou com a excitação.

O Retinal Function Imager (RFI Optical Imaging, Rehovot, Israel) é um instrumento de imagem funcional multiparâmetro não invasivo que mede diretamente os parâmetros hemodinâmicos, como velocidade do fluxo sanguíneo retinal, estado oximétrico e respostas metabólicas à ativação fótica. Além disso, permite o mapeamento da perfusão capilar sem nenhum agente de contraste. Esses parâmetros da função retiniana são degradados por anormalidades retinianas. Esta revisão delineia o desenvolvimento desses parâmetros e demonstra sua aplicabilidade clínica para a detecção não invasiva da função retinal em várias modalidades. Os resultados sugerem múltiplas aplicações clínicas para o diagnóstico precoce de doenças da retina e possível orientação crítica de seu tratamento.

Mapas funcionais obtidos por várias tecnologias, incluindo técnicas de imagem óptica, f-MRI, PET e outros, podem estar contaminados com artefatos biológicos, como padrões vasculares ou grandes manchas de parênquima. Esses artefatos originam-se principalmente de alterações na microcirculação que resultam de alterações de volume dependentes da atividade ou de alterações oximétricas que não coincidem com a atividade neuronal per se. Os métodos padrão nem sempre são suficientes para reduzir esses artefatos, caso em que artefatos espaciais conspícuos mascaram detalhes dos padrões de atividade subjacentes. Aqui, propomos um algoritmo simples que remove com eficiência artefatos biológicos espaciais que contaminam mapas funcionais de alta resolução. Validamos esse procedimento aplicando-o a mapas corticais resultantes de imagens ópticas, com base em sinais de corantes sensíveis à voltagem ou em sinais intrínsecos. Para remover os padrões espaciais vasculares, primeiro construímos um modelo de artefatos típicos (vascular / pulsação cardíaca / vasomoção), usando componentes principais derivados de informações de linha de base obtidas na ausência de estimulação. Em seguida, modificamos esse modelo por meio da minimização de similaridade local (LSM), obtida medindo a similaridade de vizinhança entre os dados contaminados e o modelo de artefato e, em seguida, abolindo a similaridade. LSM, portanto, removeu os padrões espaciais originários dos componentes da vasculatura cortical, incluindo grandes campos de parênquima capilar, ajudando a desvendar detalhes dos padrões de atividade neuronal que de outra forma seriam mascarados por esses artefatos vasculares. Os exemplos obtidos em nossos experimentos de imagem com gatos anestesiados e macacos comportados mostraram que o método LSM é geral e reproduzível, e muitas vezes superior a outros procedimentos disponíveis. (C) 2008 Elsevier B.V. Todos os direitos reservados.

No neocórtex, os neurônios com propriedades de resposta semelhantes são frequentemente agrupados em estruturas semelhantes a colunas, dando origem ao que se tornou conhecido como arquitetura funcional - o mapeamento de várias dimensões de recursos de estímulo na folha cortical. Pelo menos parcialmente, devemos esta descoberta à disponibilidade de várias técnicas de imagens cerebrais funcionais, post-mortem e in-vivo, que se tornaram disponíveis nas últimas duas gerações, revolucionando a neurociência ao fornecer informações sobre a organização espacial dos neurônios ativos em o cérebro. Aqui, nos concentramos em como nossa compreensão dessa arquitetura funcional está ligada ao desenvolvimento dessas metodologias de imagem funcional, especialmente aquelas que geram imagens da atividade neuronal indiretamente, por meio de sinais metabólicos ou hemodinâmicos, em vez de diretamente por meio da medição da atividade elétrica. Algumas dessas abordagens permitem explorar a arquitetura funcional em uma resolução espacial mais alta do que outras. Em particular, a imagiologia óptica de sinais intrínsecos atinge o detalhe marcante semelhante a 50 um e, juntamente com outras metodologias, permitiu caracterizar as respostas metabólicas e hemodinâmicas induzidas pela atividade neuronal evocada sensorialmente. Aqui, revisamos esses achados sobre as características espaço-temporais do acoplamento neurovascular e discutimos suas implicações para imagens cerebrais funcionais, incluindo tomografia por emissão de posição e técnicas de neuroimagem não invasivas, como imagens de ressonância magnética funcional, aplicáveis ​​também ao cérebro humano.

Pouco se sabe sobre o "inverso" do campo receptivo - a região do espaço cortical cujo padrão espaço-temporal de atividade elétrica é influenciado por um determinado estímulo sensorial. Nós nos referimos a essa área ativada como o campo de resposta cortical, cujas propriedades permanecem inexploradas. Aqui, a dinâmica dos campos de resposta cortical evocados no córtex visual por pequenas grades orientadas à deriva local foram explorados usando corantes sensíveis à voltagem. Descobrimos que o campo de resposta cortical era frequentemente caracterizado por um platô de atividade, além da borda do qual a atividade diminuía rapidamente. A localização da borda do platô foi amplamente independente da orientação do estímulo. No entanto, aproximadamente 20 ms após o início do platô, 1-3 picos surgiram nele e foram amplificados por 25 ms. O spiking foi limitado às zonas de pico, cuja localização dependia fortemente da orientação do estímulo.Assim, ao lado da amplificação seletiva de uma resposta supralimiar espacialmente restrita, a ativação mais ampla para logo abaixo do limiar abrange todos os domínios de orientação dentro de uma vizinhança retinotópica bem definida do estímulo atual, preparando o córtex para o processamento de estímulos subsequentes.

No cérebro de vertebrados, os estímulos externos são frequentemente representados em domínios funcionais distintos distribuídos pela superfície cortical. Técnicas de imagem rápida usadas para medir padrões de atividade de população registram filmes com muitos pixels e muitos quadros, ou seja, conjuntos de dados com alta dimensionalidade. Aqui, demonstramos que a análise de componente principal (PCA) seguida por análise de componente independente espacial (sICA) pode ser explorada para reduzir a dimensionalidade dos conjuntos de dados registrados no bulbo olfatório e no córtex somatossensorial de camundongos, bem como no córtex visual de macacos, sem perder as respostas específicas do estímulo. Diferentes populações neuronais são separadas com base em sua ativação espaço-temporal específica de estímulo. Ambas as características de resposta espacial e temporal podem ser obtidas objetivamente, simultaneamente. No bulbo olfatório, grupos de glomérulos com diferentes latências de resposta podem ser identificados. Isso é mostrado para gravações de entrada de neurônio do receptor olfatório medido com um traçador de axônio sensível ao cálcio e para a dinâmica da rede medida com o corante sensível à voltagem RH 1838. No córtex somatossensorial, barris que respondem à estimulação de bigodes simples podem ser detectados automaticamente. Nas colunas de orientação do córtex visual podem ser extraídas. Em todos os casos, os artefatos devido ao movimento, batimento cardíaco ou respiração foram separados do sinal funcional por sICA e podem ser removidos do conjunto de dados. O sICA seguindo PCA é, portanto, uma técnica poderosa para compressão de dados, análise imparcial e dissecação de dados de imagem de atividade populacional, coletados com alta resolução espacial e temporal. (c) 2006 Elsevier Inc. Todos os direitos reservados.

Imagens ópticas, tomografia por emissão de pósitrons e imagens de ressonância magnética funcional (fMRI) dependem de respostas vasculares à atividade neuronal de imagem. Embora essas técnicas de imagem sejam usadas com sucesso para o mapeamento funcional do cérebro, a dinâmica espaço-temporal detalhada dos eventos hemodinâmicos nos vários compartimentos microvasculares permanece desconhecida. Aqui, usamos imagens ópticas de alta resolução na área 18 de gatos anestesiados para explorar seletivamente as alterações do volume sanguíneo cerebral (CBV) evocadas sensorialmente nos vários compartimentos microvasculares corticais. Para evitar os efeitos de confusão das alterações de hematócrito e oximetria, desenvolvemos e usamos um novo traçador de plasma sanguíneo fluorescente e combinamos essas medições com imagens ópticas de sinais intrínsecos em um comprimento de onda quase isosbéstico para hemoglobina (565 nm). A resposta vascular começou no nível arteriolar, espalhando-se rapidamente em direção aos capilares e vênulas. As veias maiores ficaram para trás. Os capilares exibiram alterações claras de volume sanguíneo. As arteríolas e artérias tiveram a maior resposta, enquanto a resposta venosa foi a menor. As informações sobre a dinâmica da tensão de oxigênio específica do compartimento foram obtidas em sessões de imagem usando iluminação de 605 nm, um comprimento de onda conhecido por refletir principalmente as alterações oximétricas, sendo, portanto, mais diretamente relacionado à atividade elétrica do que as alterações do CBV. Essas imagens eram radicalmente diferentes: a resposta começava no nível do parênquima, seguida apenas mais tarde pelos outros compartimentos microvasculares. Esses resultados têm implicações para a modelagem de respostas de fMRI (por exemplo, o modelo de balão). Além disso, os mapas funcionais obtidos por imagem da resposta do CBV capilar foram semelhantes, mas não idênticos aos obtidos usando o sinal oximétrico inicial, sugerindo a presença de diferentes mecanismos regulatórios subjacentes a esses dois processos hemodinâmicos.

Mapas corticais e conexões de feedback são características onipresentes do córtex cerebral visual. O papel das conexões de feedback, no entanto, não é claro. Este estudo teve como objetivo revelar possíveis relações organizacionais entre as projeções de feedback da área V2 e os mapas funcionais de orientação e retinotopia da área V1. A imagem óptica de sinais intrínsecos foi combinada com a histoquímica da citocromo oxidase e anatomia de conexão em macacos-coruja. As injeções de traçador foram administradas em domínios de orientação seletiva em regiões de listras de citocromo oxidase claras e espessas adjacentes à borda entre essas listras. As projeções de feedback de V2 foram consideradas mais difusas do que as conexões horizontais intrínsecas em V1, mas mesmo assim demonstraram agrupamento. Os aglomerados de axônios de feedback projetaram-se preferencialmente para as regiões de citocromo oxidase interblob. A distribuição das orientações preferidas dos domínios destinatários em V1 era ampla, mas parecia enviesada em direção a valores semelhantes à orientação preferida das células projetadas em V2. A distribuição espacial global das projeções de feedback em V1 foi anisotrópica. O eixo principal da anisotropia era sistematicamente paralelo a um eixo retinotópico em V1 correspondendo à orientação preferencial das células de origem em V2. Concluímos que as conexões de feedback de V2 a V1 podem desempenhar um papel no aumento da resposta em V1 aos elementos de contorno colineares.

O avanço no tratamento da cegueira depende do desenvolvimento de novas tecnologias que possibilitem a detecção precoce, o acompanhamento e o tratamento da doença. Os autores descrevem imagens diretas e não invasivas de quatro parâmetros: fluxo sanguíneo, oximetria sanguínea, estado metabólico e vasculatura oculta, particularmente capilares. Estes são parâmetros funcionais da retina conhecidos por serem degradados por doenças retinianas. O novo Retinal Function Imager (Optical Imaging, Ltd., Rehovot, Israel) pode gerar imagens de todos os quatro parâmetros como diferenças de intensidade de refletância intrínseca sobre a superfície da retina. Durante as últimas 2 décadas, a geração de imagens de pequenos sinais ópticos tem sido uma ferramenta poderosa para o mapeamento funcional de alta resolução no neocórtex. Neste artigo: esta tecnologia é aplicada à retina e demonstra uma ferramenta geral para a função retinal de sondagem não invasiva em muitas modalidades. As alterações funcionais por imagem antes do surgimento das consequências anatômicas prometem ser uma ferramenta poderosa para o diagnóstico precoce e o tratamento de doenças retinianas.

Este capítulo mostra que o disparo espontâneo de neurônios individuais está intimamente ligado às redes corticais nas quais eles estão inseridos. A ideia de rede é um conceito central na pesquisa teórica do cérebro e agora finalmente é possível visualizar diretamente as redes corticais e seus estados em ação, em alta resolução espaço-temporal.

Durante as últimas décadas, os neurocientistas se beneficiaram com o surgimento de muitas técnicas poderosas de imagem funcional que cobrem amplas escalas espaciais e temporais. Agora podemos imaginar moléculas individuais controlando a diferenciação celular, crescimento e morte de células individuais e seus neuritos processando entradas elétricas e enviando saídas de circuitos neuronais realizando cálculos neurais in vitro e no cérebro intacto. Atualmente, a imagem baseada em corantes sensíveis à voltagem (VSDI) oferece a mais alta resolução espacial e temporal para imagens de funções neocorticais no cérebro vivo e abriu o caminho para uma nova era na imagem funcional da dinâmica cortical. Facilitou a exploração de mecanismos fundamentais que fundamentam o desenvolvimento, função e plasticidade neocortical no nível do fundo da coluna cortical.

O objetivo final do mapeamento cerebral funcional de alta resolução é uma condição única (mapas de estímulo versus sem estímulo) em vez de imagens diferenciais (comparando dois "mapas de estímulos"), porque os estímulos apropriados ("ortogonais") raramente estão disponíveis. Isso requer alguns componente (s) de sinais hemodinâmicos dependentes de atividade para co-localizar de perto com a atividade elétrica, como o aumento inicial na desoxihemoglobina, mostrado anteriormente para produzir mapas funcionais de condição única de alta qualidade. Por outro lado, as respostas vasculares não locais dominam nos mapas de condição única baseados no volume sanguíneo cerebral (CBV). Os mapas diferenciais de CBV são amplamente restritos ao parênquima, o que implica que parte da resposta de CBV se colocaliza com a atividade elétrica em uma escala espacial fina. Ao remover a ativação vascular de superfície dos dados de imagem óptica, documentamos a existência de um componente de resposta do CBV capilar, regulado em escala espacial fina e produzindo mapas de condição única exibindo uma resolução semelhante a 100 mum. O mapeamento funcional de condição única com base no volume e no fluxo sanguíneo em nível colunar deve, portanto, ser viável, desde que o componente de resposta capilar seja fotografado de forma seletiva.

Explorar ilusões visuais revela princípios fundamentais do processamento cortical. A percepção ilusória do movimento de estímulos imóveis foi descrita há quase um século por psicólogos da Gestalt (1,2). No entanto, os mecanismos neuronais subjacentes permanecem desconhecidos. Para explorar os mecanismos corticais subjacentes à ilusão de 'movimento linear' (3), usamos imagens ópticas em tempo real (4-6), que são altamente sensíveis à atividade subliminar. Examinamos, no córtex visual do gato anestesiado, as respostas a cinco estímulos: um pequeno quadrado estacionário e uma barra longa, um quadrado móvel, uma barra prolongada e a conhecida ilusão de movimento linear (3), um quadrado estacionário que precede brevemente um longa apresentação de barra estacionária. Ao passo que piscar a barra sozinha evocou os padrões de atividade localizados, de curta latência e alta amplitude esperados (7,8), apresentando um quadrado de 60 a 100 ms antes de uma barra induzir os padrões de atividade dinâmica semelhantes aos do movimento rápido. O quadrado anterior, embora fisicamente imóvel, criava uma atividade cortical sublimiar de propagação gradual que deve contribuir para o movimento ilusório, porque era indistinguível das representações corticais do movimento real nessa área. Essas descobertas demonstram o efeito dos padrões espaço-temporais dos potenciais sinápticos subliminares no processamento cortical e na formação da percepção.

O córtex somatossensorial primário do roedor é espontaneamente ativo na forma de despolarizações de membrana localmente sincronizadas (estados UP) separados por períodos hiperpolarizados quiescentes (estados DOWN) tanto sob anestesia quanto durante a vigília silenciosa. Gravações de células inteiras in vivo e gravações de unidade tetrode foram combinadas com imagens de corante sensível à voltagem para analisar a relação da atividade de neurônios piramidais individuais na camada 2/3 para a dinâmica espaço-temporal do conjunto das despolarizações espontâneas. Estas foram breves e localizadas em uma área de uma coluna de barril ou ocorreram como ondas de propagação dependentes da transmissão sináptica glutamatérgica local na camada 2/3. A atividade espontânea inibiu as respostas sensoriais evocadas pela deflexão do bigode, respondendo quase inteiramente pela grande variabilidade de tentativa a tentativa de potenciais pós-sinápticos evocados sensorialmente e potenciais de ação. As respostas sinápticas sensoriais subliminares evocadas enquanto uma área cortical foi despolarizada espontaneamente foram menores, mais breves e espacialmente mais confinadas. Surpreendentemente, as deflexões dos bigodes evocaram menos potenciais de ação durante as despolarizações espontâneas, apesar dos neurônios estarem mais próximos do limiar. A atividade espontânea contínua, portanto, regula a amplitude e a propagação dependente do tempo da resposta sensorial na camada 2/3 do córtex em barril.

A atividade cortical espontânea - atividade contínua na ausência de entrada sensorial intencional - tem sido estudada extensivamente (1), usando métodos que variam de EEG (eletroencefalografia) (2-4), através de imagens de corante sensível à voltagem (5-7), até gravações de neurônios únicos (8,9). Foi demonstrado que a atividade cortical contínua desempenha um papel crítico no desenvolvimento (10-14) e também deve ser essencial para o processamento da percepção sensorial, pois modula a atividade evocada por estímulo (5,15,16) e está correlacionada com o comportamento ( 17). No entanto, seu papel no processamento de informações externas e sua relação com representações internas de atributos sensoriais permanecem desconhecidos. Usando imagens de corantes sensíveis à voltagem, estabelecemos anteriormente uma ligação estreita entre a atividade contínua no córtex visual de gatos anestesiados e o disparo espontâneo de um único neurônio (6). Aqui, relatamos que tal atividade engloba um conjunto de estados corticais que mudam dinamicamente, muitos dos quais correspondem intimamente a mapas de orientação. Quando esse estado de orientação emergia espontaneamente, abrangia várias hipercolunas e era frequentemente seguido por um estado correspondente a uma orientação proximal. Sugerimos que os estados corticais de comutação dinâmica podem representar o contexto interno do cérebro e, portanto, refletir ou influenciar a memória, a percepção e o comportamento.

O processamento sensorial e sua percepção requerem que as informações locais também estejam disponíveis globalmente. De fato, no neocórtex dos mamíferos, a excitação local se espalha por grandes distâncias por meio das conexões horizontais de longo alcance na camada 2/3 e pode se espalhar por uma área cortical inteira se as vias polissinápticas excitatórias também forem ativadas. Portanto, é necessário um equilíbrio entre a excitação local e a inibição surround. Aqui, exploramos os aspectos espaço-temporais da despolarização e hiperpolarização cortical de ratos anestesiados com uretano. Novos corantes sensíveis à voltagem (VSDs) foram usados ​​para visualização de alta resolução em tempo real das respostas corticais às deflexões dos bigodes e estímulos cutâneos da almofada do bigode. Esses avanços facilitaram a geração de imagens da atividade em andamento e das respostas evocadas, mesmo sem o cálculo da média do sinal. Descobrimos que o movimento de um único bigode evocou uma resposta cortical exibindo uma ou três fases. Durante uma resposta trifásica, houve primeiro uma despolarização cortical em uma pequena região cortical do tamanho de um único barril cortical. Posteriormente, essa despolarização aumentou e se espalhou lateralmente de forma oval, preferencialmente ao longo das fileiras do campo barril. Durante a segunda fase, a amplitude da resposta evocada diminuiu rapidamente, provavelmente devido à inibição recorrente. Posteriormente, a terceira fase exibindo um rebote de despolarização foi observada e nítida, e oscilações semelhantes a 16 Hz foram detectadas. As condições de estímulo revelando uma hiperpolarização envolvente da rede durante a segunda fase também foram encontradas. Ao usar um VSD novo e aprimorado, as descobertas presentes lançaram uma nova luz sobre os parâmetros espaciais da intrincada interação cortical espaço-temporal de inibição e excitação.

A atividade cortical espontânea de neurônios individuais é freqüentemente descartada como ruído ou considerada como não tendo significado funcional e, portanto, é ignorada. Nossos resultados sugerem que tais conceitos devem ser revisados. Exploramos a atividade populacional coerente de conjuntos neuronais na área sensorial primária na ausência de uma entrada sensorial. Avanços recentes em imagens ópticas em tempo real com base em corantes sensíveis à voltagem (VSDI) facilitaram a exploração da atividade da população e sua relação íntima com a atividade de neurônios corticais individuais. Foi demonstrado por gravações intracelulares in vivo que o sinal do corante mede a soma das alterações do potencial de membrana em todos os elementos neuronais na área de imagem, enfatizando potenciais sinápticos subliminares e potenciais de ação dendrítica em arborizações neuronais originadas de neurônios em todas as camadas corticais cujos os dendritos atingem as camadas corticais superficiais. Assim, o VSDI nos permitiu visualizar a atividade bastante ilusória em dendritos neuronais que não podem ser explorados prontamente por gravações de uma única unidade. Surpreendentemente, descobrimos que a amplitude desse tipo de atividade subliminar contínua é da mesma ordem de magnitude da atividade evocada. Também descobrimos que esta atividade contínua exibiu alta sincronização ao longo de muitos milímetros de córtex. Em seguida, investigamos a influência da atividade contínua na resposta evocada e mostramos que as duas interagem fortemente. Além disso, descobrimos que estados corticais que estavam anteriormente associados apenas com a atividade evocada podem realmente ser observados também na ausência de estimulação, por exemplo, a representação cortical de uma determinada orientação pode aparecer sem qualquer entrada visual. Esta demonstração sugere que a atividade contínua também pode desempenhar um papel importante em outra função cortical, fornecendo um substrato neuronal para a dependência do processamento de informações sensoriais no contexto, comportamento, memória e outros aspectos da função cognitiva.

Os estudos de imagens ópticas de orientação e preferência de direção no córtex visual normalmente usam a média vetorial para obter mapas de ângulo e magnitude. Este método mostrou singularidades de orientação de meia rotação (cata-ventos) localizadas dentro de regiões de baixa magnitude de vetor de orientação. A preferência de direção é geralmente ortogonal à preferência de orientação, mas frequentemente se desvia disso, particularmente em regiões de baixa magnitude do vetor de direção. As regiões lineares de rápida mudança na preferência de direção terminam nas singularidades de orientação ou próximas. O método de cálculo da média do vetor é problemático, no entanto, porque não separa claramente a variação espacial na largura de ajuste de orientação da variação na altura. Também pode estimar erroneamente a direção preferida em regiões onde a preferência é fraca. Neste artigo, analisamos mapas ópticos do córtex visual do gato ajustando funções de ajuste de modelo às respostas. Este novo método revela características não evidentes anteriormente. A altura e a largura do ajuste de orientação variam independentemente ao longo do mapa: a altura de ajuste é sempre baixa perto das singularidades, no entanto, regiões de largura de ajuste de orientação ampla e estreita podem ser encontradas em regiões de baixa altura de ajuste, frequentemente alternando em forma de raio em torno das singularidades. Os ângulos de orientação e preferência de direção são sempre ortogonais. As reversões na preferência de direção formam linhas que se originam precisamente nas singularidades de orientação.

A dinâmica espaço-temporal da resposta sensorial na camada 2/3 do córtex somatossensorial primário evocado por uma única deflexão de bigode breve foi investigada por imagens simultâneas de corante sensível à voltagem (VSD) e gravações de voltagem de célula inteira (WC) no rato anestesiado combinado com reconstruções de árvores dendríticas e axonais das pirâmides L2 / 3. Gravações de WC simples e duplas de células piramidais indicaram uma forte correlação entre a resposta da população de VSD local e as mudanças de potencial pós-sináptico subliminares simultaneamente medidas na amplitude e no curso do tempo. A primeira resposta VSD foi detectada 10-12 mseg após a deflexão do bigode centrado acima do barril isomórfico ao bigode principal estimulado. Foi restringido horizontalmente ao tamanho de uma única coluna de barril coextensiva com o caramanchão dendrítico das pirâmides relacionadas com coluna de barril em L2 / 3. A propagação horizontal da excitação permaneceu confinada a uma única coluna de barril com fraca deflexão dos bigodes. Com deflexões intermediárias, a excitação espalhou-se em colunas de barril adjacentes, propagando-se duas vezes mais rapidamente ao longo das linhas do campo de barril do que através dos arcos, consistente com as arborizações axonais preferidas em L2 / 3 de neurônios piramidais reconstruídos.Finalmente, maiores deflexões de bigode evocaram excitação espalhando-se por todo o campo de barril dentro de semelhante a 50 mseg antes de diminuir ao longo do próximo semelhante a 250 mseg. Assim, o mapa cortical subliminar que representa uma deflexão de bigode é dinâmico na escala de tempo de milissegundos e depende fortemente da força do estímulo. A ativação espaço-temporal sequencial da rede neuronal excitatória em L2 / 3 por um estímulo sensorial simples pode, portanto, ser explicada principalmente pela restrição colunar de conexões excitatórias L4 a L2 / 3 e o campo axonal das pirâmides relacionadas ao barril.

Um novo método de imagem óptica crônica com base em novos corantes sensíveis à voltagem (VSDs) foi desenvolvido para facilitar as explorações dos padrões espaciais e temporais subjacentes às funções cognitivas superiores no neocórtex de macacos que se comportam. Usando este sistema, fomos capazes de explorar a dinâmica cortical, com alta resolução espacial e temporal, ao longo de um período menor ou igual a 1 ano do mesmo pedaço do córtex. Os córtices visuais de macacos treinados foram corados uma a três vezes por semana e, imediatamente após cada sessão de coloração, o macaco começou a realizar a tarefa comportamental, enquanto as áreas visuais primária e secundária (V1 e V2) foram fotografadas com uma imagem ótica rápida sistema. Imagens de VSD repetidas de longo prazo (VSDI) da mesma área cortical não interromperam a arquitetura cortical normal, conforme confirmado repetidamente por imagens ópticas com base em sinais intrínsecos. Os padrões espaciais de mapas funcionais obtidos por VSDI eram essencialmente idênticos aos obtidos do mesmo pedaço de córtex por imagem com base em sinais intrínsecos. Ao comparar as amplitudes relativas dos sinais evocados e o mapa diferencial obtido usando essas duas metodologias de imagem diferentes, descobrimos que o VSDI enfatiza a atividade subliminar mais do que a imagem baseada em sinais intrínsecos, que enfatizam mais a atividade de spiking. A latência da resposta evocada por VSD em V1 variou de 46 a 68 ms nos diferentes macacos. A amplitude da resposta V2 foi de apenas 20-60% daquela em V1. Conforme esperado pela anatomia, as respostas retinotópicas aos estímulos visuais locais se espalharam lateralmente pela superfície cortical a uma velocidade de difusão de 0,15-0,19 m / s em uma área maior do que o esperado pelo fator de ampliação clássico, atingindo sua extensão espacial anisotrópica máxima em aproximadamente 40 ms. Correlacionamos a dinâmica observada dos padrões de ativação cortical com os movimentos oculares sacádicos do macaco e descobrimos que, devido ao lento deslocamento da resposta cortical em relação aos seus efeitos

Para facilitar a combinação de imagens ópticas com várias técnicas baseadas em eletrodos, nós projetamos e produzimos uma 'janela craniana de topo deslizante' de montagem em crânio e um 'microdrive posicionador de eletrodo' removível. Esses novos dispositivos foram usados ​​para estudar o processamento sensorial em experimentos crônicos e agudos no córtex cerebral de gatos e macacos. Este conjunto permite imagens ópticas simultâneas de sinais intrínsecos ou corantes sensíveis à voltagem combinados com gravação extracelular (gravação de unidade única e múltipla e potencial de campo local), gravação intracelular, microestimulação ou injeção direcionada de traçadores. Depois que a arquitetura funcional é determinada por imagem óptica, os eletrodos são direcionados para um local cortical selecionado sob controle visual total, em uma variedade de ângulos de penetração (30-90 graus), acessando uma grande área cortical. O dispositivo consiste em três partes: (1) uma câmara de montagem em crânio, (2) uma tampa deslizante e (3) um microdrive. O microdrive pode ser facilmente removido e a janela craniana é então selada e coberta com uma tampa protetora plana. Para experimentos crônicos, este arranjo permite que o animal seja manipulado por um longo período enquanto equipado com uma janela craniana selada de volume e peso mínimos, e com risco insignificante de dano acidental ou infecção. (C) 2002 Elsevier Science B.V. Todos os direitos reservados.

Exploramos a dinâmica espaço-temporal da atividade evocada por odor no bulbo olfatório principal (MOB) de rato e camundongo usando imagem de corante sensível à voltagem (VSDI) com uma nova sonda. A alta resolução temporal do VSDI revelou sequências específicas de odor de ativação glomerular. O aumento das concentrações de odor reduziu as latências de resposta, aumentou as amplitudes de resposta e recrutou novas unidades glomerulares. No entanto, a sequência de ativação glomerular foi mantida. Além disso, encontramos atividade MOB distribuída bloqueada ao ciclo de respiração nasal. A distribuição espacial de sua amplitude e fase era heterogênea e alterada pela entrada sensorial de uma maneira específica para o odor. Nossos dados mostram que no bulbo olfatório dos mamíferos, a identidade e a concentração do odor são representadas por padrões espaço-temporais, ao invés de padrões espaciais apenas.

Apresentamos um substituto dural de silicone transparente, que temos usado nos últimos 7 anos para imagiologia da dinâmica cortical em macacos acordados que se comportam. Este substituto nos permitiu registrar opticamente por mais de um ano sinais de corantes intrínsecos ou sensíveis à voltagem. É fino e elástico o suficiente para permitir a passagem do microeletrodo sem nenhum dano, usando controle visual total para direcionar o eletrodo para o local de registro desejável. Este implante tem se mostrado crucial para manter o córtex em boas condições fisiológicas e para preservar suas características ópticas que são necessárias para a imagem óptica. Descrevemos os detalhes do implante cirúrgico do substituto dural de silicone, a manutenção do córtex exposto por longos períodos de tempo, a reação cortical a este implante e suas possíveis implicações clínicas em humanos, e o procedimento de reabilitação em macacos. (C) 2002 Elsevier Science B.V. Todos os direitos reservados.

O campo ocular frontal e a área vizinha 8Ar do córtex dos primatas estão envolvidos na programação e execução de sacadas. A microestimulação elétrica nessas regiões produz sacadas contralaterais de curta latência. Para determinar como a dinâmica espaço-temporal da atividade evocada por microestimulação é convertida em planos sacádicos, usamos uma combinação de imagem óptica em tempo real e microestimulação em macacos que se comportam. Os curtos trens de estimulação evocaram uma onda rápida e generalizada de despolarização seguida por hiperpolarização grande e prolongada inesperada. Durante essa hiperpolarização, as sacadas são quase exclusivamente ipsilaterais, sugerindo um papel importante para a hiperpolarização na determinação do objetivo da sacada.

Como a alta seletividade para a orientação do estímulo emerge no córtex visual? Modelos dominados por feedforward talâmicos de seletividade de orientação predizem seletividade constante durante a resposta visual, enquanto modelos recorrentes intracorticais predizem melhora dinâmica na seletividade. Imaginamos o córtex visual do gato com corantes sensíveis à voltagem para medir a dinâmica de ajuste de orientação de uma grande população de neurônios. A largura da curva de sintonia não se estreitou após o início da resposta, enquanto a diferença entre as respostas preferidas e ortogonais (profundidade de modulação) primeiro aumentou, depois diminuiu. Identificamos uma supressão das respostas evocadas, denominada entalhe de desaceleração-aceleração evocada (DA), que foi maior para a resposta ortogonal. Além disso, a seletividade de pico das curvas de sintonia foi contemporânea ao entalhe DA evocado. Essas descobertas sugerem que, no cérebro do gato, o processamento cortical visual sustentado não restringe o ajuste da orientação, em vez disso, as interações intracorticais podem amplificar a profundidade da modulação e suprimir a resposta ortogonal relativamente mais do que o preferido. Assim, os modelos feedforward e os modelos recorrentes de seletividade de orientação devem ser combinados .

A compreensão das características espaço-temporais do volume sanguíneo cortical evocado sensorialmente e das mudanças de oxigenação é importante do ponto de vista fisiológico, bem como para a interpretação dos resultados obtidos por várias técnicas de neuroirnaging, como imagens ópticas, PET e f-MRI, e para o seu aperfeiçoamento. A imagem detalhada, no entanto, permaneceu indefinida por mais de um século. Nós investigamos o volume de sangue e as alterações de oxigenação em gatos anestesiados e macacos acordados usando imagens intrínsecas em isosbéstica e outros comprimentos de onda, laser Doppler, espectroscopia de imagem, supressão de fosforescência e imagens de fluorescência de respostas dependentes de atividade de sondas extrínsecas injetadas por via intravenosa. Descobrimos que o início das alterações do volume do sangue foi atrasado (& gt 300 ms) em relação a uma diminuição rápida na oxigenação do sangue. Assim, os efeitos do volume sanguíneo não podem simplesmente explicar a "queda inicial". Medições de 570 nm e imagens de alta resolução (80 ms, 19 horas) de um traçador fluorescente injetado na circulação sanguínea facilitaram a resolução das respostas de diferentes compartimentos microvasculares. Os resultados preliminares mostram que as arteríolas lideraram o aumento da volemia, espalhando-se rapidamente para os demais compartimentos microvasculares. As veias ficaram para trás. Mapas funcionais de estímulo vs. branco (mapas de condição única) em um macaco consciente e um gato anestesiado foram obtidos apenas durante a fase inicial de desoxigenação a 605 nm. Mais tarde ou a 570 nm, os artefatos de vasos dominaram. Esses resultados indicaram uma co-localização mais forte do consumo de oxigênio e da atividade elétrica em comparação com o aumento subsequente de volume e fluxo, que não são bem regulados no nível da coluna cortical. (C) 2002 Elsevier Science B.V. Todos os direitos reservados.

Imagens de alta resolução da representação somatotópica da mão no córtex somatossensorial primário do macaco macaque (área S-I) foram obtidas por imagem óptica com base em sinais intrínsecos. Para visualizar os mapas somatotópicos, criamos imagens de respostas ópticas à estimulação tátil suave de cada dedo individual. A ativação evocada pela estimulação de um único dedo foi mais forte em uma faixa transversal estreita (semelhante a 1 x 4 mm) através do giro pós-central. Como esperado, uma organização sequencial dessas bandas foi encontrada. No entanto, uma sobreposição significativa, especialmente para as áreas ativadas dos dedos 3-5, foi encontrada. Surpreendentemente, além dos domínios específicos do dedo, descobrimos que para cada um dos dedos, a estimulação fraca ativou também uma segunda "mancha comum" do córtex, localizada apenas medialmente à representação do dedo. Esses resultados foram confirmados por gravações direcionadas de unidades múltiplas e únicas, guiadas pelos mapas ópticos. Os mapas permaneceram estáveis ​​ao longo de muitas horas de gravação. Ao otimizar os procedimentos de imagem, fomos capazes de obter os mapas funcionais de forma extremamente rápida (por exemplo, o mapa de cinco dedos no macaco macaque pode ser obtido em apenas 5 min). Além disso, descrevemos a imagem óptica intraoperatória da representação da mão no cérebro humano durante a neurocirurgia e, em seguida, discutimos as implicações dos presentes resultados para a resolução espacial alcançável por outras técnicas de neuroimagem, contando com as respostas da microcirculação à atividade elétrica evocada sensorial. Este estudo demonstra a viabilidade do uso de imagens ópticas de alta resolução para explorar de forma confiável a plasticidade de curto e longo prazo das representações corticais, bem como para aplicações no ambiente clínico.

Explorações de aprendizagem e memória, outras mudanças plásticas de longo prazo e funções cognitivas adicionais no cérebro de primata que se comportam se beneficiariam muito com a capacidade de criar imagens da arquitetura funcional dentro do mesmo pedaço do córtex, no nível colunar, por um longo período de Tempo. Desenvolvemos métodos para imagens ópticas de longo prazo com base em sinais intrínsecos e visualizamos repetidamente os mesmos domínios funcionais no córtex de macacos com comportamento por um período que se estende por mais de 1 ano. Usando imagens ópticas e espectroscopia de imagem, primeiro exploramos a relação entre a atividade elétrica e os eventos hemodinâmicos no primata acordado e a comparamos com preparações anestesiadas. Verificamos que, enquanto a amplitude do sinal intrínseco era muito maior no animal acordado, seu padrão temporal era semelhante ao observado nos animais anestesiados. Em ambos os grupos, a concentração de desoxihemoglobina atingiu um pico 2-3 segundos após o início do estímulo. Além disso, o aumento precoce dependente da atividade na concentração de desoxihemoglobina (o "mergulho inicial") foi muito mais co-localizado com a atividade elétrica do que o aumento retardado na concentração de oxiemoglobina, conhecido por estar associado a um aumento no fluxo sanguíneo. As implicações desses resultados para a melhoria da resolução espacial da imagem por ressonância magnética funcional dependente do nível de oxigenação sanguínea são discutidas. Após a caracterização do sinal intrínseco no primata em comportamento, usamos este novo método de imagem para explorar a estabilidade dos mapas corticais no córtex visual primário do macaco. Mapas funcionais de orientação e colunas de dominância ocular foram considerados estáveis ​​por um período superior a 1 ano.

O córtex visual do gato contém um mapa topográfico do espaço visual, além de mapas espacialmente periódicos sobrepostos de dominância ocular, frequência espacial e orientação. É hipotetizado que o layout desses mapas é determinado por duas restrições: continuidade ou mapeamento suave das propriedades do estímulo em toda a superfície cortical e uniformidade de cobertura ou representação uniforme de combinações de recursos do mapa no espaço visual. Aqui, usamos uma medida quantitativa de uniformidade de cobertura (c ') para testar a hipótese de que os mapas corticais são otimizados para cobertura. Quando perturbamos as relações espaciais entre a dominância ocular, a frequência espacial e os mapas de orientação obtidos em regiões únicas do córtex, descobrimos que os mapas corticais estão no mínimo local para c '. Isso sugere que a otimização da cobertura é um princípio organizacional importante que rege o desenvolvimento do mapa cortical.

Revelar o layout dos mapas corticais é importante tanto para compreender os processos envolvidos em seu desenvolvimento quanto para descobrir os mecanismos subjacentes à computação neural. A organização típica dos mapas de orientação no córtex visual do gato é que os ciclos radiais de orientação completos são mapeados em torno das singularidades de orientação. Em contraste, longas zonas lineares de representação da orientação foram detectadas no córtex visual primário do musaranho. Neste estudo, procuramos a existência de longas sequências lineares e amplas zonas lineares nos mapas de preferência de orientação do córtex visual Eat. imagem óptica baseada em sinais intrínsecos foi usada. Longas sequências lineares e amplas zonas lineares de orientação preferencial foram ocasionalmente detectadas ao longo da fronteira entre as áreas 17 e 18, bem como dentro da área 18. Zonas adjacentes de organizações radiais e lineares distintas foram observadas ao longo da área fs de um único hemisfério. No entanto, as organizações radiais e lineares não foram necessariamente segregadas longas (7,5 mm) sequências lineares de orientação preferida foram encontradas embutidas dentro de uma organização de orientação semelhante a catavento típica. Concluímos que, embora a organização radial seja dominante, uma organização perfeitamente linear pode se desenvolver e realizar o processamento relacionado à orientação no córtex visual do gato.

A relação entre a atividade de um único neurônio neocortical e a dinâmica da rede na qual ele está inserido foi explorada por gravações de unidade única e imagens ópticas em tempo real. A taxa de disparo de um único neurônio espontaneamente ativo depende fortemente do padrão espacial instantâneo da atividade contínua da população em uma grande área cortical. Padrões espaciais muito semelhantes de atividade populacional foram observados quando o neurônio disparou espontaneamente e quando foi impulsionado por seu estímulo ideal. Os padrões evocados podem ser usados ​​para reconstruir a atividade espontânea de neurônios individuais.

As técnicas de imagem convencionais forneceram imagens de alta resolução no domínio espacial ou no domínio temporal. A imagem óptica que utiliza corantes sensíveis à voltagem há muito tem o potencial não realizado de alcançar alta resolução em ambos os domínios simultaneamente, fornecendo detalhes espaciais subcolunares com precisão de milissegundos. Aqui, apresentamos uma série de desenvolvimentos em corantes sensíveis à voltagem e instrumentação que tornam prática a imagem funcional da dinâmica cortical, tanto em preparações anestesiadas quanto em vigília, facilitando muito a exploração do córtex. Ilustramos esse avanço analisando a emergência, milissegundo por milissegundo, de mapas de orientação no córtex visual do gato.

O mapeamento cerebral funcional moderno depende de interações da atividade elétrica neuronal com a microcirculação cortical. A existência de uma desoxigenação inicial altamente localizada e evocada por estímulo permanece uma controvérsia. Aqui, as mudanças na tensão de oxigênio dependente da atividade na microcirculação foram medidas diretamente, usando a inibição da fosforescência dependente de oxigênio de um indicador exógeno. O primeiro evento após a estimulação sensorial foi um aumento no consumo de oxigênio, seguido por um aumento no fluxo sanguíneo. Como o consumo de oxigênio e a atividade neuronal estão co-localizados, mas o fluxo sanguíneo atrasado não, a ressonância magnética funcional focada nesta fase inicial renderá uma resolução espacial muito maior, permitindo, em última análise, a visualização não invasiva de módulos de processamento fundamentais no cérebro humano.

Uma série de novas técnicas de imagem estão disponíveis para os cientistas visualizarem o cérebro em funcionamento diretamente, revelando detalhes sem precedentes. Essas técnicas de imagem proporcionaram um novo nível de compreensão dos princípios subjacentes ao desenvolvimento, organização e função corticais. Neste capítulo, vamos nos concentrar em imagens ópticas no cérebro de mamíferos vivos, usando duas técnicas de imagens complementares. A primeira técnica é baseada em sinais intrínsecos. A segunda técnica é baseada em corantes sensíveis à voltagem. Atualmente, essas duas técnicas de imagem óptica oferecem a melhor resolução espacial e temporal, mas também têm limitações inerentes. Forneceremos alguns exemplos de novas descobertas obtidas principalmente em trabalhos realizados em nosso laboratório. O foco estará na compreensão dos aspectos metodológicos que, por sua vez, devem contribuir para o uso ideal dessas técnicas de imagem. Revisões gerais que descrevem o trabalho anterior feito em preparações mais simples foram publicadas em outro lugar (Cohen, 1973 Tasaki e Warashina, 1976 Wagoner e Grinvald, 1977 Wagoner, 1979 Salzberg, 1983 Grinvald, 1984 Grinvald et al., 1985 De Weer e Salzberg, 1986 Cohen e Lesher, 1986 Salzberg et al., 1986 Loew, 1987 Orbach, 1987 Blasdel, 1988, 1989 Grinvald et al., 1988 Kamino, 1991 Cinelli e Kauer, 1992 Frostig, 1994).

Métodos modernos de neuroimagem funcional, como tomografia por emissão de pósitrons (PET), imagens ópticas de sinais intrínsecos e ressonância magnética funcional (fMRI) utilizam mudanças hemodinâmicas dependentes de atividade para obter mapas indiretos da atividade elétrica evocada no cérebro.Enquanto a PET e a IRM sensível ao fluxo mapeiam as alterações do fluxo sanguíneo cerebral (CBF), a imagem óptica e a IRM dependente do nível de oxigenação do sangue mapeiam áreas com alterações na concentração de hemoglobina desoxigenada (HbR), no entanto, a relação entre CBF e HbR durante a ativação funcional nunca foi testado experimentalmente, portanto, investigamos essa relação usando espectroscopia de imagem e técnicas de fluxometria laser-Doppler, simultaneamente, no córtex visual de gatos anestesiados durante a estimulação sensorial. Descobrimos que a alteração microcirculatória mais precoce foi de fato um aumento na HbR, enquanto o aumento do CBF atrasou em mais de um segundo após o aumento da HbR, A HbR aumentada foi acompanhada por um aumento simultâneo na concentração de hemoglobina total (Hbt), provavelmente refletindo um aumento inicial do volume sanguíneo. Descobrimos que as mudanças do CBF atrasaram após as mudanças de Hbt em 1 a 2 segundos ao longo da resposta. Esses resultados apóiam a noção de regulação neurovascular ativa do volume sanguíneo no leito capilar e a existência de um processo passivo retardado de enchimento capilar.

No córtex visual primário, os neurônios com propriedades de resposta semelhantes são organizados em colunas. À medida que mais e mais sistemas colunares são descobertos, torna-se cada vez mais importante estabelecer as regras que governam as relações geométricas entre diferentes colunas. Como um primeiro passo para examinar esta questão, investigamos as relações espaciais entre os domínios de orientação, dominância ocular e frequência espacial na área do gato 17. Usando imagens ópticas de sinais intrínsecos, obtivemos mapas de alta resolução para cada uma dessas características de estímulo do mesmo cortical regiões. Encontramos relações claras entre as colunas de orientação e de dominância ocular: muitas linhas de iso-orientação cruzaram as bordas entre as bordas de dominância ocular em ângulos retos e as singularidades de orientação se concentraram nas regiões centrais das colunas de dominância ocular. Relações geométricas semelhantes, embora mais fracas, foram observadas entre os domínios da orientação e da frequência espacial. Os mapas de dominância ocular e frequência espacial também se mostraram espacialmente relacionados: houve uma tendência dos domínios de baixa frequência espacial evitarem as regiões de fronteira das colunas de dominância ocular. Esse arranjo específico dos diferentes sistemas colunares pode garantir que todas as combinações possíveis de características de estímulo sejam representadas pelo menos uma vez em qualquer região do córtex visual, evitando assim a ocorrência de pontos cegos funcionais para um determinado atributo de estímulo no campo visual.

As frequências espaciais e temporais são atributos importantes da cena visual. É uma questão de longa data se esses atributos são representados de forma espacialmente organizada no córtex visual primário do gato (1-4). Usando imagens ópticas de sinais intrínsecos (5-10), mostramos aqui que os estímulos de grade de diferentes frequências espaciais flutuando em várias velocidades produzem padrões de atividade distintos. Em vez de observar um mapa de mudança contínua de preferência de frequência espacial na superfície cortical, encontramos apenas dois conjuntos distintos de domínios, um preferindo baixa frequência espacial e alta velocidade, e o outro, alta frequência espacial e baixa velocidade. Comparamos o arranjo desses domínios de frequência espaço-temporal com o padrão de coloração da citocromo oxidase, que, com base no trabalho no córtex estriado de primatas, é pensado para refletir a partição do córtex visual em diferentes fluxos de processamento. Descobrimos que as bolhas de citocromo oxidase no córtex estriado de gato coincidem com domínios envolvidos no processamento de conteúdos de baixa frequência espacial e alta frequência temporal da cena visual. Juntamente com outros resultados recentes (11), nossos dados sugerem que os domínios de frequência espaço-temporal são uma manifestação de fluxos paralelos no córtex visual do gato, com padrões distintos de impulsos talâmicos e projeções extra-estriadas.

Palavras-chave: INVIVO DE FLUXO DE SANGUE

O objetivo deste estudo foi explorar a organização funcional da direção do movimento na área do gato 18. Imagens ópticas foram usadas para registrar a atividade das populações de neurônios. Encontramos uma distribuição irregular de regiões corticais exibindo preferência por uma direção em relação à direção oposta de movimento, O grau de agrupamento de acordo com a preferência de direção foi dois a quatro limes menor do que o observado para orientação. Em geral, a preferência de direção mudou suavemente ao longo da superfície cortical, no entanto, foram observadas descontinuidades nos mapas de direção. Essas descontinuidades formaram linhas que separaram pares de manchas com preferência por direções opostas. Os mapas funcionais para direção e preferência de orientação estavam intimamente relacionados, um patch de iso-orientação foi dividido em regiões que exibiram preferência para direções opostas, ortogonais à orientação. Além disso, as linhas de descontinuidade dentro do mapa de direção frequentemente conectavam pontos de singularidade no mapa de orientação. Embora a organização de ambos os domínios estivesse relacionada, as respostas seletivas de direção e orientação eram separáveis, enquanto a resposta seletiva de acordo com a direção do movimento era quase independente do comprimento das barras usadas para estimulação visual, a resposta seletiva à orientação diminuiu significativamente com a diminuição do comprimento das barras. Extensas gravações elétricas de uma e várias unidades, direcionadas a domínios selecionados dos mapas funcionais, confirmaram as características reveladas pela imagem óptica. Concluímos que o processamento significativo da direção do movimento é realizado no início da via visual do gato.

A atividade evocada no córtex dos mamíferos e as respostas comportamentais resultantes exibem uma grande variabilidade para apresentações repetidas do mesmo estímulo. Este estudo examinou se a variabilidade pode ser atribuída à atividade contínua. Padrões de atividade espaço-temporal contínuos e evocados no córtex visual do gato foram medidos com imagens ópticas em tempo real, potenciais de campo local e descargas de neurônios individuais foram registradas simultaneamente, por técnicas eletrofisiológicas. A atividade evocada pareceu determinística, e a variabilidade resultou da dinâmica da atividade em curso, presumivelmente refletindo o estado instantâneo das redes corticais. Apesar da grande variabilidade, as respostas evocadas em tentativas individuais puderam ser previstas pela soma linear da resposta determinística e a precedendo a atividade contínua, a atividade contínua deve desempenhar um papel importante na função cortical e não pode ser ignorada na exploração dos processos cognitivos.

Um método de aprimoramento de imagem, em que sinais analógicos de vídeo são fornecidos, uma imagem analógica de referência é selecionada e os sinais da imagem são digitalizados, os sinais digitalizados são convertidos em sinais de referência analógicos de vídeo, os sinais de referência são sincronizados com sinais analógicos de vídeo para serem aprimorados , os sinais analógicos de referência convertidos são subtraídos dos sinais analógicos de vídeo, e só então os sinais analógicos subtraídos são amplificados, de forma a se obter uma sequência de imagens aprimoradas, em tempo real. Também é fornecido um sistema de aprimoramento de imagem.

1. Nós examinamos a organização espaço-temporal da atividade contínua nas áreas visuais 17 e 18 de gatos, em relação à atividade espontânea de neurônios individuais. Para procurar atividade coerente, sinais de corante sensíveis à voltagem foram correlacionados com a atividade de neurônios individuais pelo uso de média disparada por pico. Em cada sessão de registro, uma área de pelo menos 2 x 2 mm de córtex foi fotografada, com 124 diodos. Além disso, os registros elétricos de duas unidades isoladas, o potencial de campo local (LFP) dos mesmos microeletrodos e o eletroencefalograma de superfície (EEG) foram registrados simultaneamente. 2. Os sinais ópticos registrados a partir do corante foram semelhantes ao LFP registrado no mesmo local. Sinais ópticos registrados de diferentes locais corticais exibiram um curso de tempo diferente. Portanto, a imagem ótica em tempo real fornece informações que são equivalentes de várias maneiras às gravações LFP em vários locais. 3. O disparo espontâneo de neurônios individuais foi altamente correlacionado com os sinais ópticos e com o LFP. Em 88% dos neurônios gravados durante a atividade espontânea, uma correlação significativa foi encontrada entre a ocorrência de um pico e o sinal óptico gravado em uma grande região cortical ao redor do local de gravação. Este resultado indica que a atividade espontânea de neurônios individuais não é um processo independente, mas está bloqueado no tempo para o disparo ou para as entradas sinápticas de vários neurônios, todos ativados de forma coerente, mesmo sem uma entrada sensorial. 4. Para os casos que mostram correlação com o sinal óptico, 27-36% do sinal óptico durante a ocorrência de spikes estava diretamente relacionado à ocorrência de spikes espontâneos em um único neurônio, em uma área de 2 X 2 mm. Na mesma área cortical, 43-55% da atividade estava diretamente relacionada ao estímulo visual. 5. Surpreendentemente, descobrimos que a amplitude dessa atividade contínua coerente, registrada opticamente, era quase tão grande quanto a atividade evocada pela estimulação visual ideal. O ampli

Usamos imagens ópticas com base em sinais intrínsecos para explorar a arquitetura funcional da área MT do macaco-coruja, uma região cortical que se acredita estar envolvida principalmente no processamento de movimento visual. Conforme previsto por relatórios anteriores de uma única unidade, encontramos mapas corticais específicos para a direção dos estímulos visuais em movimento. No entanto, esses mapas de direção não foram distribuídos uniformemente em toda a área MT. Dentro das regiões de direção específica, a ativação produzida por estímulos que se movem em direções opostas se sobrepõe significativamente. Também descobrimos que estímulos de diferentes formas, movendo-se na mesma direção, ativavam diferentes regiões corticais dentro da área MT, indicando que a direção do movimento não é o único parâmetro de acordo com qual área MT do macaco-coruja está organizada. Na verdade, encontramos evidências claras de uma organização robusta para orientação na área MT. Em todo o MT, a preferência de orientação muda suavemente, exceto em descontinuidades isoladas em forma de linha ou ponto. Geralmente, as regiões emparelhadas de preferência de direção oposta foram englobadas dentro de um único domínio de orientação. O grau de segregação nos mapas de orientação foi de 3 a 5 vezes o encontrado nos mapas de direção. Esses resultados sugerem que a área MT, como V1 e V2, possui uma organização funcional rica e multidimensional, e que a orientação, uma variável de forma, é uma dessas dimensões.

O processamento de imagens retinais é realizado nas miríades de arborizações dendríticas de neurônios corticais. Tal processamento envolve integração dendrítica complexa de numerosas entradas, e a saída subsequente é transmitida a vários alvos por extensos eixos axonais. Até agora, os detalhes desse processamento intrincado permaneceram não examinados. Este relatório descreve a utilidade da imagem óptica em tempo real no estudo da atividade da população e na exploração do processamento dendrítico cortical. Em contraste com as gravações de unidade única, os sinais ópticos medem principalmente as mudanças no potencial transmembrana de uma população de elementos neuronais, incluindo os potenciais sinápticos subliminares frequentemente elusivos que afetam a extensa arborização das células corticais. Usando pequenos estímulos visuais com bordas nítidas e imagens em tempo real das respostas corticais, descobrimos que logo após seu início, a atividade cortical se espalha a partir de seu local retinotópico de iniciação, cobrindo uma área pelo menos 10 vezes maior, nas camadas corticais superiores. A atividade se espalha a velocidades de 100 a 250 mu / mseg. Perto da borda V1 / V2 a ativação direta é anisotrópica e detectamos também propagação anisotrópica a '' constante de espaço '' para a propagação foi semelhante a 2,7 mm paralela à borda e semelhante a 1,5 mm ao longo do eixo perpendicular. Além disso, encontramos interações corticais entre atividades corticais evocadas por um pequeno "estímulo central" e por grandes "estímulos circundantes" posicionados fora do campo receptivo clássico. Todos os estímulos surround usados ​​suprimiram a resposta cortical ao estímulo central. Sob algumas condições de estímulo, a supressão de orientação iso-ortogonal foi mais pronunciada do que a supressão de orientação ortogonal. A dependência de orientação da supressão e sua dependência do tamanho de alguns estímulos específicos indicam que pelo menos parte da interação inibitória do centro circundante era de origem cortical. As descobertas relatadas aqui levantam a possibilidade de que a distribuição

Palavras-chave: Anatomia e Morfologia Biologia do Desenvolvimento Neurociências

No córtex visual primário dos primatas, os neurônios que compartilham propriedades de resposta semelhantes são agrupados formando domínios funcionais que aparecem como um mosaico de manchas ou faixas, muitas vezes atravessando toda a profundidade cortical da pia à substância branca. Da mesma forma, cada sítio cortical se conecta lateralmente por meio de uma extensa rede de projeções intrínsecas que são organizadas em vários grupos (manchas) e alcançam distâncias de até alguns milímetros. A relação entre os domínios funcionais e esses patches conectados posteriormente permaneceu uma questão controversa, apesar dos intensos esforços de pesquisa. Para investigar esta relação, obtivemos mapas funcionais de alta resolução da arquitetura cortical por imagens ópticas in vivo. Posteriormente, as injeções extracelulares do marcador anterógrado sensível biocitina foram direcionadas para domínios funcionais selecionados. Dentro do sistema de dominância ocular, descobrimos que as conexões intrínsecas de longo alcance tendiam a ligar as regiões monoculares das colunas de dominância ocular do mesmo olho. Além disso, descobrimos que os domínios binoculares formaram um conjunto separado de conexões na área V1. As regiões binoculares foram seletivamente conectadas entre si, mas não foram conectadas a regiões estritamente monoculares, sugerindo que constituem um sistema colunar distinto. No outro subsistema que subsiste à preferência de orientação, fragmentos de conexões intrínsecas tendiam a vincular domínios que compartilhavam preferências de orientação semelhantes. As análises da precisão dessas conexões indicaram que em ambos os subsistemas funcionais,

Neste estudo, usamos imagens ópticas com base em sinais intrínsecos dependentes de atividade para determinar a distribuição de células que respondem a grades de várias orientações que se movem em diferentes direções na área 18 do córtex visual do gato. Para testar o agrupamento direcional-seletivo de neurônios, comparamos os mapas de atividade cortical obtidos por estimulação com duas grades de orientação idêntica, mas movendo-se em direções opostas. Descobrimos que esses mapas são quase idênticos, sugerindo que os neurônios não são notavelmente agrupados em colunas de direcionalidade. Também comparamos mapas de atividades obtidos com grades de diferentes orientações. Cada um dos mapas de orientação era semelhante aos mapas de 2-desoxiglicose relatados anteriormente. Tendo compilado as informações obtidas a partir das diferentes orientações em um '' mapa de preferência de orientação '', descobrimos, em contraste com relatórios anteriores, que os domínios de iso-orientação não são bandas paralelas alongadas, mas são pequenos remendos organizados em '' cataventos '' ao redor pontos aos quais nos referimos como "centros de orientação". Além disso, mostramos que os únicos locais em que a preferência de orientação muda rapidamente são esses centros de orientação e não linhas ou loops. Além disso, este relatório esclarece que nossas observações sobre a arquitetura funcional da área do gato 18, embora à primeira vista em desacordo com as observações anteriores, são na verdade totalmente consistentes com elas. Portanto, propomos que no córtex visual do gato os padrões de preferência de orientação semelhantes a cataventos formam um mosaico irregular de unidades modulares com uma densidade média de 1,2 cataventos por milímetro quadrado.

As relações entre bolhas de citocromo oxidase, colunas de dominância ocular e domínios de orientação iso, subsistemas subjacentes à percepção visual, foram exploradas no córtex visual primário de macacos macacos. Mapas de alta resolução desses três subsistemas foram adquiridos. Imagens ópticas baseadas em sinais intrínsecos dependentes de atividade revelaram que a característica organizacional mais proeminente da preferência de orientação era um arranjo radial, formando uma estrutura semelhante a um catavento em torno de um ponto de singularidade. Mais de 80% desses cata-ventos foram centralizados ao longo da linha média das colunas de dominância ocular. Os contornos de iso-orientação de cata-ventos adjacentes cruzavam as bordas das colunas de dominância ocular em ângulos aproximadamente retos. Cataventos com direções iguais ou opostas de mudança de preferência de orientação conectavam-se suavemente entre si. Em média, todas as orientações foram igualmente representadas. Exatamente na mesma área cortical, as bolhas de citocromo oxidase, que se acredita estarem envolvidas no processamento de cores, também foram mapeadas, usando a histologia da citocromo oxidase. Como os centros dos cataventos, os centros das bolhas também ficam ao longo da linha média das colunas de dominância ocular. No entanto, os centros das pinwwheels não coincidem com os centros das bolhas, esses dois subsistemas são espacialmente independentes. Módulos de "hipercoluna", cada um incluindo dois cataventos completos em duas colunas adjacentes de ocularidade complementar, bem como porções de algumas bolhas, eram freqüentemente encontrados, mas não pareciam ser a unidade primária de organização cortical. Uma alternativa para hipercolunas é proposta.

Questões de longa data relacionadas aos mecanismos cerebrais subjacentes à percepção podem finalmente ser resolvidas pela visualização direta da arquitetura e função do córtex dos mamíferos. Esse avanço foi realizado com o auxílio de duas técnicas de imagem óptica com as quais se pode ver literalmente como funciona o cérebro. A educação desta tecnologia exigiu uma abordagem multidisciplinar integrando a pesquisa do cérebro com química orgânica, espectroscopia, biofísica, ciências da computação, óptica e processamento de imagens. Além das ramificações tecnológicas, pesquisas recentes lançaram uma nova luz sobre os mecanismos corticais subjacentes à percepção sensorial. As aplicações clínicas dessa tecnologia para o mapeamento preciso da superfície cortical de pacientes durante a neurocirurgia já começaram. Abaixo está um breve resumo de nossa própria pesquisa e uma descrição das especificações técnicas das duas técnicas de imagem óptica. Como toda técnica, a imagem óptica também sofre de limitações severas. Aqui, enfatizamos principalmente algumas de suas vantagens em relação a todas as técnicas de imagem alternativas atualmente em uso. As limitações são discutidas criticamente em nossas revisões recentes. Para uma série de outras revisões, consulte Cohen (1989).

A imagem óptica da arquitetura funcional do córtex, com base em sinais intrínsecos, é uma ferramenta útil para o estudo do desenvolvimento, organização e função do cérebro vivo de mamíferos. Esta técnica relativamente não invasiva é baseada em pequenas mudanças dependentes da atividade das propriedades ópticas do córtex. Até agora, a imagem funcional foi realizada apenas em animais anestesiados. Aqui, estabelecemos que essa técnica também é adequada para explorar o cérebro de primatas que se comportam acordados.Projetamos uma câmara selada crônica e montamos no crânio de um macaco cynomolgus (Macaca fascicularis) sobre o córtex visual primário para permitir a imagem através de uma janela de vidro transparente. A restrição da posição da cabeça por si só foi suficiente para eliminar o ruído do movimento em experimentos de imagens de macacos acordados. A imagem de alta resolução das colunas de dominância ocular e das bolhas de citocromo oxidase foi obtida simplesmente tirando fotos do córtex exposto quando o macaco acordado estava assistindo a filmes de vídeo alternadamente com cada olho. Além disso, os mapas funcionais poderiam ser obtidos sem sincronização da aquisição de dados com a respiração do animal e o eletrocardiograma. A dependência do comprimento de onda e o curso de tempo do sinal intrínseco foram semelhantes em macacos anestesiados e acordados, indicando que as fontes de sinal eram as mesmas. Concluímos, portanto, que a imagem óptica é bem adequada para explorar a organização funcional relacionada às funções cognitivas do cérebro do primata, bem como fornecer uma ferramenta de diagnóstico para delinear as fronteiras corticais funcionais e avaliar as funções adequadas de pacientes humanos durante a neurocirurgia.

O córtex dos mamíferos é organizado de forma colunar: os neurônios que ficam abaixo uns dos outros, da pia à matéria branca, geralmente compartilham muitas propriedades funcionais. Em toda a superfície cortical, células com propriedades de resposta semelhantes também estão agrupadas, formando faixas ou manchas alongadas. Algumas propriedades de resposta, como a preferência de orientação no córtex visual, mudam gradualmente ao longo da superfície cortical, formando "mapas de orientação". Para determinar o layout preciso dos domínios de iso-orientação, o conhecimento das respostas não apenas para uma, mas para muitas orientações de estímulo é essencial. Portanto, a representação exata dos mapas de orientação foi dificultada por dificuldades técnicas e permaneceu controversa por quase trinta anos. Aqui, usamos imagens ópticas in vivo com base em sinais intrínsecos para reunir informações sobre as respostas de um pedaço de córtex a grades em muitas orientações diferentes. Esse conjunto completo de respostas fornece informações detalhadas sobre a estrutura do mapa de orientação em um grande pedaço de córtex da área 18 do gato. Descobrimos que as regiões corticais que respondem melhor a uma orientação formam manchas altamente ordenadas em vez de faixas alongadas. Essas manchas de iso-orientação são organizadas em torno de "centros de orientação", produzindo padrões semelhantes a cataventos, nos quais a preferência de orientação das células muda continuamente ao longo do córtex. Também analisamos nossos dados para mudanças rápidas na preferência de orientação e descobrimos que essas 'fraturas' são limitadas aos centros de orientação. Os cataventos e centros de orientação são uma característica organizacional proeminente que deve ser importante entender seu desenvolvimento, bem como sua função no processamento da informação visual.

O projeto de um macroscópio construído com lentes fotográficas é descrito e várias aplicações são demonstradas. O macroscópio incorpora epi-iluminação, uma abertura numérica de 0,4 e uma distância de trabalho de 40 mm para campos amplos de imagem na faixa de 1,5-20 mm de diâmetro. Em ampliações de 1 x a 2,5 x, as imagens de fluorescência adquiridas com o macroscópio eram 100-700 vezes mais brilhantes do que as obtidas com objetivas de microscópio comerciais em ampliações semelhantes. Em várias aplicações biológicas, a eficiência de coleta de luz aprimorada (20 vezes, típico) não apenas minimizou os efeitos de branqueamento, mas, em conjunto com o rendimento de iluminação aprimorado (15 vezes, típico), também aumentou significativamente a visibilidade do objeto. Fototoxicidade reduzida e aumento da relação sinal-ruído foram observados na imagem óptica em tempo real in vivo da atividade cortical usando corantes sensíveis à voltagem. Além disso, o macroscópio tem uma profundidade de campo 5 a 10 vezes mais fina do que a de um microscópio convencional de baixa potência. Esta profundidade de campo rasa facilitou a imagem da arquitetura cortical com base em sinais corticais intrínsecos dependentes de atividade no cérebro de primata vivo. Nessas medidas de reflexão, grandes artefatos dos vasos sanguíneos superficiais, que foram observados com lentes convencionais, foram eliminados com o macroscópio.

Neste livro, as questões relativas às populações neuronais foram investigadas principalmente usando gravações de uma e várias unidades com eletrodos. A complexidade da organização funcional revelada por esses estudos indica a necessidade de novos métodos que possam obter informações complementares difíceis ou impossíveis de obter com microeletrodos. Métodos de imagem que fornecem mapas de alta resolução espacial ou temporal da organização cortical de grandes áreas corticais são particularmente promissores para estudos de organização funcional.

As medições ópticas do nervo óptico de rato, carregadas com o novo indicador Ca2 + Fura-2, fornecem a primeira evidência da presença de transientes intracelulares rápidos [Ca2 +] dependentes de atividade em axônios mielinizados do sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. Os resultados sugerem que os canais de Ca2 + voltagem-dependentes estão presentes em alguns dos axônios mielinizados. Medições ópticas de axônios corados com corante sensível à voltagem transportado anterogradamente sugerem a presença de condutâncias de potássio dependentes de Ca2 + nesses axônios. Este relatório também demonstra que o Fura-2 pode detectar prontamente mudanças no [Ca2 +] dentro das células como resultado da atividade elétrica, e estabelece sua adequação para medições de transientes intracelulares de Ca2 + no domínio do tempo de milissegundos.

A disponibilidade de corantes sensíveis à voltagem adequados e arranjos de fotodetectores facilitou o monitoramento óptico da atividade elétrica simultaneamente de centenas de locais nos processos de células nervosas individuais, tanto em cultura quanto em gânglios de invertebrados. Este método também fornece uma capacidade única de detectar atividade em muitos neurônios individuais em um gânglio invertebrado inteiro controlando respostas comportamentais específicas. A atividade in vitro de populações individuais de elementos neuronais (corpos celulares, axônios, dentritos ou terminais nervosos) em muitos loci vizinhos em fatias de cérebro de mamíferos ou estruturas cerebrais isoladas foi investigada. Recentemente, os padrões dinâmicos de atividade elétrica evocados no cérebro intacto de vertebrados ou mamíferos por estímulos naturais também foram monitorados. Ao empregar gravação óptica computadorizada e um processador de exibição, as imagens exibidas em vídeo de elementos neuronais podem ser sobrepostas aos padrões correspondentes da atividade elétrica detectada opticamente, permitindo assim que os padrões espaço-temporais da atividade intracelular sejam visualizados em câmera lenta.

Este capítulo descreve uma nova abordagem para investigar a distribuição espaço-temporal da atividade elétrica em sistemas nervosos. Usando corantes sensíveis à voltagem e um sistema de medição eletro-óptico, recentemente se tornou possível monitorar a atividade elétrica simultaneamente de vários locais nos processos de células nervosas individuais, seja em cultura ou em um sistema nervoso central (SNC) intacto in vitro, para detectar a atividade de muitos neurônios individuais controlando uma resposta comportamental em gânglios de invertebrados, ou para acompanhar a atividade de populações de neurônios em muitos loci vizinhos em fatias de cérebro de mamíferos ou no cérebro intacto. Empregando gravações ópticas e um processador de exibição, as imagens das células nervosas aparecem em um monitor de TV quando estão eletricamente ativas. Assim, a propagação da atividade elétrica pode ser literalmente visualizada em câmera lenta. Este capítulo descreve o progresso recente na implementação dessa nova técnica.


Microscopia

Princípios básicos

O advento da microscopia de fluorescência foi um grande passo no estudo de células vivas. Alavancando as emissões características de fluoróforos biológicos excitados, como proteínas fluorescentes, é possível obter informações sobre a estrutura e função celular (Figura 2). Seguindo a microscopia de fluorescência tradicional, vem o desenvolvimento de métodos multi-fótons, onde os fluoróforos são excitados por dois ou mais fótons [35]. A absorção de vários fótons é obtida com um único laser de pulso focado em um ponto limitado por difração na amostra. Com maior potência de pico, há um aumento na probabilidade de absorção de vários fótons levando à excitação de fluoróforo. A fluorescência de dois fótons está representada na Figura 3a. Para atender a energia de excitação, neste caso, dois fótons de 800 nm são usados. Um fóton de 400 nm tem energia equivalente, como pode ser usado na excitação de um único fóton, mas com métodos de vários fótons, apenas a área do foco do laser na amostra é excitada. Devido à excitação mais focada, há um efeito fototóxico geral mais baixo. Além disso, como o espalhamento de fótons de comprimento de onda mais longo é menor, os métodos de múltiplos fótons têm penetração mais profunda quando comparados à excitação de fóton único.

Aplicações de proteínas fluorescentes. (a) Três células epiteliais renais caninas Madin-Darby com GFP-rac1 e dsRed-E-caderina. Rac1 é uma molécula de sinalização pleiotrópica intimamente associada à adesão célula-célula e à motilidade celular. A caderina-E é uma proteína de adesão célula-célula responsável por facilitar a comunicação entre duas células em contato. Barra de escala: 10 μm. Contribuição de Lance Kam (Columbia University, Nova York). (b) Membranas de células endoteliais do cordão umbilical humano visualizadas usando EYFP. Barra de escala: 40 μm. (c) Célula endotelial do cordão umbilical humano marcada com GFP-actina em mitose, com filamentos de actina alinhados em direção aos centríolos. Barra de escala: 30 μm. Contribuição de Samuel Sia (Columbia University, Nova York).

Microscopia de dois fótons de na Vivo Função cerebral. (a) Mecanismo básico de fluorescência de dois fótons. (b) Esquema da preparação cirúrgica do córtex exposto, com janela de vidro selada e posicionamento da objetiva do microscópio. O ponto verde mostra a localização da fluorescência de dois fótons. (c) Exemplos de mapas de dois fótons da vasculatura após injeção intravenosa de fluoresceína conjugada com dextrano. Pontos e listras pretas mostram o movimento dos glóbulos vermelhos. (d) Imagem de canal duplo de sinais neuronais (verdes) e vasculares (vermelhos): (esquerda) Oregon Green 488 BAPTA-1 AM de neurônios sensíveis ao corante de cálcio e (direita) camundongo transgênico expressando proteína fluorescente verde (GFP) em uma subpopulação de neurônios (mouse fornecido por Jeffrey M. Friedman, Rockefeller University, New York) [101]. O vermelho Texas dextran é o traçador intravascular em ambos os casos. (e) Imagem de três canais de modelo de camundongo com doença de Alzheimer Tg2576 APP com corante direcionado a amiloide (azul), neurônios expressando GFP e dendritos (verde) e vasculatura (vermelho). Adaptado de [52] e contribuição de Elizabeth Hillman (Columbia University, Nova York).

Na microscopia STED (Stimulated Emission Depletion) [36, 37], dois lasers pulsados ​​são usados ​​em conjunto para quebrar a barreira de difração. O primeiro pulso de laser tem um comprimento de onda que excita os fluoróforos e é imediatamente seguido por um segundo pulso de laser que esgota a fluorescência. O esgotamento da fluorescência é alcançado quando o comprimento de onda do segundo laser é ajustado para ser maior do que a emissão de fluorescência. A absorção de um fóton do segundo laser induz os elétrons a cair para um nível de energia mais baixo (emissão estimulada), evitando a fluorescência típica. A diferença de área dos dois feixes focalizados deixa apenas uma área muito pequena de onde a fluorescência é detectada. Esta área é menor do que um ponto limitado por difração. Usando STED, as imagens foram capturadas com uma resolução de

30 nm [35]. Em outro estudo usando a amida rhomadina e uma técnica de foto comutação, uma resolução de 15 nm foi alcançada [38]. Em [39, 40], um sistema de captura óptica foi usado para fazer medições de resolução de angstrom de escalonamento de pares de RNA polimerase e, portanto, estabeleceu um importante referencial de resolução em biologia molecular.

A microscopia eletrônica ofereceu uma resolução de

5 nm para imagem de tecido biológico [41]. No entanto, preparar uma amostra para ser visualizada por um microscópio eletrônico é um processo rigoroso que não permite a geração de imagens de amostras vivas [42]. Uma técnica comum de preparação de amostra é a criofixação, que é uma técnica de alta pressão e ultracongelamento que resulta em contraste na microscopia eletrônica [43]. Mesmo que as amostras não sejam mais viáveis, a microscopia eletrônica forneceu insights inestimáveis ​​sobre os detalhes estruturais das organelas e membranas [44].

Os microscópios de força atômica não adquirem informações opticamente, mas sim registrando as forças intermoleculares entre a ponta da sonda e uma superfície. O principal componente de aquisição de informações de um microscópio de força atômica é um cantilever com uma ponta de silício em escala nanométrica. A ponta é aproximada da amostra e a deflexão do cantilever devido às forças de Van der Waals é registrada para gerar um mapa de contorno da superfície da amostra [45, 46]. Em comparação com um microscópio eletrônico, a amostra não precisa de nenhum tratamento especial que realmente destruiria a amostra e impediria sua reutilização. No entanto, o uso de contato ou modo de toque de um microscópio de força atômica, que colide com a superfície da amostra para adquirir medições como tensão, pode danificar mecanicamente as células e o tecido. Outras técnicas de microscopia de sonda incluem microscopia de tunelamento de varredura e microscopia óptica de varredura de campo próximo [47].

Aplicativos atuais

A microscopia de fluorescência é freqüentemente usada em biologia de sistemas e há um forte impulso para o desenvolvimento de métodos de alto rendimento. Na aplicação de telas de RNAi em todo o genoma para documentar o fenótipo para cada gene suprimido [48, 49], pode haver milhões de imagens de uma única tela que pode chegar a vários terabytes de dados [50]. É a modelagem de biologia de sistemas que alivia o gargalo de processamento dessa grande quantidade de dados de imagem de tela de RNAi, fornecendo um meio eficiente de classificação. Com a microscopia de alto rendimento, há muito mais dados gerados do que podem ser anotados ou avaliados manualmente e, portanto, o desenvolvimento de um modelo de classificação eficiente e ajustado é fundamental para desbloquear o potencial dos métodos de alto rendimento.

Como visto na Figura 2, as proteínas fluorescentes podem ser usadas para visualizar muitos aspectos funcionais e estruturais das células. O uso de métodos multi-fótons também pode fornecer informações sobre as mudanças estruturais e bioquímicas das células [51]. Os métodos multi-fótons têm uma ampla gama de aplicações, incluindo na Vivo imagem do cérebro em animais (Figura 3) [52–54], onde a microarquitetura cortical foi investigada com resolução de célula única [55]. Microscópios eletrônicos têm sido usados ​​para elucidar a estrutura da macromolécula [41]. Quanto às aplicações em câncer, microscópios de força atômica têm sido usados ​​para monitorar o estado superenrolado do DNA, que é preferencial à ligação da proteína supressora de tumor p53 [56]. Também em relação à detecção dos níveis de p53 nas células, a microscopia de fluorescência tem sido usada para determinar a eficácia dos adenovírus oncolíticos. Os adenovírus oncolíticos especialmente projetados têm como alvo os tecidos cancerosos e são programados para se replicar se o nível de p53 celular estiver baixo. A terapia oncolítica viral é uma área de pesquisa intensa para o tratamento do câncer e, à medida que as técnicas de microscopia avançam, também aumentará a capacidade de avaliar a eficácia dos vetores virais para a ablação do tumor [57, 58].

Vantagens e limitações

Há muito se afirma que a natureza ondulatória da luz impõe um limite aparentemente fundamental ao poder de resolução de um microscópio. A limitação era de aproximadamente metade do comprimento de onda da luz visível ou 200 nm. Recentemente, houve uma melhora na resolução de mais de 10 vezes com os avanços na microscopia [35, 38]. No entanto, as técnicas ópticas limitaram a penetração, uma vez que a luz se espalha facilmente no tecido. Isso pode ser parcialmente melhorado com o uso de lasers mais potentes, mas isso, por sua vez, pode levar a efeitos de fotodegradação aumentados, o que pode limitar a quantidade de tempo que um experimento pode ser executado.

A microscopia, como outras técnicas modernas de imagem, tornou-se cada vez mais dependente de software para aquisição e análise de imagens. A tecnologia de imagem pode ser aprimorada ou limitada pelo software com o qual está associada. A Tabela 2 contém uma visão geral do software de análise de imagem de microscopia atual. Com avanços em algoritmos de aquisição e microscopia óptica holográfica foi alcançada, pela qual informações tridimensionais completas podem ser adquiridas em uma única imagem [59, 60]. Como resultado, os dados volumétricos da série temporal podem ser coletados sem a necessidade de alterar o foco e digitalizar vários planos z.


Discussão

Aqui, estudamos os padrões e mecanismos espaço-temporais de WD no córtex cerebral. Nós combinamos imagens de lapso de tempo de 2 fótons in vivo de um traçador de membrana fluorescente através de uma janela craniana e lesões mediadas por laser para rastrear a extensão total de WD para árvores axonais corticais não mielinizadas individuais (Fig. 1). Fornecemos novos insights sobre a degeneração do axônio cortical: (1) segmentos abaixo

600 μm de comprimento consistentemente sofrem uma forma mais rápida de WD (roWD) (2) a densidade sináptica, mas não a complexidade da árvore, contribui para o tempo de axônio cortical WD (3) AAD é insignificante em axônios corticais lesionados e (4) semelhante a WD em outras partes do sistema nervoso e AAD, um NAD + - via de sinalização dependente, independente da transcrição, atrasa o axônio cortical roWD e WD.

A imagem óptica in vivo da lesão da medula espinhal forneceu insights únicos sobre os mecanismos de degeneração e regeneração dos axônios nos últimos anos [20, 23, 58]. No entanto, só agora estamos começando a explorar esta ferramenta para entender os princípios da degeneração e regeneração dos axônios no cérebro dos mamíferos [37,38,39,59,60,61]. As limitações dos métodos ópticos através de janelas de vidro para induzir danos locais incluem a incapacidade de modelar tipos mais complexos de condições de lesão, como aquelas encontradas em lesão cerebral traumática ou esclerose múltipla e a dificuldade de obter compostos terapêuticos no cérebro para manipular o ambiente local in vivo [62]. Existem três vantagens principais da transecção axonal mediada por laser em comparação com os métodos relatados anteriormente. Em primeiro lugar, a microcirurgia a laser revela todo o processo de degeneração tão próximo quanto 4–10 μm do local da lesão ao longo da extremidade terminal do axônio [13, 38]. Em contraste, após lesão mecânica ou por picada de agulha, as distorções anatômicas significam que as alterações axonais só podem ser observadas à distância (& gt 100 μm) do local da lesão. Em segundo lugar, a lesão axonal local pode ser induzida sem romper a dura-máter e os vasos sanguíneos sobrejacentes, diminuindo as contribuições de mediadores inflamatórios, reduzindo assim a complexidade das interações celulares e melhorando a reprodutibilidade experimental [38, 63]. Em terceiro lugar, vários neurônios, ou mesmo partes de um neurônio [25], podem ser direcionados simultaneamente com danos mínimos ao tecido circundante [13, 36, 38, 64,65,66,67].A combinação desse método de lesão com o monitoramento seletivo do axolema, ao invés do axoplasma como em estudos anteriores, nos permitiu medir com precisão o tempo das fases de execução da degeneração do axônio, descartando instâncias de fragmentação citoplasmática não acompanhada diretamente pela perda de integridade da membrana (como relatado anteriormente [4, 15], e como nossos dados sugerem que é o caso para AAD, Fig. 5). Esses resultados indicam que componentes axoplasmáticos, como microtúbulos e neurofilamentos, são os primeiros a se alterar no DW, enquanto a membrana axonal persiste por mais tempo, de acordo com esses relatos anteriores [4, 15]. Esperamos que este paradigma e seus refinamentos, por exemplo, por imagens simultâneas do citoesqueleto [68], mitocôndrias [69] e marcadores de membrana, sejam úteis para investigar a degeneração axonal em outros modelos de doença de camundongo (por exemplo, doença de Alzheimer) ou quimérico humano-camundongo modelos, que empregam antecedentes genéticos específicos do paciente [31, 70].

Até onde sabemos, nosso é o primeiro estudo a enfrentar o desafio de monitorar a dinâmica espaço-temporal, bem como lançar luz sobre os mecanismos de WD no córtex cerebral de mamíferos na resolução de um único axônio. Usamos uma estratégia de marcação direcionada principalmente para axônios não mielinizados excitatórios originários da camada cortical 2/3/5/6 e do tálamo, devido à sua vulnerabilidade em várias condições neurodegenerativas e de lesão aguda. A cinética de degeneração relatada cai dentro dos prazos publicados para WD na medula espinhal murina [20], nervos periféricos [71] e nervo óptico [18], mas revela que segmentos corticais do axônio cortical & lt

600 μm têm um padrão de progressão de degeneração espacial e temporal diferente em comparação com WD e AAD. Mesmo que apenas uma pequena porcentagem (& lt 1%) do eixo axonal quando lesionado sofre roWD, roWD afeta até 2-3 vezes mais comprimento do axônio do que AAD [20] (ver arquivo adicional 5).

Em trabalhos anteriores em larvas de peixe-zebra, o comprimento do segmento axonal desconectado não era um parâmetro crítico, não afetando a duração da fase de latência (que aqui chamamos de início) e apenas influenciando ligeiramente a taxa de fragmentação [13]. A diferença nas taxas de fragmentação entre WD e roWD em neurônios corticais de mamíferos (Fig. 2d, g) pode refletir a variabilidade natural do processo de degeneração entre as espécies e o sistema nervoso. Está bem estabelecido que a cinética da degeneração é variável entre os axônios em adultos [11], e ainda mais durante o desenvolvimento. Por exemplo, axônios trigeminais axotomizados no peixe-zebra em desenvolvimento mostram diferenças dependentes do estágio embrionário no tempo de início da degeneração e uma falta distinta de AAD [13]. Outros subtipos de axônio, como aqueles das projeções da linha lateral do peixe-zebra, passam por um processo semelhante ao AAD em que uma lacuna se forma rapidamente em ambos os lados da lesão, embora nenhuma evidência de fragmentação tenha sido detectada [29].

Para axônios corticais, o tempo de iniciação (início, Fig. 2d, e) e fase de execução (cinética de fragmentação, Figs. 2d e 3c) difere dependendo de um comprimento de corte de aproximadamente 600 μm. Nossos dados não são consistentes com um mecanismo baseado em comprimento linear para explicar o início da degeneração do axônio cortical, conforme sugerido por outros que descobriram que segmentos desconectados mais longos levam mais tempo para começar a degeneração, por exemplo, em axônios trigêmeos de peixe-zebra transfectados [13]. Um mecanismo "dependente do limite" provavelmente controla o roWD cortical e o WD conforme ilustrado em um arquivo adicional (consulte o arquivo adicional 2). Pode ser um "fator de proteção" ou um limite baseado em nível de "fator de gatilho de degeneração". Para um limite baseado em nível de 'fator de proteção', a quantidade de um inibidor de degeneração (por exemplo, NAD +, ou enzima sintetizadora de NAD neuro protetora Nmnat2 [14, 72, 73]) diminuiria [74] abaixo de um nível de limite crítico antes do término do processo de resselagem da membrana quebrada (que pode ocorrer dentro de 30 minutos após a lesão in vitro [75]), desencadeando o rápido início da fragmentação. Em segmentos mais longos, a membrana da extremidade cortada selaria novamente antes do esgotamento e, como tal, esses fragmentos persistem. Para um limite baseado em nível de 'fator de gatilho de degeneração', uma quantidade crítica de um gatilho, como influxo de cálcio (por exemplo, via efetores a jusante, como calpaínas [76]), mediado pelo influxo de cálcio extracelular através da extremidade de corte [77, 78], seria rapidamente alcançado em segmentos mais curtos que, portanto, se fragmentariam rapidamente em comparação com segmentos mais longos. A rápida remoção de segmentos axonais curtos e danificados do neurópilo pode ter evoluído como um mecanismo para restaurar rapidamente a homeostase do cérebro e manter o neurópilo livre de detritos.

Nossos resultados sobre a regulação de roWD cortical e WD por mecanismos dependentes de NAD + (Fig. 6) são consistentes com dados anteriores de degeneração sináptica dopaminérgica e estriatal atrasada em camundongos Wld S [79, 80], fornecendo evidência adicional in vivo de que Wld Terapêutica neuroprotetora baseada em S pode ser desenvolvida não apenas para degeneração de fibra mielinizada, mas também para degeneração de fibra de substância cinzenta não mielinizada. Esses resultados demonstram uma maior conservação dos mecanismos moleculares que controlam a WD, apesar dos diferentes padrões espaço-temporais de degeneração em diferentes áreas do sistema nervoso dos mamíferos [26].

Os axônios corticais têm início de degeneração mais retardado quanto maior a densidade de conexões sinápticas (Fig. 4). A perda de sinapses na neurodegeneração pode ocorrer independentemente da perda axonal e do corpo celular, sugerindo que diferentes mecanismos regulam a degeneração desses compartimentos [81,82,83]. Nossa hipótese é que a presença de sinapses limita o esgotamento dos fatores de proteção do axônio ou o acúmulo de gatilhos de degeneração, possivelmente por meio de uma difusão mais lenta ao longo do axônio ou devido a ser reticulada com a maquinaria sináptica, prolongando a fase de latência antes da fragmentação.

No futuro, a abordagem de imagem óptica in vivo usada aqui pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a degeneração do axônio cortical, uma etapa necessária no desenvolvimento de terapias eficazes para neutralizar ou estabilizar a progressão do axônio e perda sináptica no cérebro doente e ferido.


Impulsionando a Biologia com Super Resolução

A microscopia de super resolução revolucionou nossa compreensão da biologia ao lançar luz sobre o mundo molecular além do limite de difração. A microscopia de luz tradicional é limitada a cerca de 200 nm de resolução em circunstâncias ideais, onde a resolução é aproximadamente a metade do comprimento de onda da luz emitida. Tudo o que for menor do que esse limite aparece como um ponto limitado por difração.

O limite de difração (d) está relacionado ao comprimento de onda da luz emitida (λ) e à abertura numérica (NA) da objetiva.

A microscopia de super resolução revelou estruturas até então desconhecidas na biologia e nos mostrou o comportamento dinâmico de moléculas individuais. A microscopia de super resolução usa truques físicos para ver além do limite de difração, incluindo amostras de iluminação com um padrão de mudança, fluorescência de depleção na borda do feixe de excitação e imagens de moléculas únicas. Essas técnicas estão constantemente melhorando com os avanços na criação de corantes, velocidade de aquisição e redução da fototoxicidade.

Talley J. Lambert (2015). Célula da artéria pulmonar de vaca destacando os componentes celulares actina (preto), mitocôndrias (vermelho) e DNA (azul). Competição Nikon Small World. https://www.nikonsmallworld.com/galleries/2015-photomicrography-competition/cow-lung-artery-cell

A iluminação estruturada visualiza padrões e é ideal para imagens ao vivo

Microscopia de iluminação estruturada (SIM) usa uma grade móvel para visualizar padrões e estruturas além do limite de difração. Quando duas grades estão desalinhadas, elas criam padrões de interferência conhecidos como Franjas moiré. Se você conhece a identidade de uma grade, pode deduzir e reconstruir matematicamente a segunda grade a partir das franjas de Moiré. O SIM usa luz de excitação focada em um padrão listrado para fazer uma grade. A amostra atua como a grade desconhecida que é reconstruída.

“Quando uma grade está desalinhada com outra atrás, isso é um Moiré.” https://i.gifer.com/CfiN.gif

O SIM é ideal para imagens de super resolução de amostras vivas devido à sua aquisição rápida e baixa intensidade de iluminação, embora sua resolução seja mais modesta do que outras técnicas de super resolução. O SIM atinge uma resolução lateral de 100 nm e um corte óptico com uma resolução axial de cerca de 300 nm. Outra vantagem do SIM é que ele não requer corantes especializados, permitindo imagens de super resolução em todo o espectro de cores usando corantes padrão. Portanto, é trivial para um usuário pegar uma amostra preparada para microscopia confocal ou de campo amplo e realizar o SIM.

O SIM tem algumas ressalvas. Como a amostra é reconstruída, as imagens finais não são quantitativas, portanto, a análise de colocalização de imagens SIM não deve ser feita usando correlações de intensidade de pixel, mas sim métodos baseados em objeto, como medir a sobreposição de objetos segmentados (ver Hong et al. , (2017)). A consideração cuidadosa da biologia e dos parâmetros de reconstrução é essencial, já que pseudoestruturas fora de foco ("favo de mel") são comuns, especialmente com sinal não pontilhado, como preenchimento de células. Por último, o SIM não tem um bom desempenho ao obter imagens de seções profundas do tecido, pois a dispersão distorce os padrões de iluminação e emissão.

Supressão de fluorescência para uma imagem mais nítida com STED

A microscopia de depleção de emissão estimulada (STED) funciona de maneira semelhante à varredura confocal de feixe, mas diminui o tamanho do ponto fluorescente usando a emissão estimulada, produzindo uma resolução lateral de cerca de 50 nm. Tal como acontece com a imagem, focar o feixe de excitação em uma amostra é limitado por difração. O STED usa um feixe de depleção em forma de rosca (também conhecido como feixe STED) que circunda o feixe de excitação para reduzir a área excitada que fica fluorescente.

Esquema da depleção de STED para reduzir a função de propagação do ponto de fluorescência eficaz (PSF). De Hiersemenzel et al., (2013)

STED é útil para imagens fixas e ao vivo, mas a área de imagem deve ser reduzida para ter resolução de tempo de escala de milissegundos, e o feixe STED de alta intensidade pode contribuir para a fototoxicidade com imagens prolongadas. As amostras requerem preparação especial mínima, além do uso de proteínas fluorescentes compatíveis com STED ou corantes como CF®405M, CF®488A e CF®680R que podem ser esgotados pelo feixe STED. Ao contrário de outras técnicas de super resolução, o STED é quantitativo porque não depende de pós-processamento ou reconstrução.

Imagens confocais (superior) vs STED (inferior) de peroxissomos (azul), vimentina (verde), gigante (vermelho) e poros nucleares (cinza). Adaptado de Winter et al., (2017)

Melhorando STED com Corantes e Lasers Superiores

O STED é comumente limitado a um ou dois canais STED por experimento devido à impraticabilidade do uso de vários feixes STED. Com os avanços na engenharia de corantes, o hiperespectral STED (“Hiper-STED”) foi desenvolvido para gerar imagens simultaneamente de até quatro corantes, incluindo CF®680R usando um único feixe STED (Winter et al., 2017). Juntamente com a detecção espectral, esta técnica aumenta a velocidade da imagem e reduz a fototoxicidade. O laser supercontínuo de luz branca usado no Hyper-STED atualmente tem um custo proibitivo, mas a acessibilidade deve melhorar no futuro com custos de hardware mais baixos e a disponibilidade de mais corantes compatíveis com STED.

Hyper-STED de 3 cores em células vivas rotulando tubulina (verde), retículo endoplasmático (azul) e endossomos (vermelho). Adaptado de Winter et al., (2017)

Imagens de moléculas individuais fornecem uma visão sobre a estrutura e a dinâmica molecular

O advento de corantes brilhantes e fotoestáveis ​​e proteínas fluorescentes permitiu uma nova era de imagens de molécula única para descobrir a ultraestrutura e o comportamento dinâmico de moléculas individuais. Ao coletar fótons de pontos isolados, as técnicas de molécula única calculam a posição mais provável da molécula dentro de uma resolução de 20 nm. A microscopia de reconstrução ótica estocástica (STORM) se baseia na fotoativação aleatória de corantes entre os estados claro e escuro, enquanto seu irmão, a microscopia de localização de fotoativação (PALM), usa a fotoativação de conjuntos de moléculas únicas isoladas para construir uma imagem. O rastreamento de partícula única (SPT) nos mostra o comportamento dinâmico das moléculas à medida que se movem.

Localização de molécula única a partir de uma função de difusão de ponto limitada por difração (Gustafsson et al., N.d.).

STORM oferece resolução incomparável a um custo

STORM oferece a mais alta resolução em microscopia óptica. Ao localizar moléculas únicas, o STORM constrói uma imagem composta feita desses pontos localizados por vários ciclos de fotoativação e branqueamento. STORM tem a intrincada estrutura de montagens intracelulares, incluindo o elegante citoesqueleto axonal, de uma forma que não era possível com as técnicas convencionais. No entanto, STORM sofre de baixa velocidade de aquisição e fototoxicidade devido à exposição constante da amostra ao laser de fotoativação intensa.

STORM revelou a estrutura periódica do axônio (Xu et al., 2013).

STORM usa photoswitching, corantes “piscantes”, como vários corantes CF®, que têm estados distintos de claro e escuro. Embora a geração de imagens ao vivo com STORM seja possível, ela é mais bem aplicada a amostras fixas onde ciclos de imagens suficientes podem ser realizados ou amostras ao vivo onde o movimento do objeto é mínimo. Buffers, rotulagem e condições de montagem precisam ser cuidadosamente otimizados para promover a troca de corante. Tal como acontece com outras técnicas de super resolução, as inovações em corantes estão impulsionando melhorias no STORM. O STORM depende de iluminação intensa e constante, e o STORM multicolor requer tinturas que podem ser separadas espectralmente. Corantes intermitentes espectralmente distintos com brilho molecular aprimorado reduzem a intensidade da iluminação de luz e fototoxicidade, e permitem o STORM multicolor com corantes orgânicos simples.

Rastreamento de molécula única revela comportamento molecular

Enquanto o STORM é usado para obter insights estruturais, o rastreamento de molécula única (SMT) estuda o comportamento dinâmico das moléculas. Experimentos de imagem ao vivo usando STED, SIM ou imagem de microscopia convencional o média comportamento da população de moléculas marcadas, mas experimentos SMT permitem o estudo de moléculas individuais, rendendo informações valiosas, como a existência de populações distintas de moléculas de difusão e parceiros moleculares.

Os experimentos SPT rastreiam as taxas de difusão de proteínas transmembrana (faixas roxas) que interagem com PSD-95 (mapa de densidade pseudocolorado) com (SEP-TM-Bind) ou sem domínio de ligação PSD-95 (SEP-TM-Nonbind) (Li & amp Blanpied, 2016).

O rastreamento de molécula única depende de fluoróforos fotoestáveis. Os pontos quânticos têm sido usados ​​devido ao seu alto brilho e fotoestabilidade, mas são grandes em comparação com corantes orgânicos e proteínas fluorescentes. O desenvolvimento está focado na produção de corantes orgânicos fotoestáveis ​​e proteínas fluorescentes com alto brilho molecular e baixas taxas de fotobranqueamento. Os corantes CF® CF®633 e CF®680R são ideais para rastreamento de molécula única, pois sua excitação vermelho e vermelho distante reduz a fototoxicidade.

Imagem em profundidade com microscopia de 2 fótons

A super resolução e a microscopia convencional são prejudicadas quando se tenta obter imagens profundas no tecido ou em organismos que se comportam. A luz visível é absorvida ou espalhada pelo tecido, limitando sua penetração, mas a luz infravermelha e infravermelha é menos afetada. Enquanto a microscopia de fóton único tradicional excita um fluoróforo com um comprimento de onda de luz absorvido, a microscopia de 2 fótons usa dois fótons de comprimento de onda mais longos. A microscopia de 2 fótons é comumente usada no nível celular ou macroscópico com objetivos de longa distância de trabalho para organização de imagem em nível de órgão com corantes incluindo CF®488A, CF®594 e CF®680R.

A microscopia de 2 fótons também é comumente usada para imagens de biossensores, como cálcio e, recentemente, imagens ultrarrápidas de liberação de dopamina (Patriarchi et al., 2018). Assim, os desenvolvimentos na microscopia de 2 fótons centram-se na velocidade de aquisição e na melhoria da resolução na escala celular por meio da engenharia de corantes. Embora a microscopia de 2 fótons possa penetrar melhor no tecido para excitar as moléculas de corante, a fluorescência emitida também está sujeita ao espalhamento. Para esse fim, foram desenvolvidos corantes red-shifted como CF®680R para melhorar a resolução em imagens profundas.

Tendências de super resolução daqui para frente

A microscopia de super resolução continua a melhorar. As principais áreas de melhoria são os corantes e a preparação de amostras. Recentemente, o SIM foi combinado com os princípios STORM para estender ainda mais sua capacidade de resolução (D. Li et al., 2015). A microscopia de super resolução foi combinada com novos métodos de preparação de amostras, como microscopia de expansão, para analisar ainda mais a organização molecular (Tillberg et al., 2016 Wang et al., 2018 H. Xu et al., 2019).

  1. Dodgson, J., Chessel, A., Cox, S., & amp Carazo Salas, R. E. (2015). Microscopia de Super-Resolução: SIM, STED e Microscopia de Localização. Em T. E. S. Dahms & amp K. J. Czymmek (Eds.), Microscopia Avançada em Micologia (pp. 47-60). Springer International Publishing. https://doi.org/10.1007/978-3-319-22437-4_3
  2. Hiersemenzel, K., Brown, E. R., & amp Duncan, R. R. (2013). Gerando imagens de grandes coortes de canais de íon único e sua atividade. Fronteiras em Endocrinologia, 4. https://doi.org/10.3389/fendo.2013.00114
  3. Hong, S., Wilton, D. K., Stevens, B., & amp Richardson, D. S. (2017). Microscopia de Iluminação Estruturada para a Investigação da Estrutura e Função Sináptica. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1538, 155–167. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6688-2_12
  4. Gustafsson, M. G. L., Betzig, E., Hess, H. F., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., & amp Davidson, M. W. (n.d.). ZEISS Microscopy Online Campus | Introdução à Microscopia de Superresolução. Zeiss Education in Microscopy and Digital Imaging. Recuperado em 7 de julho de 2020, de http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/introduction.html
  5. Li, D., Shao, L., Chen, B.-C., Zhang, X., Zhang, M., Moses, B., Milkie, DE, Beach, JR, Hammer, JA, Pasham, M., Kirchhausen, T., Baird, MA, Davidson, MW, Xu, P., & amp Betzig, E. (2015). IMAGEM AVANÇADA. Imagem de iluminação estruturada de resolução estendida da dinâmica endocítica e do citoesqueleto. Science (Nova York, N.Y.), 349(6251), aab3500. https://doi.org/10.1126/science.aab3500
  6. Li, T. P., & amp Blanpied, T. A. (2016). Controle de difusão de proteína transmembrana dentro da densidade pós-sináptica avaliada por rastreamento de molécula única simultânea e microscopia de localização. Fronteiras na neurociência sináptica, 19. https://doi.org/10.3389/fnsyn.2016.00019
  7. Patriarchi, T., Cho, JR, Merten, K., Howe, MW, Marley, A., Xiong, W.-H., Folk, RW, Broussard, GJ, Liang, R., Jang, MJ, Zhong, H., Dombeck, D., Zastrow, M. von, Nimmerjahn, A., Gradinaru, V., Williams, JT, & amp Tian, ​​L. (2018).Imagem neuronal ultrarrápida da dinâmica da dopamina com sensores projetados geneticamente codificados. Ciência, 360(6396), eaat4422. https://doi.org/10.1126/science.aat4422
  8. Tillberg, P. W., Chen, F., Piatkevich, K. D., Zhao, Y., Yu, C.-C. (Jay), Inglês, BP, Gao, L., Martorell, A., Suk, H.-J., Yoshida, F., DeGennaro, EM, Roossien, DH, Gong, G., Seneviratne, U., Tannenbaum , SR, Desimone, R., Cai, D., & amp Boyden, ES (2016). Microscopia de expansão de retenção de proteína de células e tecidos marcados com proteínas fluorescentes padrão e anticorpos. Nature Biotechnology, 34(9), 987–992. https://doi.org/10.1038/nbt.3625
  9. Wang, Y., Yu, Z., Cahoon, C. K., Parmely, T., Thomas, N., Unruh, J. R., Slaughter, B. D., & amp Hawley, R. S. (2018). Microscopia de expansão combinada com microscopia de iluminação estruturada para analisar complexos de proteínas. Nature Protocols. https://doi.org/10.1038/s41596-018-0023-8
  10. Winter, F. R., Loidolt, M., Westphal, V., Butkevich, A. N., Gregor, C., Sahl, S. J., & amp Hell, S. W. (2017). Nanoscopia multicor de células fixas e vivas com um único feixe STED e detecção hiperespectral. Relatórios Científicos, 7(1), 46492. https://doi.org/10.1038/srep46492
  11. Xu, H., Tong, Z., Ye, Q., Sun, T., Hong, Z., Zhang, L., Bortnick, A., Cho, S., Beuzer, P., Axelrod, J., Hu, Q., Wang, M., Evans, SM, Murre, C., Lu, L.-F., Sun, S., Corbett, KD, & amp Cang, H. (2019). Organização molecular do eixo meiótico do cromossomo de mamíferos revelado por microscopia de expansão STORM. Proceedings of the National Academy of Sciences, 116(37), 18423-18428. https://doi.org/10.1073/pnas.1902440116
  12. Xu, K., Zhong, G., & amp Zhuang, X. (2013). Actina, espectrina e proteínas associadas formam uma estrutura citoesquelética periódica nos axônios. Ciência, 339(6118), 452–456. https://doi.org/10.1126/science.1232251

Christopher Pratt, PhD

Christopher Pratt obteve seu PhD em biologia celular e neurociência pela Carnegie Mellon University em 2016 sob a orientação de Marcel Bruchez, PhD. Para sua tese, ele desenvolveu e aplicou novas sondas fluorescentes para entender o tráfego de vesículas sinápticas e canais iônicos no cérebro, tornando-o um microscopista fervoroso. Com uma paixão por comunicar ciência e dados, Christopher é um colaborador regular do Blog Full Spectrum da Biotium e é um escritor freelance de ciências e medicina, analista e consultor de pesquisa baseado em Chicago, Illinois. Visite seu site, twitter ou LinkedIn e entre em contato!


Resumo

Os hidropersulfetos de glutationa (GSSH) desempenham papéis cruciais na transdução de sinal, homeostase redox e regulação metabólica. No entanto, as funções biológicas detalhadas de GSSH nesses aspectos são extremamente ambíguas. A principal barreira para entender o papel do GSSH em sistemas biológicos é a falta de ferramentas de detecção com alta resolução espaço-temporal. Para resolver esses problemas, estamos buscando novas ferramentas químicas para detecção de GSSH. Aqui, desenvolvemos a primeira sonda fluorescente raciométrica de dois fótons (TP-Dise) para detecção de GSSH com alta resolução espacial e temporal em células e tecidos vivos. Com base em nossa sonda TP-Dise, investigamos a biossíntese de GSSH, e os resultados indicam que GSSH é principalmente de duas sulfurtransferases, CBS e CSE. Além disso, exploramos a função biológica de GSSH na proteção de células de danos celulares induzidos por íons de mercúrio pela primeira vez. Os resultados experimentais indicam que os íons de mercúrio podem induzir a morte celular, causando autofagia mitocondrial. GSSH atua como antagonista e antioxidante e pode efetivamente aliviar os danos causados ​​pelo estresse do mercúrio.


MATERIAIS E MÉTODOS

Animais

Todos os estudos e procedimentos envolvendo animais estiveram em estrita conformidade com as recomendações da Diretiva da Comunidade Europeia (2010/63 / UE) para a proteção de animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros fins científicos. O projeto foi especificamente aprovado pelos comitês de ética do Institut Curie CEEA-IC # 118 e Institut Pasteur (referência # 2015-0008) e pelo Ministério da Pesquisa da França (referências de autorização # 0424003, # 13310-2018020112578233-v1, # 6354- 2016080912028839-v4, # 11206-2017090816044613-v2). Cumprimos os princípios internacionalmente estabelecidos de substituição, redução e refinamento de acordo com o Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório (Conselho Nacional de Pesquisa 2011). Criação, fornecimento de animais, bem como manutenção e cuidados com camundongos no Animal Facility do Institut Curie (licença da instalação # C75-05-18), antes e durante os experimentos, atendeu totalmente às necessidades e bem-estar dos animais. O sofrimento dos animais foi reduzido ao mínimo.

As seguintes linhas do mouse foram utilizadas neste trabalho: R26 mTmG camundongos (24), NMRI-Foxn1 nu / nu (adquirido no Janvier Labs), Pax7 CreERT2 camundongos (30), e Rag KO / KO -GFP camundongos [B6 (Cg) -Rag2 tm1.1Cgn / JTg (UBC-GFP) (25, 26)]. Todos os experimentos foram realizados em camundongos fêmeas de 4 a 8 semanas de idade.

Prototipagem

A concepção tridimensional (3D) da janela, molde e suporte foi realizada usando o SOLIDWORKS 2018 (Dassault Systèmes). A impressão 3D de protótipos de porta-janela foi realizada usando um sistema caseiro [Modelagem de deposição fundida (FDM)] e MultiJetFusion [Hewlett-Packard (HP)] usando vários materiais, predominantemente acrilonitrila butadieno estireno genérico (FDM) e poliamida e polipropileno (PP ) (fusão). Recomendamos a fusão PP para maior resolução de impressão, temperatura e estabilidade higroscópica.

Produção de janelas

Os componentes (A e B) de silicone transparente biocompatível (Elkem) foram misturados na proporção de 1: 1 (A: B) de acordo com as diretrizes do fabricante por 5 min por 50 g de mistura. A mistura foi então desgaseificada por 5 e 10 min (& lt10 mbar) com uma liberação de vácuo entre para maximizar a remoção de ar. A remoção do ar foi concluída por centrifugação da mistura a 1000g por 5 min. A mistura de silicone desgaseificada foi mantida por um máximo de 24 horas a 4 ° C para evitar a polimerização espontânea. As janelas foram produzidas usando um molde de compressão de pegada única de três estágios feito de aço usinado, que foi mantido a 100 ° C durante a moldagem. Aproximadamente 1 ml de silicone foi colocado na pegada antes de fechar o molde e aplicar compressão a 5 toneladas por 10 min. As janelas polimerizadas foram então pós-curadas por pelo menos 24 horas a 60 ° C e subsequentemente lavadas em etanol absoluto antes da autoclavagem. Embora não testado até o momento, os tamanhos dos implantes podem ser modificados (por exemplo, versões menores para locais de tecido específicos) sujeitos à otimização da rigidez do elastômero para preservar as propriedades mecânicas do dispositivo necessárias para manutenção sem sutura.

Caracterização óptica de janelas PDMS

As aberrações óticas, cromáticas e morfológicas dependem do caminho ótico, que inclui a objetiva e o núcleo do microscópio. Portanto, todos os ensaios foram realizados usando uma única configuração de microscópio e água como meio de imagem. Todas as medições foram adquiridas usando uma abertura numérica de 40 × / 1 (NA) objetiva Water DIC PL APO VIS-IR em um microscópio de disco giratório vertical (cabeça de varredura CSU-X1 de Yokogawa Carl Zeiss, Roper Scientific, França), equipada com um Câmera CoolSNAP HQ2 charge-coupled device (CCD) (Photometrics) e software MetaMorph.

Aberrações ópticas (PSF). Para medir o PSF que representa aberrações ópticas decorrentes de alterações de RI, preparamos géis de agarose a 2% contendo 1: 200 de fluoresceína e microesferas modificadas com carboxilato de FluoSpheres diluídas 1: 400 (0,2 μm de diâmetro). Para ambas as janelas de vidro e PDMS, adquirimos oito pilhas de 100 μm com um tamanho de etapa de 0,2 μm em profundidades crescentes da interface janela / gel (Z0, definido usando o sinal de fundo no canal de fluoresceína). PSF foi calculado usando o plugin MetroloJ (33) em Fiji (ImageJ v1.53) em pelo menos 20 contas por seção.

Aberrações cromáticas. Para medir as aberrações cromáticas que representam aberrações ópticas induzidas por alterações de RI específicas do comprimento de onda, preparamos géis de agarose a 2% contendo microesferas TetraSpeck (4 μm de diâmetro) diluídas a 1: 400. Os dados foram adquiridos acima de 200 μm do primeiro grânulo detectado em Z para janelas de vidro e PDMS. As intensidades e exposições do laser foram definidas para obter uma faixa de intensidade semelhante (12 bits). R e Rref foram calculados usando o plugin MetroloJ (33) em Fiji (ImageJ v1.53) em pelo menos 30 contas por condição.

Aberrações morfológicas. Para medir as aberrações morfológicas que podem surgir de uma superfície de janela irregular, fizemos imagens de uma microrrede (Argolight SLG-075, padrão B) usando um comprimento de onda de excitação a laser de 405 nm através de água apenas (descoberto), vidro, PDMS relaxado ou esticado ( a 200%) janela PDMS (ondulada) em duplicatas. As grades de pontos foram segmentadas usando Fiji v1.53 (limiar & gt analisar partículas) e as coordenadas de pontos foram extraídas. Usando um motivo central (cruz 00) e o ponto superior esquerdo (−105 −75), corrigimos a rotação da grade sob os diferentes materiais e comparamos as coordenadas corrigidas de cada ponto para "apenas meio" (medido) ou o Matriz de padrão B teórico (15 × 15 μm). Mapas gráficos de deformação foram gerados usando o pacote R ggplot2 (34).

Implantação de janela

Antes da cirurgia, todos os instrumentos foram esterilizados por autoclave ou esterilização por calor. As janelas PDMS foram esterilizadas em autoclave para evitar o escurecimento. Para garantir a esterilidade durante todo o procedimento, a preparação e manuseio do mouse, o ajuste das taxas de fluxo da anestesia e tarefas semelhantes foram realizadas por um assistente, limitando o cirurgião a entrar em contato apenas com ferramentas cirúrgicas esterilizadas e o campo cirúrgico. A temperatura fisiológica do corpo do camundongo anestesiado foi mantida durante todo o procedimento usando uma câmara de indução aquecida e estação cirúrgica aquecida.

Cuidados pré-operatórios

Antes da anestesia, os camundongos receberam 125 mg / kg de Noroclav (140 mg / ml de amoxicilina 35 mg / ml de ácido clavulânico) e um coquetel analgésico [0,1 mg / kg de buprenorfina (Buprecare) e 5 mg / kg de carprofeno (RIMADYL )] por injeção subcutânea. Os analgésicos foram administrados na dobra cutânea do pescoço para todos os experimentos além da implantação em modelos PDX, onde foram administrados na dobra cutânea da perna posterior.

Preparação do campo cirúrgico

Os camundongos foram anestesiados em uma câmara de indução com 4% de isoflurano (ISOFLURIN). Uma vez anestesiados, os camundongos foram transferidos para uma almofada térmica e a anestesia foi mantida com uma concentração de isoflurano de 1,5 a 2%. Uma pomada oftálmica foi aplicada nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. No local planejado para o implante, o cabelo do camundongo foi aparado com um cortador eletrônico para animais de estimação (Aesculap Exacta). Os pelos residuais foram removidos com creme depilatório por no máximo 2 minutos para minimizar o risco de danos à pele e ressecamento. Cabelos soltos e creme foram removidos usando Betadine Scrub 4% antes de enxágue com água estéril. A pele raspada e áreas adjacentes foram posteriormente desinfetadas com Betadine 10% dérmico. Por fim, a área cirúrgica preparada foi coberta por filme estéril pré-cortado (Tegaderm).

Implantação (realizada pelo cirurgião). Recomendamos as seguintes ferramentas cirúrgicas para limitar os danos à pele e aos tecidos: Pinça Graefe extrafina reta 1 × 2 dentes [para pele e membranas Fine Science Tools (FST) # 11153-10], pinça plana sem corte (para janela e tecido), pinça romba serrilhada (para a janela), tesouras retas finas e afiadas (para pele e membranas FST # 14568-09) e tesouras retas rombas de estrabismo (para dissecar romba a bolsa subcutânea FST # 14574-09).

Para implantar a janela PDSM (Ø18 mm) na área cirúrgica preparada, foi feita uma incisão de 10 mm na pele sobreposta ao tecido de interesse [correspondendo a aproximadamente 15 mm quando esticado (Fig. 2A)]. Em seguida, usando uma tesoura romba, a pele foi cuidadosamente destacada dos tecidos subjacentes aproximadamente 5 a 10 mm ao redor da incisão para gerar espaço suficiente para a janela implantada. Durante todo o procedimento, solução salina pré-aquecida (NaCl 0,9% estéril) foi utilizada para prevenir a desidratação dos tecidos. Antes de posicionar a janela, o local da incisão foi preenchido com solução salina pré-aquecida para minimizar o risco de introdução de ar por baixo da janela durante a implantação. Usando uma pinça fina com bordas rombas e planas, a janela do PDMS foi dobrada ao meio e colocada no bolso da incisão onde foi desdobrada sob a pele. Normalmente, o procedimento desde a primeira incisão até o pré-posicionamento da janela sob a pele era realizado em menos de 3 minutos (fig. S2, A e B). Para encaixar a janela no lugar, as bordas da pele foram posicionadas na ranhura da janela usando duas pinças que alternam entre segurar a moldura superior e deslizar a pele ao redor da janela (semelhante à técnica de ajuste de um pneu em um aro). Durante esta etapa, o tamanho da incisão pode ser ajustado, se necessário, para selar bem a pele ao redor da janela. Usuários experientes são capazes de realizar todo o procedimento cirúrgico em

Cuidados pós-operatórios

Após a cirurgia, os camundongos foram colocados em uma gaiola pré-aquecida (em uma almofada aquecida) para se recuperar da anestesia. Os camundongos foram monitorados de perto quanto a sinais de dor, desconforto e infecção após a implantação da janela. A segunda e última dose do antibiótico Noroclav foi fornecida por injeção subcutânea no dia seguinte à cirurgia. A pele ao redor da janela foi limpa com Betadine dérmico 1% a cada 2 a 4 dias para prevenir infecção. O ibuprofeno foi administrado na água de beber (0,4 mg / ml) durante 7 dias após a cirurgia para minimizar a inflamação e a dor. Se forem observados sinais de dor, analgésicos pós-operatórios [0,1 mg / kg de buprenorfina (Buprecare) e 5 mg / kg de carprofeno (RIMADYL)] podem ser administrados por injeção subcutânea no dia após a cirurgia.

Os camundongos com janelas foram alojados em grupo, sempre que possível, após a cirurgia e fornecidos com enriquecimento de gaiola adequado para recuperação pós-cirúrgica, incluindo material de nidificação, alojamento e bastões de mastigar. O alimento de recuperação (DietGel Recovery, ClearH20) foi fornecido na gaiola para limitar o estresse mecânico de atingir o comedouro. Camundongos alojados individualmente sem enriquecimento ambiental suficiente podem ter maior probabilidade de danificar o dispositivo durante os primeiros 1 a 2 dias após a cirurgia. Técnica cirúrgica asséptica rigorosa, incluindo tratamento preventivo com antibiótico e ibuprofeno, minimiza esse risco, reduzindo a inflamação e a irritação. No geral, os animais mais jovens foram mais propensos a danos na pele decorrentes do procedimento, o que pode ser devido à razão janela / tamanho do animal e / ou aumento da atividade em idades mais precoces. A limpeza da gaiola não pareceu afetar o risco de infecção do implante. Normalmente, os ratos exibiram perda de peso menor no dia após a cirurgia (−4,20 ± 4,74%, dentro dos limites éticos), que foram restaurados no dia 2 (+ 2,93 ± 3,18%). Como esperado, as janelas de PDMS retêm suas características dimensionais após a implantação, não exibindo inchaço discernível como resultado de exposições marginais a fluidos biológicos durante os períodos de estudo (máximo de 35 dias testados).

Manuseando ratos com janela

Quando a implantação é realizada corretamente com assepsia rigorosa, nenhum rato deve perder espontaneamente as janelas implantadas. As janelas correm o risco de deslocamento, no entanto, nos primeiros dias após a cirurgia ao manusear camundongos usando técnicas convencionais de contenção. Assim, recomendamos a adaptação de técnicas de manuseio ao avaliar camundongos nos dias imediatamente após a implantação da janela e considerar o uso de anestesia leve com gás sempre que possível, por exemplo, ao realizar procedimentos como injeção intraperitoneal.

Guia de resolução de problemas para o procedimento de implantação

(A) O ar fica preso sob a janela durante a implantação. Prepare uma seringa de 1 ml com NaCl a 0,9% pré-aquecido estéril e uma agulha de calibre 30. Posicione o mouse de forma que a porta de injeção fique voltada para cima e desinfete-o com etanol 70%. Utilizando uma pinça fina, segure o local da injeção e injete 200 a 500 μl de solução salina por baixo da janela: As bolhas de ar irão mover-se para perto do local da injeção. Aspire lentamente usando a seringa para remover o ar e o máximo possível de solução salina (como demonstrado no filme S4). Seque a porta de injeção. Aguarde até que a solução salina seja absorvida antes de fazer a imagem.

(B) O ar aparece sob a janela após a implantação. Durante a cirurgia, tome cuidado para fazer uma incisão reta. Incisões irregulares e irregulares aumentam o risco de vazamento de ar. Verifique a integridade da janela: Se a janela estiver perfurada, ela deve ser descartada. Verifique cuidadosamente a pele na ranhura quanto a quebras, pois pequenos cortes podem causar vazamento de ar. Se for observado um pequeno corte ou entalhe (máximo de 1 a 2 mm), coloque uma pequena quantidade de cola na ranhura para vedar o vazamento e prossiga para (A). No dia seguinte, verifique cuidadosamente a ausência de bolhas de ar.

(C) Presença de pequena quantidade de fluido (exsudato) e células imunológicas entre o tecido e a janela. Isso é comum por alguns dias após a cirurgia e deve desaparecer após 2 a 3 dias. Para minimizar este risco, reveja o procedimento cirúrgico para garantir uma assepsia rigorosa, verifique / troque o ibuprofeno na água potável e certifique-se de que os alimentos estão acessíveis para limitar o estresse mecânico. Se o exsudato impedir a obtenção de imagens, administre solução salina pré-aquecida através da porta de injeção para enxaguar sob a janela [ver (A) fig. S3E]. Como as células do sistema imunológico podem retornar ao local após a lavagem nos dias seguintes à cirurgia, essa etapa pode precisar ser repetida em uma sessão de aquisição subsequente, dependendo da frequência de imagem desejada.

(D) Cabelo debaixo da janela. Revise a etapa de preparação. Apare uma área maior, se necessário. Um esparadrapo pode ser usado antes da incisão para prender os fios de cabelo perdidos residuais.

(E) A pele fica mais fina ou seca ao redor da janela. Se esse problema ocorrer nos primeiros 7 dias após a implantação, reduza a incubação do creme depilatório e / ou mude de marca. Use uma pinça 1 × 2 dentes para reduzir os danos à pele. Limite os danos à vasculatura ao realizar uma dissecção romba para destacar a pele. Esse problema pode aparecer após a manutenção de longo prazo (& gt2 semanas), mas, em nossa experiência, não afetou a imagem (sem infecção, sem bolhas de ar) quando os cuidados pós-operatórios foram realizados adequadamente.

(F) Pele ou tecido tornam-se necróticos. Encerre imediatamente o experimento. Isso nunca deve acontecer, revise o procedimento cirúrgico (incluindo assepsia, ressecamento do tecido e danos à vasculatura).

Imagem intravital por meio de janelas PDMS

A obtenção de imagens no dia da implantação não é recomendada para evitar estresse adicional na área da cirurgia e restrição excessiva da janela. A solução salina fisiológica residual sob a janela imediatamente após a implantação também pode afetar a profundidade da imagem. Em vez disso, execute imagens no dia seguinte (dia 1), no mínimo. Enquanto o mouse está anestesiado, administrar antibióticos pós-operatórios por injeção subcutânea. Inspecione cuidadosamente o dispositivo e limpe a área cirúrgica conforme descrito acima. Os camundongos são anestesiados com gás usando isoflurano a 4% (ISOFLURIN) inicialmente e mantidos com isoflurano de 1,5 a 2,5% para imagens de curto prazo.Ao realizar imagens de lapso de tempo abrangendo várias horas, reduza a concentração de isoflurano para entre 0,8 e 1,2%. Esses níveis de anestesia são ideais para a manutenção a longo prazo de camundongos em um estado sem resposta com um padrão respiratório lento, constante e não forçado. Padrões respiratórios irregulares e anormais estão associados a anestesia persistente superior a 1,5%, o que perturba a imagem (aumenta as deformações de imagem induzidas por movimento) e pode diminuir os tempos de sobrevivência (35) Respiração rápida e respostas reflexas indicam anestesia insuficiente, o que também perturba a imagem e aumenta o risco do camundongo despertar durante a imagem.

Antes da imagem

Para manter a hidratação do animal para imagens de curto prazo (& lt2 a 3 horas), administrar 250 μl / 10 g de solução salina por injeção subcutânea após a indução da anestesia. Em experimentos que excedem 3 horas, a hidratação do camundongo pode ser mantida durante a imagem usando uma infusão subcutânea ou intraperitoneal de glicose e eletrólitos (

50 a 100 μl / hora) por meio de uma linha interna. Nosso suporte personalizado, adaptado para microscópios verticais (pronto para imprimir arquivos STL fornecidos no arquivo de dados S1), permite a imobilização de corpos regionais por compressão. Uma estrutura cônica rígida (contendo meio de imersão, geralmente água) pressiona a borda da janela, permitindo que o tecido e a janela sejam expostos e esticados sob a objetiva enquanto o mouse repousa sobre uma cama de espuma, que preserva a respiração enquanto amortece os movimentos. O mouse é posicionado no suporte de imagem e gentilmente empurrado no palco estático, centralizando a janela na abertura cônica. O mouse deve ser fortemente restrito para que a espuma absorva a compressão excessiva. O mouse é então observado por 5 minutos para verificar a respiração e a estabilidade da anestesia. Antes de colocar o suporte na platina do microscópio, a abertura cônica é preenchida com 2 a 3 ml de água pura. O suporte pode ser adaptado para configurações de microscópio invertido, usando meio de imersão à base de gel em vez de água para geração de imagens. Crítico: Não use meio de imagem à base de óleo com janelas de PDMS, pois os solventes hidrofóbicos podem resultar em inchaço da janela, fragilidade e toxicidade para os tecidos subjacentes. Colocar uma lamela de vidro sobre a janela do PDMS pode permitir o uso de objetivas à base de óleo para imagens de estruturas de tecidos superficiais, desde que o material subjacente permaneça totalmente protegido.

Durante a imagem

Encontre estruturas de interesse usando campo claro ou fluorescência com as oculares. Durante a digitalização, otimize a potência do laser e os tempos de exposição para minimizar a fototoxicidade e a saturação de pixels. As janelas PDMS são resistentes a rajadas de laser de alta potência e, portanto, são compatíveis com aplicações de fotodegradação e fotoablação localizadas.

Depois da imagem

O meio de imagem deve ser removido da abertura cônica usando uma toalha de papel. O mouse é liberado do suporte e colocado em uma almofada aquecida (a 38 ° C) para recuperação. Durante este tempo, a janela é limpa com uma toalha de papel e etanol 70%, e a pele ao redor é desinfetada com Betadine dérmico 1%.

Guia de solução de problemas para procedimentos de imagem

(G) A janela não pode ser posicionada corretamente na abertura cônica. Use uma espuma mais macia no suporte que permite encaixar em qualquer posição.

(H) O meio de imagem (água) vaza. A abertura cônica não está centrada na janela. Reposicione-o ou use um meio de imagem à base de gel.

(I) O titular perturba a respiração. Reduza a dose de isoflurano. Reduza a compressão no animal. Esculpa a espuma, garantindo que as vias respiratórias do mouse não sejam restringidas. Cinzel a espuma para modificar a posição do mouse (um plano horizontal pode não ser ideal para o tecido de interesse).

(J) Má visibilidade durante a imagem. O acúmulo de exsudato e / ou formação de “membrana” epitelioide abaixo da janela (que pode se desenvolver com manutenção de longo prazo) pode interferir na imagem. Isso também foi observado com janelas de vidro / titânio (6, 13) e é provavelmente devido a reações inflamatórias em resposta à cirurgia. Para minimizar esse risco, reveja o procedimento cirúrgico, tomando cuidado para limitar os danos aos tecidos e manter uma assepsia rigorosa durante todo o processo. Embora a estrutura semelhante a uma membrana epitelioide afete a profundidade da imagem do tecido, em geral, ela não tem impacto prejudicial na qualidade da imagem. No entanto, quando acoplado com células imunes e / ou fibrose, pode impedir a imagem. Para aliviar esse problema, solução salina pré-aquecida pode ser administrada através da porta de injeção para enxaguar sob a janela [seguindo o protocolo em (A) fig. S3E e filme S4). Alternativamente, reposicione a janela em uma área diferente do tecido de interesse ou encerre o experimento.

Microscopia intravital

Os animais foram anestesiados e posicionados para obtenção de imagens usando o suporte feito sob medida, conforme descrito acima. A imagem intravital foi realizada em um microscópio confocal multifotônico Nikon A1R MP vertical equipado com um laser Spectra-Physics Insight DeepSee pulsado (680 a 1300 nm, pulsos de 120 fs com alinhamento automático), Luigs & amp Neumann XY estágio motorizado e quatro detectores GaAsP não detectados com conjuntos de filtros SP492, BP 525/50, BP 575/50 e BP 629/56. O microscópio foi circundado por uma caixa escura aquecida mantida a 38 ° C. Todas as imagens foram adquiridas usando objetivas de água 16 × NA 0.8 ou 25 × NA 1.1 Plan Apo LambdaS. Um comprimento de onda de excitação de 960 nm foi usado para GFP e TdTomato, além de imagens SHG de colágeno.

Processamento e visualização de imagens

As aquisições de lapso de tempo foram corrigidas para movimentos e desvios usando o plugin "Corrigir 3D Drift" (36) em Fiji (ImageJ v1.53) usando o canal SHG como referência.

Geração de células tumorais PDX expressando tdTomato

Tumores PDX de sarcoma de Ewing (IC-pPDX-87) foram removidos cirurgicamente e dissociados enzimaticamente ao nível de uma única célula usando o protocolo descrito em Stewart et al. (37) As células foram ressuspensas (2,25 × 10 7 células por 1,5 ml) em meio Eagle modificado por Dulbecco / F12 suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina e 2% de B27 (todas da Thermo Fisher Scientific) e transduzidas durante a noite com um TdTomato-lentivírus em um 2- tubo de ml usando um Intelli-Mixer RM-2L (Dutcher), programa F1, 5 revoluções por minuto, em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2. TdTomato-lentivírus foi gerado substituindo a sequência GFP por tandem Tomato no plasmídeo Lenti-sgRNA-GFP (plasmídeo Addgene no. 65656 http://n2t.net/addgene:65656 um presente de C. Vakoc). No dia seguinte, as células foram giradas em 500g por 10 min. Para uma injeção, 1 × 10 7 células foram ressuspensas em 50 μl de mídia e mantidas em gelo. Cinquenta microlitros de Matrigel (Corning, ref. 354234) foram adicionados à suspensão de células antes da injeção no tecido adiposo interescapular usando uma seringa de insulina (BD, ref. 324891).

Estudos de regeneração muscular

Lesão muscular foi realizada em Pax7 CreERT2 R26 mTmG camundongos adultos no momento da implantação da janela de imagem PDMS por injeção intramuscular de 50 μl de cardiotoxina (1 μM de Latoxan, L8102) diluída em NaCl a 0,9%. A cardiotoxina foi administrada antes do posicionamento da janela ou depois pela porta de injeção. Os camundongos receberam 3 mg de base livre de tamoxifeno (Euromedex) por injeção intraperitoneal 2 dias antes da imagem intravital.

Imagem IVIS

A imagem de fluorescência NIR foi realizada usando uma câmera CCD altamente sensível montada em uma caixa de espécime à prova de luz (IVIS 50 Living Image versão: 4.3.1.0.15880). Os animais foram anestesiados em uma câmara de indução aquecida com 4% de isoflurano e posteriormente colocados em um estágio aquecido dentro da caixa da câmera e fornecidos com 1,5 a 2% de isoflurano para manter a anestesia durante a imagem. O sinal de fluorescência emitido foi detectado pelo sistema de câmera IVIS, integrado, digitalizado e exibido. Os filtros de excitação para fluorescência de tomate e GFP foram 535 (filtro DsRed, posição 3) e 465 (filtro GFP, posição 2), respectivamente. Os tempos de exposição e binning de pixels foram otimizados automaticamente para cada canal de fluorescência para minimizar a superexposição e normalizados para comparação usando a fórmula normalized_intensity = (medido_intensity / exhibition_time) / binning_factor 2. Os parâmetros brutos são fornecidos no arquivo de dados S2.


Assista o vídeo: Imagens Incríveis da Natureza 4k (Agosto 2022).