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Como existe a fenda sináptica?

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Não estou perguntando por que a fenda sináptica existe, ou seja, qual a função que ela desempenha, em vez disso Como as.
Portanto, eu sei que o neurotransmissor se difunde através dele, tem 20-40 nm de largura e contém lâmina basal (pelo menos em NMJs), mas não consigo encontrar qualquer alusão ao que causa a lacuna; como as duas membranas não se tocam apenas e como uma distância tão consistente é criada entre os neurônios.
Até agora o Google falhou comigo neste ponto, embora talvez eu não esteja pesquisando bem o suficiente, qualquer ajuda seria muito apreciada.


Existem proteínas de membrana que atuam como componentes estruturais da lacuna (ou seja, as sinapses não estão apenas flutuando ali, elas estão ancoradas umas às outras por meio de proteínas de membrana).

https://en.wikipedia.org/wiki/Neuroligin https://en.wikipedia.org/wiki/Neurexin

Os exemplos mais comuns são neurexina (expressa no terminal pré-sináptico) e neuroligina (expressa no terminal pós-sináptico). Não surpreendentemente, essas proteínas estão envolvidas na formação de sinapses no cérebro em desenvolvimento, bem como no cérebro adulto (em processos plásticos onde novas sinapses são formadas). Para uma primeira aproximação, conforme as sinapses estão crescendo, suas proteínas de membrana se ligam a seus parceiros e ficam ancoradas. Isso também leva à sinalização intracelular e maior maturação da sinapse. É assim que as sinapses sabem onde se anexar.


Fissuras sinápticas glutamatérgicas neuronais alcalinizam em vez de acidificar durante a neurotransmissão

O dogma de que a fenda sináptica acidifica durante a neurotransmissão é baseado na co-liberação de neurotransmissores e prótons das vesículas sinápticas e é sustentado por dados diretos de sinapses sensoriais do tipo fita. No entanto, não está claro se a acidificação ocorre em sinapses que não são do tipo fita. Aqui, usamos indicadores de pH fluorescentes codificados geneticamente para examinar o pH da fenda em sinapses neuronais convencionais. Na junção neuromuscular da mulher Drosófila larvas, observamos picos alcalinos de mais de 1 unidade log durante a locomoção fictícia na Vivo. Ex vivo, os potenciais de ação única evocaram transientes de pH alcalinizantes de apenas ∼0,01 unidade log, mas esses transientes somaram rapidamente durante o disparo contínuo. Um indicador químico de pH direcionado para a fenda corroborou esses achados. Os transientes da fenda de pH eram dependentes do movimento de Ca 2+ através da membrana pós-sináptica, ao invés da liberação do neurotransmissor per se, um resultado consistente com a alcalinização da fenda sendo conduzida pela atividade antiportante Ca 2+ / H + da membrana plasmática Ca 2+ -ATPase em a membrana pós-sináptica. O direcionamento dos indicadores de pH para o microambiente dos canais de Ca 2+ controlados por voltagem pré-sináptica revelou que a alcalinização também ocorreu dentro da fenda própria na zona ativa e não apenas nas regiões extra-sinápticas. A aplicação dos indicadores de pH no cálice de camundongo de Held, uma sinapse central de mamífero, revelou de forma semelhante a alcalinização da fenda durante o disparo em machos e fêmeas. Essas descobertas, feitas em duas sinapses diferentes do tipo não em fita, sugerem que a alcalinização da fenda durante a neurotransmissão, ao invés da acidificação, é um fenômeno generalizável nas sinapses neuronais convencionais.DECLARAÇÃO DE SIGNIFICADO A neurotransmissão é altamente sensível ao pH do meio extracelular. Isso é facilmente evidente nos sintomas neurológicos que acompanham os desequilíbrios ácido / base sistêmico. Dados de imagem de sinapses sensoriais do tipo fita mostram que a própria neurotransmissão pode acidificar a fenda sináptica, provavelmente devido à co-liberação de prótons e glutamato. Não está claro se o mesmo fenômeno ocorre nas sinapses neuronais convencionais devido às dificuldades na coleta de tais dados. Se ocorrer, proporcionará uma camada adicional de modulação da neurotransmissão dependente da atividade. Nossos achados de alcalinização, ao invés de acidificação, dentro da fenda de duas sinapses neuronais diferentes encorajam uma reavaliação do escopo das influências do pH dependente da atividade na neurotransmissão e na plasticidade sináptica de curto prazo.

Palavras-chave: glutamatérgica pH imagiologia sináptica fenda sináptica plasticidade.

Copyright © 2020 autores.

Figuras

Imagem transcuticular de pHusion-Ex em ...

Imagem transcuticular de pHusion-Ex no na Vivo NMJ revela alcalinização da fenda sináptica ...

Imaging pHusion-Ex no ex-vivo ...

Imaging pHusion-Ex no ex-vivo NMJ revela alcalinização da fenda sináptica em ...

Um repórter de pH químico preso ...

Um repórter de pH químico preso na fenda no ex vivo NMJ ...

A alcalinização da fenda é sincronizada com ...

A alcalinização da fenda é sincronizada com a extrusão de Ca 2+ dos compartimentos sinápticos adjacentes. UMA…

A alcalinização da fenda evocada por explosão é modulada ...

A alcalinização da fenda evocada por explosão é modulada pela capacidade de tamponamento do pH extracelular. UMA , NMJ ...

Mudanças de pH dependentes da atividade no ...

Alterações de pH dependentes da atividade no cálice mamífero da sinapse de Held. UMA , Representação ...

Imaging Cac-kisser-pHerry-TM no ex…

Imaging Cac-kisser-pHerry-TM no ex vivo NMJ confirma alcalinização dentro da fenda em ...


A bouillabaisse da fenda sináptica

A fenda sináptica é tão pequena (abaixo de 400 Angstroms - 40 nanoMetros) que não pode ser vista com o microscópio óptico (o menor comprimento de onda da luz visível 3.900 Angstroms - 390 nanoMetros). Isso levou a uma batalha contundente entre Cajal e Golgi há pouco mais de um século sobre se o cérebro era realmente feito de células. Mesmo que o trabalho de Golgi tenha levado ao delineamento de neurônios individuais, ele pensava que o cérebro era uma rede contínua. Ambos ganharam o Nobel em 1906.

Semifast avançou até meados dos anos 60, quando estava na faculdade de medicina. Finalmente tínhamos o microscópio eletrônico, para que pudéssemos ver as sinapses. Eles apareceram como pequenos espaços CLEAR (por exemplo, os elétrons passaram facilmente por ele deixando-o branco) entre os neurônios. Neurotransmissores estavam sendo descobertos ao mesmo tempo e a sinapse seria a analogia com os tubos de vácuo, que podiam passar eletricidade em apenas uma direção (sim, o transistor, embora inventado, não tinha sido usado para fazer nada parecido com um computador - o Intel 4004 não foi até os anos 70). É claro que agora sabemos que a informação flui para a frente e para trás através da sinapse, com os endocanabinóides (por exemplo, maconha natural) sendo o principal neurotransmissor retrógrado.

Uma vez que não parecia haver nada na fenda sináptica, pensava-se que os neurotransmissores se difundiam livremente através dela para os receptores do outro lado (pós-sináptico). uma zona de voo livre.

Avance para o presente para uma revisão maravilhosa (e estafante de ler por causa da complexidade do assunto, não da forma como está escrito) do que está na fenda sináptica [Cell vol. 171 pp. 745 - 769 ’17] http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31246-1 (Provavelmente está atrás de um acesso pago). Existem mais de 120 referências e, em vez de ser apenas um catálogo, o único autor Thomas Sudhof discute extensivamente em qual trabalho experimental deve ser acreditado (não que Sudhof esteja dizendo que o trabalho é fraudulento, mas que não pode ser usado para extrapolar para o cérebro humano vivo). A revisão é um trabalho impressionante para um indivíduo.

O material na fenda sináptica é tão diverso e tão intimamente envolvido consigo mesmo e com as membranas de ambos os lados que o que é necessário para a compreensão não é um químico, mas um sociólogo. Provavelmente, a maioria das moléculas a serem discutidas estão presentes em um número tão pequeno que a lei de ação da massa não se aplica, nem as constantes de ligação que dependem de um grande número de ligantes e receptores. Não apenas isso, mas as constantes de ligação não foram determinadas para muitos dos jogadores.

Agora, alguns detalhes anatômicos e números. É extremamente difícil descobrir até que ponto a fenda sináptica se estende lateralmente. Molecular Biology of the Cell ed. 5 p. 1149 tem uma imagem bastante típica com um marcador de tamanho e parece ter cerca de 2 mícrons (20.000 Angstroms, 2.000 nanoMetros) - isso é 314.159.265 Angstroms quadrados (3,14 mícrons quadrados). Então, vamos supor que cada proteína ocupe um quadrado de 50 Angstroms em um lado (2.500 Angstroms quadrados). Isso é espaço para 125.600 proteínas de cada lado, assumindo uma embalagem extremamente densa. No entanto, a densidade dos receptores de acetilcolina na junção neuromuscular é de 8.700 / mícron quadrado, um empacotamento também considerado extremamente denso que daria apenas 26.100 dessas proteínas em uma sinapse do SNC distribuída de maneira semelhante. Portanto, os números estão, pelo menos, no limite certo (o que significa que eles estão dentro de uma ordem de magnitude, por exemplo, dentro de uma potência de 10) de estarem corretos.

Quando você vê quantas proteínas e variedades diferentes da mesma proteína residem na fenda, os números para cada elemento individual provavelmente serão pequenos, o que significa que você não pode usar a mecânica estatística, mas deve usar a sociologia em vez disso.

A revisão se concentra nas neurExinas (coloco E em maiúscula para me ajudar a lembrar que são pré-sinápticas). Porque? Porque são os mais estudados de todos os jogadores. Que trabalho eles são. Os humanos têm 3 genes para eles. Um dos 3 contém 1.477 aminoácidos, espalhados por 1.112.187 pares de base (1,1 megaBases) junto com 74 exons. Isso significa que pouco mais de 1/10 de um por cento do gene está, na verdade, codificando os aminoácidos que o compõem. Acho que é preciso energia para a RNA polimerase II costurar os ribonucleotídeos no pré-mRNA de 1,1 megabase, mas não consegui (rapidamente) descobrir quanto por ribonucleotídeo. Parece um desperdício de energia, a menos que haja alguma outra função no processo que ainda não descobrimos.

A maior parte da molécula reside na fenda sináptica. Existem 6 domínios LNS com 3 repetições intercaladas do tipo EGF, um domínio de alça de cisteína, uma região transmembrana e uma sequência citoplasmática de 55 aminoácidos. Existem 6 locais para splicing alternativo e, como existem dois promotores para cada um dos 3 genes, existe uma forma mais curta (beta neurexina) com menos material extracelular do que a forma longa (alfa-neurexina). Quando tudo estiver dito e feito, existem mais de 1.000 variantes possíveis dos 3 genes.

Ao contrário dos neurônios olfatórios, que expressam apenas um ou dois dos quase 1.000 receptores olfatórios, os neurônios expressam várias isoformas de cada um, aumentando a complexidade.

As regiões LNS das neurexinas são como imunoglobulinas e preenchem a caixa de 60 x 60 x 60 Angstrom. Como a fenda sináptica tem no máximo 400 Angstroms de comprimento, as alfa-neurexinas (se estendidas) alcançam todo o comprimento.

Aqui, as neurexinas ligam-se às neuroliginas, que são sempre pós-sinápticas - desculpe, não mnemônicas. Eles são mais simples na estrutura, mas são o produto de 4 genes, e apenas cerca de 40 isoformas (devido ao splicing alternativo) são possíveis. Os neurolignos 1, 3 e 4 são encontrados nas sinapses excitatórias, a neuroligina 2 é encontrada nas sinapses inibitórias. A parte intracetada das neuroliginas se assemelha a uma enzima importante (acetilcolinesterase), mas que é cataliticamente inativa. É aqui que estão os neurexins.

Isso é complexo o suficiente, mas Sudhof observa que as neurexinas são centros que interagem com várias classes de moléculas pós-sinápticas, além das neuroliginas - distroglicana, receptores GABA [A], calsisteninas, latrofilinas (das quais existem 4). Existem pelo menos 50 moléculas de adesão celular pós-sináptica - “Poucas são bem compreendidas, embora muitas sejam descritas”.

As neurexinas têm três locais principais onde outras coisas se ligam e todos os locais podem ser ocupados ao mesmo tempo. Só para dar uma ideia da complexidade envolvida (antes de prosseguir para questões maiores).

O segundo domínio LNS (LNS2) é encontrado apenas nas alfa-neurexinas e se liga à neuroexofilina (das quais existem 4) e ao distroglicano.

O 6º domínio LNS (LNS6) se liga a neuroliginas, LRRTMs, receptores GABA [A], cerebelinas e latrofilinas (das quais existem 4) _

A sequência justamembrana das neurexinas liga-se a CA10, CA11 e C1ql.

As cerebelinas (das quais existem 4) ligam-se a todas as neurexinas (de uma variedade de splice particular) e, de maneira interessante, a alguns receptores pós-sinápticos de ácido glutâmico. Portanto, há uma cadeia direta através da sinapse da neurexina à cerebelina e ao canal iônico (GLuD1, GLuD2).

Há muito mais coisas na revisão. Mas aqui está algo que eu não vi lá. As pessoas já falaram sobre fios de prótons - locais em proteínas que permitem que os prótons saltem de um local para outro e se movam muito mais rápido do que se tivessem que esbarrar em tudo em solução. Lembre-se de que as moléculas estão se movendo muito rapidamente - a água está se movendo a 590 metros por segundo em temperatura ambiente. Como a fenda sináptica é de 40 nanômetros (40 x 10 ^ -9 metros, deve levar apenas 40 * 10 ^ -9 metros / 590 metros / segundo 60 trilionésimos de segundo (60 picoSegundos) para cruzar, assumindo que a sinapse é livre zona de voo - mas não é como a análise mostra exaustivamente.

É possível que os vários neurotransmissores na sinapse (ácido glutâmico, ácido gama aminobutírico, etc.) se liguem às várias proteínas que cruzam a fenda para obter seu alvo na membrana pós-sináptica (por exemplo, fios de neurotransmissores). Não vi qualquer menção à ligação do neurotransmissor às várias proteínas na revisão. Esta pode realmente ser uma ideia original.

Eu gostaria de colocar mais números em muitas dessas coisas, mas são terrivelmente difíceis de encontrar. Diz-se que tanto as neuroliginas quanto as neurexinas têm hastes que as empurram para fora da membrana, mas não consigo descobrir quantos aminoácidos elas contêm. Ele não consegue descobrir quanta energia é necessária para copiar o gene da neurexina de 1,1 megabase para o mRNA (ou mesmo quanta energia é necessária para adicionar um ribonucleotídeo a uma cadeia de mRNA existente).

Outro ponto - as proteínas têm uma vida útil finita. Como eles são reabastecidos? Sabemos que existe alguma síntese sináptica de proteínas - o corpo celular envia pacotes de mRNAs para a sinapse para serem traduzidos lá. Existem pelo menos 50 proteínas diferentes mencionadas na revisão e não se esqueça das milhares de isoformas possíveis, cada uma das quais requer um mRNA separado.

Antigo ditado chinês - as montanhas são altas e o imperador está longe. A síntese de proteínas na fenda sináptica é provavelmente local. Como o que é feito e quando é um problema totalmente diferente.

Uma grande parte da revisão diz respeito a mutações em todas essas proteínas associadas a doenças neurológicas (particularmente autismo). Toda essa área tem uma longa e variada história. É necessário um alto grau de cinismo antes de acreditar que qualquer uma dessas mutações seja causal. Como um neurologista que lida com epilepsia, vi toda a ideia de mutações nos canais iônicos que causam a epilepsia que quebram e queimam - aqui está um link - https://luysii.wordpress.com/2011/07/17/we've-found-the-mutation -causando-sua-doença-não-tão-rápido-diz-este-papel /

Mais uma vez, tiro o chapéu para o Dr. Sudhof pelo que deve ter sido uma enorme quantidade de trabalho


Transmissão sináptica:

A estrutura de uma sinapse colinérgica e da junção neuromuscular deve ser conhecida. O receptor de acetilcolina na primeira imagem à esquerda é mais conhecido como receptor colinérgico nicotínico.

Em uma sinapse colinérgica (esta é a única sinapse que você precisa saber), um potencial de ação aumenta a permeabilidade da membrana pré-sináptica ao estimular a abertura dos canais bloqueados por íons Ca2 +. Isso causa um influxo de íons Ca2 + no botão pré-sináptico, descendo seu gradiente de concentração por difusão facilitada. A alta concentração de íons Ca2 + faz com que as vesículas de acetilcolina (neurotransmissores) se fundam com a membrana pré-sináptica. NB: É melhor dizer acetilcolina do que Ach porque dá a você mais compreensão e ajuda com perguntas se disser 'acetilcolina' em vez de Ach. Se você vai usar o Ach é importante que saiba o que é. A acetilcolina deixa o botão pré-sináptico por exocitose na fenda sináptica. A acetilcolina se difunde pela fenda sináptica e se liga aos receptores colinérgicos, fazendo com que os canais bloqueados pelo ligante de Na se abram. Isso causa um influxo de íons Na + no neurônio pós-sináptico, tornando o neurônio pós-sináptico despolarizado e, se o limiar for atingido, um potencial de ação é gerado. A acetilcolina é removida da fenda sináptica pela enzima acetilcolina esterase em produtos por formas complementares para evitar um impulso contínuo. NB: A acetilcolina esterase pode ser abreviada para Ache, no entanto, é melhor também se referir a essa enzima como acetilcolina esterase, pois ela o ajudará em questões com este nome. Os produtos são ativamente transportados para o botão pré-sináptico pelo uso de Pi do ATP em vesículas para fazer acetilcolina. Os íons Ca2 + são ativamente transportados para fora do botão pré-sináptico pelo uso de Pi do ATP.

Acima está um exemplo de neurotransmissores excitatórios. É aqui que o neurônio pós-sináptico é despolarizado, levando a um potencial de ação sendo disparado quando o limite é atingido. Os neurotransmissores também podem ser inibitórios, quando hiperpolarizam o neurônio pós-sináptico, abrindo os canais de íon K = abertos.

No entanto, as junções neuromusculares funcionam exatamente da mesma maneira:

  • Membrana pós-sináptica: A membrana pós-sináptica do músculo é profundamente dobrada para formar fendas. É aqui que a acetilcolina esterase é armazenada. NB: É importante que você diga membrana pós-sináptica do músculo e não membrana pós-sináptica de um neurônio, pois um neurônio pós-sináptico não está envolvido em uma junção neuromuscular.
  • Receptores: Existem muito mais receptores na membrana pós-sináptica do músculo do que na membrana pós-sináptica de um neurônio.
  • Neurotransmissores: A acetilcolina é excitatória em todas as junções neuromusculares, enquanto na sinapse pode ser excitatória ou inibitória.

A soma espacial é onde muitos neurônios pré-sinápticos se conectam a um neurônio pós-sináptico. Uma pequena quantidade de neurotransmissores excitatórios pode ser suficiente para que o limiar seja alcançado no neurônio pós-sináptico e causando a criação de um potencial de ação. Se alguns neurotransmissores são inibitórios, o efeito geral pode não ser um potencial de ação, pois será difícil atingir o limiar no neurônio pós-sináptico. A soma temporal ocorre quando há um disparo rápido de dois ou mais potenciais de ação que chegam ao mesmo tempo de um neurônio pré-sináptico. Isso significa que mais neurotransmissores são liberados na fenda, tornando um potencial de ação mais provável de ocorrer à medida que o limite pode ser atingido.

Algumas drogas imitam ou inibem a ação dos neurotransmissores:

  • Se um medicamento provoca o desencadeamento de um potencial de ação, isso ocorre porque o medicamento e o receptor têm formas complementares onde mimetizam o neurotransmissor. Esses tipos de drogas são considerados agonistas.
  • Se uma droga não causa potencial de ação, mas está ligada aos receptores, isso significa que a droga é complementar ao receptor, mas bloqueia o receptor, de forma que poucos receptores são ativados. Esses tipos de drogas são considerados antagonistas.
  • Se uma droga se liga a uma acetilcolina esterase, isso significa que menos complexos enzima-substrato serão formados com a acetilcolina, criando um impulso contínuo.
  • Se mais receptores são estimulados, é porque a droga libera mais neurotransmissores do que o normal.
  • Se menos receptores são estimulados, é porque a droga inibe a liberação de neurotransmissores.

Obs: A recordação de nomes de medicamentos e o mecanismo dos medicamentos não precisam ser lembrados no exame. No exame será dada uma informação sobre um medicamento e seu mecanismo e só você tem que explicar por que isso aconteceu, que são os itens acima. Estas são as únicas explicações que você precisa saber e estão destacadas em verde.


Drogas na transmissão sináptica

As drogas podem afetar qualquer um dos estágios do "ciclo de vida" de um neurotransmissor.

As drogas que se ligam a receptores na membrana pós-sináptica (e às vezes pré-sináptica) se dividem em dois grupos:

Agonistas: ligam-se a receptores e simulam ou aumentam as ações de um neurotransmissor (ou seja, abrindo canais iônicos e causando EPSPs ou IPSPs).
Antagonistas: têm o efeito oposto dos agonistas, bloqueando os receptores e inativando-os (geralmente ocupando o espaço, mas sem causar especificamente a abertura do canal ou a operação do mensageiro secundário). O efeito do neurotransmissor é anulado ou diminuído.
A tabela abaixo lista algumas drogas comuns, sua ação no cérebro e seu comportamento observável:

Agonista do receptor de acetilcolina

Fumantes: relaxamento, vigilância, redução do desejo por comida.
Não fumantes: náuseas, vômitos, cólicas e diarréia.

1. Reduz o fluxo de Ca2 + nas células
2. Agonista GABA
3. Aumenta o número de locais de ligação para o glutamato
4. Interfere com alguns sistemas de mensageiro secundários

O efeito de baixas doses é excitatório.
O efeito de doses moderadas a altas é inibidor.

Bloqueia a recaptação de dopamina e norepineferina

Sentimentos de bem-estar e confiança.
Desejo reduzido de sono e comida.

Opiáceos (heroína, morfina, codeína)

Supressão da dor e euforia.
Suprime tosse e diarreia

Agonista do receptor de serotonina

O álcool inibe a neurotransmissão de duas maneiras. Primeiro, ele inibe os canais excitatórios no neurônio pós-sináptico. Em seguida, reduz a taxa de potenciais de ação do neurônio pré-sináptico.

Nas sinapses em que a adenosina é o neurotransmissor primário, uma alta taxa de disparo pós-sináptica leva à sonolência. A cafeína inibe a sonolência ao inibir a neurotransmissão da adenosina.

A nicotina afeta a neurotransmissão, causando mais potenciais de ação no neurônio pré-sináptico e fazendo com que mais dopamina seja liberada por vesícula.

A cocaína proporciona uma sensação de euforia ao bloquear a recaptação da dopamina pelo neurônio pré-sináptico. Isso leva a uma concentração mais alta de dopamina na sinapse e mais disparos pós-sinápticos.

O mecanismo pelo qual a heroína afeta a neurotransmissão não é claro, mas acredita-se que aumente a taxa de fusão das vesículas nos neurônios pré-sinápticos que usam a dopamina como neurotransmissor.


Procedimento

Na primeira parte da atividade de investigação guiada, os alunos irão estimar a largura da fenda sináptica das sinapses mostradas nas Figuras 1A e 2. A seguir, refiro-me aos dois modelos mostrados nestas figuras como "Modelo Morfométrico de Sinapse" e “Modelo Esquemático de Sinapse”, respectivamente.

No momento em que os alunos começam a Parte 1, eles devem estar familiarizados com os prefixos métricos relevantes e os valores correspondentes mostrados na Tabela 1. Os alunos também devem ser capazes de relacionar os resultados obtidos através da atividade de investigação a algumas dimensões fundamentais das células nervosas em o sistema nervoso central, como a gama de tamanhos de soma (células granulares no cerebelo:

4 μm células Betz do córtex motor: 100 μm) e a faixa de diâmetros dos axônios (0,1–10 μm) entre as células.

Prefixo. Símbolo. Fator de multiplicação. Poder .
(sem prefixo) 1 10 0
centi c 0.01 10 −2
mili m 0.001 10 −3
micro µ 0.000001 10 −6
nano n 0.000000001 10 −9
Prefixo. Símbolo. Fator de multiplicação. Poder .
(sem prefixo) 1 10 0
centi c 0.01 10 −2
mili m 0.001 10 −3
micro µ 0.000001 10 −6
nano n 0.000000001 10 −9

O prefixo métrico é uma modificação da unidade básica de medida para indicar o valor da unidade. Exemplos: 1 μm (micrômetro) = 1 · 10 −6 m 5 ms (milissegundo) = 5 · 10 −3 s.

Para a estimativa das dimensões sinápticas, os alunos recebem impressões das sinapses do modelo mostradas nas Figuras 1A e 2, incluindo uma descrição dos componentes rotulados. A única outra informação que eles recebem é que o diâmetro do axônio pré-sináptico é de 0,5 μm. Com base nessas informações, os alunos são solicitados a estimar as dimensões dos dois componentes a seguir dos dois modelos de sinapses: (1) comprimento do terminal pré-sináptico (definido como a dimensão perpendicular ao eixo do axônio) e (2) largura do fenda sináptica. Para estimar essas dimensões, eles devem seguir estas etapas:

Meça (em milímetros) o diâmetro do eixo axonal em cada uma das duas impressões.

Supondo que o diâmetro do eixo axonal seja de 0,5 μm, use os resultados obtidos na etapa 1 para calcular o fator de ampliação dos desenhos mostrados em cada uma das duas figuras. Isso é feito dividindo o diâmetro medido no desenho por 0,5 μm. Lembre-se de usar unidades de medida idênticas para seus cálculos.

Meça (em milímetros) o comprimento do terminal pré-sináptico (definido como a dimensão perpendicular ao eixo do axônio) em cada uma das duas impressões.

Use os fatores de ampliação calculados na etapa 2 e os resultados correspondentes obtidos na etapa 3 para estimar os comprimentos reais dos terminais pré-sinápticos mostrados nos dois desenhos.

Meça (em milímetros) a largura da fenda sináptica em cada uma das duas impressões.

Use os fatores de ampliação calculados na etapa 2 e os resultados correspondentes obtidos na etapa 5 para estimar a largura real das fendas sinápticas mostradas nos dois desenhos.

Resultados

Vamos supor que, na impressão do Modelo Esquemático de Sinapse, o diâmetro do eixo axonal seja de 40 mm (observe que este valor pode variar entre diferentes impressões) - ou seja, esta estrutura é 80.000 vezes ampliada, em comparação com o real dimensões de um axônio típico, aqui assumido como sendo 0,5 μm. O comprimento do terminal pré-sináptico (determinado na mesma impressão como sendo 85 mm ou 0,085 m) é, portanto, 8,5 · 10 −2 m ÷ 80.000 = 1,06 · 10 −6 m ou 1,06 μm ou ≈1 μm. Aplicando o mesmo procedimento, a largura da fenda sináptica é estimada em 475 nm (± 0,5 μm).

Da mesma forma, a aplicação do procedimento acima ao modelo morfométrico de sinapse produz ≈1 μm para o comprimento do terminal pré-sináptico e ≈20 nm para a largura da fenda sináptica.

Avaliação dos resultados

Modelos educacionais de sinapses químicas, como o mostrado na Figura 2, geralmente fornecem uma boa indicação das proporções relativas do terminal pré-sináptico e do axônio do qual esse terminal emerge. Por exemplo, no córtex visual adulto, comprimentos terminais entre 0,5 μm e 2,2 μm, com uma média de 1,2 μm, foram medidos (Stettler et al., 2006). Os diâmetros dos axônios no sistema nervoso central variam normalmente entre 0,1 μm e 10 μm, mas os axônios mais finos são os mais abundantes (Perge et al., 2012). Assim, uma razão de cerca de 2: 1 do comprimento do terminal pré-sináptico para o diâmetro do eixo do axônio, conforme ilustrado na Figura 2, está bem dentro da faixa das proporções dos axônios e terminais encontrados no sistema nervoso central.

Por outro lado, uma largura de 0,5 μm da fenda sináptica, conforme indicado pelo Modelo Esquemático de Sinapse, está longe - aproximadamente por um fator de 25. Estudos de microscopia eletrônica mostraram que a distância entre as membranas sinápticas opostas normalmente varia entre 15 nm e 25 nm (Peters et al., 1991 Zuber et al., 2005). Como será demonstrado na Parte 2, esta severa distorção da dimensão real da fenda sináptica em muitos modelos educacionais de sinapses químicas, sem mencionar que as dimensões dos componentes sinápticos não são desenhados em escala, tem sérias consequências para o impacto previsto sobre tempo de difusão do neurotransmissor e concentração de moléculas transmissoras na fenda sináptica e, portanto, para o funcionamento da sinapse.

Em contraste, o modelo de sinapse morfométrico apresentado na Figura 1A representa de forma realista as dimensões relativas do diâmetro do axônio versus o comprimento do terminal pré-sináptico e a largura da fenda sináptica. Se o diâmetro do axônio for 0,5 μm, o terminal pré-sináptico será

1 μm de comprimento e a fenda sináptica será

20 nm de largura. Além disso, a vesícula sináptica mostrada na Figura 1B terá então um diâmetro de

40 nm, um valor que se enquadra bem na faixa de tamanho das vesículas sinápticas contendo transmissores clássicos, como o glutamato (Zhang et al., 1998).


Degradação Enzimática

A atividade de alguns neurotransmissores é encerrada pela degradação por uma enzima que está na fenda sináptica. Esses neurotransmissores incluem acetilcolina e outros que são neuropeptídeos, o que significa que são cadeias de aminoácidos. Uma enzima se liga ao neurotransmissor e o quebra em pedaços, de modo que o neurotransmissor não pode mais se encaixar em um receptor na célula receptora. Algumas toxinas nervosas usadas como guerra química ou pesticidas bloqueiam a atividade dessas enzimas. O gás nervoso Sarin atua bloqueando a atividade da acetilcolinesterase, a enzima que degrada a acetilcolina.


Tomografia crioeletrônica e transmissão sináptica no cérebro

O cérebro é de longe a mais complexa e uma das estruturas biológicas mais eficientes conhecidas pelo homem. Um cérebro humano consiste em aproximadamente 86 bilhões de células nervosas altamente interconectadas, ou neurônios. A capacidade dos organismos superiores de responder rapidamente a estímulos externos, de criar ferramentas e comportamentos organizados para a sobrevivência, bem como, nos humanos, de apoiar o pensamento abstrato e a consciência está crucialmente ligada à capacidade dos neurônios de trocar informações e criar curtos ou longos - caminhos de prazo para sua transferência entre diferentes áreas do cérebro. Ao contrário de dispositivos artificiais, como computadores, nos quais as informações são criadas e manipuladas na forma de correntes elétricas que fluem dentro de circuitos eletrônicos fortemente conectados, os neurônios no cérebro mantêm sua individualidade como células e, principalmente, se comunicam entre si por meio da troca de espécies químicas, conhecidas como neurotransmissores. Ao longo de centenas de milhões de anos de evolução, o processo pelo qual os neurotransmissores são trocados entre os neurônios foi otimizado para um nível incrível de eficiência e confiabilidade. Só recentemente, no entanto, fomos capazes de obter alguns insights sobre os complexos mecanismos bioquímicos que regulam esse processo.

Os neurônios se comunicam entre si transmitindo neurotransmissores por meio de pontos de contato, as chamadas sinapses neuronais. Designua / Shutterstock.com

Como os neurônios trocam informações
Os neurônios têm uma morfologia muito característica em comparação com outras células, e são caracterizados por uma estrutura longa e delgada, chamada axônio, que se projeta do corpo celular e termina na forma de um grupo ramificado de ramos contendo terminais pré-sinápticos. As sinapses neuronais são pontos de contato entre os neurônios, onde a informação é transferida de uma célula pré-sináptica para uma pós-sináptica. Em um neurônio excitado, a chegada de um sinal elétrico do corpo celular às sinapses pode causar a fusão de pequenas vesículas cheias de moléculas de neurotransmissores com a membrana sináptica e liberar seu conteúdo para o espaço extracelular entre os dois neurônios, conhecido como fenda sináptica. . A ligação do neurotransmissor ao receptor pós-sináptico desencadeia processos químicos que resultam na criação de sinais elétricos nos neurônios pós-sinápticos, completando assim a transferência de informações.

A transferência de informações entre neurônios individuais no cérebro ocorre por meio de uma liberação cuidadosamente regulada de substâncias químicas
neurotransmissores.

A liberação do neurotransmissor é um processo muito rápido e complexo, que requer uma coordenação espaço-temporal precisa dos processos bioquímicos envolvendo proteínas pré-sinápticas. Nem todas as vesículas sinápticas podem ser liberadas: outros processos bioquímicos estão envolvidos na preparação de algumas das vesículas para liberação, para formar o chamado pool de liberação imediata. These processes are mostly carried out by macromolecular protein complexes, which, in many cases, exist in transient form and survive only for the time required for them to exert their function.

In cryo-EM, samples are cooled so fast that water molecules don’t have time to transform into a crystalline state. PolakPhoto/Shutterstock.com

Imaging neurotransmitter release
Electron microscopy (EM) can be used to image biological samples, similar to conventional optical microscopy. In EM, the use of a beam of electrons, rather than visible light, makes it possible to reach a much higher level of resolution than standard microscopy. During EM observation, however, samples have to be kept in a vacuum. This is major problem in the case of biological systems, because water, which constitutes a large component of the sample, evaporates in the vacuum, leading to irreparable sample damage. Chemical fixation followed by controlled dehydration can be used to partially solve this problem, which makes EM suitable in the study of the structure and function of cellular organelles. Nonetheless, this technique still causes sample alterations that preclude the study of cellular processes at a molecular level.

Cryo-electron tomography
In cryo-EM, samples are cooled so fast that water molecules do not have enough time to reorient and form ice crystals, which brings them to a glass-like solid form, called a vitreous state. Dr Vladan Lučić at Max Planck Institute of Biochemistry is an expert in the use of cryo-EM in combination with tomography, a method in which multiple images of a sample with different orientations are combined to form a three-dimensional image (tomogram). This approach yields high resolution, three-dimensional images of fully hydrated, vitrified cellular samples, preserved in their native environment and state. Using this method, Dr Lučić and his collaborators have for the first time been able to image protein complexes and vesicles, both at synaptic ends, ready to release neurotransmitters, and in the process of being transported along an axon. This is an important result, as it confirms that the vesicles and the protein complexes involved in the releases of the neurotransmitters are likely to be synthesised in the cell body and then transported through the axon to the synapses, and provides a simultaneous view of both the protein cargo and the lipid membranes involved in the transport.

Synaptic vesicles and neural activity
Cryo-electron tomography experiments carried out on biochemically isolated synapses from rodent brains show that, at the active zone, which is a synaptic area where neurotransmitters are ready to be released, the synaptic vesicles are kept tethered to the synaptic membrane by different types of filaments, which, together with filaments that interlink vesicles, act as the main structural elements organising the vesicles. To understand the function and role of these filaments in the neurotransmitter release process, Dr Lučić and his collaborators have developed automated software procedures that make it possible to analyse the morphology, precise location and interrelation of these complexes at synapses imaged under different release-relevant states. They found that these filaments are dynamic structures that respond to synaptic stimulation and regulate the clustering of the synaptic vesicles by limiting vesicle dispersion at rest and allowing the vesicles to mobilise for release during synaptic activity.

Cryo-electron tomography has the potential to provide a detailed molecular picture of the mechanism of neurotransmitter release at
synaptic membranes.

Based on these findings, Dr Lučić has proposed a structural model of neurotransmitter release, in which synaptic vesicles are initially linked to the synaptic membrane via long tethers, and may acquire multiple, shorter tethers in subsequent steps. This change in their structural organisation makes the vesicles primed for the release of neurotransmitters in the synaptic cleft.

Three-dimensional view of a synapse: A indicates the analysed area. B shows 3D segmentation of synaptic vesicles (yellow), synaptic vesicle connectors (red), and synaptic vesicle tethers (blue). C and D show a synaptic vesicle connector (C) and a tether (D). Copright © 2010 Fernández-Busnadiego et al.

Towards a molecular model of neurotransmitter release
Despite the unprecedented level of insight into the mechanism of synaptic activity made possible by cryo-electron tomography, a number of technical issues hamper the application of this method to fully unravel the complexity of vesicle priming and neurotransmitter release at synaptic membranes. One of the intrinsic advantages of cryo-electron tomography is that all components of a given sample are imaged at the same time. By contrast, optical microscopy can be used to image only those molecular species that are artificially labelled and made fluorescent. This fact complicates enormously the identification of molecules and their complexes in cryo-electron tomography, except in the case of very large complexes of distinct shape.

To address this limitation of cryo-electron tomography, Dr Lučić and his collaborators are currently pursuing two approaches. One of them consists in analysing synapses where a protein is genetically removed. This provides hints on the molecular identity of the structures that are missing compared to the unmodified synapses. The second approach relies on the development of template-free software for the detection and classification of membrane-bound complexes in cellular cryo-electron tomography that contain large number of different proteins. Some of the protein classes obtained with this method are sufficiently homogeneous to allow averaging using available procedures.

This work has already led to a tentative identification of some protein complexes, based on their average structures and cellular location, and it is the first step toward the application of cryo-electron tomography to the direct detection, localisation and identification of protein complexes involved in synaptic transmission within their native cellular environment.

ktsdesign/Shutterstock.com

Personal Response

In which fields, in addition to our fundamental understanding of brain function, will your work have the largest impact?

While this work is guided by our interest in synaptic transmission, the method we developed is more general. It can be applied to other cellular targets where vesicles play a prominent role, such as the vesicular transport and the secretory system. Furthermore, we already extended our procedure to analyse molecular complexes that bridge the synaptic cleft, thus expanding the applicability to other types of cellular junctions, such as those prominent in the immune response and the development.


4. Plastic Interactions within the Synaptic Cleft

SAMs are strategically positioned to contribute to synaptic plasticity, given that they can alter synapse structure and function through their ability to sculpt and regulate synaptic protein interaction networks. Below we highlight several important mechanisms that have come to light that regulate SAMs, their diversity, and their functions in a synaptic activity-dependent way. We further present supporting examples to illustrate the general themes ( Figure 3 ).

SAMs can contribute to synaptic plasticity. SAM function can be regulated by synaptic activity through different processes. Protein levels can change (1) as a result of altered localization targeting a protein to or away from the synaptic membrane surface (1a), protein synthesis (1b), protein degradation (1c), and ectodomain shedding (1d). The availability of members within a broad portfolio of potential partners can be altered (2). SAMs can be diversified through alternative splicing (3). SAMs can be repositioned in the synaptic cleft (4). Protein interactions supported by SAMs can be modulated by astrocytic factors (5). Details are as discussed in the text.

4.1. Alteration of SAM Protein Levels in the Synaptic Cleft

It has long been held that synaptic protein abundance is implicated in synaptic plasticity. In particular, altering the abundance of a specific SAM at a synapse could fundamentally impact the development, maintenance, and ultimate elimination of that synapse. A number of studies have used quantitative proteomics of synaptosomal fractions to correlate synaptic protein abundance (including those of SAMs) to events implicated in synaptic plasticity, for example, the long term synaptic adaptions that accompany the administration of drugs of abuse. Repeated morphine administration robustly downregulated CNTN1, L1CAM, neurocan, and OPCML in striatal presynaptic fractions [27], while in a second study neurexin, NCAM, and NTM protein levels decreased more than 40% in rat forebrain synaptosomal fractions, though in this case OPCML protein levels were unaltered [28]. Importantly, these studies showed that the abundance of synaptic proteins was altered in a highly selectively way. Of 175 proteins that could be identified proteomically, only 30 were robustly and consistently altered by morphine treatment (i.e., 17%), indicating that the SAMs that were altered represented highly significant changes [27]. In other studies, experience dependent plasticity induced in animals by trimming their whiskers to cause sensory deprivation resulted in

30% lower levels for the SAMs Pcdh1, ICAM5, Plexin-A1, and Lphn 3 in juvenile mice (a period where synaptogenesis peaks) [29]. Also in this latter study, the protein abundance was only very selectively altered only a small number of proteins were affected which included specific SAMs, while 95% of the 7000 tentative synaptic proteins examined showed no significant changes [29]. The above proteomic studies signify that the protein abundance of SAMs can change in response to events triggering synaptic plasticity. However, several caveats exist. These proteomic approaches offer only a global view of protein abundance, profiling changes in protein levels averaged over a large, heterogeneous population of synapses pooled together from many different kinds of neurons and supporting glial cells. In addition, only those proteins that are technically accessible were monitored, that is, only those proteins which were extracted in sufficiently abundant quantities to enable their detection and analysis by mass spectrometric methods [30].

How do protein levels for a specific SAM change in response to synaptic activity at a specific, single synapse or just a small subset of select synapses? Several processes have been identified that modulate SAM protein levels at the level of a single synapse, altering synapse morphology and stabilizing (or destabilizing) synaptic strength on a very local scale in response to synaptic activity (see (1a)–(1d) in Figure 3 ).

SAMs can accumulate or be depleted from membrane surfaces in the synaptic cleft as a result of altered stability, for example, due to loss of stabilizing partners, recruitment, trafficking, internalization, and/or phosphorylation of cytoplasmic tails. For instance, levels of neurexin 1& # x003b2 at the synaptic membrane rise in response to neural activity, apparently due to an increase in stability (or suppressed dynamics) at the synaptic terminal [31]. NLGN1 and NLGN3 have increased surface membrane levels upon chemically induced LTP and decreased levels after LTD as a result of being dynamically exchanged at the postsynaptic membrane through active cytoskeleton transport [32]. In addition, surface expression of NLGN1 is also increased through CAMKII phosphorylation of its cytoplasmic tail in response to synaptic activity [33]. Other SAMs such as OPCML, CNTN1, and cadherins also display decreasing or increasing protein levels in the synaptic cleft in response to synaptic activity as a result of internalization into the cell or mobilization to the synaptic membrane surface [34�].

Protein levels can rise in the synaptic cleft as a result of activity-induced expression via local protein synthesis at the synapse (recently reviewed in [38]). For example, expression of LRRTM1 and LRRTM2 (synaptic organizers that induce presynaptic differentiation) increases as a function of synaptic activity because influx of Ca2+ into the postsynaptic neuron following NMDA-receptor activation induces nuclear Ca2+-dependent transcription [39]. & # x003b1-Dystroglycan expression is also upregulated by prolonged increased neuronal activity at inhibitory synapses in the CNS elevating its protein levels [40]. In addition, local translation of DSCAM in dendrites has been shown to be rapidly induced by synaptic activity [41].

SAM levels can also decrease at synapses as a result of degradation, thereby regulating synapse development and survival. Evidence is building that highly targeted protein degradation takes place at synapses locally and that it can be regulated by synaptic activity (for recent review see [38]). Intriguingly, elegant studies have revealed that the C. elegans SAM, SYG-1, can locally inhibit an E3 ubiquitin ligase complex that tags proteins for degradation, protecting adjacent synapses from elimination [42].

One particular form of proteolysis, ectodomain shedding, is now widely documented to regulate SAM protein levels in the synaptic cleft. During shedding, the extracellular domain of a SAM is proteolytically released from its transmembrane segment or its GPI anchor that tethers it to the synaptic membrane. Liberating the SAM ectodomain permits the protein interactions and extracellular matrix to be remodeled within the synaptic cleft. Ectodomain shedding is involved in structural as well as functional synaptic plasticity and impacts key processes like LTP and LTD (for recent reviews see [43, 44]). Exactly where the released ectodomains end up is unclear. Do they remain in the synaptic cleft, binding and blocking their normal protein partners from forming trans-synaptic interactions? Or are the shed ectodomains lost from the synaptic cleft, diffusing outwards to affect other neighboring synapses? Alternatively, are they perhaps simply degraded locally?

Both presynaptic as well as postsynaptic SAMs have been demonstrated to undergo ectodomain shedding in vitro and in vivo. Activity-dependent proteolytic release has been shown for many well-known SAMs, including neuroligins, neurexins, calsyntenins, SIPR& # x003b1, ICAMs, LARs, Slitrks, and nectins, and their release is executed by various proteases including matrix metalloproteases, ADAM proteases, and alpha/gamma-secretases [14, 43, 45�]. The downstream consequence of ectodomain shedding varies. In the case of the postsynaptic adhesion molecule NLGN1, shedding destabilizes the presynaptic partner neurexin 1& # x003b2 at synapses and decreases the presynaptic release probability of synaptic vesicles, thereby depressing synaptic transmission [48, 50]. Ectodomain release of NLGN1 has relevance for disease, because it is promoted by epileptic seizures [50]. Release of the Sirp & # x003b1 ectodomain has a completely different consequence, because it promotes synapse maturation [51]. Likewise, ectodomain release of CLSTN1, which is found on the postsynaptic membrane of inhibitory and excitatory synapses, permits the transmembrane stub and Ca2+-binding cytoplasmic domain to be internalized and accumulate in the spine apparatus where it is thought to carry out a role in postsynaptic Ca2+- signaling [54].

Taken together, multiple processes exist that regulate protein levels of specific SAMs in the synaptic cleft of single synapses in response to synaptic activity.

4.2. Availability of a Broad Portfolio of Different SAMs Containing Variable, Synergistic, and Competing Partners

It is estimated that there are more than 470 putative cell adhesion molecules in humans [55], although how many of these are expressed in the brain and are synaptic is not known. Nevertheless, a broad portfolio of SAMs has been validated to date and it provides a powerful mechanism to generate a myriad of different possible interactions, some of which can be affected by synaptic activity, thereby contributing to mechanisms of synaptic plasticity (see (2) in Figure 3 ). Diversity is achieved in several ways. Most SAMs are modular in nature and use a combinatorial approach to build up their extracellular region by alternating different structural modules, for example, Ig domains, FN3 domains, and cadherin EC domains ( Figure 1 ). In addition, most SAM families contain several members that, while sharing a conserved domain structure, vary in amino acid sequence. In some families, individual members are diversified even further through alternative splicing of their mRNA, inserting, deleting, or exchanging anywhere from one to more than a hundred amino acids in the encoded protein. For instance, more than a thousand splice variants have been demonstrated for neurexins (discussed below).

The portfolio of SAMs can be expanded even further on a functional level in two key ways. First, SAMs can assume evolving functions over time, carrying out one function during the early stages of brain development, while connectivities are being formed, and then switching to another function in the mature adult brain. For example, early during synapse development, neuroligins and LRRTMs appear to compensate for one another however once synapses have formed, neuroligins and LRRTMs affect excitatory synaptic transmission differently [56]. Likewise, during early development cadherins are important for synapse adhesion, stabilization, and synaptogenesis in young neurons however once mature synapses have formed, they no longer are needed to keep neuronal and synaptic structures in place but appear to play a role in signaling, structural plasticity, and cognitive function [34]. Second, certain SAMs appear to work together synergistically, generating new functions that do not extend to the individual members alone. Case in point, different combinations of protocadherin family members form dimeric cis-complexes that oligomerize into larger tetrameric trans-complexes the functional roles of these different species are still being worked out [57, 58]. Members of different families can also interact with each other in a mix-and-match approach. For example, cadherins bind each other to form trans-complexes spanning the synaptic cleft, but they also can bind protocadherins side-by-side forming cis-complexes [34].

Given such a broad portfolio of SAMs, how different are the proteins functionally or are many of them redundant? The extent to which different SAMs carry out substantially different functions or are redundant is controversial. Some SAMs clearly have discrete and different biological functions. For example, NLGN1 can induce synapse formation in young primary hippocampal cultures, but SynCAM1 cannot [59]. Members of the same SAM family can also have dramatically different roles NLGN2 is found exclusively at inhibitory synapses, while NLGN1 is found predominantly at excitatory synapses [23]. Likewise, Slitrk1 and Slitrk3 promote excitatory versus inhibitory synapse formation, respectively [60, 61] However, equally so, SAMs can also demonstrate functionally redundant actions. For instance, LRRTM1, LRRTM2, NLGN1, and NLGN3, proteins that increase synapse numbers in vitro, appear functionally redundant because only knockdown of all four proteins together decreases the number of formed synapses significantly [62]. Thus, though many SAMs exist, their exact functional roles and the extent to which these are unique or overlap needs to be further investigated, both alone and in the broader context of the synaptic cleft.

The power of a broad portfolio of SAMs binding each other and sculpting interactomes within the synaptic cleft is beautifully illustrated by the complex interaction network that has been revealed centered on neurexins. Presynaptically tethered neurexins reach across the synaptic cleft to bind postsynaptic ligands such as the neuroligins, LRRTMs, and & # x003b1-dystroglycan, forming trans-synaptic bridges ( Figure 4(a) ). Neurexins also recruit calsyntenins, though whether this interaction is direct or indirect is debated [14, 63, 64]. At excitatory synapses, neurexins extend across the synaptic cleft to bind LRRTMs or NLGN1 promoting excitatory synapse development [23, 65�] ( Figure 4(b) ). Because these postsynaptic partners utilize the same or an overlapping binding surface on neurexin, LRRTM2 and NLGN1, for example, compete with each other for neurexin binding, though the functional consequences are not clear [56, 65, 66]. In contrast, at inhibitory synapses, neurexins form a trans-synaptic interaction with NLGN2 promoting inhibitory synapse development [23]. However, competing with this interaction, the postsynaptic adhesion molecule MDGA1 binds NLGN2 tightly side-by-side forming a cis-complex on the dendritic surface that prevents the neurexin:NLGN2 trans-synaptic bridge, thereby decreasing inhibitory synapse development [16, 17] ( Figure 4(c) ). Also at inhibitory synapses, neurexin 1& # x003b1 binds to & # x003b1-dystroglycan or neurexophilin 1 (NXPH1) in a mutually exclusive manner. One consequence of & # x003b1-dystroglycan engaging the neurexin 1& # x003b1 L2 domain is that it prevents binding of neuroligins to the distant neurexin 1& # x003b1 L6 domain suggesting that an (allo)steric mechanism regulates these protein partner interactions [68], (refer back to Figure 1 ). Therefore, the neurexin-centered interactome provides examples of how SAMs can compete with each other for binding partners em cis ou in trans and also be subject to (allo)steric mechanisms that regulate protein partner interactions.

Synaptic protein interaction network coordinated by neurexins. (a) Neurexins (blue ovals) bind many protein partners tethered to the postsynaptic membrane including neuroligins, LRRTMs, & # x003b1-dystroglycan, calsyntenins (CLSTN), and the GABAUMA-receptor, as well as partners that are secreted such as neurexophilins. (b) NLGN1 and LRRTM2 can both bind neurexins at an overlapping binding site generating two competing trans-interactions. (c) Neurexins and MDGA1 can both bind NLGN2 at an overlapping binding site generating competing cis- e trans-interactions.

It is possible that different SAMs interact with each other in a series of sequential and concerted steps to develop and regulate synapses see also recent review by [69]. Revealing such a playbook of interactions will be no easy task because it is complex to accurately assess SAM function. Protein interactions that occur in vitro in a controlled experimental setting may not occur in vivo in the synaptic cleft or only under select circumstances. Likewise, SAM functions may exist in vivo that are not easily measurable in vitro. By way of illustration, neurexins are synaptogenic in vitro in coculture assays suggesting they are essential to form synapses, yet, in vivo, triple knockout of all three alpha- or beta-neurexins does not prevent synapse formation [70, 71]. Likewise, CNTNAP2, considered a genuíno SAM, does not appear important for synapse formation in and of itself, rather it prevents the elimination of new synapses in some way based on live imaging studies through cranial windows in mice [72]. Taken together, the broad portfolio of SAMs present in mammalian brain appears critical to generate diverse, adaptable protein interaction networks that mediate the different stages of a synapse, starting from its initial formation to its ultimate elimination, and to permit activity-dependent regulation once it has formed.

4.3. Diversification of SAMs through Alternative Splicing

One important mechanism to generate diversity of SAMs in the nervous system that deserves special attention is the process of alternative splicing, which has been shown to be regulated by synaptic activity in some cases (see (3) in Figure 3 ). Alternative splicing provides a very efficient and genetically 𠇌ost-effective” mechanism to generate a large panel of proteins that share a common scaffold but each differ from one another to some extent. Alternative splicing of mRNA transcripts result in insertions, deletions, and substitutions of amino acids in the encoded protein and can involve single residues, small inserts, or even complete domains. Several well-known SAM families undergo alternative splicing of their mRNAs generating a portfolio of protein molecules with altered properties and function.

Neurexins form one of the best studied families of SAMs diversified through alternative splicing. Neurexins are encoded by three genes (1, 2, and 3) that each produce a short beta form and a long alpha form, by virtue of two different promoters [23] see also Figure 1 . Single molecule mRNA sequencing of tens of thousands of neurexin mRNAs has demonstrated that there are at least

1,400 variants by one report and more than 2,000 variants by another in the adult mouse brain [73, 74], though the transcripts are not all equally abundant [74]. Alternative splice inserts can be incorporated at six places in the extracellular region of neurexin 1& # x003b1 (SS#1 through SS#6), adding polypeptide inserts of up to 30 amino acids at five of these insertion sites see Figure 1 and [23, 74]. Incorporation of splice inserts has functional consequences because several inserts have been shown to regulate the interaction of neurexins with different postsynaptic partners. For example, incorporation of SS#2 in the L2 domain of neurexin 1& # x003b1 decreases its binding to & # x003b1-dystroglycan, while SS#4 regulates the affinity of neurexins to postsynaptic partners such as neuroligins, LRRTMs, & # x003b1-dystroglycan, cerebellin precursor protein, and latrophilin/ADGRL (recently reviewed by [23, 68, 75]). Proteomic quantitation has confirmed that distinct neurexin splice variants bind different amounts of protein partners, corroborating a mechanism whereby alternative splicing regulates the binding affinity of neurexins for different ligands in vivo [76]. From a biochemical and protein structural perspective, SS#2 and SS#4 change the affinity of Ca 2+ -binding sites central to protein interaction sites on the L2 and L6 domains, while SS#4 also induces structural plasticity because it can adopt multiple conformations [77�]. From a functional perspective, mice engineered to constitutively include SS#4 in neurexin 3& # x003b1 show a decrease in synaptic strength and impaired LTP in vivo because postsynaptic AMPA-receptor levels are decreased at the synapse (as a result of increased AMPA-receptor endocytosis), although the underlying mechanism is not clear [80]. For most neurexin splice inserts, however, their effects on protein structure and function are not well delineated. Likewise, the function of rare neurexin splice variants, in which multiple domains are deleted, is also not known, nor if these yield functional proteins in the first place [74].

The very large portfolio of neurexin alternative splice forms is strategically positioned to play an important role in synaptic plasticity. In the mammalian brain, specific neurexin splice forms demonstrate cell type specific distributions and brain region specific expression both at the mRNA as well as the protein levels [73, 76, 81]. Importantly, incorporation of certain splice inserts is neuronal activity dependent, and an altered splicing profile can be reversed [82�]. For example, analysis of mRNAs in single medium spiny neuron cells (MSNs) demonstrated that neurexin 1& # x003b1 and neurexin 1& # x003b2 are prevalent in D1R-MSNs, but much less so in D2R-MSNs, and mostly contain the SS#4 insert [81]. However, exposure to repeated cocaine administration, a circumstance triggering synaptic plasticity, reduces neurexin 1 mRNA levels in D2R-MSNs even further and alters the profile of splice forms [81]. Therefore, alternative splicing of neurexins generates diversity of protein structure and function, and it can be regulated by events linked to synaptic plasticity.

Other SAM families are regulated by alternative splicing in their extracellular domain as well, altering the affinity with which they bind protein partners in the synaptic cleft. These include the neuroligins where splice inserts regulate interactions with neurexins (refer back to Figure 1 , [85�]) PTPδ and PTPσ where splicing regulates binding to Slitrks, interleukin-1 receptor accessory protein (IL1RAP), and SALM3 [89�] and the family of adhesion GPCRs where alternative splicing alters the domain composition of the extracellular region and consequently the profile of interacting protein partners [95].

4,4. Altered Location of SAMs within the Synaptic Cleft

The advent of powerful high resolution microscopy techniques has revealed that SAMs can be redistributed within the synaptic cleft in response to synaptic activity (see (4) in Figure 3 ). Recent studies show that the synaptic cleft is made up of structurally distinct subcompartments and SAMs can segregate to different regions of the cleft. Upon synaptic activity, however, certain molecules can move within or to the periphery of the synaptic cleft. The impact of these redistributions on synaptic function, however, is not clear. For instance, SynCAM1 and EphB2 receptor tyrosine kinase (EphB2) are two postsynaptic SAMs with different roles. SynCAM1 induces synapse formation and subsequently also maintains excitatory synapses, while EphB2 promotes excitatory synaptogenesis in the rapid early phase of synaptogenesis before neurons mature. By tracking SynCAM1 and EphB2 in the synaptic cleft at excitatory synapses, Perez de Arce and coworkers demonstrated that SynCAM1 is located around the cleft's edge while EphB2 is embedded deeper within the central PSD region [96]. Strikingly, upon application of an LTD paradigm, SynCAM1 underwent redistribution on the surface of the synaptic membrane forming puncta of increasing size, an intriguing finding given that SynCAM1 regulates LTD in vivo and suggesting this redistribution has functional significance [96]. Another SAM, N-cadherin, forms trans-synaptic bridges with N-cadherin molecules tethered to the opposing synaptic membrane. N-cadherin plays an important role presynaptically by regulating synaptic vesicle recruitment and recycling, and postsynaptically in spine remodeling and trafficking of AMPA-Rs, which is important for hippocampal LTP [97]. Superresolution microscopy has shown that N-cadherin localizes predominantly as puncta at the periphery of synapses and to a much lesser extent along the synaptic cleft in unstimulated cultured hippocampal neurons [97]. However, upon synaptic stimulation followed by a rest period, N-cadherin distributes broadly throughout the synaptic cleft [97]. Thus an increasing body of work shows that SAMs can be redistributed as a result of synaptic activity, likely altering protein interactomes in the synaptic cleft. How different SAMs are redistributed and the impact of such redistribution on synaptic function remain to be further elucidated.

4.5. Astrocytic Control of SAMs

A fascinating development has been the demonstration that astrocytes (a type of glial cell found interspersed between neurons which can ensheath synapses) secrete factors that modulate the action of SAMs (see (5) in Figure 3 ). During the development of the nervous system, astrocytes regulate synapse formation and remodeling, impacting synapse number through their ability to promote the formation and elimination of synapses [98]. A single mouse astrocyte can ensheath more than 100,000 synapses [99]. In the mature brain, astrocytes also can modulate synaptic plasticity [98]. Immature astrocytes secrete thrombospondin 1 and thrombospondin 2 (TSP-1 and TSP-2), large, trimeric extracellular matrix proteins that promote the formation of silent synapses in vitro and in vivo (i.e., synapses that are presynaptically active, but postsynaptically silent because they lack functional AMPA-Rs) [100]. TSP1 can bind postsynaptic neuroligins, increasing the speed of excitatory synapse formation at early stages in cultured rat hippocampal neurons, although not the final density of the synapses formed in mature neurons [101]. Hevin, another protein secreted by astrocytes, can modify the interaction between two SAMs in the synaptic cleft by working as an adaptor protein [102]. Hevin binds directly to neurexin 1& # x003b1 and NLGN1(+B), a pair of SAMs that normally do not interact, and engages them in a trans-synaptic bridge promoting excitatory synapse formation [102]. It is thought that the nine-amino-acid splice insert at site B in NLGN1(+B) sterically blocks the interaction between NLGN1 and the sixth LNS domain of neurexin 1& # x003b1 (L6) (refer back to Figure 1 ) thereby forming a key component of the “neurexin-neuroligin splice code,” reviewed in [23]. The bridging of neurexin 1& # x003b1 and NLGN1(+B) by hevin, overriding the splice code, was shown to be critical to form thalamocortical connections in the developing visual cortex in vivo [102]. Therefore, astrocytes by secreting proteins that interact with genuíno SAMs can modify their interactions and regulate protein interactomes in the synaptic cleft.

4,6. Novel Mechanisms to Regulate SAMs

It is likely that additional novel mechanisms exist that regulate SAMs, impacting their function in synaptic activity-dependent ways. One tantalizing mechanism is that SAMs undergo protein structural changes in response to synaptic activity. Perhaps mechanisms will be validated confirming that SAMs can sense synaptic activity in the synaptic cleft and adjust their protein interactions in response via (allo)steric mechanisms. Certainly, incorporation of an alternative splice insert in a SAM in response to synaptic activity (as discussed above) would be one way to induce a protein conformational change. Such a splice insert driven conformational change would have the potential to alter protein interactions within the synaptic cleft. The splice inserts SS#1 and SS#6 in neurexin 1& # x003b1 are of interest in this respect because they integrate into molecular hinges within the neurexin ectodomain and are poised to alter the conformation of domains with respect to one another. However, it is not known yet if these splice inserts are subject to activity-dependent incorporation [74, 103]. A novel protein conformation or interaction site in a SAM might also be induced upon binding of a protein partner and controlled though synaptic activity-induced expression of that partner (refer back to Figures 2(b) and 2(c) ). Neuronal activity-induced expression of & # x003b1-dystroglycan [40], which binds the L2 domain of neurexin 1& # x003b1 and appears to sterically block the interaction of neurexin 1& # x003b1 with neuroligins via the L6 domain, is a prime example [68] (refer back to Figure 1 ). Synaptic stimulation also appears to induce homodimerization of N-cadherin, an event altering the overall protein architecture [104]. Lastly, the protein conformation of a SAM containing Ca 2+ -binding sites might also be altered by changes in Ca 2+ levels in the synaptic cleft as a result of synaptic activity, affecting its interactions with protein partners. Experimental evidence is accumulating that Ca 2+ levels decrease in the synapse cleft in response to (prolonged) synaptic activity, a result of Ca 2+ flooding into the presynaptic terminal during synaptic vesicle release and/or into the postsynaptic terminal upon NMDA-receptor activation [105, 106]. It has been suggested that the extracellular Ca 2+ -level in the synaptic cleft is

1 mM and can drop significantly, maybe as much as 30�% as presynaptic and postsynaptic channels open [107]. Studies on trans-complexes of cadherins have shown that their interactions depend in part on extracellular Ca 2+ levels and are rapidly decreased when extracellular Ca 2+ is depleted [108]. Thus, additional and novel mechanisms to regulate SAMs in response to synaptic activity may be validated in the near future.


Computer Techniques and Algorithms in Digital Signal Processing

Bryan W. Stiles , Joydeep Ghosh , in Control and Dynamic Systems , 1996

2.1 Habituation

Habituation is perhaps the simplest form of learning. In the absence of an unconditioned stimulus, the response to any conditioned stimulus degrades with each repetition of that conditioned stimulus. In biological neural systems, it has been observed that neurons respond more strongly to stimuli which occur infrequently. If a stimulus occurs often and is not classically conditioned, the neuron loses its ability to respond to that stimulus. Conversely if the stimulus is not observed for a long period of time, the neurons ability to respond may return. Experimenting with Aplysia has clarified the neural basis for habituation [BK85] . Bailey and Kandel showed that habituation was localized at a single synapse. Repeated firing of the presynaptic neuron depressed the strength of the synaptic connection. The postsynaptic neuron, therefore, responded less strongly to any stimulus which activated the presynaptic neuron. This behavior showed both short and long term effects. In the short term, synaptic strength could be caused to decrease quickly and then rebound. Conversely, if the synaptic strength was reduced for a long period of time it required a long period of time to reestablish itself. Short term activation of the presynaptic neuron was found to reduce the influx of Ca 2 + which is necessary for neurotransmitter release. Long term habituation led to long periods of Ca 2 + deprivation which in turn made the electrical connection between neurons immeasurable and caused changes in the physical structure of the synapse.

The Byrne and Gingrich model is based on the flow of neurotransmitter among the external environment and two pools internal to the neuron [BG89] . One of the pools, the releasable pool, contains all the neurotransmitter ready to be released when the neuron is activated. The other pool, the storage pool, contains a store of neurotransmitter for long term use. Short term habituation is explained as the depletion of the releasable pool due to frequent activation of the neuron. The increased level of Ca 2 + which results from the occurrence of the conditioned stimulus increases both the flow from the storage pool to the releasable pool and the release of neurotransmitter. It is the increase in neurotransmitter release which leads to activation of the neuron. In this manner, both pools are depleted by the frequent occurrence of conditioned stimuli. The neurotransmitter in the releasable pool can be replenished by diffusion from the storage pool or by other neurotransmitter flows which are regulated through sensitization and classical conditioning. Long term habituation can be explained by depletion of the storage pool itself. The Byrne and Gingrich model assumes a single flow into the storage pool from the external environment. This flow is proportional to the difference between the current neurotransmitter concentration in the pool and the steady state value.

Another model for both long term and short term habituation was presented by Wang and Arbib and is reproduced as follows with straight forward modifications [WA92] . This model was produced independently from the Byrne model, and is based on Wang and Arbib’s own experimental observations. The modifications introduced here merely change the equations from continuous to discrete time, which is necessary in order to use them later in an artificial neural network. Aqui eu(t) is the current input vector from the neurons whose outputs are habituated, and C(t) is the vector of synaptic strengths. The dependence of C(t) on sensitization or classical conditioning effects is ignored. Since this habituation only version of C(t) is dependent only on the activation of the presynaptic neuron, only the single subscript, eu, is needed. Synapses attached to the same presynaptic neuron habituate in the same manner. Henceforth C(t) will be referred to as the habituation value to avoid confusion with either a more complete model of synaptic strength or artificial neural network parameters.

In this model, τeu is a constant used to vary the habituation rate and α is a constant used to vary the ratio between the rate of habituation and the rate of recovery from habituation. A função zeu(t) monotonically decreases with each activation of the presynaptic neuron. This function is used to model long term habituation. Due to the effect of zeu(t) after a large number of activations of the presynaptic neuron the synapse recovers from habituation more slowly. Some assumptions about the range of values for the constants are made in order to assure that Ceu(t) e zeu(t) remain within the range [0,1]. Especificamente, τeu, γ, the product of τeu,·and α e eueu(t) must all be in the same range [0,1]. For simplicity, Cį(0) will always be assumed to be unity unless otherwise stated.

It is apparent in Wang and Arbib’s model that in the long term, if the presynaptic neuron is not completely inactive the synaptic strength will eventually decay to zero, because zeu(t) is monotonically decreasing. This was valid for Wang and Arbib’s research because they were examining the response of animals to artificial stimuli which are of no importance to the animals in question. Sensitization and classical conditioning are ignored in this model. If these other two learning mechanisms were included in the model, then the synaptic strength would only decay to zero in the absence of any unconditioned stimuli.


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