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CRISPR / Cas9 editou E.coli em AFM?

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Estou fazendo experimento CRISPR / Cas9 em E. coli. Estou introduzindo o plasmídeo recombinante BPK764 (que carrega Cas9 + sgRNA projetado e adicionado posteriormente naquele plasmídeo) no compent E.coli células que já carregam outro plasmídeo com o gene GFP. O sgRNA será projetado de forma que corresponda àquele gene GFP, porque meu ponto principal é cortar o gene GFP. O principal resultado desta experiência será E.coli células que expressam / não expressam o gene GFP (dependendo da eficácia CRISPR / Cas9), portanto, as células resultantes serão ou, provavelmente, não serão verdes. Vou ver isso sob a lâmpada ultravioleta e por microscopia fluorescente.

Agora estou chegando à minha pergunta. Existe algo nessas células resultantes (alguma característica, como estrutura da membrana, módulo jovem, que difere das células CRISPR não tratadas) que pode ser visualizado em AFM (microscopia de força atômica)? Algo que muda nas células após a inserção do plasmídeo que pode confirmar a eficácia desse experimento?

Ou talvez alguma outra ideia sobre este experimento usando AFM?


A menos que você esteja direcionando especificamente os genes envolvidos na morfologia física da célula, duvido que você encontraria quaisquer diferenças entre as células CRISPR e não CRISPR que sejam mensuráveis ​​via AFM.

Talvez você deva ter como alvo genes conhecidos por contribuir para a estrutura da parede celular, que eu esperaria ser o material dominante que contribui para o módulo de Young. Uma vez que você mencionou o GFP como uma ferramenta para selecionar cortes "bem-sucedidos", pode valer a pena olhar para a geração de um plasmídeo multiplex que permite alvejar vários loci com uma única construção. Esses kits estão disponíveis no Addgene e contêm publicações e manuais associados sobre como podem ser usados.

Então, para resumir, não, eu não acho que haja algo fisicamente diferente sobre as células que foram tratadas com CRISPR em comparação com um grupo de controle. Se você quiser usar CRISPR para efetuar um nocaute da fluorescência nas células competentes que você descreveu e alterar a mecânica celular, provavelmente você teria que gerar um plasmídeo CRISPR multiplex com vários cassetes de gRNA para GFP e talvez algum gene envolvido na formação da parede celular. Lembre-se de que sua porcentagem de eficiência é composta com cada nova meta no mesmo multiplex - em vez de um único corte ser considerado bem-sucedido, você terá aumentado a barra para 2 cortes considerados bem-sucedidos, sem fazer nada para melhorar a eficiência de um único corte evento.

Espero que isso ajude, e será um prazer discutir isso mais.


Confiável e barato edição de gene, usado tanto para "consertar" defeitos genéticos em pacientes ou para introduzir mudanças genômicas para estudos adicionais em um laboratório de pesquisa, é uma tecnologia muito desejada. Desde seu desenvolvimento por volta de 2012, CRISPR (abreviatura de clustroso runiformemente euespaçado short palindrômico repeats) sistemas ganharam reconhecimento como técnicas poderosas de edição de genes. Os recursos e vídeos fornecidos na seção Bibliografia cobrem muitas das informações sobre como funciona o CRISPR. O CRISPR aproveita as bactérias naturais do sistema imunológico usadas para combater os vírus. O mecanismo de defesa antiviral é baseado na incorporação de fragmentos de DNA de vírus no DNA bacteriano. Esta parte do DNA é chamada de Matriz CRISPR. Dentro da matriz CRISPR, os fragmentos de DNA de vírus adquiridos são separados por curtas repetições de sequência de nucleotídeos conservadas (Figura 1). A bactéria pode então usar esse DNA de vírus adquirido para se identificar e se defender contra novas ameaças virais no futuro.


Figura 1. Vista esquemática de uma matriz de espaçador de repetição CRISPR.

Vários tipos diferentes de sistemas CRISPR foram identificados, mas o mais estudado é o CRISPR-Cas9 sistema. Neste sistema, os genes próximos à matriz de espaçador de repetição CRISPR codificam um mecanismo de defesa único que consiste em um RNA de guia único e um endonuclease (Cas9), uma proteína capaz de cortar o DNA de fita dupla. O RNA de guia único (sgRNA ou gRNA) ajuda a direcionar o perigoso DNA do vírus, e a endonuclease Cas9 degrada os ácidos nucléicos estranhos induzindo a quebra da fita dupla. O sgRNA contém uma ou mais sequências CRISPR adquiridas da matriz espaçadora de repetição CRISPR. No caso de uma infecção por vírus, o sgRNA se combina com a nuclease Cas9 para construir um Complexo sgRNA-Cas9 e o orienta para o alvo apropriado no DNA do vírus (Figura 2).

Como o mecanismo CRISPR pode cortar qualquer parte do DNA, a bactéria deve proteger seu próprio DNA de danos. o PAM (motivo adjacente do protoespaçador) região é uma sequência curta de DNA e um componente de direcionamento essencial que permite à bactéria distinguir seu próprio DNA de DNA estranho. O sgRNA só irá aderir e desativar uma sequência de DNA que contenha uma sequência PAM próxima. O sgRNA bloqueia na sequência PAM e começa a descompactar a fita dupla de DNA para testar se o sgRNA corresponde ao DNA alvo. Uma vez que uma sequência correspondente é encontrada, o sgRNA se liga ao sítio genômico alvo por meio de emparelhamento de bases complementares e a nuclease Cas9 corta o DNA do vírus de fita dupla, inativando o vírus.


Figura 2. O RNA de guia único combina com Cas9 e guia a nuclease para o alvo dentro de um DNA genômico de fita dupla. O sgRNA bloqueia no alvo de DNA diretamente ao lado da sequência de PAM necessária. Se o sgRNA corresponder ao DNA alvo, a nuclease Cas9 corta os pares de bases 3 de fita dupla de DNA a montante do motivo PAM. (Crédito da imagem: Marius Walter [CC BY-SA 4.0], Wikimedia Commons, 2017)

Os pesquisadores descobriram agora uma maneira de manipular a sequência de nucleotídeos do sgRNA para que o sistema Cas9 possa ter como alvo qualquer sequência de DNA para clivagem. Uma vez que a nuclease Cas9 corta o DNA alvo, a célula natural Mecanismos de reparo de DNA Há duas vias principais dentro de uma célula que resultam no reparo de quebras de fita dupla de DNA. O primeiro caminho é o via de junção de extremidade não homóloga (NHEJ), que está sujeito a erros e pode levar a mutações de inserção ou exclusão no DNA. O segundo caminho é o mecanismo de reparo direto homólogo (HDR), que permite a inserção de um modelo de DNA específico (de fita simples ou dupla) no local alvo. Para saber mais detalhes sobre essas duas vias, você pode ver a Simulação de mecanismo de reparo de DNA de gatilhos CRISPR-Cas9 no LabXchange. Atualmente, as duas aplicações mais comuns da tecnologia CRISPR são a mutação direcionada de genes específicos, resultando em nocautes funcionais de genes e a substituição de uma variante de gene por outra. Ambas as estratégias aproveitam o mecanismo CRISPR natural. Nocaute de gene e substituição de genes tornaram muito mais fácil investigar as funções dos genes e estabelecer ligações causais entre variações genéticas e fenótipos biológicos.

A tecnologia CRISPR-Cas9 foi usada com sucesso em células bacterianas e de mamíferos, permitindo a criação de animais transgênicos com mutações direcionadas. A maioria das pesquisas do CRISPR tem se concentrado no tratamento de doenças através da introdução de alterações genéticas nas células do sangue, pulmão ou cérebro. Os pesquisadores têm grandes esperanças de que esta tecnologia um dia permitirá aos cientistas reparar variantes de genes causadores de doenças em pacientes com certas doenças genéticas. Essa abordagem é especialmente promissora em doenças como anemia falciforme, fibrose cística e doença de Huntington, cada uma delas ligada a uma única variante de gene. Em 2019, os primeiros ensaios clínicos de edição de genes começaram, visando pacientes com anemia falciforme. No futuro, o CRISPR também pode ter um impacto significativo na agricultura e no meio ambiente, incluindo seu impacto na saúde humana. Por exemplo, o CRISPR pode ser usado para modificar as plantações para torná-las mais resistentes à seca ou às pragas, ou para erradicar os insetos que disseminam doenças, como os mosquitos.

Embora a edição do genoma traga benefícios potenciais significativos, também levanta profundas questões éticas. Quais são os padrões de segurança CRISPR apropriados? Onde estão os limites desta tecnologia? A edição de genes nos aproxima de "bebês projetados"? E quanto à discriminação genética em potencial? Como podemos conceder acesso equitativo às tecnologias de edição de genes? Em 2018, o pesquisador chinês He Jiankui afirmou ter editado os genomas de dois embriões humanos, que então se desenvolveram em dois bebês humanos, destacando a necessidade de um discurso público contínuo para abordar essas questões éticas fundamentais relacionadas ao CRISPR.

Neste projeto, você mesmo fará um experimento de edição do gene CRISPR! Especificamente, você usará CRISPR para modificar o DNA genético de Escherichia coli de modo que se torna resistente à estreptomicina. Estreptomicina é um antibiótico que se liga ao ribossomo e o impede de produzir proteínas, impedindo a replicação e o crescimento da bactéria. Neste projeto, seu objetivo é fazer uma mutação específica na proteína da subunidade ribossômica rpsL que evita que a estreptomicina se ligue a ela, permitindo que a bactéria cresça em meio de estreptomicina. A modificação de seu DNA precisa mudar uma única base de DNA para que o aminoácido lisina na posição 43 (K43) se transforme em treonina. Para tanto, o kit inclui dois CRISPR plasmídeos e um específico Modelo de reparo de DNA que carrega a mudança de DNA desejada. Você testará se também pode atingir a mutação desejada ao fazer a reação CRISPR sem o modelo de reparo de DNA. Você acha que isso irá funcionar? Experimente este projeto para descobrir!


1. Introdução

As tecnologias CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associado) têm avançado muito nossas capacidades de engenharia genética nos últimos anos. Amplamente encontrados em bactérias e arquéias, os sistemas CRISPR-Cas constituem os sistemas imunológicos adaptativos que atuam contra a invasão de ácidos nucléicos estranhos [1]. Em geral, os sistemas CRISPR-Cas são compostos por um RNA CRISPR (crRNA) e proteínas Cas. O crRNA é complementar à sequência alvo e, portanto, orienta as proteínas Cas para o reconhecimento específico da sequência e clivagem. A modificação genética pode então ser introduzida por qualquer união de extremidade não homóloga propensa a erros (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR) que cria modificações genômicas precisas. Enquanto os eucariotos usam ambos os mecanismos para responder a quebras de DNA [2,3], a maioria dos procariotos emprega HDR [[4], [5], [6]]. Esses mecanismos podem ser explorados para várias biotecnologias baseadas em CRISPR-Cas.

Uma série de tecnologias CRISPR-Cas promissoras foram desenvolvidas, revolucionando a pesquisa e a aplicação em biologia. Em comparação com as estratégias tradicionais de engenharia de DNA [7,8], como a recombinação & # x003bb-Red, a edição do genoma CRISPR-Cas é um método sem marcadores, versátil e eficiente, e requer menos triagem para identificar os clones positivos. Além disso, a engenharia das proteínas Cas para Cas deficiente em nuclease (dCas) expande ainda mais o poder dos sistemas baseados em CRISPR-Cas para uma repressão e ativação transcricional fácil, eficiente e multi-alvo, permitindo o controle do nível de expressão de potencialmente quaisquer genes de interesse sem manipular a sequência genômica. Além disso, novas tecnologias baseadas em CRISPR-Cas estão em constante desenvolvimento. Por exemplo, por fusão de desaminases a dCas, os sistemas CRISPR-Cas podem ser adaptados para permitir a edição de base em DNA e RNA, sem a necessidade de clivagem de DNA ou quaisquer modelos de doadores. Além disso, com base no efeito colateral das proteínas Cas, os sistemas CRISPR-Cas foram explorados para detectar ácidos nucleicos específicos em nível de attomole [[9], [10], [11]].

Os sistemas CRISPR-Cas são classificados como Classe 1 e Classe 2, que são baseados no complexo efetor multiproteico e uma única proteína Cas, respectivamente. Dependendo de sua complexidade e proteínas de assinatura, os sistemas CRISPR-Cas são divididos em seis tipos (Tipo I-VI). Entre eles, o tipo II-A CRISPR-Cas9 e o tipo V-A CRISPR-Cas12a (anteriormente referido como Cpf1) foram os mais amplamente estudados e desenvolvidos como ferramentas genéticas em bactérias. Notavelmente, com base nos resultados do PubMed usando os termos & # x0201cCas9 & # x0201d e & # x0201cCas12a (ou Cpf1) & # x0201d, & # x0223c5000, artigos foram publicados nos últimos dois anos (Fig. 1), indicando o surgimento de um tópico de pesquisa. Existem muitas análises importantes sobre as aplicações do CRISPR-Cas em organismos eucarióticos, como leveduras, fungos filamentosos, plantas e células de mamíferos [[12], [13], [14], [15]]. Aqui, discutiremos o CRISPR-Cas com um foco particular nas tecnologias e aplicações associadas do CRISPR-Cas9 e CRISPR-Cas12a em várias espécies bacterianas.

Números de publicações do NCBI PubMed contendo Cas9 e Cas12a (Cpf1). Os dados de 2018 são coletados no final de agosto.


Biotecnologia CRISPR-Cas9 / Cas12a e aplicação em bactérias

As tecnologias CRISPR-Cas remodelaram muito o campo da biologia. Nesta revisão, discutimos o CRISPR-Cas com um foco particular nas tecnologias e aplicações associadas do CRISPR-Cas9 e CRISPR-Cas12a, que foram mais amplamente estudados e usados. Discutimos os mecanismos biológicos de CRISPR-Cas como sistemas de defesa imunológica, sistemas anti-CRISPR-Cas recentemente descobertos e as variantes de Cas emergentes (como xCas9 e Cas13) com características únicas. Em seguida, destacamos várias biotecnologias CRISPR-Cas, incluindo edição de genoma dependente de nuclease, regulação do gene CRISPR (incluindo interferência / ativação CRISPR), edição de base de DNA / RNA e detecção de ácido nucleico. Por último, resumimos as aplicações atualizadas das biotecnologias para biologia sintética e engenharia metabólica em várias espécies bacterianas.


Conteúdo

Sistema de recombinação λ-red Editar

O sistema de recombinação λ-red foi publicado em 1998 e permite a inserção, exclusão ou mutações para E. coli genes. [2] Neste sistema, o operon vermelho do bacteriófago λ é transfectado em E. coli células para facilitar a incorporação de DNA alvo linear no E. coli genoma. O operon λ-red do bacteriófago consiste no exo, aposta, e gam genes que, juntos, são responsáveis ​​pela recombinação. A exonuclease (exo) do fago λ degrada o DNA alvo linear transfectado da extremidade 5 '. [3] Beta se liga à extremidade 3 'de fita simples resultante e a incorpora ao DNA alvo para formar o DNA recombinante. [3] Fago λ gama é necessário para inibir E. coli atividade de nuclease e proteger o DNA linear transformado na Vivo. [4]

Após a indução da atividade do operon λ-red, um cassete linear de fita dupla que codifica um marcador selecionável, tal como resistência a antibióticos, é transformado nas células no lugar do gene alvo e incorporado no DNA atrás de um promotor indutível específico. [2] Isso permite a seleção do crescimento das células recombinantes com o local de inserção adequado verificado usando a reação em cadeia da polimerase (PCR). A incorporação específica pode ser alcançada incluindo iniciadores de PCR de flanqueamento em torno do DNA linear inserido que são complementares ao local de inserção direcionado. Após a seleção dos recombinantes, uma segunda transformação é necessária para remover o marcador seletivo. Um plasmídeo que expressa flippase (FLP) pode ser transformado nas células recombinadas, que podem clivar especificamente os locais alvo de reconhecimento de FLP (FRTs) que flanqueiam o gene de resistência a antibióticos. [2] Embora isso remova com sucesso o marcador seletivo do genoma, deixa cicatrizes de FRT no lugar do gene alvo.

O sistema λ-red também foi otimizado para recombinação sem cicatrizes, no entanto, este é um sistema de duas etapas que consiste em seleção e contra-seleção. Neste caso, um cassete de gene com um marcador selecionável duplo pode ser incorporado ao DNA no local específico da mutagênese. Após a seleção de recombinantes, uma transformação subsequente para transfectar DNA linear com a mutação desejada é realizada, que será então recombinada homóloga no DNA celular no lugar do marcador. Portanto, a contra-seleção contra as células contendo o marcador precisa ser realizada para identificar as células que incorporaram com sucesso o DNA linear na sequência alvo. Isso pode ser verificado usando a triagem de PCR. [5]

O método de recombinação detalhado acima é vantajoso, pois fornece uma alternativa aos processos de recombinação de baixa eficiência, trabalhosos e de várias etapas usando endonucleases e ligases. Portanto, a recombinação λ-red é mais específica em termos de possíveis alterações genômicas que não são governadas por localizações de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição. No entanto, ele também tem muitas limitações. Várias rodadas de transformações podem aumentar o risco de erro e aumentar o tempo de recombinação. Portanto, a eficiência pode ser baixa (0,1–10% para mutações pontuais 10 −5 –10 −6 para inserções, deleções ou substituições) e requer um longo crescimento em colônias viáveis ​​entre as transformações e as seleções recombinantes. Tudo junto, isso contribui para um procedimento de mutagênese longo e ineficiente, mesmo para mutações únicas. [6] Essa técnica também pode deixar cicatrizes que podem contribuir para a desestabilização do cromossomo e impactar no sucesso da manipulação.

Edição de recombinação CRISPR / Cas9

Um método mais recente para edição de genoma usa sequências CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e a endonuclease Cas9 (proteína 9 associada a CRISPR). Esses componentes são parte integrante da resposta imunológica de algumas bactérias. [7] e foram reaproveitados para a engenharia do genoma. Neste sistema, as sequências correspondentes ao bacteriófago estranho ou ao DNA de plasmídeo são incorporadas como sequências "espaçadoras" no genoma bacteriano localizado entre os loci CRISPR repetidos. As endonucleases cas são capazes de iniciar quebras de fita dupla dentro desses DNAs estranhos que são complementares aos RNAs CRISPR transcritos (crRNA, ou “protospacers”), degradando-os assim. Um motivo conservado do protoespaçador adjacente (PAM, sequência 5'-NGG-3 ') localizado imediatamente a jusante do protoespaçador no genoma celular é necessário para a clivagem de Cas9. Juntos, esse sistema permite imunidade adaptativa ao material genético viral dinâmico. [8]

Em 2013, métodos para aproveitar este sistema para uso na edição de mutações ou inserções de E. coli sequências foram publicadas. [9] Este método inclui a construção de um plasmídeo que consiste na cas9 gene e loci CRISPR contendo o DNA alvo correspondente, denominado RNA guia único (sgRNA). Após a expressão ser induzida, Cas9 é capaz de identificar a sequência de DNA alvo do genoma celular ao encontrar o complemento de sgRNA e iniciar quebras de fita no E. coli genoma.Isso permite que uma sequência de DNA linear transfectada seja incorporada ao genoma, contando com a maquinaria celular para usar o DNA linear flanqueado por regiões homólogas específicas para o local clivado como um modelo para reconstruir usando reparo direcionado por homologia. [9]

Este método é vantajoso porque permite que múltiplas mutações sejam introduzidas no genoma em um experimento. Ele também melhorou muito a eficiência em relação às tecnologias anteriores e permite quase qualquer tipo de mutação com facilidade. Essas vantagens tornam a técnica de recombinação CRISPR / Cas9 a mais promissora para aplicação na saúde humana. No entanto, existem grandes desvantagens, incluindo, mais proeminentemente, clivagem fora do alvo que pode resultar em interrupções não intencionais do genoma. [10]

Integração de recombinação λ-red e Cas9 Editar

Reisch e Prather foram os pioneiros em uma técnica que combina os sistemas de recombinação λ-red e CRISPR / Cas9 para formar uma nova metodologia chamada no-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) para E. coli modificações do genoma. Neste método, um plasmídeo contendo o gene para a expressão de Cas9 (cas9) é primeiro transformado em E. coli células. Depois de selecionar os transformantes usando resistência a antibióticos, outro plasmídeo contendo o gene alvo de interesse na forma de sgRNA e o operon λ-red é transformado. Após a expressão induzida do sistema de recombinação λ-red, o DNA linear deve ser incorporado ao E. coli o genoma é transformado nas células. A expressão de Cas9 e o sgRNA são então induzidas, o que resulta em Cas9 localizando o E. coli DNA alvo com base no complemento de sgRNA. Cas9 é capaz de iniciar uma quebra de fita dupla e o sistema λ-red é capaz de trazer o DNA linear para E. coli genoma para recombinação homóloga. As células são então curadas do plasmídeo contendo o sgRNA específico e, em seguida, o próximo plasmídeo contendo a sequência alvo de sgRNA específica pode ser transformado e o processo é repetido. [1]

Este sistema é capaz de modificar várias localizações do genoma rapidamente. Nos casos em que um pequeno número de mutações é introduzido no genoma, a eficiência de tempo de no-SCAR é comparável a outros métodos. Porém, com um grande número de alterações, essa técnica é superior. [1]

Edição de plasmídeos

A edição sem SCAR usa plasmídeos para modificação do genoma criado usando clonagem de extensão de polimerase circular. [11] Resumidamente, em uma reação de uma etapa, este processo pode montar e clonar várias inserções em qualquer vetor e não requer digestão com enzimas de restrição, ligação ou recombinação homóloga. Portanto, este método contribui para a relação custo-benefício e o rendimento do sistema no-SCAR.

A técnica no-SCAR usa um sistema de dois plasmídeos porque a co-transformação de ambos cas9 contendo plasmídeo e o plasmídeo sgRNA resulta em morte celular. Mais especificamente, a letalidade celular é uma consequência do Cas9 clivar o E. coli DNA que corresponde ao sgRNA. Para contornar esse problema, vários plasmídeos são usados ​​para manter o controle expressional de ambos cas9 e sgRNA.

O PTET O promotor desempenha um papel integral na expressão de ambos os plasmídeos. Ele conduz a expressão transcricional de ambos os sgRNA de interesse e cas9 na célula hospedeira após indução com anidrotetraciclina (aTc). Na ausência do indutor, o PTET o promotor é reprimido pela proteína repressora de tetraciclina expressa constitutivamente (TetR). Portanto, a presença de TetR na célula hospedeira antes da introdução de ambos sgRNA e cas9 é uma medida para evitar a letalidade celular. [1]

O primeiro plasmídeo usado no trabalho pioneiro de Reisch e Prather é composto por: o cas9 gene sob o controle do PTET promotor o tetR gene, que codifica a proteína repressora de tetraciclina, sob o controle de um promotor constitutivo e o cm r gene para resistência ao cloranfenicol. Foi observado que a expressão vazada de Cas9 ocorreu mesmo sem indução do PTET promotor. Portanto, para evitar a morte celular, uma tag de RNA mensageiro de transferência (ssrA) foi incluída no plasmídeo a jusante do cas9 gene. No caso de expressão de Cas9 com vazamento, a tag ssrA C-terminal seria reconhecida pela protease ClpP e degradaria Cas9 para permitir um melhor controle expressional da proteína. Juntos, esses componentes constituem o plasmídeo pCas9cr4 e permitem o direcionamento do cromossomo da célula hospedeira. [1]

O segundo plasmídeo utilizado no método no-SCAR consiste em: o sgRNA de interesse expresso sob o controle do PTET promotor os três genes que compõem o sistema λ-red (exo, bet e gam) sob o controle do Párabe promotor, que é induzido por arabinose e o gene que confere resistência a aminoglicosídeos, como espectinomicina e estreptomicina. Esses componentes constituem o plasmídeo pKDsg-XXX para facilitar as alterações mediadas por λ-red do E. coli genoma, onde -XXX denota a sequência alvo a ser modificada. [1]

Em resumo, teoricamente, os plasmídeos para uso neste método podem ser construídos para permitir a personalização absoluta do protocolo. Uma estipulação é que cada um dos dois plasmídeos construídos deve ter marcadores selecionáveis ​​distintos, como genes que conferem resistência a dois antibióticos diferentes, para permitir a seleção direcionada e contra-seleção. Além disso, o plasmídeo pCas9cr4 pode ser adquirido na Addgene (ID 62655) para implementação direta em um experimento de recombinação sem SCAR, e os plasmídeos pKDsgRNA-p15 (ID 62656) e pKDsgRNA-ack (ID 62654) também podem ser adquiridos na Addgene.

Edição de transformações

A próxima etapa no protocolo no-SCAR é transformar os plasmídeos pCas9cr4 e pKDsg-XXX e os oligonucleotídeos lineares no E. coli células próprias. Para conseguir isso, as células são feitas para serem eletrocompetentes, um dos métodos, como usado por Reisch e Pather, está usando um gradiente de degrau de densidade de glicerol / manitol, que é rápido e simples. [12] Isso permite a transformação por meio de eletroporação e introdução de plasmídeos e DNA nas células.

A fim de aumentar a eficiência da transformação, as células transformadas são cultivadas em caldo superótimo para acelerar o processo de recuperação após a transformação. Neste método, duas transformações subsequentes devem ser realizadas a fim de incorporar os plasmídeos pCas9cr4 e pKDsg-XXX necessários para a recombinação. Isso ocorre porque estudos preliminares descobriram que quando Cas9 e sgRNA foram expressos ao mesmo tempo sem o DNA linear a ser incorporado ao genoma, a morte celular foi induzida devido à interrupção do gene crucial. [1] Portanto, a expressão da maquinaria de recombinação e sgRNA foram mantidos sob estrito controle e transformados gradualmente para reduzir a letalidade celular.

Para garantir que o plasmídeo pCas9cr4 foi primeiro admitido com sucesso nas células, as células foram cultivadas em uma placa contendo cloranfenicol, o plasmídeo pCas9cr4 continha o gene cm r , conferindo resistência ao cloranfenicol, que garantiu que apenas os recombinantes bem-sucedidos crescessem. Placas triplicadas de 10 μL de culturas recuperadas, bem como diluições de 10 −1, 10 −2 e 10 −3 foram então localizadas e incubadas durante a noite a 30 ° C e CFU, ou unidade formadora de colônia, avaliações foram feitas para identificar mutantes bem-sucedidos usando o método de galvanização miniaturizado descrito anteriormente. [13] Uma vez que a mutação de interesse foi rastreada usando crescimento durante a noite em placas de meio mínimo M9 suplementadas com glicerol, cloroacetato e SOC (caldo superótimo com repressão catabólica), as colônias foram remendadas em placas seletivas usando um palito e incubadas a 30 ° C por duas noites. [1] Após crescimento de colônia suficiente, as células foram transfectadas com o plasmídeo pKDsg-XXX contendo o aada gene, e como resultado eram resistentes aos aminoglicosídeos espectinomicina e estreptomicina. Para garantir que o plasmídeo pKDsg-XXX foi admitido com sucesso nas células, as células foram cultivadas em uma placa contendo cloranfenicol e espectinomicina para selecionar células contendo os plasmídeos pCas9cr4 e pKDsg-XXX.

Após a recombinação bem-sucedida do DNA linear para o genoma alvo, as origens do plasmídeo e os marcadores podem ser reutilizados como resultado do método de cura do plasmídeo. O pKDsgRNA contém uma grelha de leitura aberta sensível à temperatura que, quando cultivada a 37 ° C, desnatura o plasmídeo. Isso permite a cura fácil do plasmídeo que não inclui quaisquer reagentes adicionais. Isto é útil porque após a cura do plasmídeo pKDsg-XXX, outro plasmídeo pKDsg-XXX com um sgRNA diferente pode ser subsequentemente transfectado no E. coli células para introduzir mais mutações nas sequências celulares alvo. Depois que todas as mutações são introduzidas, ambos os plasmídeos devem ser curados. Infelizmente, o plasmídeo pCas9cr4 carece de um mecanismo de cura inerente, então Reisch e Prather foram os pioneiros em um mecanismo de cura de plasmídeo ao introduzir um pKDsgRNA cujo sgRNA é complemento do plasmídeo pCas9cr4. Especificamente, eles construíram um pKDsg-p15A que tinha como alvo a origem de replicação de p15A do plasmídeo pCas9cr4. Após a seleção dos recombinantes, a expressão de Cas9 e sgRNA foi induzida com a adição de aTc. Após plaqueamento em placas seletivas e crescimento a 37 ° C, eles não observaram a formação de colônias nas placas LB contendo cloranfenicol, indicando perda do plasmídeo pCas9cr4 devido a uma quebra de fita dupla mediada por Cas9 no plasmídeo. Mini-preparações de plasmídeo adicionais demonstraram que nenhum plasmídeo foi retido nas células, indicando, portanto, a cura do plasmídeo. Esta técnica pode ser facilmente aplicada para curar outros plasmídeos também. [1]

Editar Recombinações

Os oligonucleotídeos usados ​​para recombinações subsequentes devem seguir várias diretrizes para ajudar a maximizar o sucesso. [14]

Primeiro, o comprimento ideal do oligo para o DNA linear transfectado deve estar entre 60 e 90 pares de bases. Esta diretriz é baseada em observações anteriores de que este comprimento tem a maior eficiência de substituição alélica. Os oligos mais longos são propensos a formar estruturas em grampo que não são apenas inibidoras, mas também são mais caras para sintetizar. Oligos mais curtos têm energias de hibridização mais baixas, resultando em estabilidade diminuída do oligo para o alvo cromossômico. Desta sequência, pelo menos 15 pares de bases devem ser homólogos à sequência alvo em ambas as extremidades 5 'e 3' para fornecer anelamento de oligo suficiente. [14]

Outra consideração é a inclusão de ligações fosforotioato. Em uma ligação de fosforotioato, um dos oxigênios que não formam ponte entre as bases de nucleotídeos é substituído por um átomo de enxofre, alterando as propriedades químicas. Esta modificação é necessária no desenho do oligo porque resulta na diminuição da suscetibilidade à degradação da exonuclease. No máximo, quatro dessas ligações devem estar situadas perto da extremidade 5 'do oligo. [14] Muitas ligações de fosforotioato podem ser problemáticas, cada sítio modificado cria um centro quiral, que pode levar a uma mistura racêmica de isômeros com características e propriedades variáveis. [15] [16]

Otimização adicional pode ser alcançada projetando oligos que têm como alvo a fita retardada na replicação do DNA, porque o direcionamento da fita retardada resulta em uma frequência mais alta de recombinantes. Na replicação do DNA, os primers de RNA devem ser inseridos ao longo da fita retardada para que a DNA polimerase seja capaz de sintetizar a fita na direção 5 'para 3'. Esta síntese descontínua resulta na fita retardada sendo mais exposta, o que permite um emparelhamento mediado por beta mais fácil do oligo com o DNA alvo do que quando comparado com o emparelhamento com a fita principal. [14]

Finalmente, o mecanismo de reparo de incompatibilidade (MMR) oferece proteção inerente à célula contra a incompatibilidade de bases de nucleotídeos. Portanto, quaisquer mutações introduzidas nos oligonucleotídeos podem ser direcionadas pelo MMR. Existem várias maneiras de evitar isso. Primeiro, o uso de uma cepa de E. coli com deficiência de MMR erradicará esse problema. No entanto, isso também resulta em uma taxa mais alta de outras mutações aleatórias em todo o genoma. Outro método para reduzir o reparo de incompatibilidade é enterrar as mutações de interesse dentro de outras mutações silenciosas. Como as mutações silenciosas não costumam causar efeitos catastróficos, elas são mal detectadas pelo mecanismo MMR. [17] A presença de bases modificadas também ajudará a evitar o maquinário MMR porque elas não são reconhecidas. [14] Finalmente, segmentos longos de mutações serão menos afetados por segmentos curtos de mutações. [14]

Os oligonucleotídeos transformados são incorporados ao DNA celular por meio de recombinação homóloga mediada por endonuclease λ-red e Cas9. [1] λ-red é ativado quando a arabinose se liga ao AraC expresso, induzindo a dimerização da proteína AraC e a subsequente ligação ao DNA para ativar o promotor [18] antes da transfecção do oligonucleotídeo. Esta etapa é seguida pela expressão induzida da nuclease Cas9 e do sgRNA através da ligação de anidrotetraciclina ao PTET promotor. Cas9, com a orientação do sgRNA transformado, identifica o E. coli complementa a sequência alvo e inicia uma quebra de fita dupla. Um aspecto crucial é que o gene alvo deve estar próximo a montante da sequência PAM. [19] Felizmente, a sequência PAM NGG ocorre em 424.651 instâncias em ambas as fitas do E. coli cromossomo, portanto, este método não é limitado em sua especificidade alvo. [20]

Enquanto isso, λ gam dimerizado se liga às nucleases RecBCD e SbcCD do hospedeiro, inibindo todas as suas atividades conhecidas, o que evita a degradação do DNA estranho linear. [21] λ exo se liga ao DNA transformado linear de fita dupla e o degrada processamente em uma direção de 5 'para 3'. Exo é uma proteína trimérica globular que forma um anel com um centro oco que posiciona o DNA linear para clivagem. Um lado do anel é grande o suficiente para admitir DNA de fita dupla, mas a outra extremidade só pode acomodar DNA de fita simples, fornecendo detalhes sobre o mecanismo de ação exo. Este processo resulta em saliências 3 'de fita simples no DNA linear. [22] Subsequentemente, λ beta, um membro de uma família de recombinase, liga-se às saliências 3 'e medeia o recozimento ao complemento E. coli DNA. Este processo ocorre por meio da invasão da saliência 3 'de fita simples no DNA alvo complementar na fita retardada durante a síntese de DNA, permitindo o emparelhamento facilitado por beta. [23]

Em resumo, este protocolo permite um direcionamento de genoma quase ilimitado, desde que uma estipulação seja considerada: este método é limitado ao direcionamento E. coli sequências que estão localizadas diretamente a montante de uma sequência PAM NGG, portanto, os experimentos devem ser projetados para acomodar essa restrição.

Edição de tela de PCR

Uma vez que as colônias são selecionadas, os transformantes são genotipados usando PCR específico para alelos. [24] Nesse processo, um primer de PCR mutante é usado para selecionar o genótipo mutante em relação ao tipo selvagem. Se o genótipo mutante estiver presente, ele se emparelha com a extremidade 3 'do iniciador de PCR, enquanto o genótipo de tipo selvagem resulta em DNA incompatível na extremidade 3'. A incompatibilidade entre a extremidade 3 'do primer e o tipo selvagem impede a extensão do primer e, portanto, apenas o genótipo mutante produz um produto de PCR. A polimerase Taq hotstart sem atividade de exonuclease 3 'a 5' foi usada para PCR de colônia dos mutantes putativos. [1]

O método sem SCAR é capaz de induzir mutações pontuais, deleções mediadas por oligonucleotídeos e inserções de sequência curta com alta eficiência. No caso de mutações pontuais, os oligonucleotídeos direcionados à fita retardada são projetados para alterar a sequência PAM ou as sequências do protoespaçador dentro de 12 pares de bases do PAM, pois esta é a região mais importante para a especificidade Cas9. [1] Com este processo, são possíveis mutações sem sentido e sem sentido. No entanto, as transformações subsequentes diferem entre mutações sem sentido e sem sentido: as transformações duplas, em que o plasmídeo pCas9cr4 e o oligonucleotídeo são transformados simultaneamente, são mais eficientes para mutações sem sentido, enquanto as transformações únicas, em que cada plasmídeo e oligonucleotídeo são transformados independentemente, são mais adequadas para mutações sem sentido [1] conforme demonstrado por PCR de colônia. O método também é capaz de excluir com sucesso grandes regiões do DNA cromossômico usando oligonucleotídeos projetados com homologia a montante e a jusante da área de exclusão. No caso de deleções, um único protocolo de transformação é mais eficiente e mostra uma taxa de exclusão de 100% após PCR de colônia. [1] Trabalho adicional deve ser realizado para determinar as causas das diferentes eficiências de transformação para vários tipos de mutação.

As inserções de sequência curta também são possíveis usando o método sem SCAR. A fim de contornar as restrições de comprimento de oligonucleotídeo, sequências de dsDNA linear são usadas para inserir fragmentos no cromossomo. Como o sistema usa um plasmídeo que expressa os genes exo e gama do sistema λ-red, ele é capaz de usar técnicas de recombinação de oligonucleotídeos para inserção de sequência. Mais especificamente, as fitas de dsDNA facilitam a inserção através do mecanismo de intermediários de fita simples na forquilha de replicação. Métodos anteriores foram bem sucedidos em inserir 30pb no cromossomo [25], enquanto o método sem SCAR foi capaz de inserir uma sequência dez vezes maior (300pb). Mais importante, as telas de PCR identificaram uma taxa de inserção de 100% em três experimentos separados. [1] Embora a eficiência de recombinação diminua com o tempo, [26] espera-se que o método sem SCAR facilite com sucesso as inserções de mais de 1 kB de sequência. [1]

Limitações Editar

O sistema atual não é capaz de selecionar simultaneamente contra mais de um alvo [1] como resultado de dificuldades na síntese de DNA e métodos de clonagem independentes de ligação. Essencialmente, isso significa que as sequências altamente repetitivas necessárias para múltiplos sgRNA em um único plasmídeo são restringidas por falhas na maquinaria biológica necessária para expressá-las e direcioná-las para mais de um alvo. Melhorias futuras são necessárias para permitir manipulações genômicas simultâneas usando vários sgRNA distintos em um único plasmídeo.

Desafios subjacentes à recombinação de plasmídeo e perda de sequências de protoespaçador também impactam o método no-SCAR e requerem melhorias adicionais. [1] A pobre recombinação de plasmídeo é a base da frequência de dificuldades de escape que podem impactar a eficiência da manipulação genética.

Edição de Pesquisa

O método no-SCAR é mais eficiente do que as técnicas de clonagem padrão, incluindo a recombinação de ssDNA [27], bem como outras técnicas de edição de genoma sem cicatrizes. O método permite um número ilimitado de alterações genômicas em uma única etapa sem o uso de marcadores selecionáveis. A grande vantagem do método, especificamente em termos de aplicações de pesquisa, é a rapidez do protocolo.No artigo seminal de Reisch e Prather, o método no-SCAR exigiu 5 dias de trabalho, incluindo a etapa de clonagem necessária para o direcionamento de sgRNA. Uma vez que as células contêm o plasmídeo pCas9cr4, as experiências subsequentes podem ser concluídas em apenas 3 dias, permitindo a edição rápida do genoma. Atualmente, o método no-SCAR é mais rápido do que qualquer outro método publicado [1] e é uma opção atraente para pesquisadores interessados ​​em estudar os efeitos de inúmeras modificações.

Quando comparado especificamente com outras técnicas de edição de genoma sem cicatrizes, incluindo o método publicado por Datsenko e Wanner, [2] o método sem SCAR é menos demorado quando múltiplas mutações são desejadas. Dois componentes do método medeiam essa capacidade de mutação rápida. Primeiro, o plasmídeo pCas9cr4 é retido nas células após a primeira iteração, evitando assim a transfecção repetitiva do plasmídeo nas células. Nos casos em que três modificações do genoma são desejadas, por exemplo, isso significa que o método no-SCAR é capaz de mediar essas mutações quatro dias mais rápido do que o próximo método mais rápido. [1] Em segundo lugar, o gene do tipo selvagem nunca é removido do cromossomo. Isso significa que a triagem de PCR é capaz de identificar mais rapidamente vários mutantes porque genes essenciais do tipo selvagem podem ser direcionados com facilidade.

Saúde humana Editar

A descoberta do sistema de edição de genoma CRISPR / Cas9 revolucionou a pesquisa genética. Em termos de saúde humana, tem aplicações tanto em doenças específicas quanto em sistemas de células-tronco que modelam essas mesmas doenças. Na pesquisa com células-tronco, o sistema CRISPR foi aplicado com sucesso a um amplo espectro de doenças. Mutações no repressor transcricional CTCF de células-tronco intestinais em cultura de pacientes com fibrose cística foram corrigidas usando CRISPR / Cas. [28] Aplicativos subsequentes construídos sobre correções de sequência simples e reparados com sucesso uma anormalidade de inversão cromossômica na hemofilia A. [29] Ambos os aplicativos demonstram a utilidade de emparelhar CRISPR / Cas com modelos de células-tronco no estudo e tratamento de doenças genéticas. Com o advento das células-tronco pluripotentes induzidas derivadas do paciente (iPSCs), a aplicabilidade do CRISPR / Cas é ainda mais fortalecida. Até o momento, os métodos CRISPR repararam com sucesso mutações genéticas associadas a doenças em 1) distúrbios metabólicos, como β-talassemia, [30] 2) deficiências imunológicas, como imunodeficiência combinada grave (SCID) [31] e 3) doenças neuromusculares, como Duchenne distrofia muscular. [32] As correções dessas mutações genéticas, mais importante, são veículos futuros em potencial para terapias celulares e genéticas, onde as próprias células-tronco reparadas do paciente podem ser reimplantadas. O método no-SCAR, como uma melhoria do sistema CRISPR / Cas, terá um papel importante na modelagem de doenças humanas usando células iPS e, no futuro, no tratamento dessas mesmas doenças.


Engenharia Genética Mediada por CRISPR / Cas9 em Biologia Industrial

Os microrganismos industriais podem produzir vários produtos químicos de valor agregado a partir de matéria-prima de baixo custo, incluindo biomassa renovável e resíduos orgânicos (Yao et al., 2018). Para melhorar o desempenho dos microrganismos industriais, as modificações genéticas foram geralmente implementadas para construir as fábricas de células microbianas desejadas. Embora vários métodos estejam disponíveis para modificações genéticas, é demorado e trabalhoso. Felizmente, como um surpreendente & # x0201Cgift, & # x0201D, o sistema CRISPR / Cas9 melhorou muito a eficiência da engenharia genética. Aqui, revisamos as aplicações do sistema CRISPR / Cas9 em bactérias, leveduras e fungos filamentosos com ênfase especial em E. coli e S. cerevisiae, que eram as fábricas de células mais comumente usadas.

A Aplicação da CRISPR / Cas9 em Bactérias

Escherichia coli é freqüentemente usado para produzir uma variedade de produtos químicos valiosos, drogas e biocombustíveis na biotecnologia industrial. Um método tradicional de nocaute de gene em E. coli foi adotar o sistema de recombinação homóloga Red para mediar a recombinação homóloga de DNA. No entanto, é ineficiente e especialmente não adequado para recombinação de vários locais (Murphy e Campellone, 2003). Para melhorar a eficiência da engenharia genética, Jiang et al. construir um sistema de plasmídeo triplo como mencionado acima. Essa nova ferramenta de engenharia genética melhorou significativamente a eficiência da modificação genética e, assim, acelerou o desenvolvimento da biologia industrial. Em estudos anteriores, Cas9 e gRNA foram expressos em dois plasmídeos, respectivamente, pois a expressão simultânea sobrecarregaria o metabolismo do organismo e causaria a morte celular. Portanto, Cas9 ou gRNA devem ser reprimidos antes de um evento de edição do genoma. Cas9 e gRNA podem ser montados em um plasmídeo contendo um promotor pBAD, que é reprimido por glicose e induzido por arabinose e um replicon sensível à temperatura repA101ts, de modo que transformado E. coli poderia crescer em placas corrigidas com glicose e ser editado sob a indução com 2 g / L de arabinose. Este procedimento rápido e fácil para edição do genoma pode ser executado continuamente, já que vários loci requerem apenas uma construção de plasmídeo e uma etapa de transformação. Para melhorar ainda mais a eficiência de edição simultânea de vários loci, foi desenvolvida uma técnica de edição de genoma multiplex assistida por CRISPR / Cas9. A técnica de edição de genoma multiplex assistida por CRISPR / Cas9 continha três plasmídeos: pRedCas9 contendo ambos recombineering & # x003BB-Red e sistema Cas9 sob o controle do promotor pBAD, pMgRNAs contendo gRNAs e pDonorDNAs carregando vários cassetes de DNA de doadores (Feng et al., 2018). Em outro estudo versátil, Li et al. em primeiro lugar, co-expressou um plasmídeo contendo um gRNA direcionado ao bla gene e Cas9 com o sistema de recombinação & # x003BB-Red em E. coli (Li et al., 2015). Em seguida, a edição genética começou com a cotransformação do DNA doador e do plasmídeo gRNA nas células precedentes. Em comparação com o sistema previamente estabelecido, este sistema otimizado tem uma maior eficiência de edição de genes e menos tempo de operação, quase 100% para substituições de códons e genes nocaute em 2 dias. Vale ressaltar que o uso de um DNA de fita dupla como modelo de doador tem um desempenho melhor do que um DNA de fita simples nas deleções de genes. Posteriormente, este sistema otimizado foi empregado para fortalecer a via MEP, substituindo os promotores e os sítios de ligação ao ribossomo, inserindo uma via biossintética heteróloga & # x003B2-caroteno e otimizando o metabolismo central do carbono (Li et al., 2015). Finalmente, o melhor produtor rendeu 2,0 g / L & # x003B2-caroteno na fermentação em batelada alimentada. Este extenso trabalho dificilmente pode ser concluído sem o emprego de ferramentas baseadas em CRISPR, revelando seu grande potencial para manipulação eficiente e diversificada de DNA genômico. O método de recombinação Cas9 foi explorado ainda mais com o desenvolvimento da ferramenta de engenharia de genoma rastreável (CREATE) habilitada para CRISPR (Garst et al., 2017). Aplicação desta ferramenta em E. coli permitiu a transformação simultânea de várias bibliotecas de modelos recombinados de plasmídeo (Garst et al., 2017). A estratégia CREATE foi empregada para construir bibliotecas de genoma da via do isopropanol através da introdução de múltiplas variações no local de ligação do ribossomo em E. coli, levando à construção e teste de & # x0007E1,000 cepas em poucos dias. O melhor desempenho atingiu um título de 7,1 g / L de isopropanol em 24 h (Liang et al., 2017).

Além das aplicações versáteis em E. coli, as ferramentas baseadas em CRISPR também tiveram desempenho satisfatório em outras bactérias (Tabela 1). Por exemplo, tecnologias de engenharia genética para solventes Clostridium ainda eram imaturos devido à baixa eficiência de transformação, recombinação endógena homóloga inadequada e fisiologia e metabolismo mal compreendidos (Papoutsakis, 2008 Pyne et al., 2014 Bruder et al., 2016). Recentemente, CRISPR / Cas9 para Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4, uma cepa produtora de hiper-butanol, foi desenvolvida. A eficiência da engenharia do genoma foi melhorada de 20 a 75% selecionando o promotor P otimizadoJ23119 a partir de E. coli para expressão de gRNA. Depois de deletar dois genes essenciais da fosfotransacetilase (PTA) e butirato quinase (BUK) para a produção de acetato e butirato, a produção de butanol atingiu 19,0 g / L, que é um dos níveis mais altos já relatados em fermentações em lote (Wang et al., 2017). Esta ferramenta de edição baseada em Cas9 pode ser facilmente adaptada para uso em microrganismos intimamente relacionados, abrindo caminho para elucidar o mecanismo de produção de solventes e construir cepas robustas com características desejáveis ​​de produção de butanol. Além disso, as ferramentas de edição baseadas em Cas9 também foram empregadas com sucesso para a produção de produtos químicos a granel, como succinato em Synechococcus elongatus (Li et al., 2016), isopropanol-butanol-etanol em Clostridium acetobutylicum (Wasels et al., 2017), e & # x003B3-ácido amino-butírico (GABA) em Corynebacterium glutamicum (Cho et al., 2017). A ampla aplicação do sistema CRISPR / Cas9 em uma variedade de gêneros de bactérias demonstra que ele desempenha um papel crítico no desenvolvimento próspero da bioindústria.

tabela 1. Aplicações do sistema CRISPR / Cas9 em bactérias.

A Aplicação do Sistema CRISPR / Cas9 em Leveduras

As leveduras desempenham um papel crítico na biologia industrial, pois uma ampla gama de produtos pode ser produzida por leveduras, incluindo biofarmacêuticos, biocatalisadores, aditivos alimentares, produtos químicos finos e biocombustíveis renováveis ​​(Raschmanova et al., 2018). Devido à sua fisiologia robusta, as leveduras podem ser cultivadas em condições de crescimento adversas, como pH baixo e temperaturas elevadas. Além disso, as leveduras podem ser introduzidas em sistemas de modificação pós-tradução eucarióticos complexos, que estão ausentes em hospedeiros bacterianos e muitas vezes vitais para a produção de biofármacos (Thomas et al., 2013). Até agora, uma série de ferramentas de engenharia genética baseadas no CRISPR / Cas9 foram exploradas em leveduras para melhorar a eficiência da modificação genética (Mitsui et al., 2019).

Por décadas, S. cerevisiae tem sido um organismo modelo bem conhecido nas áreas de pesquisa e aplicação (Jako & # x0010Diunas et al., 2016). Verificar a eficiência do sistema CRISPR / Cas9 em S. cerevisiae, o marcador selecionável genômico endógeno negativo CAN1 (que codifica a permease de arginina) pode ser escolhido como um gene alvo (Dicarlo et al., 2013). Para melhorar ainda mais a eficiência do gene knockout, foram projetados oligonucleotídeos de fita dupla de 90 pb (dsOligo), incluindo braços homólogos para o local alvo e um códon de parada interno como o modelo HR. A frequência recombinada de mutações selecionadas a partir do meio contendo canavanina (um análogo tóxico de arginina que pode matar células contendo CAN1 gene) foi quase 100%, fornecendo bases para ferramentas simples e poderosas de engenharia de genoma em leveduras. Este sistema pode ser usado para derrubar LEU2, TRP1, URA3, e HIS3 em levedura industrial poliplóide S. cerevisiae ATCC 4124 com eficiência de até 60% e uma cepa deficiente quádrupla (& # x00394ura3, & # x00394trp1, & # x00394leu2, & # x00394his3) foi construído com sucesso (Zhang et al., 2014). A fim de melhorar ainda mais a eficiência da edição genética do sistema CRISPR / Cas9, a tecnologia de clonagem do USUÁRIO foi, portanto, empregada para montar vários sgRNAs em um plasmídeo para a interrupção eficiente do gene e engenharia do promotor de um a cinco loci alvo em uma etapa (Jako & # x0010Diunas et al., 2015a). Esta abordagem de edição de genoma sem criador de uma etapa alcançou altas eficiências de 50 & # x02013100% de edições simples a quíntuplas. No entanto, a baixa eficiência da cotransformação de plasmídeos de gRNA e doadores de HR correspondentes dificultou as aplicações de engenharia de genoma em grande escala (Lian et al., 2018). Para resolver este problema, um sistema CRISPR integrado por homologia (HI-CRISPR) fundindo um modelo HR de 100 pb à extremidade 5 & # x02032 das sequências de crRNA foi construído, levando a 87% de eficiência de nocaute multiplex de CAN1, ADE2, e LYP1 (Bao et al., 2015). Este sistema HI-CRISPR melhorou ainda mais a eficiência da edição multiplex do genoma e da engenharia em escala do genoma.

Além do nocaute do gene, o sistema CRISPR / Cas9 também pode mediar a inserção do gene usando o braço homólogo do DNA do doador para o gene alvo. Para controlar melhor os níveis celulares de dobramento correto de sgRNA, a ribozima HDV foi fundida à extremidade 5 & # x02032 de sgRNA para proteger a extremidade 5 & # x02032 do sgRNA de 5 & # x02032 exonucleases. Esta estratégia de expressão de HDV-gRNA aumentou significativamente a eficiência da edição do genoma multiplex em cepas de leveduras diplóides, nas quais o transportador de celodextrina heteróloga (cdt-1) e endógena & # x003B2-glucosidase (gh1-1) foram inseridos. Como resultado, a eficiência da utilização da celobiose foi aumentada em 10 vezes por meio da mutagênese dirigida ao local de cdt-1 e gh1-1 genes através do sistema CRISPR / Cas9 multiplexado (Ryan et al., 2014). Enquanto isso, Ronda et al. cotransformed um vetor epissomal expressando três gRNAs com três DNAs doadores contendo genes de síntese de & # x003B2-caroteno de BTS1, crtYB, e crtI em S. cerevisiae, permitindo que ele sintetize & # x003B2-caroteno (Ronda et al., 2015). Da mesma forma, três genes exógenos (XYL1, XYL2, e XYL3) que codifica para xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase de Scheffersomyces stipites foram integrados aos loci de PHO13 e ALD6 no S. cerevisiae utilizando o sistema CRISPR / Cas9 (Tsai et al., 2015). As cepas refatoradas alcançaram a capacidade de utilizar xilose e puderam ser prontamente usadas para fermentações em grande escala, já que nenhum marcador resistente a antibióticos foi adotado. Além disso, uma ferramenta de engenharia de genoma mais versátil, integração multiloci facilitada por Cas9 de na Vivo assembled DNA parts (CasEMBLR), foi construído combinando DNA assembly, HR de DSBs usando DNAs de doadores e cassetes de expressão de gRNA multiplex (Jako & # x0010Diunas et al., 2015b). Como uma prova de conceito, este CasEMBLR foi empregado para montar e integrar os cassetes de expressão gênica (braço de homologia a montante, promotor, gene estrutural, terminador e braço de homologia a jusante) de CrtYB, CrtI, e CrtE nos locais de ADE2, HIS3, e URA3, com uma eficiência de engenharia livre de marcadores de 31%.

CRISPR / Cas9 também foi implementado em muitas outras leveduras industriais (Tabela 2). Por exemplo, para construir promotores mais adequados para sgRNA em Schizosaccharomyces pombe, Jacobs et al. construiu uma cassete de expressão adicionando o RNA líder de rrk1 gene entre o promotor e a sequência de sgRNA, e fundiu as ribozimas HH com a extremidade 3 & # x02032 do sgRNA maduro para atingir o processamento correto de sgRNA 3 & # x02032. Este sistema atingiu uma alta eficiência de 98% quando um modelo de doador foi cotransformado. Para simplificar ainda mais a operação do sistema CRISPR / Cas9 em S. pombe, Zhang et al. desenvolveu um procedimento livre de clonagem incluindo um plasmídeo codificando Cas9 com lacuna e uma inserção de sgRNA amplificada por PCR. Ura4 e rrk1 o promotor-líder estava apenas entre a lacuna do plasmídeo que codifica Cas9. A inserção de sgRNA amplificada por PCR consistia na sequência alvo de sgRNA e estrutura, e flanqueada com os braços homólogos de ura4 e promotor-líder. Por conseguinte, um plasmídeo circular incluindo Cas9 e sgRNA poderia gerar dois fragmentos de reparo de lacuna. Este procedimento livre de clonagem poderia alterar a sequência alvo de sgRNA apenas usando um premier sgRNA de 83 pb em vez de clonar todo o plasmídeo sgRNA.

mesa 2. Aplicações do sistema CRISPR / Cas9 em leveduras.

As aplicações do sistema CRISPR / Cas9 em fungos filamentosos

Devido ao considerável valor econômico de seus metabólitos, fungos filamentosos têm sido aplicados para produzir antibióticos, ácidos orgânicos, pigmentos, ácidos graxos poliinsaturados e assim por diante (Dufoss & # x000E9 et al., 2014 Ji et al., 2014 Xu X. et al., 2015). No entanto, os desafios de entrega através da parede celular do fungo e a falta de promotores e plasmídeos disponíveis impediram o desenvolvimento de ferramentas de engenharia genética em fungos filamentosos. Além disso, a baixa eficiência de edição e a conseqüente grande quantidade de tempo de trabalho impediram a futura aplicação de fungos filamentosos na indústria. O CRISPR / Cas9 emergente trouxe um grande avanço para a manipulação genética em fungos filamentosos.

As estratégias convencionais de engenharia genética para melhorar a eficiência do RH deveriam excluir KU70 ou KU80 heterodímero (Weld et al., 2006). No entanto, se KU70 ou KU80 for interrompido, os fungos filamentosos se tornarão mais sensíveis a ambientes de crescimento com requisitos específicos para alguns produtos químicos, como fleomicina, bleomicina e metanossulfonato de metila / etila (Liu et al., 2015). Para superar esse obstáculo, o sistema CRISPR / Cas9 no fungo filamentoso de Trichoderma reesei usando códon otimizado específico e em vitro A transcrição de RNA foi estabelecida (Hao e Su, 2019). A maior frequência de FC única em T. reesei usando um par de braços de homologia & # x02265600-bp foi quase 100%. Posteriormente, um sistema de junção de extremidade mediado por microhomologia baseado em CRISPR / Cas9 em Aspergillus fumigatus também foi estabelecido flanqueando o sgRNA com HH e HDV. Este sistema alcançou a edição precisa do gene alvo com uma alta eficiência de 95 & # x02013100% por meio de braços de homologia muito curtos (& # x0007E35-bp), indicando que pode funcionar como uma ferramenta de edição de genoma poderosa e versátil em A. fumigatus (Zhang et al., 2016). Além do sucesso na aplicação em diferentes espécies de Aspergillus, este sistema evoluído também foi empregado em diversas espécies de fungos filamentosos, ampliando a aplicação do sistema CRISPR / Cas9 (Hao e Xia, 2015 Weber et al., 2016 Weyda et al., 2017).

Juntas, a tecnologia de edição de genes mediada por CRISPR / Cas9 não apenas editou eficientemente o gene alvo individual, mas também mostrou desempenhos satisfatórios na edição multigênica, o que promoveu muito o desenvolvimento de manipulações genéticas em fungos filamentosos.


Procedimentos experimentais

Cepas bacterianas e meios de comunicação

Tudo E. coli as cepas foram cultivadas rotineiramente em Caldo Lysogeny (LB) ou em placas de ágar LB incluindo suplementos antibióticos conforme apropriado (100 μg ml -1 de ampicilina 100 μg ml -1 higromicina 20 μg ml -1 cloranfenicol 150 μg ml -1 estreptomicina). A clonagem e a propagação do plasmídeo foram realizadas usando E. coli DH5α (NEB). Todas as cepas bacterianas usadas ou criadas neste estudo estão listadas na Tabela S5.

Construção de plasmídeos

pSIMcpf1 foi construído por modificação de pSIM18 (Chan et al., 2007) para adicionar uma cópia otimizada por códons de Acidaminococcus sp. BV3L6 cpf1 (Rousset et al., Swainston 2016 et al., 2018) expresso a partir do promotor constitutivo BBa_J23151 e um array CRISPR Cpf1 indutível por arabinose que incorpora duas sequências espaçadoras que têm como alvo a origem de replicação de pMB1. pTF foi construído modificando pTargetF (Qi et al., 2013) para substituir o cassete Cas9 sgRNA por uma matriz Cas12a CRISPR usando um fragmento de DNA sintético. pTF-lacZ foi construído modificando o pTF para adicionar um DNA sintético contendo uma matriz CRISPR dupla, visando dois PAMs no E. coli lacZ gene e braços homólogos de 500 pb flanqueando essas sequências. Um rfp gene a jusante do promotor PJS23100 com terminadores de flanco foi clonado entre dois braços homólogos. O fragmento foi projetado para ter sequências de prefixo (actctagagaattca) e sufixo (atctacaagagtaga) de 15 bp, que permitem a clonagem direta no vetor pTF linearizado por PCR inverso com os iniciadores pTFopen-F / R via clonagem InFusion (Takara Bio Inc.). Os plasmídeos CRISPRi foram construídos por clonagem de fragmentos de DNA sintético consistindo em ddcpf1 A993A e matriz CRISPR downstream (direcionamento rfp) conduzido por um Ptrc promotor, nos plasmídeos pBbS8c-RFP, pBbA8c-RFP, pBbS2c-RFP, pBbA2c-RFP, pBbS6c-RFP e pBbA6c-RFP 33. Os plasmídeos repórter RFP foram construídos por amplificação por PCR de 198 pb de ORFs de gene alvo usando iniciadores com saliências de 15 pb (Tabela S1) para clonagem por InFusion no plasmídeo pBbE11a-RFP PCR linearizado com iniciadores pBbrfpopen-F / R.

Projeto de sequências espaçadoras e matrizes

Para knockouts de gene, PAMs Cas12a (TTTV) foram identificados aproximadamente no centro do gene alvo, para knock-ins eles foram escolhidos mais próximos do ponto de integração desejado, em qualquer fita. Para CRISPRi, os PAMs foram selecionados como os primeiros dentro da extremidade 5ʹ da ORF na fita positiva. Uma vez que o PAM foi identificado, o espaçador foi projetado como 23 bp imediatamente a jusante na mesma fita (positiva).

Introdução de matrizes CRISPR e dDNA para pTF

As matrizes foram projetadas e sintetizadas comercialmente como parte de uma cassete que também incluía qualquer dDNA necessário (Fig. S1). O pTF foi linearizado por PCR com os iniciadores pTF-open-F / R (Tabela S1) usando a polimerase CloneAmp e a cassete clonada usando InFusion Cloning (Takara Bio Inc.).

Introdução de DNA de carga para pTF-lacZ

O DNA de carga foi amplificado por PCR usando polimerase CloneAmp e iniciadores incluindo sequências de prefixo (CAGGAATTCCATATG) e sufixo (TATAGACCATTCGAG) e, em seguida, clonado em pTF-lacZ, PCR linearizado usando iniciadores pTF-lacZ-cargo-F / R (Tabela S1).

Introdução de matrizes CRISPR para pBbS8c-ddcpf1

Matrizes de espaçadores simples ou duplos são introduzidos em pBbS8c-ddcpf1-Δ, usando PCR inverso com iniciadores projetados para incluir saliências que codificam espaçadores e uma sobreposição de complementaridade de 15 bp para clonagem por InFusion. Pares de iniciadores personalizáveis ​​para cada plasmídeo (pddcpf1-crRNAins-xxx-F / R) foram projetados para este PCR (Tabela S1).

Edição CRISPR

pSIMcpf1 foi introduzido na cepa alvo e foi usado para fazer células eletrocompetentes. Uma única colônia foi inoculada em 5 ml de LB suplementado com 150 µg ml -1 de higromicina e cultivada durante a noite a 30 ° C com agitação. A cultura foi então sub-cultivada, 1: 100 em 100 ml de meio fresco e cultivada a 30 ° C com agitação até OD600

0,2 foi atingido após o que foi decantado para tubos de centrífuga de 2 x 50 ml e incubado em banho-maria a 42 ° C por 15 minutos imediatamente seguido de incubação em banho de gelo / água por 20 minutos. Os tubos foram então centrifugados a 3500 g por 10 min a 4 ° C e então o sobrenadante descartado. Cada um dos peletes foi ressuspenso em 40 ml de glicerol a 10% gelado e centrifugado novamente seguido de ressuspensão em 1 ml de glicerol a 10% e transferência para tubos de centrífuga de 1,5 ml. Cada tubo foi centrifugado a 9000 g por 1 min e ressuspenso novamente. Isto foi repetido mais três vezes seguido por uma ressuspensão final em 250 µl de glicerol a 10% arrefecido. As células foram eletroporadas com 50 ng de plasmídeos pTF e semeadas em LB agar contendo 150 µg mL -1 de higromicina e 100 µg mL -1 de estreptomicina e então cultivadas por 24 h a 30 ° C. As séries de diluição de Miles e Misra foram usadas para enumerar as UFCs para cada transformação. As colônias foram selecionadas para a mutação correta usando PCR de colônia com primers projetados para flanquear ambos os lados dos locais de recombinação. Para remover ambos os plasmídeos, uma única colônia foi inoculada em 5 ml de LB contendo 150 µg ml -1 de higromicina e 0,2% de L-arabinose e incubada a 30 ° C com agitação até uma DO600 do

1 antes da subcultura 1: 1000 em LB com 0,2% de L-arabinose e incubar a 37 ° C, com agitação por 16 h. Foi preparada uma série de diluições de 10 vezes e 100 µl das diluições 10-5 e 10-6 semeadas em ágar LB sem antibióticos e depois incubadas durante 16 h a 37 ° C. Normalmente, 20 colônias foram plaqueadas em réplicas em três placas de ágar contendo higromicina, estreptomicina ou sem antibióticos, para confirmar a perda de ambos os plasmídeos.

Medições de expressão de RFP para regulação do gene CRISPRi

Os plasmídeos foram transformados em E. coli DH5α / MG1655 e colônias quádruplas foram cultivadas durante a noite em 0,5 ml de meio (contendo antibióticos conforme apropriado) em um bloco de poço profundo de 2,2 ml a 30 ° C com agitação a 850 rpm. As culturas foram subcultivadas 1: 100 em uma placa de microtitulação de parede preta (Greiner 655096) contendo meio fresco (200 µl) com ou sem suplementação com IPTG (100 μM), L-arabinose (10 mM) e anidrotetraciclina (200 nM). As placas foram seladas com um selo de barreira de umidade (4titude 4ti-0516) e, em seguida, incubadas a 30 ° C com agitação a 850 rpm por 16 h. As leituras foram feitas usando um leitor de placas CLARIOstar (BMG Biotech) para absorbância (600 nm) e fluorescência RFP (584 nm de excitação, 607 nm de emissão).

Extração de RNA

pBbS8c-ddcpf1 variantes foram transformadas frescas em E. coli DH5α e colônias em triplicado foram cultivadas durante a noite em LB (cloranfenicol) e usadas para inocular 5 ml de meio fresco a uma diluição de 1/50 em tubos cônicos de 50 ml. As culturas foram cultivadas a 37 ° C, com agitação a 180 rpm, até o início da fase logarítmica OD600 = 0,2-0,4 após o que foram induzidos com L-arabinose 10 mM e IPTG 0,1 mM e o crescimento continuou. Quando o OD600 atingiu 1-1,4 (1 h) as culturas foram centrifugadas a 21.000 g por 1 min, o sobrenadante é descartado e o pellet é congelado em nitrogênio líquido. O RNA foi extraído usando o TRIzol Plus RNA Purification Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) e a DNase tratada usando o PureLink DNase Set (Thermo Fisher). Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 1 ml de TRIzol e, em seguida, o método realizado conforme descrito pelo fabricante antes da eluição em 50 µl. Cada amostra foi analisada por eletroforese capilar usando um Bioanalyser para determinar seus números de integridade de RNA (RIN) e as razões 260/280 foram determinadas usando um Nanodrop (Thermo) (Tabela S6).

Análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR)

O cDNA da primeira fita foi sintetizado a partir de 100-200 ng de RNA total iniciado com hexâmeros aleatórios usando o Sistema de síntese de primeira fita SuperScript IV (ThermoFisher) de acordo com as instruções do fabricante. Os primers de oligonucleotídeo para qPCR foram projetados usando a ferramenta IDT PrimerQuest e estão listados na Tabela S7, incluindo comprimentos de amplicon. qPCR foi realizada usando SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Ltd., Watford, Reino Unido) em reações de 20 μl em um CFX Connect Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories Ltd) seguindo o protocolo do fabricante. Os parâmetros quantitativos do ciclo de PCR foram os seguintes: desnaturação inicial a 98 ° C por 3 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação de 10 s a 98 ° C e anelamento de 30 s e extensão a 57 ° C. A especificidade da amplificação foi confirmada pela análise da curva de fusão após qPCR (Fig. S6) e eletroforese em gel de agarose. Todas as reações foram realizadas em triplicados técnicos. Ciclos de quantificação (Cq) foram calculados usando o software CFX Manager Versão 3.0 (Bio-Rad Laboratories Ltd). A expressão de genes alvo foi normalizada para genes de referência hcaT e idnT (Zhou et al., 2011 ).


Vantagens do sistema de edição de genes microbianos CRISPR da GenScript

A tecnologia CRISPR / Cas tornou-se rapidamente um dos sistemas de edição de genoma mais fáceis e eficazes e, quando combinada com a recombinação λ Red, tem várias vantagens sobre as estratégias de edição mais comuns:

  • desatado
  • Edição multigene: pode nocautear até 3 genes simultaneamente
  • Precisão até o par de base
  • Seleção fácil: nenhum marcador selecionável é necessário

Resultados

Projeto da abordagem CRISPR-Cas9 visando DNA de "isca"

Para abordar a possível essencialidade dos dois paralogs XS em S. ambofaciens, uma cópia extra desses genes foi integrada no attLocal B do fago PhiC31 usando o vetor pSET152 (arquivo adicional 1: Tabela S1).

Posteriormente, as cepas continham 2 cópias idênticas de lsr2A (SAM23877-RS19855) ou lsr2B (SAM23877-RS17060) genes em seus genomas. Para editar especificamente o locus nativo, desenvolvemos uma abordagem baseada na introdução de DNA "isca" na vizinhança do gene alvo. Isso foi conseguido pela introdução de um plasmídeo não replicativo abrigando as regiões a montante e a jusante que circundam a cópia de interesse dentro do genoma nativo (Fig. 1). Este DNA "isca" foi inserido especificamente no cromossomo após um único evento de recombinação possivelmente ocorrendo entre as regiões a montante ou a jusante. Este evento de recombinação único pode ser facilmente selecionado pela introdução de um marcador de seleção dentro do DNA de "isca", a resistência à higromicina neste estudo. A eficiência deste primeiro estágio depende amplamente da frequência de recombinação homóloga. Isso pode variar notavelmente dependendo da espécie, do comprimento das regiões homólogas e da localização do local de recombinação dentro do genoma [27,28,29].

Estágios principais da abordagem CRISPR-Cas9 de DNA de "isca" para realizar a edição específica da cópia do gene. A abordagem é baseada na inserção específica por recombinação homóloga de um marcador de seleção e um DNA estranho abrigando as regiões a montante ('U') e a jusante ('D') em torno da cópia de interesse. A estrela representa os vários designs possíveis do DNA modelo usado para reparar a lesão por recombinação homóloga. Por razões de clareza, o esquema representa apenas um primeiro evento de recombinação que ocorre entre as sequências U, mas a recombinação homóloga também pode ocorrer entre as sequências D. Posteriormente, uma ferramenta genética que codifica Cas9 e um sgRNA direcionado especificamente contra DNA de "isca" estranho é introduzido transitoriamente na cepa recombinante. A quebra de fita dupla induzida por este complexo pode ser reparada por um segundo evento de recombinação entre as sequências U ou D, resultando na reversão ou na edição específica da cópia, respectivamente. Na ausência de um segundo marcador de seleção na posição estrela, a distinção entre as duas situações pode ser obtida por PCR (as setas representam as posições dos primers). As imagens mostram resultados representativos da PCR realizada sem template (“Ø”), no genoma nativo (“WT”) ou no genoma de mutantes deletados sem cicatrizes (“Δ”) obtidos durante este estudo. Os tamanhos esperados do produto de PCR eram 1106 pb e 815 pb para nativos e deletados lsr2A loci, e 729 pb e 481 pb para nativos e deletados lsr2B loci, respectivamente (consulte a seção Método para obter mais detalhes). Os tamanhos esperados do produto de PCR para loci nativos e deletados são indicados (“L”: GeneRuler ™ 1 kb DNA ladder, Thermo Scientific)

Projetamos um sgRNA visando este marcador de seleção usando a análise do site CRISPRy (https://crispy.secondarymetabolites.org/#/input) [30] e Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder /) [31] para selecionar uma região alvo de 20 nucleotídeos que se prevê não ter alvos fora de S. ambofaciens genoma. Aproveitamos o alto conteúdo de GC de S. ambofaciens genoma (cerca de 72%) para projetar uma sequência com um baixo conteúdo de GC (40%), minimizando ainda mais o risco de ter alvos indesejados. A introdução de uma ferramenta genética que codifica um complexo CRISPR-Cas9 direcionado a este DNA "isca" deixa a segunda cópia do gene intacta, enquanto induz uma quebra de fita dupla na vizinhança da cópia de interesse (Fig. 1).

Essa quebra é então reparada pela maquinaria celular. Em bactérias, a via NHEJ é menos prevalente do que em eucariotos [4]. Se os genes do tipo NHEJ podem estar envolvidos na plasticidade do genoma e na resistência a danos ao DNA de S. ambofaciens [32, 33], o reparo eficiente de danos induzidos por Cas9 pela via NHEJ requer a superexpressão de uma DNA ligase D heteróloga nesta bactéria [11]. Portanto em S. ambofaciens abrigando sequências repetidas (a montante e a jusante) perto do gene alvo, a quebra de DNA de fita dupla induzida por CRISPR-Cas9 estimula a ocorrência de um segundo evento de recombinação entre as sequências repetidas a montante ou a jusante (Fig. 1). Em ambos os casos, as sequências de plasmídeo são perdidas, permitindo a triagem de clones sensíveis à higromicina para identificar os clones nos quais o sistema CRISPR-Cas9 induziu este segundo evento de recombinação. Neste estudo, nós rastreamos pelo menos 30 clones por cepa e observamos que eles eram todos sensíveis à higromicina após a indução da expressão de Cas9. Isso confirma que HDR é a via predominante envolvida no reparo do DNA em Streptomyces abrigando sequências repetidas perto da quebra de fita dupla.

A eliminação sem cicatrizes de lsr2 paralogs em Streptomyces ambofaciens

Dependendo da sequência presente entre as regiões a montante e a jusante dentro do DNA "isca", esta abordagem CRISPR-Cas9 permite a exclusão, substituição ou inserção de genes. Em nosso caso, as sequências a montante e a jusante eram imediatamente adjacentes, de modo que a edição do gene leva à exclusão sem cicatrizes da cópia de interesse (Fig. 1). Ao evitar a inserção de sequências de codificação de promotor e resistência a antibióticos, a exclusão sem cicatrizes é pensada para minimizar o impacto da exclusão no resto do genoma. Isso limita vieses no fenótipo mutante. Uma vez que a ação de CRISPR-Cas9 é necessária apenas transitoriamente, usamos um plasmídeo termossensível que codifica o sgRNA e um Cas9 induzível. Esta expressão transitória minimiza a toxicidade e os potenciais efeitos fora do alvo do sistema CRISPR-Cas9.

Para distinguir entre a reversão do genoma parental e a deleção específica de cópia resultante do segundo evento de recombinação, analisamos por PCR a organização genética do locus alvo em cepas contendo ou sem uma cópia extra de lsr2A e lsr2B integrado em PhiC31 attSite B. Observamos que, enquanto as frequências de deleção do locus nativo não foram estatisticamente diferentes entre as cepas que abrigam ou carecem de uma cópia extra de lsr2B (Fig. 2), a exclusão do nativo lsr2A locus foi obtido apenas na cepa contendo uma cópia integrada de lsr2A em PhiC31 attB local. Uma vez que usamos o mesmo sgRNA para realizar lsr2A e lsr2B edição, podemos excluir uma diferença no reconhecimento do alvo. Esses resultados sugerem fortemente que lsr2A é potencialmente um gene essencial.

Proporção de clones de gene nativo com exclusão de cópia obtidos após a abordagem CRISPR-Cas9 direcionada ao DNA de "isca". Uma abordagem CRISPR-Cas9 direcionada ao DNA de "isca" foi realizada para excluir lsr2A ou lsr2B paralogs em S. ambofaciens WT ou cepas relacionadas contendo uma extracopia de lsr2 paralog (WT attPhiC31ΩpSET152-lsr2X, X sendo qualquer um UMA ou B) A cepa WT contendo um vetor vazio (WT attPhiC31ΩpSET152) foi usado como um controle. O número de clones sensíveis à higromicina (isto é, tendo perdido o gene de resistência à higromicina após o direcionamento CRISPR-Cas9) que abrigam um nativo ou um deletado lsr2A ou lsr2B gene foi determinado por análise de PCR. o p1 valor representa o p valor obtido a partir de um teste Exato de Fisher para dados de contagem comparando as frequências de exclusão com a condição WT (para um determinado lsr2 abordagem paralog CRISPR-Cas9). o p2 valor representa o p valor do mesmo teste realizado para comparar as frequências de deleção a uma frequência teórica de 0,5 (usando o mesmo total efetivo como referência). Abreviatura: ns = não estatisticamente significativo

Finalmente, esta abordagem permite o monitoramento da proporção relativa de eventos de reversão vs. deleção em diferentes origens genéticas. Em nosso caso, observamos que a exclusão de lsr2B foi tão frequente quanto a reversão para o genótipo WT, independentemente da presença de uma cópia extra (fig. 2). Por outro lado, a exclusão de lsr2A foi estatisticamente menos frequente (p valor de 0,01778, teste exato de Fisher para dados de contagem) do que a reversão na cepa contendo uma cópia integrada de lsr2A em PhiC31 attB local (Fig. 2). Isso sugere que mesmo na presença de uma cópia extra de lsr2A sob o controle do constitutivo kasOp* promotor [34], a exclusão do lsr2A o locus nativo pode ter um impacto na fisiologia ou aptidão das bactérias.


Um quebra-cabeça CRISPR-Cas9 revelado por aprendizado de máquina

Durante meu pós-doutorado no laboratório de Luciano Marraffini na Universidade Rockefeller, tive a oportunidade de trabalhar nos primeiros desenvolvimentos das tecnologias CRISPR-Cas9 e, em particular, em sua aplicação para modificar o genoma de bactérias ou controlar a expressão de genes. A variante de Cas9 cataliticamente morta, conhecida como dCas9, pode ser programada para se ligar a quase qualquer gene de interesse, mas fica apenas no DNA em vez de introduzir uma interrupção, como o Cas9 faria. A ligação de dCas9 ao DNA é forte o suficiente para bloquear a RNA polimerase quando na orientação adequada (o guia deve se ligar à fita codificadora do gene alvo), e a facilidade com que pode ser reprogramado o torna uma ferramenta fantástica para estudar o efeito de silenciamento de genes.

O dCas9 bloqueia a transcrição de forma eficiente quando o RNA guia se liga à fita de codificação

Quando comecei meu grupo no Institut Pasteur 4 anos atrás, um dos meus primeiros objetivos era configurar uma tela de todo o genoma para explorar as propriedades do dCas9 para investigar a função dos genes em E. coli de forma sistemática. Um fantástico pós-doutorado chamado Lun Cui juntou-se ao laboratório para liderar este projeto e obteve os primeiros resultados em um ano. Uma biblioteca agrupada de

10 ^ 5 RNAs guia expressos a partir de um plasmídeo foram introduzidos em um E. coli cepa carregando dCas9 sob o controle de um promotor induzível. O efeito de cada guia no crescimento de E. coli foi medido monitorando a abundância relativa de guias na população enquanto induzia a expressão de dCas9.

Ficamos satisfeitos em observar que os RNAs-guia que têm como alvo a fita codificadora de genes essenciais foram rapidamente esgotados da biblioteca, conforme esperado. A análise desses dados pode revelar muitas informações interessantes sobre genes essenciais e quase essenciais, que começamos a investigar e publicaremos em outro estudo futuro.Enquanto trabalhamos nisso, fizemos a observação intrigante de que alguns guias prejudicaram fortemente o crescimento de E. coli durante a ligação na orientação errada (ou seja, para a fita modelo). Nós e outros tínhamos mostrado anteriormente que a ligação dCas9 nesta orientação leva apenas a repressão moderada (

Redução de 10-60% na expressão). Alguns genes essenciais provavelmente não toleram nem mesmo uma redução moderada em seu nível de expressão. No entanto, ficamos realmente intrigados ao ver que alguns genes não essenciais, incluindo lpoB, um gene envolvido na síntese da parede celular, foram direcionados por guias na fita modelo que produziu um defeito de adequação. Era improvável que a repressão moderada de um gene não essencial fosse tóxica, mas ainda assim chamei um especialista em síntese de parede celular para perguntar a ele se o que observamos com lpoB fazia algum sentido, não.

Diluições em série de E. coli carregando RNAs guia direcionados ao gene lpoB na fita de codificação (C-lpoB) ou na fita modelo (T-lpoB). O guia T-lpoB mata E. coli não porque bloqueia a expressão de lpoB, mas por causa do efeito de "semente ruim".

Ficou claro que lpoB não estava envolvido neste fenótipo quando o deletamos do genoma de E. coli e ainda observou o mesmo efeito de toxicidade. O mistério se aprofundou quando percebemos que não se tratava de um fenômeno isolado. Até 7% dos guias direcionados à cadeia modelo de genes eram tóxicos. Nossa atenção foi atraída para lpoB apenas porque, por acaso, dois dos três guias que visam sua vertente template mostram esse fenômeno. Nossa primeira hipótese para explicar a toxicidade desses guias era que eles provavelmente tinham posições fora do alvo bloqueando a expressão de genes essenciais. Isso acabou sendo correto para alguns deles, mas não para os guias que visam lpoB. Na verdade, a grande maioria desses guias inesperadamente tóxicos não tem um alvo óbvio fora do alvo no cromossomo de E. coli isso pode explicar sua toxicidade.

Assim, recorremos a uma abordagem de aprendizado de máquina para investigar se esses guias tóxicos compartilhavam alguns recursos de sequência. Um modelo de rede neural usando apenas a sequência guia como entrada foi capaz de prever a toxicidade com bastante precisão (Pearson-r: 0,54). Essa abordagem nos ajudou a identificar o papel desempenhado pelos últimos 5 nucleotídeos do RNA guia. Existem 1.024 sequências possíveis de 5 nucleotídeos e, surpreendentemente, mais de 100 deles tornam os RNAs guias tóxicos para E. coli, com fenótipos que variam desde a formação de pequenas colônias até a completa inibição do crescimento. A extremidade 3 'da sequência guia também é conhecida como sequência da semente e, portanto, denominamos essa toxicidade de efeito de "semente ruim".

Cinco nucleotídeos de identidade para um gene alvo é muito pouco para ter um efeito substancial na expressão do gene, e esses guias tóxicos podem ter várias centenas de posições alvo possíveis no cromossomo de E. coli, tornando este fenômeno particularmente intrigante e difícil de investigar. Nos dois anos seguintes, tentamos resolver esse enigma com várias abordagens, algumas delas relatadas no manuscrito, mas que até agora levaram a poucos insights. Um em particular era simplesmente selecionar mutantes capazes de sobreviver à toxicidade de alguns guias e sequenciá-los para procurar mutações que pudessem apontar para o mecanismo. A fim de evitar a seleção de mutantes que simplesmente inativaram dCas9, rastreamos os clones que não apresentaram o fenótipo de toxicidade, mantendo uma forte repressão no alvo. Pudemos encontrar esses clones com relativa facilidade e ficamos muito animados para sequenciar seu genoma, nossa imaginação já correndo solta com hipóteses sobre o que encontraríamos.

Quando os resultados voltaram, ficamos terrivelmente desapontados ao ver que as únicas mutações que encontramos estavam no próprio dCas9, e a maioria eram na verdade mutantes de mudança de quadro. Esses mutantes provavelmente eram capazes de expressar baixos níveis de dCas9 por meio do deslizamento ribomossômico, explicando como eles foram selecionados em nossa tela. Outros esforços heróicos de Lun Cui para isolar mutantes interessantes, com designs de tela mais inteligentes e seleção meticulosa de colônias, apenas revelaram maneiras mais intrincadas de E. coli pode reduzir o nível de expressão de uma proteína. No final, esses experimentos não nos trouxeram mais perto de encontrar o mecanismo de toxicidade. O que eles nos disseram, no entanto, foi que reduzir a concentração de dCas9 poderia aliviar a toxicidade enquanto mantinha uma forte repressão no alvo. Assim, realizamos a tela novamente, desta vez com uma expressão mais baixa de dCas9, e obtivemos belos resultados. O efeito dos RNAs guia tornou-se muito mais consistente e o efeito da "semente ruim" foi bastante atenuado. Ao todo, este estudo forneceu muitos insights sobre as propriedades do dCas9 em E. coli, e nos ajudou a formular regras de design que você encontrará na discussão do artigo. Ainda assim, o mistério do efeito da "semente ruim" permanece, mas não vamos jogar a toalha tão facilmente, portanto, fique atento.

David Bikard

Entusiasta de Microbiologia, CRISPR e Biologia Sintética. Chefe de laboratório do Institut Pasteur (@institutpasteur). Fundador e CSO @EligoBio


Assista o vídeo: CRISPR-Cas9 Genome Editing Technology (Agosto 2022).