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Qual é a distância entre o rRNA 3 '18s (a sequência de consenso Kozak) e o sítio A dos ribossomos eucarióticos durante a tradução da proteína?

Qual é a distância entre o rRNA 3 '18s (a sequência de consenso Kozak) e o sítio A dos ribossomos eucarióticos durante a tradução da proteína?



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Repostado do Quora

A sequência Kozak mostrou ser importante no início da tradução e o local A é o local de reconhecimento do anticódon. Se a distância não é conhecida, como posso descobrir qual é? A estrutura cristalina de todo o complexo mRNA-rRNA-tRNA foi determinada? Em caso afirmativo, qual programa de modelagem seria melhor para estabelecer distâncias intermoleculares?


A sequência de consenso Kozak (KCS) está presente próxima ou sobreposta ao códon de início. Não tenho certeza do que você quer dizer com distância entre isso e o site A. O códon de início é localizado no local P no momento do início da tradução. A distância entre o códon de início / KCS e o local A na iniciação é a mesma que a distância entre os locais P e A (acho que ~ 20Å). O site A continua se movendo durante a tradução e, portanto, a distância continua aumentando. O estudo de cristal está disponível; Veja aqui.

Veja esta figura do estudo acima mencionado para as posições relativas do códon de início, local P (saída) e local A (entrada).


Qual é a distância entre o rRNA 3 '18s (a sequência de consenso Kozak) e o sítio A dos ribossomos eucarióticos durante a tradução da proteína? - Biologia

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Resumo

Durante a iniciação da tradução em procariotos, a extremidade 3 'do rRNA 16S se liga a uma região logo acima do códon de iniciação. A relação entre esta região de Shine-Dalgarno (SD) e a ligação dos ribossomos aos pontos de início da tradução foi bem estudada, mas faltou uma conexão matemática unificada entre o SD, o códon de iniciação e o espaçamento entre eles. Usando a teoria da informação, construímos um modelo que trata esses três componentes de maneira uniforme, atribuindo ao SD e à região de iniciação (IR) conservações em bits de informação, e atribuindo ao espaçamento uma incerteza, também em bits. Para construir o modelo, primeiro alinhamos a região SD, maximizando o conteúdo de informação lá. A facilidade deste processo confirmou a existência do padrão SD dentro de um conjunto de 4122 revisados ​​e revisados Escherichia coli gene começa. Este grande conjunto de dados nos permitiu mostrar graficamente, por logotipos de sequência, que o espaçamento entre o SD e a região de iniciação afeta a conservação do local SD e seu padrão. Usamos o SD alinhado, o espaçamento e a região de iniciação para modelar a ligação ao ribossomo e para identificar inícios de genes que não estão em conformidade com o modelo do local de ligação do ribossomo. Um total de 569 inícios provados experimentalmente são mais conservados (têm maior conteúdo de informação) do que o conjunto completo de inícios revisados, o que provavelmente reflete um viés experimental contra a detecção de produtos gênicos que têm sítios de ligação de ribossomo ineficientes. Os modelos foram refinados ciclicamente, removendo os locais fracos não conformes. Após esse procedimento, os modelos derivados da anotação de início do gene original ou revisada foram semelhantes. Portanto, esta técnica baseada na teoria da informação fornece um método para construir facilmente modelos de sítios de ligação ao ribossomo biologicamente sensíveis. Esses modelos devem ser úteis para refinar as previsões de início de gene de qualquer genoma bacteriano sequenciado.


Outras soluções

Qual é o melhor visualizador molecular?

Pergunta de acompanhamento à resposta de Christopher VanLang para Qual é a distância entre o rRNA 3 '18s (a sequência de consenso de Kozak) e o sítio A dos ribossomos eucarióticos durante a tradução da proteína?

Responder:

É uma questão de gosto, embora pessoalmente eu seja um grande fã de VMD. Se isso não flutuar.

Questões de genética! Hemoglobina, mRNA, ribossomos !?

7. [2pt] Considere o gene que especifica a estrutura da hemoglobina. Organize os eventos a seguir na sequência mais provável em que ocorreriam. Se a resposta for ABCDEFGHIJ, digite ABCDEFGHIJ. A) Anemia é observada. B) A forma do.

Responder:

Ajuda da Biologia da Ciência?

1 Durante a tradução em uma célula eucariótica _____. Escolha uma resposta. uma. os ribossomos se movem para o núcleo b. O tRNA carrega moléculas de aminoácidos para o núcleo, onde são adicionadas a uma cadeia polipeptídica em crescimento c. polipeptídeos são sintetizados em ribossomos.

Responder:

1. C 2. B 3. B 4. C 5. E 6. A 7. D 8. E 9. A 10. B .. mas você precisa saber qual é a extremidade 3 'e qual.

O dogma central da biologia molecular afirma que a informação flui em uma direção de?

A. núcleos para RNA para citoplasma. B. ribossomos para proteínas para DNA. C. genes para núcleos para ribossomos. D. DNA para RNA para proteínas. 2. Escolha a sequência de nucleotídeos da fita de RNA que seria complementar à seguinte fita de DNA: GTAGTCA. A. UATUAGA.

Responder:

1 D 2 Nada disso, mas coloque C. Seria correto se fosse ao contrário. 3 D 4 D 5 A 6 B 7 B 8 9 A.

Questões de bioquímica - transcrição, tradução e algumas outras.

Ei, eu fiz uma prova esta manhã e estou revisando minha prova e esperava que alguém pudesse me ajudar com as respostas para estas? São apenas afirmações verdadeiras ou falsas. (A ajuda com apenas UM é muito apreciada, estou tendo problemas para passar.

Responder:

n1 Parece correto n2 Sim n3 Sim n4 Sim. O zinco n8 é coordenado por Cys e His no motivo dedo de zinco.

Os ribossomos procarióticos diferem daqueles presentes no citosol eucariótico. qual das alternativas a seguir é a correta?

A) A tradução pode ocorrer ao mesmo tempo que a transcrição em eucariotos, mas não em procariotos. B) Os procariotos são capazes de usar uma variedade muito maior de moléculas como fontes de alimento do que os eucariotos. C) Alguns antibióticos seletivos podem bloquear a síntese de proteínas.

Responder:

C parece bom para mim. Vá C. Desculpe, eu tenho meu mestrado em Biotecnologia, então não devo explicar.

Por favor, ajude o dever de casa a ser entregue amanhã. Alguma resposta ajudará?

1. Uma grande região de DNA que direciona a formação de uma proteína é chamada de A) promotor B) nucleotídeo C) monômero D) gene 2. Qual das seguintes ligações a um tipo específico de aminoácido A) mRNA B) tRNA C ) rRNA D) DNA 3.Novo mRNA é feito através do processo de.

Responder:

1. D. gene 2. B. tRNA 3. B. transcrição 4. B. bases contendo nitrogênio 5. C. enzimas 6. C. replicação.

Biologia: Genética (do gene à proteína)?

Acabamos de começar do gene para a proteína e quero entender a transcrição e a tradução em uma célula eucariótica antes de prosseguir. Por favor corrija-me se eu estiver errado. No núcleo, o RNA é transcrito a partir de um DNA que é criado por uma RNA polimerase quando.

Responder:

Os tRNAs são transcritos separados. As aminoacil-tRNA sintetases são enzimas citoplasmáticas que pegam.

Qual é a função da sequência 3 'poli-A no mRNA eucariótico?

uma. proteção contra enzimas citosólicas b. sinal de splicing do intron c. local de fixação inicial para ribossomos d. rescisão de tradução

Responder:

Não tenho 100% de certeza, mas pelo que entendi, a resposta correta seria & quotA & quot-Proteção.


Quarta-feira, 26 de maio de 2010

Biologia molecular - Objetivo do RNA poli (A) +?

Estou aprendendo análise de RNA-seq. Sempre encontro essa fase "poli (A) + RNA". Depois de pesquisar, descobri: "A maioria dos RNAs mensageiros contém uma cauda poli (A), enquanto os RNAs estruturais não. A seleção de poli (A), portanto, enriquece para o RNA mensageiro. A técnica se mostrou essencial para a construção de bibliotecas de cDNA."

Isso significa que, na construção do cDNA, sempre usamos aqueles com cauda de A? Em seguida, outros RNAs como tRNA são filtrados e não usados ​​para obter seu cDNA? Eu encontro alguns registros de RNAs na UCSC onde microRNAs estão incluídos.

Quando dizemos biblioteca poli (A) + RNA, qual é a diferença entre uma normal? Ou a biblioteca de RNA normal é uma biblioteca de RNA poli (A) +? Obrigado.

Órbita - E se a Terra e a Lua girassem em torno uma da outra como Plutão e Caronte?

Ambas as respostas são muito boas. Há mais alguns detalhes a serem considerados se quisermos examinar todas as hipóteses neste cenário divertido, mas excêntrico.

Já mencionado, a proporção do tamanho é de 8 para 1, não 81 para 1, portanto, para começar, o Caronte como a Lua seria muito maior no céu. A Lua, com cerca de 10 vezes a massa, figurando uma densidade ligeiramente maior devido a alguma compactação menor, ainda seria 2,1 vezes maior, assumindo a mesma distância, o que a tornaria 4 vezes mais brilhante no céu noturno. A lua cheia seria bastante impressionante. Talvez (apenas um pouco) brilhante o suficiente para ler se fosse um grande livro de texto. (algumas pessoas afirmam ser capazes de ler à luz da lua agora, a maioria não consegue, mas 4 vezes mais brilhante, uma lua cheia pode ser brilhante o suficiente.

Eclipses solares se tornariam mais frequentes e durariam cerca de duas vezes mais tempo e você pode pensar que a Terra seria um pouco mais fria devido à Lua bloqueando alguma luz solar, mas a Lua, acredite ou não, irradia mais calor na terra do que bloqueia porque o A lua iluminada que está voltada para nós tem quase 400 graus F no pico do dia e não é difícil ver que uma superfície com temperatura irradia um pouco de calor. Não muito, mas um pouco. Uma pergunta sobre isso aqui, então um pouco mais de 4 vezes a energia (ignorando as perdas do eclipse solar), cerca de 1 / 2.500 do calor do sol, pode resultar em 1/10 de um grau à noite durante a lua cheia. Não muito, certamente, mas mensurável para qualquer pessoa com instrumentos sensíveis o suficiente. O brilho e o tamanho da Lua seriam obviamente mais perceptíveis do que cerca de 1/10 de 1 grau de temperatura (C não F).

Uma lua dessa massa desaceleraria a rotação da Terra significativamente mais rápido, já mencionado, mas este, temos que pensar um pouco. Quando a Lua se formou, estava muito mais perto da Terra, cerca de 3 a 5 vezes o raio de distância da Terra. Fonte. Fica fora da Esfera da Colina, e a formação da Lua deixou a Terra girando muito rapidamente, então os efeitos (Terra girando rapidamente, marés lunares muito poderosas) ainda estariam lá, mas as marés lunares seriam 10 vezes maiores, então estamos olhando nas marés de nível de terremoto, quando a lua, 10 vezes a massa, estava de 3 a 5 raios terrestres de distância. A Lua, porque durante a formação não teria muito momento angular, rapidamente se estabeleceria em uma rotação travada por marés ao redor da Terra. O efeito da maré na Terra, sendo 10 vezes maior, causaria (aproximadamente) 10 vezes a protuberância da maré na Terra, empurraria a Lua para longe da Terra cerca de 10 vezes mais rápido, mas, ao mesmo tempo, o arrasto da maré diminuiria a Terra também seria 10 vezes maior (presumo que corresponda a cerca de 10 vezes mais rápido).

Então, basicamente, a Lua e a Terra seguiriam o sistema em que estão agora, mas continuaria cerca de 10 vezes mais rápido com uma Lua com 10 vezes a massa. A estimativa (aqui) é que levará cerca de 50 bilhões de anos para a Lua desacelerar a Terra o suficiente para entrar em bloqueio de maré, então divida isso por 10, estaríamos muito perto de um bloqueio de maré hoje. A Terra giraria muito lentamente. A lua também (provavelmente) estaria um pouco mais longe da Terra e provavelmente teria uma órbita mais instável devido às perturbações solares e, talvez, escapasse completamente. Esta é uma matemática complicada que eu prefiro não tentar (na massa atual da Lua, o Sol se tornará Gigante Vermelho muito antes de a Lua escapar ou a Terra ficar travada de forma maré, mas com uma Lua 10 vezes mais massiva, isso é provavelmente não é mais o caso e a Lua se foi ou a Lua está mais distante, tem uma órbita mais alongada e a Terra está em ou perto de travada pelas marés. Se a Lua escapar, teríamos um objeto próximo da órbita terrestre de tamanho enorme que poderia mais tarde colidir com nós ou passar pela Terra e mover nossa órbita - qualquer efeito e simplesmente o efeito de não ter lua, seria enorme.

Discussão sobre a fuga da Lua / Terra vs bloqueio das marés aqui

Se assumirmos o bloqueio total da maré, 29,5 dias (sinódico, não sidreal) e uma lua um pouco mais distante, então podemos estar olhando para 30 algo a talvez 40 dias para 1 rotação da Terra, isso é 20 dias de sol, 20 dias de noite. Isso causaria um estrago absoluto nos sistemas climáticos e nas estações. O dia após a noite teria um efeito maior do que o verão versus o inverno, e os dias de verão seriam escaldantes, embora algumas regiões possam vir bem por causa da chuva. A evolução provavelmente poderia se adaptar a isso, mas não parece divertido para mim. A distância maior pode tornar a Lua apenas 3 vezes mais brilhante no céu noturno, em vez de 4. ainda bem brilhante. Você ainda teria 6 meses de sol e 6 meses de noite nos pólos, mas para a maior parte da Terra, esta seria uma mudança radical tendo dias e noites tão longos.

Outros efeitos possíveis, Obliquidade (sem lua, talvez maior, um driver maior da era do gelo), veja aqui. Além disso, se a Terra ainda tivesse a Lua, mas a Lua estivesse em uma órbita mais alongada, ainda teríamos marés enquanto a Lua se movia para dentro e para fora para apogeu e perogeu. Ver foto

No final das contas, embora não possamos pensar muito nisso, uma lua de tamanho diferente mudaria bastante. Uma lua menor se afastaria da Terra mais lentamente e a Terra poderia ser capaz de ter uma segunda lua, talvez por captura, se a lua fosse menor, também poderíamos ter eras glaciais mais agressivas e mudanças climáticas devido a uma maior variação de obliquidade e, presumindo que o impacto gigante ainda aconteça de maneira semelhante, mas com uma quantidade menor de detritos (o que não faz sentido, mas vamos fingir), então uma lua menor não teria desacelerado a rotação da Terra tanto e a Terra poderia estar girando bastante um pouco mais rápido, 10 ou 15 horas por dia em vez de 24. Os efeitos seriam bastante significativos.


Discussão

Em eucariotos, o início da tradução de vários diferentes mRNAs celulares e virais não parece ocorrer por um único mecanismo, mas sim por uma multiplicidade de mecanismos (1-3, 5, 6). Experimentos usando modelos de mRNAs fornecem uma oportunidade para investigar fatores que influenciam esses mecanismos. Nos presentes estudos, descobrimos que a tradução iniciou de forma mais eficiente quando o códon AUG foi espaçado ≈50 nt a jusante da estrutura cap (Fig. 2 B) Além disso, descobrimos que a tradução diminuiu com a distância de um local de recrutamento ribossomal interno (Fig. 3 UMA) e que poderia iniciar a tradução de forma eficiente em códons AUG localizados a montante ou a jusante de tal local de recrutamento (Fig. 4).

Uma variedade de estudos usando mRNAs naturais e modelo revelaram os efeitos da alteração da distância entre o local de recrutamento ribossomal e os códons de AUG na tradução (4, 9, 11, 12). Por exemplo, no caso do fermento MOD5 mRNA (9), a utilização relativa de dois códons AUG poderia ser dramaticamente alterada quando a distância entre esses códons e a estrutura cap fosse alterada. O primeiro códon AUG foi usado ≈5–10% do tempo quando espaçado 10 nt da extremidade 5 ′ do mRNA, quando o espaçamento desse códon AUG foi aumentado para 65 nt, ele foi usado exclusivamente. Resultados comparáveis ​​foram obtidos em um segundo exemplo usando modelo de mRNAs contendo dois códons AUG (31). Neste estudo, a utilização relativa do primeiro códon AUG aumentou progressivamente de ≈40% a quase 100% quando seu espaçamento foi aumentado incrementalmente de 3 para 32 nt a partir da extremidade 5 ′ do mRNA. Esses resultados são consistentes com nossos resultados na Fig. 2.

Os efeitos da distância na tradução também foram observados em um estudo do RNA do vírus do mosaico amarelo do nabo (10). Neste RNA, ~ 65% da tradução foi iniciada no primeiro de dois códons AUG próximos. No entanto, quando o segundo códon AUG foi espaçado mais a jusante, sua utilização diminuiu drasticamente, enquanto a do códon uAUG aumentou, de modo que quase toda a tradução foi iniciada neste códon. A capacidade da posição do segundo códon AUG de afetar a utilização do códon uAUG sugere que os dois códons competiam pela máquina de tradução e que essa competição era afetada por suas distâncias da estrutura de cobertura.

Experimentos usando modelos de mRNAs mostraram que a tradução se iniciou preferencialmente em um códon AUG localizado mais próximo ao local de recrutamento ribossomal, seja na estrutura cap ou na cauda poli (A) (11). Quando um mRNA designado BIGCAT foi capeado, mas não poliadenilado, a tradução foi iniciada no primeiro dos dois códons AUG (ver Fig. 2 na ref. 11). Quando este mRNA foi tampado e poliadenilado, a tradução foi iniciada em ambos os AUGs, mas predominantemente no códon uAUG. No entanto, quando este mRNA foi poliadenilado, mas não tinha uma estrutura cap, a tradução iniciou predominantemente no códon AUG a jusante.

Efeitos na tradução da distância entre os códons IRES e AUG também foram observados. Por exemplo, no mRNA do vírus da encefalomiocardite, a tradução normalmente inicia em AUG-11, que é o segundo códon de AUG localizado a jusante de um IRES neste RNA (12). No entanto, a utilização relativa de diferentes códons de AUG pode ser trocada alterando sua distância do IRES. Por exemplo, encurtar a distância entre o IRES e o AUG-11 resultou na utilização quase exclusiva do AUG-12, embora com uma eficiência reduzida. O alongamento da distância aumentou a utilização do AUG-10 e reduziu a utilização do AUG-11.

Todos esses exemplos envolvem códons AUG localizados a jusante dos locais de recrutamento ribossomal. Um exemplo natural de tradução que inicia a montante de um local de recrutamento ribossomal é fornecido pelo RNA do HIV-2. Neste RNA, foi mostrado que a tradução de uma proteína Gag inicia em um códon AUG localizado 50 nt a montante de um IRES que está contido inteiramente dentro da sequência de codificação (13).

A varredura ribossômica pode explicar os resultados nos estudos discutidos acima e nos estudos atuais? A tradução ineficiente observada quando um códon AUG foi espaçado muito perto do local de recrutamento ribossomal (Fig. 2 B) (12) poderia ser consistente com a noção de varredura se uma distância mínima do local de recrutamento ribossomal fosse necessária para carregar as subunidades ribossômicas no mRNA (discutido na ref. 25). Um mecanismo de varredura, no entanto, não explica prontamente por que a tradução em códons AUG localizados mais longe do local de recrutamento ribossomal torna-se cada vez menos eficiente com o aumento da distância (Fig. 2 B e 3 B) (4, 9, 10, 12) a menos que, por exemplo, alguém invoque uma taxa decrescente de varredura ribossômica conforme aumentam os comprimentos do líder 5 ′ ou se as subunidades ribossômicas de varredura forem liberadas do mRNA a uma taxa muito alta, de modo que menos subunidades de varredura alcancem o códon de iniciação à medida que o comprimento do líder 5 ′ aumenta. Embora tais mecanismos pareçam viáveis, os estudos que mostram que a tradução pode iniciar em códons AUG localizados a montante de um local de recrutamento ribossomal (Fig. 4) (13) não são facilmente explicados pela varredura ribossômica. Varredura extensa "para trás" (de & gt60 nt) seria necessária para explicar o início da tradução que observamos nos códons AUG localizados a montante dos locais de recrutamento ribossomal. Um estudo recente sugeriu que o movimento para trás pode ocorrer, mas apenas até um máximo de 15 nt (10). No entanto, a hipótese do escaneamento geralmente não parece explicar esse tipo de movimento (26).

Sugerimos que essas várias observações e nossos próprios dados são mais facilmente explicados por mecanismos que envolvem amarração do complexo ribossômico ao mRNA ou agrupamento de subunidades ribossômicas em locais internos (Fig. 1). Por exemplo, os resultados que mostram que a tradução inicia de forma mais eficiente quando o códon AUG está localizado a uma distância específica a jusante da estrutura cap ou um IRES seria previsto para ocorrer se a subunidade ribossômica fosse amarrada ao mRNA e o reconhecimento do códon AUG ocorresse por ligação do iniciador Met-tRNA. Em distâncias subótimas, a tradução seria ineficiente por causa dos efeitos estéricos, isto é, a corrente de mRNA seria muito curta para permitir que a maquinaria de tradução se reorientasse para permitir a ligação ótima do iniciador Met-tRNA ao códon de iniciação. Quando o líder 5 ′ é suficientemente longo (≈50-nt na Fig. 2 B), a tradução seria mais eficiente porque os efeitos estéricos são mínimos e a probabilidade de o iniciador Met-tRNA se ligar ao códon de iniciação é aumentada. Com líderes 5 'cada vez mais longos, no entanto, a tradução se torna menos eficiente porque a probabilidade de localizar o códon de iniciação é reduzida.

A noção de agrupamento ribossomal, que envolve a ligação e liberação de complexos ribossômicos em elementos específicos de mRNA, foi apoiada pelos resultados de nossos estudos anteriores (17). Este mecanismo pode explicar por que a tradução diminui progressivamente nos códons AUG localizados em distâncias crescentes a montante ou a jusante do Gtx elementos (Figs. 3 e 4). Para os experimentos presentes, no entanto, não podemos descartar completamente que alguns eventos de iniciação de tradução ocorreram enquanto as subunidades ribossomais estavam amarradas a Gtx elementos

A amarração ou agrupamento ribossomal pode ser responsável por inúmeras outras observações, incluindo o shunt ribossomal (17). Além disso, esses mecanismos podem explicar por que a tradução nem sempre inicia no primeiro códon AUG, mesmo que resida em um bom contexto. A operação desses mecanismos também pode explicar por que as estruturas secundárias de mRNA individuais são ou não inibidoras da tradução. Uma estrutura secundária de RNA pode afetar a tradução mediada por complexos ribossômicos amarrados ou agrupados, alterando a flexibilidade do mRNA ou mascarando elementos de mRNA, incluindo locais de recrutamento ribossômico, bem como o códon de iniciação (Figs. 5). Visto que os líderes 5 'de diferentes mRNAs provavelmente têm conformações diferentes e interagem com diferentes fatores, a distância ideal do local de recrutamento ribossomal para o início da tradução provavelmente varia para cada mRNA.

Representação esquemática de fatores que afetam a eficiência da tradução mediada por tethering ribossomal ou agrupamento. (UMA) A subunidade 40S é mostrada amarrada diretamente a um local interno no mRNA (indicado por uma caixa vermelha). A amarração também pode ocorrer por meio de fatores intermediários ou por meio da estrutura da tampa (ver Fig. 1 UMA) Setas tracejadas representam iniciação ineficiente devido a efeitos estéricos (seta tracejada 1), mascaramento de um códon AUG por estrutura secundária de mRNA (incluindo um AUG) (seta tracejada 2) e mascaramento de um códon AUG por uma proteína de ligação de RNA (indicado como um objeto azul hachurado) (seta tracejada 3). A seta 4 mostra um AUG reconhecido durante o tethering como um códon de iniciação porque é acessível ao iniciador Met-tRNA. (B) Fatores que afetam a eficiência da tradução de um complexo submetido a agrupamento dinâmico serão semelhantes aos que afetam um complexo amarrado, exceto que o complexo ribossomal será menos restrito.

As presentes hipóteses partem da premissa de que o escaneamento por si só não pode explicar uma variedade de dados, o que nos leva a perguntar se o modelo de escaneamento é válido em qualquer caso e, em caso afirmativo, se é exclusivo. Aproximadamente 30 anos de investigação não conseguiram elucidar os detalhes mecanicistas que fundamentam o escaneamento ou para visualizar os ribossomos escaneados diretamente (27). O modo processivo de varredura levanta uma questão sobre seus requisitos de energia. Em contraste com outros exemplos biológicos de motores moleculares processivos, como o movimento da cinesina nos microtúbulos, que utiliza um ATP por etapa (28), parece não haver necessidade de energia para o movimento ribossomal para o códon de iniciação em RNAs não estruturados (29). Este achado sugere que a operação de varredura ribossomal pode prosseguir sem uma fonte de energia. Para mRNAs estruturados, a formação do complexo ribossomal no códon de iniciação parece requerer ATP (29), que é presumivelmente necessário para a atividade helicase de eIF4A. No entanto, esta helicase não é processiva (30) e é improvável que conduza a varredura de ribossomos.

Sugerimos que, para alguns mRNAs, tethering ou agrupamento são alternativas testáveis ​​para varredura. Eles acomodam os mecanismos conhecidos de recrutamento ribossomal na estrutura da tampa ou nas sequências de mRNA internas e podem explicar várias observações que não são facilmente explicadas pela varredura ribossômica. Além disso, esses modelos são consistentes com a ideia de que vários mecanismos podem ser usados ​​para facilitar e controlar o início da tradução.


Materiais e métodos

Plasmídeos.

O baixo número de cópias URA3 o plasmídeo pC982 que expressa eIF5B de levedura de comprimento total foi construído por subclonagem de ≈3,9-kb SalEU-BamFragmento HI de pC479 (6) a pRS316. Os mutantes do domínio G de eIF5B de levedura foram criados por mutagênese dirigida ao local e inseridos no mesmo vetor. O plasmídeo pC484 usado para expressar GST-levedura eIF5B396–1002 em bactérias foi descrito (4). Os derivados deste plasmídeo foram construídos para expressar mutantes eIF5B de levedura. Plasmídeos que expressam formas mutantes de domínio WT e G de GST-eIF5B humano587–1220 foram descritos (5). As porções eIF5B destes últimos plasmídeos foram subclonadas em pET28a, gerando plasmídeos para expressar hexa-histidina e T7 marcados (His6) versões de eIF5B humano587–1220.

Técnicas bioquímicas.

Análises de polissomo de levedura e em vitro os ensaios de tradução foram realizados conforme descrito (6). Ensaios de união de subunidade ou montagem de complexo 80S, ensaios de síntese de metionil-puromicina (MP) e ensaios de hidrólise de GTP foram conduzidos como descrito (7). Para ensaios de união de subunidades 5 subunidades pmol 40S, 5 pmol subunidades 60S, 5 pmol [35 S] Met-tRNA, 0,5 μg de eIF1, 0,5 μg de eIF1A, 3 μg de eIF2, 8 μg de eIF3, 2 μg de eIF4A, 0,5 μg de eIF4B, 2 μg de eIF4F, 0,3 μg de eIF5 e 1,5 μg de eIF5B foram incubados em um volume final de 100 μl. Para os ensaios de síntese de MP 2 subunidades pmol 40S, 2,5 pmol subunidades 60S, 3 pmol [35 S] Met-tRNA, 1 nmol AUG trinucleotídeo, 0,5 μg de eIF1, 0,5 μg de eIF1A, 2 μg de eIF2, 5 μg de eIF3, 0,5 μg de eIF5 e 1 μg de eIF5B foram incubados em um volume final de 40 μl. [γ- 32 P] XTP foi sintetizado por Perkin – Elmer Life Sciences.


Ensaio de "impressão digital" de extensão de primer de complexos de iniciação

O iniciador de impressão digital 5′-FAM-CAGGAGGACATGGCATTTCTC-3 ′ (20 pmol) que se liga às posições 318-338 do mRNA de SP-A1 (número de acesso do GenBank HQ021440, Fig. 1B) foi pré-recozido com 3 μg de RNA transcrito in vitro por aquecimento a 68 ° C por 2 min e resfriado a 37 ° C por 8 min. A mistura de tradução, contendo 50% de RRL, 20 μM de mistura de aminoácidos, 500 ng / μl de cicloheximida e 20 U de RNAseOUT (Invitrogen), foi adicionada a um volume final de 30 μl. As reações foram incubadas a 30 ° C durante 20 min. A reação de transcriptase reversa foi realizada em um volume total de 50 μl contendo toda a reação de ligação ao ribossomo, Tris · HCl 50 mM (pH 7,5), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 4 mM, 500 μM cada dNTPs, 20 U RNAseOUT e 200 U de M-MLV RT (Invitrogen). As reações foram incubadas a 25 ° C durante 30 min. Os produtos de extensão de primer foram extraídos com o uso do kit DNA Clean & amp Concentrator-5 (Zymo Research, Irvine, CA), diluídos em formamida Hi-Di contendo padrões de tamanho GeneScan 600 Liz (Invitrogen) e analisados ​​por eletroforese em gel capilar independentemente no Instalações principais da Penn State College of Medicine e por Genewiz (South Plainfield, NJ). Os eletroferogramas resultantes (n = 9) foram analisados ​​com o software PeakScanner (v.1.0, Applied Biosystems).


IMPLICAÇÕES DA MUDANÇA PROGRAMADA NA VIROLOGIA

Muitos vírus de RNA utilizam PRF para regular pós-transcricionalmente a expressão de vários genes codificados por seus mRNAs monocistrônicos. Os mRNAs de muitos desses vírus, por exemplo, totivírus, elementos Ty e a maioria dos retrovírus, contêm dois ou mais ORFs sobrepostos em que as principais proteínas do nucleocapsídeo viral (por exemplo, Gag) são codificadas por um 5 'ORF, enquanto as sequências codificam proteínas com enzimas funções (normalmente Pro e Pol) estão localizadas a 3 ′ de, e fora do quadro com, o Gag ORF. As proteínas enzimáticas são traduzidas apenas como resultado de eventos PRF que ocorrem em frequências de 1–40%, dependendo do vírus específico e do sistema de ensaio empregado. 54 Isso garante a produção de uma proporção maior de proteínas do nucleocapsídeo estrutural para produtos com atividades enzimáticas / replicativas. A importância de manter proporções precisas de proteínas estruturais para enzimáticas na propagação viral foi demonstrada usando dois vírus endógenos da levedura S. cerevisiae e dois retrovírus. No vírus dsRNA L-A ‘killer’ de levedura, a dimerização Gag-pol nucleada a formação da partícula viral. 55 Pequenas alterações nas eficiências de frameshifting programadas promovem a perda rápida do vírus, e acredita-se que o aumento da quantidade de proteína Gag-pol sintetizada pode fazer com que muitas partículas sejam iniciadas de forma não produtiva enquanto produzindo muito pouco pode impedir a dimerização eficiente. 56 Da mesma forma, aumentando ou diminuindo a eficiência do framehift ribossomal +1 no Ty1 O elemento retrotransponível de levedura resulta em frequências de retrotransposição reduzidas ao inibir o processamento proteolítico da poliproteína TyA-TyB (equivalente Gag-pol), bloqueando assim a formação das formas maduras de RNase H, integrase e transcriptase reversa. 48 Da mesma forma, alterar a proporção de proteínas Gag para Gag-pol em retrovírus como o HIV ou o vírus da leucemia murina Moloney interfere na formação de partículas do vírus. 57-61 Nesses vírus, a superexpressão da proteína Gag-pol também resultou no processamento ineficiente da poliproteína e na inibição da produção do vírus.

Os coronavírus também utilizam −1 PRF para sintetizar proteínas de fusão estendidas no terminal C que são subsequentemente processadas proteoliticamente. 62 A organização genômica dos coronavírus é diferente, pois as proteínas estruturais são codificadas em mRNAs subgenômicos, enquanto os genes regulados por −1 PRF estão envolvidos na função replicase / transcriptase. Um estudo que examinou as consequências da alteração da eficiência de −1 PRF no coronavírus associado a SARS (SARS-CoV) demonstrou que, embora os conjuntos de genes funcionais envolvidos sejam muito diferentes, eles apoiaram a hipótese geral de que as eficiências de PRF viral foram finamente ajustadas para fornecer um 'média de ouro' de proteínas necessárias para a replicação e viabilidade do vírus ideal 63 (Figura 2).

A eficiência do deslocamento de quadro ribossômico (PRF) programado é crítica para a montagem de partículas virais. Painel superior: taxas normais de PRF resultam nas razões estequiométricas corretas de proteínas estruturais virais (Gag) para proteínas enzimáticas (Gag-pol), permitindo a montagem eficiente de partículas virais, empacotamento do genoma viral e maturação. Painel do meio: taxas aumentadas de PRF resultam na formação de partículas virais incompletas. Painel inferior: taxas reduzidas de PRF promovem a formação de partículas virais vazias.

A exigência de muitos vírus de RNA para taxas precisas de -1 PRF sugeriu um alvo para a terapêutica antiviral. 64 Os inibidores da peptidiltransferase anisomicina, esparsomicina e preussina afetam a eficiência de -1 PRF e inibem a propagação do vírus em leveduras, 65, 66 e o ​​inibidor de eEF-2 sordarina altera +1 PRF e Ty1 retrotranspositon. 66 As telas bioquímicas e computacionais identificaram pequenos compostos capazes de ligar os sinais PRF -1 do HIV-1 59, 67, 68 e SARS-CoV. 69 Synthetic oligonucleotide-based compounds have also been shown to alter rates of −1 PRF. 70-75 The recent development of cell-based dual-fluorescence reporter systems provide inexpensive platforms for high throughput screens directed at viral PRF signals. 76, 77 Genetic methods have been employed to identify numerous cellular gene products that affect both −1 and +1 PRF (reviewed in Ref 78 ). Importantly however, all of the mutants generated by the genetics approaches promote deleterious cellular phenotypes, suggesting that global dysregulation of PRF may interfere with expression of cellular genes (see next section). Indeed, the recent demonstration that defects in rRNA pseudouridylation promote increased rates of −1 PRF support this, and suggest that such defects may contribute to the pathologies associated with the human diseases X-linked Dyskeratosis Congenita and Hoyeraal-Hreidarsson syndrome. 79


Materiais e métodos

Specimens

With the exception of laboratory rats and mice, all specimens were caught in the wild using live traps. Geographic localities of the collected specimens, all from Argentina, are as follows: C.talarum (Necochea, Buenos Aires), C.porteousi (Bonifacio, Buenos Aires), C.opimus e O.gliroides (Tres Cruces, Jujuy).

Primary cultures

Testes were decapsulated and dispersed in a medium containing 1000 U/ml collagenase, 0.1% (w/v) trypsin inhibitor, 0.1% (w/v) hyalouronidase, 0.4% (w/v) bovine serum albumin, 0.1% (w/v) DNase II, 1 mM glucose, 2.5 ng/ml amphotericin B, 1 U/ml penicillin/streptomycin at 37°C for 30 min. After pelleting, cells were plated in high glucose Dulbecco‘s modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies), 10% (v/v) fetal calf serum, 100 g/ml penicillin/streptomycin.

RNA preparation

Total RNA was routinely prepared by the acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform method of Chomczynski and Sacchi (1987) .

Sucrose gradients

Total RNA (120 μg) was run in 10–30% (w/v) sucrose linear gradients prepared in 10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA at 24 000 r.p.m. in a SW55 Beckman rotor for 13 h at 4°C. Gradients were fractionated in ∼45 fractions of 100 μl each.

Oligonucleotídeos

The following oligonucleotides were used in this paper:

Northern blots

RNA was electrophoresed in 1% (w/v) agarose–formaldehyde gels ( Lehrach et al., 1977 ) and blotted to Hybond N+ membranes (Amersham) in 50 mM NaOH overnight. Oligonucleotides were end-labeled with [γ- 32 P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Hybridizations were performed at 56°C in 0.9 M NaCl, 0.09 M Tris–HCl pH 7.5, 6 mM EDTA, 0.5% (v/v) NP-40, 100 μg/ml herring sperm DNA. Washings were performed in 6× SSC, 0.1% (w/v) SDS, at 56°C for 30 min.

Southern blots

DNA was restricted with BamHI–BglII or NcoI–BglII using 4 U of enzyme per microgram of DNA. After a double phenol extraction and ethanol precipitation, digested DNA was electrophoresed in 1% agarose gel and after denaturing with 0.5 N NaOH in 1.5 M NaCl blotted to Hybond N membranes (Amersham) in 10× SSC overnight. Probe labeling, hybridization and washing conditions were identical to those used for Northern blots.

Primer extension

Approximately 1 μg of total RNA was denatured at 95°C for 10 min in 5 μl H2O. If denaturation was performed at 65°C, as most protocols indicate, no cDNA was synthesized, confirming the need to unfold the extremely stable secondary structure of Ctenomys D6. Annealing and cDNA synthesis were performed in 20 μl final volume containing 25 pmol of oligonucleotide primer plus 8 nmol of dNTPs, 5 μCi of [α- 32 P]dCTP, 20 U of human placental ribonuclease inhibitor and 300 U of MMLV reverse transcriptase (Promega) in the buffer provided by the manufacturer. The mix was incubated at room temperature for 10 min to allow RNA–primer annealing and then at 35°C for 60 min. Nucleic acids were ethanol-precipitated in 2.5 M NH4OAc. Pellets were resuspended in 10 μl of formamide-containing loading buffer and run in 8% polyacrylamide sequencing gels.

PCR, RT–PCR, subcloning and sequencing

PCR of rDNA was performed in 50 μl containing 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1 μM primers, 10% (v/v) dimethylsulfoxide, 100 ng of genomic DNA and 1 unit of Taq DNA polymerase (Life Technologies) in the buffer provided by the manufacturer, with or without the addition of 2 μCi of [α- 32 P]dCTP. A 30-cycle reaction was preceded by incubation at 95°C for 5 min and ended by incubation at 72°C for 10 min. Each cycle consisted of incubations at 95°C for 1 min, 50°C for 30 s and 72°C for 90 s. RT–PCR was performed following the same primer extension (without labeled nucleotides, and adding a final incubation at 95°C for 10 min after the polymerization) plus PCR protocols specified above. Two microliters of each RT reaction were taken as template for the PCR. PCR and RT–PCR products (762 and 656 bp, respectively) were phosphorylated with T4 polynucleotide kinase, blunt-ended with Klenow, eluted from 1.8% (w/v) low melting point agarose gels, and subcloned into the EcoRV site of the plasmid pBS-SK+ (Stratagene). Direct sequencing of the PCR and RT–PCR products or their subclones was performed using the Prism Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit provided by Perkin Elmer in an Applied Biosynthesis 373 DNA sequencer. Genomic and cDNA clones used for further studies were named pCtgD6 and pCtcD6, respectively.