Em formação

Depois que o primer é removido da fita principal, como a DNA polimerase I adiciona dNTPs sem um 3'-OH?

Depois que o primer é removido da fita principal, como a DNA polimerase I adiciona dNTPs sem um 3'-OH?



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Tenho uma pergunta sobre a replicação em procariontes. Eu aprendi na escola que:

  1. A DNA polimerase precisa de 3'-OH para adicionar um dNTP.
  2. Os cromossomos dos procariontes geralmente são circulares.
  3. O iniciador na fita principal (é claro, os iniciadores na fita final também) é removido pela atividade de exonuclease 5 '→ 3' da DNA polimerase I.

Faz sentido que na fita retardada os primers sejam removidos e então substituídos por novos dNTPs usando o 3'-OH do fragmento de Okazaki anterior. No entanto, para o primer na fita principal, não há fragmento de Okazaki a montante e, portanto, nenhum 3'OH que a DNA polimerase possa usar para polimerização.

Como o primer é substituído por novos dNTPs na fita principal?


A vertente principal pós-iniciação

Considere primeiro a bifurcação de replicação do DNA após a iniciação.

O primer 3'-OH no fio condutor é a extremidade 3 'da fita de DNA sendo sintetizada na direção 5' para 3 '(circulada no diagrama abaixo, modificada de Berg, Bioquímica). Não foi removido porque não há necessidade de fazer isso. (O primer na fita retardada só é removido porque é RNA.) Portanto, o problema colocado na pergunta não surge.

Lembre-se de que a razão para os fragmentos de Okazaki é que não há primer de DNA 3'-OH para o atrasado , então um primer temporário de RNA 3'-OH é gerado, a RNA polimerase - ao contrário da DNA polimerase - é capaz de copiar o DNA sem um primer. Não existe esse problema para o principal vertente.

A fita principal na origem da replicação

Como @canadianer aponta em um comentário, as observações acima não aplicam-se à iniciação da replicação do DNA, a única instância em que a fita principal deve ter um primer de RNA. No caso de procariontes, como Escherichia coli replicação continua em ambas as direções de modo que, pouco tempo após a iniciação, se tem uma bolha de replicação como mostrado na figura abaixo (adaptado de Russel, iGenetics) :

Percebe-se que, na origem, o 3'-OH do DNA da fita atrasada da outra direção de replicação (caixa em vermelho) pode atuar como um primer para a função de síntese de DNA da DNA polimerase I, após sua atividade de exonuclease ter removido um nucleotídeo do início do primer de RNA no fio condutor.

Referências

Berg et al. Ch.27

A célula, CH. 5

Sandwalk: página do blog

Nota de rodapé

Houve um erro de digitação na pergunta original que causou confusão sobre qual vertente o pôster estava preocupado. Esta resposta pressupõe que principal vertente.


Resumo da Seção

A replicação em procariotos começa a partir de uma sequência encontrada no cromossomo, chamada origem de replicação - o ponto em que o DNA se abre. A helicase abre a dupla hélice do DNA, resultando na formação da forquilha de replicação. As proteínas de ligação de fita simples se ligam ao DNA de fita simples perto da bifurcação de replicação para manter a bifurcação aberta. Primase sintetiza um primer de RNA para iniciar a síntese pela DNA polimerase, que pode adicionar nucleotídeos apenas na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Uma fita é sintetizada continuamente na direção da bifurcação de replicação, é chamada de fita principal. A outra fita é sintetizada na direção oposta à bifurcação de replicação, em pequenos trechos de DNA conhecidos como fragmentos de Okazaki. Esta vertente é conhecida como vertente retardada. Assim que a replicação for concluída, os primers de RNA são substituídos por nucleotídeos de DNA e o DNA é selado com DNA ligase, que cria ligações fosfodiéster entre o 3 & # 8242-OH de uma extremidade e o fosfato 5 & # 8242 da outra fita.


Saltos quânticos na bioquímica

Anil Day, Joanna Poulton, em Foundations of Modern Biochemistry, 1996

RNA de importação de mitocôndrias

A descoberta de que o primer de RNA usado para iniciar a síntese de DNA em mitocôndrias de mamíferos foi importado do núcleo afastou a crença de que apenas as proteínas, mas não o RNA, poderiam atravessar as membranas das organelas (Chang e Clayton, 1987). A evidência de que tRNAs são importados do citosol para a mitocôndria é derivada da elucidação da capacidade de codificação do DNA mitocondrial e também da caracterização de tRNAs presentes em mitocôndrias isoladas. As mitocôndrias de mamíferos usam 22 tRNAs incomuns para decodificar os 61 códons de sentido. O genoma linear de 15,8 kb de C. Reinhardtii codifica apenas três tRNAs (Michaelis et al., 1990). Embora o DNA mitocondrial de hepática codifique 27 espécies de tRNA, duas espécies necessárias para ler os códons de leucina e treonina estão ausentes. C. reinhardtii, planta e mitocôndrias de tripanossoma parecem importar tRNAs codificados por núcleo para formar um conjunto completo para a síntese de proteínas. Onze das 31 espécies de tRNA presentes na mitocôndria da batata são codificadas pelo DNA nuclear e são importadas do citosol (Dietrich et al., 1992). O genoma do plastídio de Epifagus virginiana, um parasita não fotossintético de faias, não possui 13 genes de tRNA encontrados em plastídeos verdes. Isso sugere que a importação de tRNA também pode ocorrer em plastídeos (Wolfe et al., 1992).


Replicação de DNA

Quando a célula entra na fase S (síntese) do ciclo celular, todo o DNA cromossômico deve ser replicado. Polimerases de DNA sintetizar novas fitas adicionando nucleotídeos ao grupo 3'-OH presente no nucleotídeo anterior usando as fitas simples separadas de DNA como modelos. Este processo gera duas novas moléculas de fita dupla, chamadas cromátides irmãs, a partir de uma dupla hélice. Mas como as novas e velhas vertentes são distribuídas? A resposta a essa pergunta foi elucidada por experimentos clássicos de Meselson e Stahl.

Experiência que demonstrou replicação semiconservativa de DNA

Para uma visão geral do experimento, assista:

Agora, ouça a seguinte história sobre esses experimentos clássicos de um dos cientistas envolvidos:

Os mecanismos de replicação

Como muitos eventos moleculares que estudaremos, a replicação pode ser dividida em três estágios: iniciação, alongamento e término.

Iniciação

A DNA polimerase não começa em locais aleatórios nos cromossomos. A replicação do DNA em procariotos e eucariotos começa em um origem de replicação (Ori), que são sequências específicas em posições específicas nos cromossomos. No E. coli, a OriC origem é

245 bp de tamanho. A replicação cromossômica começa com a ligação de uma proteína iniciadora (DnaA) a uma sequência rica em AT (por exemplo, TTATCCACA em E. coli) no OriC e derrete (interrompe a ligação de hidrogênio entre) as duas fitas. Helicase enzimas serão adicionadas para desenrolar DNA adicional a partir deste ponto.

Em procariontes, com um cromossomo pequeno, simples e circular, apenas uma origem de replicação é necessária para replicar todo o genoma. Por exemplo, E. coli tem um

Genoma de 4,5 Mb (cromossomo) que pode ser duplicado em

40 minutos assumindo uma única origem, replicação bidirecional e uma velocidade de

1000 bases / segundo / forquilha para a polimerase. Pelo menos cinco DNA polimerases procarióticas foram descobertas até agora, sendo a DNA polimerase III (Pol III) a polimerase primária para replicação. Pol I é usado principalmente para preencher as lacunas criadas durante a síntese da fita retardada (descrita abaixo) ou por meio de mecanismos de correção de erros. A DNA polimerase II, IV e V são usadas para sintetizar DNA quando certos tipos de reparo são necessários em outros momentos do ciclo de vida celular.

Por que um sítio de ligação de proteína iniciadora no OriC ser uma região rica em AT?

Dica: pense no número de ligações de hidrogênio entre pares de bases AT e GC.

Em eucariotos, com vários cromossomos lineares, mais de uma origem de replicação é necessária por cromossomo para duplicar todo o conjunto de cromossomos nas 8 horas da fase S do ciclo celular. Por exemplo, o genoma diplóide humano tem 46 cromossomos (6 x 10 9 pares de bases). Mesmo os cromossomos mais curtos são

50 Mbp de comprimento e, portanto, não poderia ser replicado de uma origem. Além disso, a taxa de movimento do garfo de replicação é mais lenta do que em procariotos, apenas

100 base / segundo. Assim, os eucariotos contêm múltiplas origens de replicação distribuídas ao longo do comprimento de cada cromossomo para permitir a duplicação de cada cromossomo dentro da fase S.

Figura ( PageIndex <1> ): Esquema de um cromossomo eucariota mostrando múltiplas origens (1, 2, 3) de replicação, cada uma definindo um replicon (1, 2, 3). A replicação pode começar em momentos diferentes na fase S. Aqui, o nº 1 e o nº 2 começam primeiro, depois o nº 3. Conforme as bifurcações de replicação continuam bidirecionalmente, elas criam & ldobolhas de replicação & rdquo que se encontram e formam bolhas maiores. O resultado final são duas fitas duplex de DNA replicadas semiconservativamente, com as fitas parentais em preto e as fitas recém-sintetizadas em vermelho. (Original-Locke-CC: AN)

Alongamento

À medida que a DNA polimerase avança ao longo do molde, o nucleotídeo que forma pares de bases com cada base do molde é covalentemente ligado à extremidade 3 'da fita em crescimento. Observe que a energia é fornecida pelo próprio trifosfato de nucleotídeo, dois fosfatos são liberados e um fosfato permanece como parte da ligação fosfodiéster.

Terminação

Em procariotos, o alongamento prossegue bidirecionalmente até que os garfos de replicação se encontrem. Os primers de RNA são removidos por uma DNA polimerase especializada e, em seguida, o DNA é sintetizado em seu lugar. Os fragmentos de DNA resultantes são então "citados" juntamente com DNA ligase, uma enzima que forma ligações fosfodiéster covalentes entre dois nucleotídeos.

Em eucariotos, a replicação também prossegue bidirecionalmente até que os garfos adjacentes se encontrem ou o garfo encontre o final do cromossomo.

Implicações e limitações da atividade 5'-para-3 'da DNA polimerase

Lembre-se de que as enzimas são específicas de seus substratos. No caso da DNA polimerase, a estrutura permite apenas adicionar nucleotídeos à extremidade 3 'do DNA existente, o que apresenta alguns questionamentos:

1. Se a enzima pode apenas adicionar nucleotídeos ao DNA existente, como ela começará?

2. Como o DNA é de fita dupla, cada fita precisa ser usada como molde, mas essas fitas são antiparalelas. Como um complexo pode fazer um novo DNA em direções opostas?

3. Como a extremidade 3 'será replicada quando não houver mais lugar para um primer na fita complementar?

Obstáculo nº 1: como começar

Uma vez oriC foi aberto e as helicases foram anexadas aos dois lados da bifurcação de replicação, a máquina de replicação, também conhecida como replisome, pode começar a se formar. No entanto, antes que as DNA polimerases assumam posições, elas precisam ser preparadas. As DNA polimerases são incapazes de unir dois nucleotídeos livres individuais para começar a formar um ácido nucleico que só podem ser adicionados a uma fita pré-existente de pelo menos dois nucleotídeos. Portanto, uma RNA polimerase especializada (RNAP & rsquos não tem essa limitação) conhecida como primase é uma parte do replissomo, e a leitura cria uma fita curta de RNA chamada de primer para a DNA polimerase adicionar. Embora apenas alguns nucleotídeos sejam necessários, os primers procarióticos podem ter até 60 nt dependendo da espécie. A helicase continuará a viajar na frente da bifurcação para desenrolar o novo DNA e permitir que a primase adicione novos primers conforme necessário.

Obstáculo 2: Faça dois fios em direções opostas ao mesmo tempo

Como o DNA está sendo desenrolado na direção do movimento do garfo, ambas as fitas precisam ser sintetizadas na região desenrolada ao mesmo tempo. As duas subunidades da DNA polimerase que estão adicionando nucleotídeos estão na verdade amarradas juntas, portanto não podem viajar em direções opostas.

Helicase abre o DNA de fita dupla e conduz o resto da máquina de replicação. Como os ácidos nucleicos são polimerizados pela adição do fosfato 5 & rsquo de um novo nucleotídeo ao hidroxil 3 & rsquo do nucleotídeo anterior, uma das fitas, chamada de fio condutor, está sendo sintetizado na mesma direção em que se move a máquina de replicação. Não tem problema.

A outra fita é problemática: vista linearmente, a fita recém-sintetizada estaria indo de 3 & rsquo a 5 & rsquo na direção do movimento da helicase, mas as polimerases de DNA não podem adicionar nucleotídeos à extremidade 5 & rsquo (lembre-se de que ela tem o fosfato, não uma hidroxila). Como as células resolvem esse problema? No modelo atual, a máquina de replicação consiste na helicase, primases e duas holoenzimas da DNA polimerase III que se movem na mesma direção física (seguindo a helicase). Na verdade, os complexos de Pol III estão fisicamente ligados por meio de subunidades & tau (Figura ( PageIndex <3> ).

Figura ( PageIndex <3> ): Replicação de DNA em procariotos. A DNA polimerase III é uma holoenzima com várias subunidades. O anel azul representa a subunidade & beta (também conhecida como clamp & beta), um dímero de subunidades semicirculares que possui um orifício central através do qual o DNA é inserido. A polimerase do núcleo, por meio de uma interação & alfa- & beta, é anexada a este grampo & beta para que permaneça no DNA por mais tempo, aumentando a processabilidade de Pol III para mais de 5000nt.

Para que a outra fita seja replicada, ela deve ser alimentada na polimerase de trás para frente, dando uma volta no DNA. Movendo-se para trás da DNA helicase, primase rapidamente sintetiza um primer curto antes de ter que avançar com o replissomo e sintetizar novamente, deixando primers intermitentes em seu rastro. Assim, Pol III é forçado a sintetizar apenas fragmentos curtos do cromossomo de cada vez, chamados de fragmentos de Okazaki em homenagem a seus descobridores, Reiji e Tsuneko Okazaki. Pol III começa a sintetizar adicionando nucleotídeos na extremidade 3 & rsquo de um primer e continua até atingir a extremidade 5 & rsquo do próximo primer. Pol III não (e não pode) conectam a fita que está sintetizando com a extremidade 3 & rsquo do primer de RNA.

A replicação do DNA é chamada de processo semi-descontínuo porque, enquanto a fita principal é sintetizada continuamente, a fita retardada é sintetizada em fragmentos. Isso leva a dois problemas principais: primeiro, há pequenos pedaços de RNA deixados para trás nas fitas recém-feitas (apenas na extremidade 5 & rsquo para a fita principal, em muitos lugares para a fita atrasada) e, segundo, Pol III só pode adicionar nucleotídeos livres a um fragmento de DNA de fita simples, ele não pode conectar outro fragmento. Portanto, o novo & ldquostrand & rdquo não está inteiro, mas crivado de ligações fosfodiéster ausentes.

O primeiro problema é resolvido pela DNA polimerase I. Ao contrário da Pol III, a Pol I é uma proteína monomérica e atua sozinha, sem proteínas adicionais. Existem também 10-20 vezes mais moléculas de Pol I do que moléculas de Pol III, porque elas são necessárias para tantos fragmentos de Okazaki. A DNA Polimerase I tem três atividades:

  1. como Pol III, ele pode sintetizar uma fita de DNA com base em um modelo de DNA,
  2. também como Pol III, é uma exonuclease de revisão 3 & rsquo-5 & rsquo, mas ao contrário de Pol III,
  3. também é uma exonuclease 5 & rsquo-3 & rsquo. A atividade da exonuclease 5 & rsquo-3 & rsquo é crucial na remoção do primer de RNA. A exonuclease 5 & rsquo-3 & rsquo se liga ao DNA de fita dupla que tem uma quebra de fita simples no esqueleto do fosfodiéster, como o que acontece depois que os fragmentos de Okazaki foram sintetizados de um primer para o próximo, mas não podem ser conectados. Esta exonuclease 5 & rsquo-3 & rsquo remove então o primer de RNA. A atividade da polimerase então adiciona novos nucleotídeos de DNA ao fragmento de Okazaki a montante, preenchendo a lacuna criada pela remoção do primer de RNA. A exonuclease de revisão atua exatamente como o faz para Pol III, removendo imediatamente um nucleotídeo incorreto recém-incorporado. Após a revisão, a taxa de erro geral de incorporação de nucleotídeos é de aproximadamente 1 em 10 7.

Mesmo que o RNA tenha sido substituído por DNA, ele ainda deixa uma fita fragmentada. O último grande jogador na história da replicação do DNA finalmente aparece: DNA ligase. Esta enzima tem uma tarefa simples, mas crucial: catalisa o ataque do 3 & rsquo-OH de um fragmento no fosfato 5 & rsquo do próximo fragmento, gerando uma ligação fosfodiéster.

Veja todo o complexo em ação nesta animação:

Obstáculo nº 3: como copiar o final?

As extremidades dos cromossomos lineares apresentam um problema & ndash em cada extremidade uma fita não pode ser completamente replicada porque não há um primer para estender. Embora a perda de uma sequência tão pequena não fosse um problema, as rodadas contínuas de replicação resultariam na perda contínua de sequência da extremidade do cromossomo a um ponto onde começaria a perder sequências de genes essenciais. Portanto, esse DNA deve ser replicado. A maioria dos eucariotos resolve este problema com uma polimerase de DNA especializada chamada telomerase, em combinação com uma polimerase regular. As telomerases são DNA polimerases dirigidas por RNA. Eles são um riboproteína, como eles são compostos de proteína e RNA. Essas enzimas contêm um pequeno pedaço de RNA que serve como um modelo portátil e reutilizável a partir do qual o DNA complementar é sintetizado. O RNA em telomerases humanas usa a sequência 3'-AAUCCC-5 'como molde e, portanto, nosso DNA telomérico tem a sequência complementar 5'-TTAGGG-3' repetida milhares de vezes. Depois que a telomerase fez a primeira fita, uma primase sintetiza um primer de RNA e uma DNA polimerase, em seguida, faz um complemento da sequência estendida.

Telomerase = RNA não codificante + proteína transcriptase reversa

Em humanos, o gene para o RNA da telomerase é denominado TERC (telomerase RN / D componente) e é encontrado no cromossomo 3. Este gene, portanto, codifica um produto (um RNA), mas não uma proteína!

O gene para a proteína é denominado TERT (telomerase rEverse transcriptase) e é encontrada no cromossomo 5.

Esses produtos genéticos independentemente codificados e produzidos independentemente devem se reunir para desempenhar sua função.

Observe que o número de repetições e, portanto, o tamanho do telômero não está definido, mas pode flutuar após cada rodada do ciclo celular. Como há muitas repetições no final, essa flutuação mantém um buffer de comprimento & ndash às vezes é & rsquos mais longo, às vezes é & rsquos mais curto & ndash, mas o comprimento médio será mantido ao longo das gerações de replicação celular.

Figura ( PageIndex <4> ): Replicação do telômero mostrando a conclusão da fita principal e a replicação incompleta da fita posterior. A lacuna é replicada pela extensão da extremidade 3 & rsquo pela telomerase e então preenchida por extensão a partir de um primer de RNA. (Original-Locke-CC: AN)

Na ausência de telomerase, como é o caso das células somáticas humanas, a divisão celular repetida leva ao encurtamento dos telômeros. Se um limite crítico for atingido, as células entram em uma fase de senescência de não crescimento. A ativação da expressão da telomerase, que geralmente ocorre em células cancerosas, permite que uma célula e seus descendentes se tornem imortais porque seus telômeros não atingirão o limite crítico. Células que podem ser cultivadas em cultura, como Células HeLa que a superexpressão da telomerase pode ser propagada essencialmente indefinidamente. As células HeLa, que foram originalmente isoladas de uma paciente afro-americana com câncer, Henrietta Lacks, sem seu consentimento, foram mantidas em cultura desde 1951.

Revisão de DNA polimerase

A DNA polimerase incorpora os nucleotídeos corretos em cada nova fita com base na ligação de hidrogênio favorável que ocorre entre as bases que se ligam usando as regras de emparelhamento de bases (A-T e G-C). Se uma base incorreta for incorporada, a estrutura da dupla hélice será distorcida e freqüentemente será detectada pela enzima se não tiver avançado muito para baixo na fita. A DNA polimerase tem atividade de exonuclease 3 'a 5' para remover nucleotídeos através da incompatibilidade e, em seguida, repetir a síntese dessa região da fita com os nucleotídeos corretos. Como resultado dessa capacidade de revisão, as DNA polimerases têm taxas de erro muito baixas, permitindo que os organismos passem com sucesso informações genéticas de célula para célula e de geração para geração.


Conteúdo

Os primers de RNA são usados ​​por organismos vivos na iniciação da síntese de uma fita de DNA. Uma classe de enzimas chamadas primases adiciona um primer de RNA complementar ao modelo de leitura de novo em ambas as vertentes principais e posteriores. A partir do 3'-OH livre do primer, conhecido como o terminal do primer, uma DNA polimerase pode estender uma fita recentemente sintetizada. A fita principal na replicação do DNA é sintetizada em uma peça contínua movendo-se com o garfo de replicação, exigindo apenas um primer de RNA inicial para começar a síntese. Na fita retardada, o DNA molde é executado na direção 5 ′ → 3 ′. Uma vez que a DNA polimerase não pode adicionar bases na direção 3 ′ → 5 ′ complementar à fita molde, o DNA é sintetizado "para trás" em fragmentos curtos que se afastam da bifurcação de replicação, conhecidos como fragmentos de Okazaki. Ao contrário da fita principal, este método resulta no início e na parada repetida da síntese de DNA, exigindo múltiplos primers de RNA. Ao longo do molde de DNA, primase intercala primers de RNA que a DNA polimerase usa para sintetizar DNA na direção 5 ′ → 3 ′. [1]

Outro exemplo de primers usados ​​para permitir a síntese de DNA é a transcrição reversa. A transcriptase reversa é uma enzima que usa uma fita modelo de RNA para sintetizar uma fita complementar de DNA. O componente da DNA polimerase da transcriptase reversa requer uma extremidade 3 'existente para iniciar a síntese. [1]

Remoção do primer Editar

Após a inserção dos fragmentos de Okazaki, os primers de RNA são removidos (o mecanismo de remoção difere entre procariotos e eucariotos) e substituídos por novos desoxirribonucleotídeos que preenchem as lacunas onde o RNA estava presente. A DNA ligase então une as fitas fragmentadas, completando a síntese da fita retardada. [1]

Em procariotos, a DNA polimerase I sintetiza o fragmento de Okazaki até atingir o primer de RNA anterior. Em seguida, a enzima atua simultaneamente como uma exonuclease 5 ′ → 3 ′, removendo os ribonucleotídeos primer na frente e adicionando desoxirribonucleotídeos atrás até que a região tenha sido substituída por DNA, deixando uma pequena lacuna na estrutura do DNA entre os fragmentos de Okazaki que é selada pela DNA ligase.

Na remoção do primer eucariótico, a DNA polimerase δ estende o fragmento de Okazaki na direção 5 ′ → 3 ′, e ao encontrar o primer de RNA do fragmento de Okazaki anterior, ele desloca a extremidade 5 ′ do primer em um flap de RNA de fita simples, que é removido por clivagem de nuclease. A clivagem dos retalhos de RNA envolve a clivagem da endonuclease 1 específica da estrutura do retalho (FEN1) de retalhos curtos ou o revestimento de retalhos longos pela proteína A de replicação da proteína de ligação de DNA de fita simples (RPA) e clivagem sequencial pela nuclease Dna2 e FEN1. [2]

Os primers sintéticos são oligonucleotídeos sintetizados quimicamente, geralmente de DNA, que podem ser customizados para anelar em um local específico no DNA molde. Em solução, o primer hibridiza espontaneamente com o molde por meio do emparelhamento de bases de Watson-Crick antes de ser estendido pela DNA polimerase. A capacidade de criar e personalizar primers sintéticos provou ser uma ferramenta inestimável necessária para uma variedade de abordagens de biologia molecular envolvendo a análise de DNA. Tanto o método de terminação da cadeia Sanger quanto o método “Next-Gen” de sequenciamento de DNA requerem primers para iniciar a reação. [1]

Design do primer PCR Editar

A reação em cadeia da polimerase (PCR) usa um par de primers personalizados para direcionar o alongamento do DNA um em direção ao outro nas extremidades opostas da sequência que está sendo amplificada. Estes iniciadores têm tipicamente entre 18 e 24 bases de comprimento e devem codificar apenas os locais específicos a montante e a jusante da sequência a ser amplificada. Um primer que pode se ligar a várias regiões ao longo do DNA vai amplificar todas elas, eliminando o propósito da PCR. [1]

Alguns critérios devem ser levados em consideração ao projetar um par de primers de PCR. Os pares de primers devem ter temperaturas de fusão semelhantes, uma vez que o recozimento durante a PCR ocorre para ambas as fitas simultaneamente, e essa temperatura de fusão compartilhada não deve ser muito mais alta ou mais baixa do que a temperatura de recozimento da reação. Uma cartilha com um Tm (temperatura de fusão) muito mais alta do que a temperatura de recozimento da reação pode hibridizar erroneamente e se estender em um local incorreto ao longo da sequência de DNA. UMA Tm significativamente mais baixa do que a temperatura de recozimento pode falhar em recozer e estender.

Além disso, as sequências de primer precisam ser escolhidas para selecionar com exclusividade uma região do DNA, evitando a possibilidade de hibridização com uma sequência semelhante nas proximidades. Um método comumente usado para selecionar um local de iniciador é a pesquisa BLAST, em que todas as regiões possíveis às quais um iniciador pode se ligar podem ser vistas. Tanto a sequência de nucleotídeos quanto o próprio primer podem ser pesquisados ​​no BLAST. A ferramenta gratuita do NCBI Primer-BLAST integra o design do primer e a pesquisa do BLAST em uma aplicação, [3] assim como os produtos de software comercial como ePrime e Beacon Designer. Simulações de computador de resultados teóricos de PCR (PCR eletrônico) podem ser realizadas para auxiliar no projeto do primer, fornecendo temperaturas de fusão e recozimento, etc. [4]

A partir de 2014, muitas ferramentas online estão disponíveis gratuitamente para o design de primer, algumas das quais se concentram em aplicações específicas de PCR. Primers com alta especificidade para um subconjunto de modelos de DNA na presença de muitas variantes semelhantes podem ser projetados usando DECIPHER [ citação necessária ] .

A seleção de uma região específica do DNA para a ligação do primer requer algumas considerações adicionais. Regiões com alto nível de repetições de mononucleotídeos e dinucleotídeos devem ser evitadas, pois a formação de alças pode ocorrer e contribuir para a hibridização errônea. Os primers não devem ser facilmente recozidos com outros primers na mistura. Esse fenômeno pode levar à produção de produtos de 'dímeros de primer' contaminando a solução final. Os primers também não devem recozer fortemente em si mesmos, pois grampos internos e loops podem impedir o recozimento com o DNA molde.

Ao projetar iniciadores, bases de nucleotídeos adicionais podem ser adicionadas às extremidades traseiras de cada iniciador, resultando em uma sequência cap personalizada em cada extremidade da região amplificada. Uma aplicação para essa prática é o uso na clonagem de TA, uma técnica de subclonagem especial semelhante à PCR, em que a eficiência pode ser aumentada adicionando caudas AG às extremidades 5 ′ e 3 ′. [5]

Editar primers degenerados

Algumas situações podem exigir o uso de primers degenerados. São misturas de primers semelhantes, mas não idênticos. Isso pode ser conveniente ao amplificar o mesmo gene de organismos diferentes, pois as sequências são provavelmente semelhantes, mas não idênticas. Essa técnica é útil porque o próprio código genético é degenerado, o que significa que vários códons diferentes podem codificar o mesmo aminoácido. Isso permite que diferentes organismos tenham uma sequência genética significativamente diferente que codifique uma proteína altamente semelhante. Por esta razão, os primers degenerados também são usados ​​quando o projeto do primer é baseado na sequência da proteína, uma vez que a sequência específica dos códons não é conhecida. Portanto, a sequência de iniciador correspondente ao aminoácido isoleucina pode ser "ATH", onde A significa adenina, T para timina e H para adenina, timina ou citosina, de acordo com o código genético para cada códon, usando os símbolos IUPAC para bases degeneradas. Os primers degenerados podem não hibridizar perfeitamente com uma sequência alvo, o que pode reduzir bastante a especificidade da amplificação por PCR.

Primers degenerados são amplamente utilizados e extremamente úteis no campo da ecologia microbiana. Eles permitem a amplificação de genes de microrganismos até agora não cultivados ou permitem a recuperação de genes de organismos onde a informação genômica não está disponível. Normalmente, os primers degenerados são projetados alinhando o sequenciamento do gene encontrado no GenBank. As diferenças entre as sequências são explicadas pelo uso de degenerescências IUPAC para bases individuais. Os iniciadores de PCR são então sintetizados como uma mistura de iniciadores correspondendo a todas as permutações da sequência do códon.


2. Separação de tamanhos por eletroforese em gel

Na segunda etapa, os oligonucleotídeos terminados em cadeia são separados por tamanho por meio de eletroforese em gel. Na eletroforese em gel, as amostras de DNA são carregadas em uma extremidade de uma matriz de gel e uma corrente elétrica é aplicada. O DNA é carregado negativamente, de modo que os oligonucleotídeos serão puxados em direção ao eletrodo positivo no lado oposto do gel. Como todos os fragmentos de DNA têm a mesma carga por unidade de massa, a velocidade com que os oligonucleotídeos se movem será determinada apenas pelo tamanho. Quanto menor for um fragmento, menos fricção ele experimentará ao se mover através do gel e mais rápido ele se moverá. Como resultado, os oligonucleotídeos serão organizados do menor para o maior, lendo o gel de baixo para cima.

No manual No sequenciamento Sanger, os oligonucleotídeos de cada uma das quatro reações de PCR são executados em quatro pistas separadas de um gel. Isso permite ao usuário saber quais oligonucleotídeos correspondem a cada ddNTP.

No automatizado Seqüenciamento Sanger, todos os oligonucleotídeos são executados em uma única eletroforese em gel capilar dentro da máquina de sequenciamento.


Resumo da Seção

A replicação em procariotos começa a partir de uma sequência encontrada no cromossomo, chamada origem de replicação - o ponto em que o DNA se abre. A helicase abre a dupla hélice do DNA, resultando na formação da forquilha de replicação. As proteínas de ligação de fita simples se ligam ao DNA de fita simples perto da bifurcação de replicação para manter a bifurcação aberta. Primase sintetiza um primer de RNA para iniciar a síntese pela DNA polimerase, que pode adicionar nucleotídeos apenas na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Uma fita é sintetizada continuamente na direção da bifurcação de replicação, é chamada de fita principal. A outra fita é sintetizada na direção oposta à bifurcação de replicação, em pequenos trechos de DNA conhecidos como fragmentos de Okazaki. Esta vertente é conhecida como vertente retardada. Assim que a replicação for concluída, os primers de RNA são substituídos por nucleotídeos de DNA e o DNA é selado com DNA ligase, que cria ligações fosfodiéster entre o 3 & # 8242-OH de uma extremidade e o fosfato 5 & # 8242 da outra fita.


Depois que o primer é removido da fita principal, como a DNA polimerase I adiciona dNTPs sem um 3'-OH? - Biologia

Ao final desta seção, você será capaz de fazer o seguinte:

  • Explique o processo de replicação do DNA em procariontes
  • Discuta o papel de diferentes enzimas e proteínas no apoio a este processo

A replicação do DNA foi bem estudada em procariotos principalmente por causa do pequeno tamanho do genoma e da grande variedade de mutantes disponíveis. E. coli tem 4,6 milhões de pares de bases em um único cromossomo circular e tudo isso é replicado em aproximadamente 42 minutos, começando em um único local ao longo do cromossomo e continuando ao redor do círculo em ambas as direções. Isso significa que aproximadamente 1000 nucleotídeos são adicionados por segundo. Assim, o processo é bastante rápido e ocorre sem muitos erros.

A replicação do DNA emprega um grande número de proteínas e enzimas estruturais, cada uma das quais desempenha um papel crítico durante o processo. Um dos principais jogadores é a enzima DNA polimerase, também conhecido como DNA pol, que adiciona nucleotídeos um a um à crescente cadeia de DNA que é complementar à fita molde. A adição de nucleotídeos requer energia esta energia é obtida dos nucleosídeos trifosfatos ATP, GTP, TTP e CTP. Como ATP, o outro NTPs (trifosfatos de nucleosídeo) são moléculas de alta energia que podem servir tanto como fonte de nucleotídeos de DNA quanto como fonte de energia para impulsionar a polimerização. Quando a ligação entre os fosfatos é “quebrada”, a energia liberada é usada para formar a ligação fosfodiéster entre o nucleotídeo de entrada e a cadeia crescente. Em procariotos, três tipos principais de polimerases são conhecidos: DNA pol I, DNA pol II e DNA pol III. Sabe-se agora que o DNA pol III é a enzima necessária para a síntese do DNA. O DNA pol I é uma importante enzima acessória na replicação do DNA e, junto com o DNA pol II, é principalmente necessário para o reparo.

Como a máquina de replicação sabe por onde começar? Acontece que existem sequências de nucleotídeos específicas chamadas origens de replicação onde a replicação começa. No E. coli, que tem uma única origem de replicação em seu cromossomo (como a maioria dos procariotos), essa origem de replicação tem aproximadamente 245 pares de bases de comprimento e é rica em sequências AT. A origem da replicação é reconhecida por certas proteínas que se ligam a este local. Uma enzima chamada helicase desenrola o DNA quebrando as ligações de hidrogênio entre os pares de bases nitrogenadas. A hidrólise do ATP é necessária para este processo. Conforme o DNA se abre, estruturas em forma de Y são chamadas garfos de replicação são formados. Duas bifurcações de replicação são formadas na origem da replicação e são estendidas bidirecionalmente conforme a replicação prossegue. Proteínas de ligação de fita simples revestem as fitas simples de DNA próximas à bifurcação de replicação para evitar que o DNA de fita simples volte a formar uma dupla hélice.

A DNA polimerase tem duas restrições importantes: é capaz de adicionar nucleotídeos apenas na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242 (uma nova fita de DNA só pode ser estendida nesta direção). Também requer um grupo 3 & # 8242-OH livre ao qual pode adicionar nucleotídeos formando uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 3 & # 8242-OH e o fosfato 5 & # 8242 do próximo nucleotídeo. Isso significa essencialmente que ele não pode adicionar nucleotídeos se um grupo 3 & # 8242-OH livre não estiver disponível. Então, como ele adiciona o primeiro nucleotídeo? O problema é resolvido com a ajuda de um primer que fornece a extremidade 3 & # 8242-OH livre. Outra enzima, a RNA primase, sintetiza um segmento de RNA com cerca de cinco a dez nucleotídeos de comprimento e complementar ao DNA molde. Como essa sequência inicia a síntese do DNA, é apropriadamente chamada de primer. A DNA polimerase agora pode estender esse primer de RNA, adicionando nucleotídeos um a um que são complementares à fita modelo ((Figura)).

Art Connection

Figura 1. Uma forquilha de replicação é formada quando a helicase separa as fitas de DNA na origem da replicação. O DNA tende a se tornar mais altamente enrolado antes da bifurcação de replicação. A topoisomerase quebra e reforma a estrutura de fosfato do DNA antes da bifurcação de replicação, aliviando assim a pressão que resulta deste "superenrolamento". As proteínas de ligação de fita simples ligam-se ao DNA de fita simples para evitar que a hélice se volte a formar. Primase sintetiza um primer de RNA. A DNA polimerase III usa este primer para sintetizar a fita filha de DNA. Na fita principal, o DNA é sintetizado continuamente, enquanto na fita posterior, o DNA é sintetizado em trechos curtos chamados fragmentos de Okazaki. A DNA polimerase I substitui o primer de RNA por DNA. A DNA ligase sela as lacunas entre os fragmentos de Okazaki, unindo os fragmentos em uma única molécula de DNA. (crédito: modificação da obra de Mariana Ruiz Villareal)

Pergunta: Você isola uma cepa de célula na qual a união de fragmentos de Okazaki é prejudicada e suspeita que ocorreu uma mutação em uma enzima encontrada na bifurcação de replicação. Qual enzima tem maior probabilidade de sofrer mutação?

O garfo de replicação se move a uma taxa de 1000 nucleotídeos por segundo. A topoisomerase impede o enrolamento excessivo da dupla hélice do DNA à frente da bifurcação de replicação, pois o DNA se abre, causando cortes temporários na hélice do DNA e selando-a novamente. Porque a DNA polimerase só pode se estender na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242, e porque a dupla hélice do DNA é antiparalelo, há um pequeno problema na bifurcação de replicação. As duas fitas de DNA modelo têm orientações opostas: uma vertente está na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242 e a outra está orientada na direção 3 & # 8242 a 5 & # 8242. Apenas uma nova fita de DNA, aquela que é complementar à fita de DNA parental 3 & # 8242 a 5 & # 8242, pode ser sintetizada continuamente em direção à forquilha de replicação. Esta fita sintetizada continuamente é conhecida como a fita principal. A outra fita, complementar ao DNA parental 5 & # 8242 a 3 & # 8242, é estendida para longe da bifurcação de replicação, em pequenos fragmentos conhecidos como fragmentos de Okazaki, cada um exigindo um primer para iniciar a síntese. Novos segmentos de primer são colocados na direção da bifurcação de replicação, mas cada um apontando para longe dele. (Os fragmentos de Okazaki têm o nome do cientista japonês que os descobriu pela primeira vez. A fita com os fragmentos de Okazaki é conhecida como fita retardada.)

O filamento principal pode ser estendido a partir de um único primer, ao passo que o filamento posterior precisa de um novo primer para cada um dos fragmentos curtos de Okazaki. A direção geral do fio retardado será 3 & # 8242 a 5 & # 8242, e a do fio principal 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Uma proteína chamada grampo deslizante mantém a DNA polimerase no lugar enquanto ela continua a adicionar nucleotídeos. A pinça deslizante é uma proteína em forma de anel que se liga ao DNA e mantém a polimerase no lugar. À medida que a síntese prossegue, os primers de RNA são substituídos por DNA. Os primers são removidos pela atividade de exonuclease do DNA pol I, que usa o DNA atrás do RNA como seu próprio primer e preenche as lacunas deixadas pela remoção dos nucleotídeos do RNA pela adição de nucleotídeos do DNA. Os cortes que permanecem entre o DNA recém-sintetizado (que substituiu o primer de RNA) e o DNA previamente sintetizado são selados pela enzima DNA ligase, que catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre a extremidade 3 & # 8242-OH de um nucleotídeo e o 5 & # 8242 extremidade de fosfato do outro fragmento.

Depois que o cromossomo foi completamente replicado, as duas cópias de DNA se movem para duas células diferentes durante a divisão celular.

O processo de replicação do DNA pode ser resumido da seguinte forma:

  1. O DNA se desenrola na origem da replicação.
  2. Helicase abre as forquilhas de replicação formadoras de DNA, que são estendidas bidirecionalmente.
  3. Proteínas de ligação de fita simples revestem o DNA ao redor da forquilha de replicação para evitar o retrocesso do DNA.
  4. A topoisomerase se liga na região à frente da bifurcação de replicação para evitar o superenrolamento.
  5. Primase sintetiza primers de RNA complementares à fita de DNA.
  6. A DNA polimerase III começa a adicionar nucleotídeos à extremidade 3 & # 8242-OH do primer.
  7. O alongamento tanto da fita posterior quanto da linha principal continua.
  8. Os primers de RNA são removidos por atividade de exonuclease.
  9. As lacunas são preenchidas pelo DNA pol I pela adição de dNTPs.
  10. A lacuna entre os dois fragmentos de DNA é selada pela DNA ligase, que ajuda na formação de ligações fosfodiéster.

(Figura) resume as enzimas envolvidas na replicação do DNA procariótico e as funções de cada uma.

Replicação de DNA procariótica: enzimas e suas funções
Enzima / proteína Função Específica
DNA pol I Remove o primer de RNA e o substitui por DNA recém-sintetizado
DNA pol III Enzima principal que adiciona nucleotídeos na direção 5 & # 8242-3 & # 8242
Helicase Abre a hélice do DNA quebrando as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas
Ligase Sela as lacunas entre os fragmentos de Okazaki para criar uma fita contínua de DNA
Primase Sintetiza os primers de RNA necessários para iniciar a replicação
Pinça Deslizante Ajuda a manter a DNA polimerase no lugar quando os nucleotídeos estão sendo adicionados
Topoisomerase Ajuda a aliviar a tensão no DNA ao se desenrolar, causando quebras e, em seguida, selando novamente o DNA
Proteínas de ligação de fita simples (SSB) Liga-se ao DNA de fita simples para evitar que o DNA retroceda.

Link para aprendizagem

Reveja o processo completo de replicação do DNA aqui.

Resumo da Seção

A replicação em procariotos começa a partir de uma sequência encontrada no cromossomo, chamada origem de replicação - o ponto em que o DNA se abre. A helicase abre a dupla hélice do DNA, resultando na formação da forquilha de replicação. As proteínas de ligação de fita simples se ligam ao DNA de fita simples perto da bifurcação de replicação para manter a bifurcação aberta. Primase sintetiza um primer de RNA para iniciar a síntese pela DNA polimerase, que pode adicionar nucleotídeos apenas à extremidade 3 e # 8242 de uma fita de primer previamente sintetizada. Ambas as novas fitas de DNA crescem de acordo com suas respectivas direções 5 & # 8242-3 & # 8242. Uma fita é sintetizada continuamente na direção da bifurcação de replicação, é chamada de fita principal. A outra fita é sintetizada na direção oposta à bifurcação de replicação, em pequenos trechos de DNA conhecidos como fragmentos de Okazaki. Esta vertente é conhecida como vertente retardada. Assim que a replicação for concluída, os primers de RNA são substituídos por nucleotídeos de DNA e o DNA é selado com DNA ligase, que cria ligações fosfodiéster entre o 3 & # 8242-OH de uma extremidade e o fosfato 5 & # 8242 da outra fita.

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(Figura) Você isola uma cepa de célula na qual a união de fragmentos de Okazaki é prejudicada e suspeita que ocorreu uma mutação em uma enzima encontrada na forquilha de replicação. Qual enzima tem maior probabilidade de sofrer mutação?


Conteúdo

O método clássico de terminação de cadeia requer um molde de DNA de fita simples, um primer de DNA, uma DNA polimerase, desoxinucleotídeo trifosfatos normais (dNTPs) e di-desoxinucleotídeo trifosfatos modificados (ddNTPs), o último dos quais termina o alongamento da fita de DNA. Estes nucleotídeos de terminação de cadeia carecem de um grupo 3'-OH necessário para a formação de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos, fazendo com que a DNA polimerase cesse a extensão do DNA quando um ddNTP modificado é incorporado. Os ddNTPs podem ser marcados de forma radioativa ou fluorescente para detecção em máquinas de sequenciamento automatizadas.

A amostra de DNA é dividida em quatro reações de sequenciamento separadas, contendo todos os quatro desoxinucleotídeos padrão (dATP, dGTP, dCTP e dTTP) e a DNA polimerase. A cada reação é adicionado apenas um dos quatro didesoxinucleotídeos (ddATP, ddGTP, ddCTP ou ddTTP), enquanto os outros nucleotídeos adicionados são comuns. A concentração de desoxinucleotídeo deve ser aproximadamente 100 vezes maior do que a do didesoxinucleotídeo correspondente (por exemplo, 0,5 mM dTTP: 0,005 mM ddTTP) para permitir que fragmentos suficientes sejam produzidos enquanto ainda transcreve a sequência completa (mas a concentração de ddNTP também depende do comprimento da sequência). [2] Colocando em uma ordem mais sensata, quatro reações separadas são necessárias neste processo para testar todos os quatro ddNTPs. Após as rodadas de extensão de DNA modelo a partir do primer ligado, os fragmentos de DNA resultantes são desnaturados por calor e separados por tamanho usando eletroforese em gel. In the original publication of 1977, [2] the formation of base-paired loops of ssDNA was a cause of serious difficulty in resolving bands at some locations. This is frequently performed using a denaturing polyacrylamide-urea gel with each of the four reactions run in one of four individual lanes (lanes A, T, G, C). The DNA bands may then be visualized by autoradiography or UV light and the DNA sequence can be directly read off the X-ray film or gel image.

In the image on the right, X-ray film was exposed to the gel, and the dark bands correspond to DNA fragments of different lengths. A dark band in a lane indicates a DNA fragment that is the result of chain termination after incorporation of a dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP). The relative positions of the different bands among the four lanes, from bottom to top, are then used to read the DNA sequence.

Technical variations of chain-termination sequencing include tagging with nucleotides containing radioactive phosphorus for radiolabelling, or using a primer labeled at the 5' end with a fluorescent dye. Dye-primer sequencing facilitates reading in an optical system for faster and more economical analysis and automation. The later development by Leroy Hood and coworkers [4] [5] of fluorescently labeled ddNTPs and primers set the stage for automated, high-throughput DNA sequencing.

Chain-termination methods have greatly simplified DNA sequencing. For example, chain-termination-based kits are commercially available that contain the reagents needed for sequencing, pre-aliquoted and ready to use. Limitations include non-specific binding of the primer to the DNA, affecting accurate read-out of the DNA sequence, and DNA secondary structures affecting the fidelity of the sequence.

Dye-terminator sequencing Edit

Dye-terminator sequencing utilizes labelling of the chain terminator ddNTPs, which permits sequencing in a single reaction, rather than four reactions as in the labelled-primer method. In dye-terminator sequencing, each of the four dideoxynucleotide chain terminators is labelled with fluorescent dyes, each of which emit light at different wavelengths.

Owing to its greater expediency and speed, dye-terminator sequencing is now the mainstay in automated sequencing. Its limitations include dye effects due to differences in the incorporation of the dye-labelled chain terminators into the DNA fragment, resulting in unequal peak heights and shapes in the electronic DNA sequence trace chromatogram after capillary electrophoresis (see figure to the left).

This problem has been addressed with the use of modified DNA polymerase enzyme systems and dyes that minimize incorporation variability, as well as methods for eliminating "dye blobs". The dye-terminator sequencing method, along with automated high-throughput DNA sequence analyzers, was used for the vast majority of sequencing projects until the introduction of next generation sequencing.

Automation and sample preparation Edit

Automated DNA-sequencing instruments (DNA sequencers) can sequence up to 384 DNA samples in a single batch. Batch runs may occur up to 24 times a day. DNA sequencers separate strands by size (or length) using capillary electrophoresis, they detect and record dye fluorescence, and output data as fluorescent peak trace chromatograms. Sequencing reactions (thermocycling and labelling), cleanup and re-suspension of samples in a buffer solution are performed separately, before loading samples onto the sequencer. A number of commercial and non-commercial software packages can trim low-quality DNA traces automatically. These programs score the quality of each peak and remove low-quality base peaks (which are generally located at the ends of the sequence). The accuracy of such algorithms is inferior to visual examination by a human operator, but is adequate for automated processing of large sequence data sets.

Challenges Edit

Common challenges of DNA sequencing with the Sanger method include poor quality in the first 15-40 bases of the sequence due to primer binding and deteriorating quality of sequencing traces after 700-900 bases. Base calling software such as Phred typically provides an estimate of quality to aid in trimming of low-quality regions of sequences. [6] [7]

In cases where DNA fragments are cloned before sequencing, the resulting sequence may contain parts of the cloning vector. In contrast, PCR-based cloning and next-generation sequencing technologies based on pyrosequencing often avoid using cloning vectors. Recently, one-step Sanger sequencing (combined amplification and sequencing) methods such as Ampliseq and SeqSharp have been developed that allow rapid sequencing of target genes without cloning or prior amplification. [8] [9]

Current methods can directly sequence only relatively short (300-1000 nucleotides long) DNA fragments in a single reaction. The main obstacle to sequencing DNA fragments above this size limit is insufficient power of separation for resolving large DNA fragments that differ in length by only one nucleotide.

Microfluidic Sanger sequencing is a lab-on-a-chip application for DNA sequencing, in which the Sanger sequencing steps (thermal cycling, sample purification, and capillary electrophoresis) are integrated on a wafer-scale chip using nanoliter-scale sample volumes. This technology generates long and accurate sequence reads, while obviating many of the significant shortcomings of the conventional Sanger method (e.g. high consumption of expensive reagents, reliance on expensive equipment, personnel-intensive manipulations, etc.) by integrating and automating the Sanger sequencing steps.

In its modern inception, high-throughput genome sequencing involves fragmenting the genome into small single-stranded pieces, followed by amplification of the fragments by polymerase chain reaction (PCR). Adopting the Sanger method, each DNA fragment is irreversibly terminated with the incorporation of a fluorescently labeled dideoxy chain-terminating nucleotide, thereby producing a DNA “ladder” of fragments that each differ in length by one base and bear a base-specific fluorescent label at the terminal base. Amplified base ladders are then separated by capillary array electrophoresis (CAE) with automated, no local “finish-line” detection of the fluorescently labeled ssDNA fragments, which provides an ordered sequence of the fragments. These sequence reads are then computer assembled into overlapping or contiguous sequences (termed "contigs") which resemble the full genomic sequence once fully assembled. [10]

Sanger methods achieve read lengths of approximately 800bp (typically 500-600bp with non-enriched DNA). The longer read lengths in Sanger methods display significant advantages over other sequencing methods especially in terms of sequencing repetitive regions of the genome. A challenge of short-read sequence data is particularly an issue in sequencing new genomes (de novo) and in sequencing highly rearranged genome segments, typically those seen of cancer genomes or in regions of chromosomes that exhibit structural variation. [11]

Applications of microfluidic sequencing technologies Edit

Other useful applications of DNA sequencing include single nucleotide polymorphism (SNP) detection, single-strand conformation polymorphism (SSCP) heteroduplex analysis, and short tandem repeat (STR) analysis. Resolving DNA fragments according to differences in size and/or conformation is the most critical step in studying these features of the genome. [10]

Device design Edit

The sequencing chip has a four-layer construction, consisting of three 100-mm-diameter glass wafers (on which device elements are microfabricated) and a polydimethylsiloxane (PDMS) membrane. Reaction chambers and capillary electrophoresis channels are etched between the top two glass wafers, which are thermally bonded. Three-dimensional channel interconnections and microvalves are formed by the PDMS and bottom manifold glass wafer.

The device consists of three functional units, each corresponding to the Sanger sequencing steps. The thermal cycling (TC) unit is a 250-nanoliter reaction chamber with integrated resistive temperature detector, microvalves, and a surface heater. Movement of reagent between the top all-glass layer and the lower glass-PDMS layer occurs through 500-μm-diameter via-holes. After thermal-cycling, the reaction mixture undergoes purification in the capture/purification chamber, and then is injected into the capillary electrophoresis (CE) chamber. The CE unit consists of a 30-cm capillary which is folded into a compact switchback pattern via 65-μm-wide turns.

Sequencing chemistry Edit

Platforms Edit

The Apollo 100 platform (Microchip Biotechnologies Inc., Dublin, CA) [12] integrates the first two Sanger sequencing steps (thermal cycling and purification) in a fully automated system. The manufacturer claims that samples are ready for capillary electrophoresis within three hours of the sample and reagents being loaded into the system. The Apollo 100 platform requires sub-microliter volumes of reagents.

Comparisons to other sequencing techniques Edit

Performance values for genome sequencing technologies including Sanger methods and next-generation methods [11] [13] [14]
Tecnologia Number of lanes Injection volume (nL) Analysis time Average read length Throughput (including analysis Mb/h) Gel pouring Lane tracking
Slab gel 96 500–1000 6–8 hours 700 bp 0.0672 sim sim
Capillary array electrophoresis 96 1–5 1–3 hours 700 bp 0.166 Não Não
Microchip 96 0.1–0.5 6–30 minutes 430 bp 0.660 Não Não
454/Roche FLX (2008) & lt 0,001 4 horas 200–300 bp 20–30
Illumina/Solexa (2008) 2–3 days 30–100 bp 20
ABI/SOLiD (2008) 8 days 35 bp 5–15
Illumina MiSeq (2019) 1–3 days 2x75–2x300 bp 170–250
Illumina NovaSeq (2019) 1–2 days 2x50–2x150 bp 22,000–67,000
Ion Torrent Ion 530 (2019) 2.5–4 hours 200–600 bp 110–920
BGI MGISEQ-T7 (2019) 1 day 2x150 bp 250,000
Pacific Biosciences SMRT (2019) 10–20 hours 10–30 kb 1,300
Oxford Nanopore MinIon (2019) 3 days 13–20 kb [15] 700

The ultimate goal of high-throughput sequencing is to develop systems that are low-cost, and extremely efficient at obtaining extended (longer) read lengths. Longer read lengths of each single electrophoretic separation, substantially reduces the cost associated with de novo DNA sequencing and the number of templates needed to sequence DNA contigs at a given redundancy. Microfluidics may allow for faster, cheaper and easier sequence assembly. [10]