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3.4: Reparo de DNA - Biologia

3.4: Reparo de DNA - Biologia



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Mantendo a integridade das informações da célula: reparo do DNA

Na última seção, consideramos as maneiras como as células lidam com os desafios associados à replicação de seu DNA, um processo vital para todas as células. Embora a revisão por DNA polimerases aumente muito a precisão da replicação, existem mecanismos adicionais nas células para garantir ainda mais que o DNA recém-replicado seja uma cópia fiel do original e também para reparar danos ao DNA durante a vida normal de uma célula.

Todo o DNA sofre danos ao longo do tempo, devido à exposição aos raios ultravioleta e outras radiações, bem como a vários produtos químicos no meio ambiente. Mesmo as reações químicas que ocorrem naturalmente dentro das células podem dar origem a compostos que podem danificar o DNA. Como você já sabe, mesmo pequenas alterações na sequência do DNA, como mutações pontuais, às vezes podem ter consequências de longo alcance. Da mesma forma, danos não reparados causados ​​por radiação, produtos químicos ambientais ou mesmo uma química celular normal podem interferir na transmissão precisa de informações no DNA. Manter a integridade do "projeto" da célula é de vital importância e isso se reflete nos numerosos mecanismos que existem para reparar erros e danos no DNA.

Reparo de incompatibilidade pós-replicativa

Discutimos anteriormente a revisão de provas por DNA polimerases durante a replicação. A revisão elimina todos os erros cometidos durante a replicação. Não. Embora a revisão reduza significativamente a taxa de erro, nem todos os erros são corrigidos instantaneamente por DNA polimerases. Quais mecanismos existem para corrigir os erros de replicação que são perdidos pela função de leitura de prova das polimerases de DNA.

Os erros que escorregam durante a revisão durante a replicação podem ser corrigidos por um mecanismo denominado reparo de incompatibilidade. Embora a taxa de erro de replicação do DNA seja de cerca de um em (10 ​​^ 7 ) nucleotídeos na ausência de reparo de incompatibilidade, isso é reduzido ainda mais cem vezes para um em ) 10 ^ 9 ) nucleotídeos quando o reparo de incompatibilidade é funcional .

Quais são as tarefas que um sistema de reparo de incompatibilidade enfrenta. Isso deve:

  • Faça a varredura do DNA recém-feito para ver se há alguma base com pareamento incorreto (por exemplo, um G emparelhado com um T)
  • Identifique e elimine a região da incompatibilidade.
  • Preencha corretamente a lacuna criada pela excisão da região de incompatibilidade.

É importante ressaltar que o sistema de reparo de incompatibilidade deve ter um meio de distinguir a fita de DNA recém-feita da fita modelo, se os erros de replicação devem ser corrigidos corretamente. Em outras palavras, quando o sistema de reparo de incompatibilidade encontra um pareamento incorreto A-G, por exemplo, ele deve saber se o A deve ser removido e substituído por um C ou se o G deve ser removido e substituído por um T.

O reparo de incompatibilidade foi bem estudado em bactérias e as proteínas envolvidas foram identificadas. Os eucariotos têm um sistema de reparo de incompatibilidade que repara não apenas incompatibilidades de base única, mas também inserções e deleções. Nas bactérias, as proteínas de reparo de incompatibilidade são codificadas por um grupo de genes conhecidos coletivamente como genes mut. Alguns dos componentes mais importantes da maquinaria de reparo de incompatibilidade são as proteínas MutS, L e H. MutS atua para reconhecer a incompatibilidade, enquanto MutL e MutH são recrutados para o local de incompatibilidade pela ligação de Mut S, para ajudar a cortar a região contendo a incompatibilidade. A DNA polimerase e a ligase preenchem a lacuna e unem as extremidades, respectivamente.

Mas como o sistema de reparo de incompatibilidade distingue entre a fita original e a nova fita de DNA? Em bactérias, a existência de um sistema que metila o DNA nas sequências do GATC é a solução para esse problema. E.coli possui uma enzima que adiciona grupos metila nas adeninas nas sequências GATC. O DNA recém-replicado carece dessa metilação e, portanto, pode ser distinguido da fita molde, que é metilada. Na Figura ( PageIndex {2} ), a fita modelo mostrada em amarelo é metilada nas sequências GATC. As proteínas de reparo de incompatibilidade substituem seletivamente a fita sem metilação, mostrada em azul na figura, garantindo assim que haja erros na fita recém-feita que são removidos e substituídos. Como a metilação é o critério que permite ao sistema de reparo de incompatibilidade escolher a fita a ser reparada, o sistema de reparo de incompatibilidade bacteriana é descrito como sendo dirigido por metil.

As células eucarióticas não usam esse mecanismo para distinguir a nova fita do molde, e ainda não é compreendido como o sistema de reparo de incompatibilidade em eucariotos "sabe" qual fita reparar.

Sistemas para reparar danos ao DNA

Na seção anterior, discutimos os erros cometidos quando o DNA é copiado, onde a base errada é inserida durante a síntese da nova fita. Mas mesmo o DNA que não está sendo replicado pode ser danificado ou sofrer mutação. Esses tipos de danos não estão associados à replicação do DNA, mas podem ocorrer a qualquer momento.

O que causa danos ao DNA? Algumas das principais causas de danos ao DNA são:

  • Radiação (por exemplo, raios ultravioleta na luz solar, em cabines de bronzeamento)
  • Exposição a produtos químicos prejudiciais (como benzopireno no escapamento de automóveis e fumaça de cigarro)
  • Reações químicas dentro da célula (como a desaminação da citosina para dar uracila).

Isso significa que o DNA em suas células é vulnerável a danos simplesmente de tipos normais de ações, como caminhar ao ar livre, estar no trânsito ou de transformações químicas que ocorrem em cada célula como parte de suas atividades diárias. (Naturalmente, o dano é muito pior em situações em que a exposição à radiação ou a produtos químicos prejudiciais é maior, como quando as pessoas usam camas de bronzeamento ou fumaça repetidamente.)

Que tipo de dano esses agentes causam? A radiação pode causar diferentes tipos de danos ao DNA. Às vezes, como acontece com muitos dos danos causados ​​pelos raios ultravioleta, duas bases pirimidinas adjacentes no DNA serão reticuladas para formar dímeros de pirimidina (observe que estamos falando de duas bases pirimidinas vizinhas na mesma fita de DNA). Isso é ilustrado na figura da página anterior, onde duas timinas adjacentes em uma única fita de DNA são reticuladas para formar um dímero de timina. A radiação também pode causar rupturas na estrutura do DNA.

Produtos químicos como o benzopireno podem se ligar a bases, formando adutos volumosos de DNA, nos quais grandes grupos químicos estão ligados a bases no DNA. A formação de adutos químicos pode distorcer fisicamente a hélice do DNA, tornando difícil para as polimerases de DNA e RNA copiar essas regiões do DNA.

As reações químicas que ocorrem dentro das células podem fazer com que as citosinas no DNA sejam desaminadas em uracila, conforme mostrado na Figura ( PageIndex {3} ).

Outros tipos de danos nesta categoria incluem a formação de bases oxidadas como 8-oxo-guanina. Na verdade, eles não mudam a estrutura física da hélice do DNA, mas podem causar problemas porque o uracila e a 8-oxo-guanina se combinam com bases diferentes da citosina ou guanina original, levando a mutações na próxima rodada de replicação.

Como as células reparam esses danos? As células têm várias maneiras de remover os tipos de danos descritos acima, sendo o reparo por excisão uma estratégia comum. O reparo por excisão é um termo geral para o corte e a ressíntese da região danificada do DNA. Existem algumas variedades de reparo por excisão:

Reparo de excisão de nucleotídeo (NER)

Este sistema corrige danos por produtos químicos, bem como danos UV. Conforme mostrado na figura da página anterior, no reparo por excisão de nucleotídeos, o dano é reconhecido e um corte é feito em ambos os lados da região danificada por uma enzima chamada excinuclease (mostrada em verde). Uma pequena porção da fita de DNA contendo o dano é então removida e uma DNA polimerase preenche a lacuna com os nucleotídeos apropriados. O DNA recém-feito é unido ao resto da estrutura do DNA pela enzima DNA ligase. Em E. coli, o NER é realizado por um grupo de proteínas codificadas pelos genes uvrABC. Como você pode ver, o NER é semelhante, em princípio, ao reparo de incompatibilidade. No entanto, no NER, a distorção da hélice, causada pelo dano ao DNA, indica claramente qual fita do DNA precisa ser removida e substituída.

Reparo de excisão de base (BER)

BER lida com situações como a desaminação de citosina em uracila. Como observado anteriormente, as citosinas no DNA às vezes sofrem desaminação para formar a base de uracila.

Como as citosinas emparelham-se com guaninas e os uracilos emparelham-se com adenina, a conversão de citosina em uracila no DNA levaria à inserção de um A na fita recém-replicada em vez do G que deveria ter atravessado a partir de um C. Para evitar isso de acontecer, os uracilos são removidos do DNA por reparo de excisão de base.

No reparo por excisão de base, uma única base é primeiro removida do DNA, seguida pela remoção de uma região do DNA ao redor da base ausente. A lacuna é então reparada.

A remoção do uracil do DNA é realizada pela enzima uracil DNA glicosilase, que quebra a ligação entre o uracil e o açúcar do nucleotídeo.

A remoção da base do uracilo cria uma lacuna denominada sítio apirimidínico (sítio AP). A presença do sítio AP desencadeia a atividade de uma endonuclease AP que corta a estrutura do DNA.

Uma curta região do DNA ao redor do local do uracil original é então removida e substituída.


Biologia Molecular Celular

S. Sharma, S.C. Raghavan, em Encyclopedia of Cell Biology, 2016

Resumo

Manter a integridade genômica é fundamental para a sobrevivência de um organismo. Entre os diferentes danos ao DNA, as quebras de fita dupla (DSBs) são consideradas as mais deletérias, pois podem levar à morte celular se não forem reparadas ou a rearranjos cromossômicos quando mal reparados, levando ao câncer. A junção da extremidade do DNA não homólogo (NHEJ) e a recombinação homóloga (HR) são as principais vias de reparo de DSB em eucariotos superiores. Sendo um mecanismo preciso, o HR usa homologia extensa, enquanto o NHEJ é sujeito a erros, uma vez que não utiliza homologia ou utiliza homologia limitada. NHEJ é um mecanismo de solução rápida e opera em todo o ciclo celular. Durante o NHEJ, o heterodímero da proteína KU é recrutado para as extremidades do DNA, seguido por DNA-PKcs em associação com ARTEMIS, que processa DSBs. Pol μ e / ou λ preenche essas extremidades, quando necessário, seguido pela ligação usando o complexo XLF – XRCC4 – DNA Ligase IV. Outra via de reparo conhecida como NHEJ alternativo (A-NHEJ) ou NHEJ de backup repara os DSBs quando as proteínas-chave responsáveis ​​pelo NHEJ clássico estão ausentes ou com defeito. A escolha da via de reparo DSB entre NHEJ e HR depende do ciclo celular, da ressecção final e da estrutura final do DSB, que ativam vários sensores de danos ao DNA. Recentemente, foi demonstrado que a desregulação do reparo DSB representa uma ameaça à integridade genômica e, portanto, pode ser usada como um alvo terapêutico no tratamento do câncer.


O cGAS nuclear suprime o reparo do DNA e promove a tumorigênese

O reparo preciso de quebras de fita dupla de DNA por recombinação homóloga preserva a integridade do genoma e inibe a tumorigênese. GMP-AMP sintase cíclica (cGAS) é um sensor de DNA citosólico que ativa a imunidade inata ao iniciar a cascata de sinalização de IFN tipo I de STING-IRF3 1,2. O reconhecimento de micronúcleos rompidos por cGAS liga a instabilidade do genoma à resposta imune inata 3,4, mas o envolvimento potencial de cGAS no reparo do DNA permanece desconhecido. Aqui, demonstramos que cGAS inibe a recombinação homóloga em modelos de camundongos e humanos. O dano ao DNA induz a translocação nuclear de cGAS de uma maneira que é dependente de importina-α, e a fosforilação de cGAS na tirosina 215 mediada pela tirosina quinase linfóide B - facilita a retenção citosólica de cGAS. No núcleo, cGAS é recrutado para quebras de fita dupla e interage com PARP1 via poli (ADP-ribose). A interação cGAS-PARP1 impede a formação do complexo PARP1-Atemporal e, assim, suprime a recombinação homóloga. Nós mostramos que o knockdown de cGAS suprime os danos ao DNA e inibe o crescimento do tumor in vitro e in vivo. Concluímos que o cGAS nuclear suprime o reparo mediado por recombinação homóloga e promove o crescimento do tumor, e que o cGAS, portanto, representa um alvo potencial para a prevenção e terapia do câncer.


Replicação de DNA: notas sobre replicação, reparo e recombinação de DNA

A replicação do DNA é uma função autocatalítica do DNA. Geralmente ocorre durante a fase S do ciclo celular, quando os cromossomos estão em uma forma altamente estendida. Conforme proposto por Watson e Crick, a replicação do DNA é semiconservadora.

Na replicação semiconservativa, as duas fitas se separariam, manteriam sua integridade e cada uma sintetizaria, a partir do pool de nucleotídeos, sua fita complementar. O resultado seria que a molécula recém-sintetizada carregaria ou conservaria uma das duas fitas da molécula-mãe e a outra fita seria novamente montada. Existem evidências suficientes para provar que o DNA de fita dupla realmente se replica pelo método semiconservador.

Meselson e Stahl & # 8217s Experiment (1958):

Esses trabalhadores cultivaram Escherichia coli em um meio contendo 15 N isótopos. Depois que estes se replicaram por algumas gerações naquele meio, ambas as fitas desse DNA continham 15 N como constituintes de purinas e pirimidinas. Quando essas bactérias com 15 N foram transferidas para um meio de cultura contendo 14 N, verificou-se que o DNA separado da nova geração de bactérias possui uma fita mais pesada que a outra.

A fita mais pesada representa a fita parental e a mais leve é ​​a nova sintetizada a partir do meio de cultura, indicando assim o método semiconservador de replicação de DNA e excluindo e afastando modelos conservadores e dispersivos de síntese e replicação de DNA.

A réplica e a inibição conservadoras não produziriam nenhuma molécula de DNA com uma constituição & # 8220híbrida & # 8221. Se a replicação fosse dispersa e tímida, haveria uma mudança no DNA de & # 8220pesado para & # 8220light & # 8221 em cada geração.

Estudos subsequentes verificaram a conclusão de Meselson e Stahl & # 8217 de que a replicação do DNA é semiconservadora e a estenderam a muitos outros organismos, incluindo plantas superiores e animais.

Experiência de autoradiografia Cairn & # 8217s:

Ele usou timina radioativa ou timidina tritiada. Ao cultivar E. coli em um meio de cultura contendo timidina tritiada, a radioatividade foi incorporada nas moléculas de DNA filhas.

Na autorradiografia, a duplicação da molécula de DNA mostra um garfo replicador e tímido, o ponto em que duas cadeias se transformam em quatro. Após a primeira replicação, a radioatividade é vista como incorporada em apenas uma das fitas de DNA e ambas as fitas são marcadas após a segunda replicação. Isso suporta os modos semi-con & shyservative de replicação de DNA.

J.H. Taylor & # 8217s experimentos em pontas de raízes de Viciafaba (1957) também confirmam o método semiconservador de replicação de DNA.

eu. Replicação descontínua de DNA:

Okazaki sugeriu que a síntese de DNA prossegue simultaneamente em ambas as fitas de DNA, utilizando a mesma enzima DNA poli & shymerase na forma de pequenos fragmentos isolados. Esses segmentos são conhecidos como peças de Okazaki e consistem em 1000-2000 nucleotídeos. Estes são unidos pela enzima polinucleotídeo ligase, completando a formação da cadeia polinucleotídica e shiotídica.

A síntese descontínua de DNA é apoiada por experimentos auto-radiográficos.

ii. Replicação unidirecional e bidirecional de DNA:

J. Cairns, a partir de seus experimentos, concluiu que a síntese de DNA começa em um ponto fixo nos cromossomos e prossegue em uma direção, mas experimentos recentes sugerem réplica bidirecional e timidez.

Levinthal e Cairns propuseram que, durante a replicação, as duas fitas não se separassem completamente antes da replicação. Em vez disso, eles começam a descompactar em uma extremidade e, simultaneamente, os segmentos descompactados começam a atrair seus pares de nucleotídeos. Desta forma, a descompactação das fitas originais de DNA e a síntese de novas fitas de DNA acontecem lado a lado.

DNA polimerase:

A DNA polimerase é a principal enzima da replicação do DNA. Sua atividade foi demonstrada pela primeira vez por Kornberg em 1956. Catalisa a adição covalente de desoxirribonucleotídeos ao 3 & # 8242-OH de um nucleotídeo pré-existente denominado primer.

A enzima DNA polimerase-1 é agora considerada uma enzima de reparo de DNA, em vez de uma enzima de replicação. Esta enzima é conhecida por ter cinco locais ativos, a saber, local do modelo, local do primer, 5 & # 8217— & gt3 & # 8242 local de clivagem ou exonuclease, local de trifosfato de nucleosídeo e 3 & # 8217— & gt5 & # 8242 local de clivagem (ou 3 & # 8217— & gt5 & # Local de exonuclease 8242).

DNA polimerase I:

Está principalmente envolvido na remoção de primers de RNA de Okazaki ou fragmentos precursores e no preenchimento das lacunas resultantes devido à sua capacidade de polimerização 5 & # 8217— & gt3 & # 8242. A enzima DNA polimerase I também pode remover dímeros de timina produzidos devido à irradiação UV e preencher a lacuna devido à excisão. Isso é chamado de leitura de prova ou função de edição desta enzima.

DNA polimerase-II:

Esta enzima se assemelha à DNA polimerase-I em sua atividade, mas é uma enzima de reparo de DNA e provoca o crescimento na direção 5 & # 8217— & gt 3 & # 8242, usando grupos 3 & # 8242-OH livres.

DNA polimerase III:

Ele desempenha um papel essencial na replicação do DNA. É uma enzima multimérica ou holoenzima com dez subunidades, tais como α, β, ε, θ, г, y, δ, δ & # 8217, x e Ψ. Todas essas dez subunidades são necessárias para a replicação do DNA in vitro, no entanto, todas com funções diferentes. Por exemplo, a subunidade α tem 3 & # 8217— & gt5 & # 8242 atividade de revisão ou edição de exonuclease. A enzima central compreende três subunidades - α, β e θ. As sete subunidades restantes aumentam a processabilidade (processividade significa rapidez e eficiência com a qual uma DNA polimerase estende a cadeia de crescimento).

DNA polimerase eucariótica:

Os yotes Eukai (por exemplo, levedura, fígado de rato, células tumorais humanas) são encontrados para conter os seguintes cinco tipos de DNA polimerases:

(i) DNA polimerase α:

Esta enzima de peso molecular relativamente alto também é chamada de polimerase citoplasmática ou polimerase grande. É encontrada tanto no núcleo quanto no citoplasma.

Esta enzima também é chamada de polimerase nuclear ou pequena polimerase e é encontrada apenas em vertebrados.

Esta enzima é chamada de polimerase mitocondrial e é codificada no núcleo.

Esta enzima é encontrada em células de mamíferos e é dependente de PCNA para a processabilidade de síntese de DNA (PCNA = antígeno nuclear de proliferação celular).

Era anteriormente conhecido como DNA polimerase 5II. Esta enzima é independente do PCNA e ocorre em células HeLa de mamíferos e em leveduras de brotamento.

A grande DNA polimerase a é a enzima DNA polimerase predominante nas células eucarióticas e por muito tempo se acreditou ser a única enzima envolvida na replicação do DNA. Mas agora mais uma polimerase, a saber, a DNA polimerase 8, também está envolvida na replicação do DNA eucariótico.

Primers de DNA:

Essas enzimas catalisam a síntese de primers de RNA, que são um pré-requisito para o início da replicação do DNA na grande maioria dos organismos. Antes do início da replicação real do DNA, segmentos curtos de oligonucleotídeos de RNA, chamados primers de RNA ou simplesmente os primers, devem ser sintetizados pela enzima DNA primase utilizando trifosfatos de ribonucleosídeos.

Este primer de RNA é sintetizado pela cópia de uma sequência de bases particular de uma fita de DNA e difere de uma molécula de RNA típica porque, após a síntese, o primer permanece ligado por hidrogênio ao molde de DNA.

Os primers têm cerca de 10 nucleotídeos de comprimento nos eucariotos e são feitos em intervalos na fita posterior, onde são alongados pela enzima DNA polimerase para iniciar cada fragmento de okazaki. Esses primers de RNA são posteriormente excisados ​​e preenchidos com DNA com a ajuda do sistema de reparo de DNA em eucariotos.

Em bactérias, duas enzimas diferentes são conhecidas por sintetizar oligonucleotídeos de RNA primer & # 8211 RNA polimerase (na fita principal) e DNA primase (na fita retardada).

Polinucleotídeo Ligase:

Esta enzima é uma enzima importante tanto na replicação quanto no reparo do DNA. A DNA ligase catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre o grupo 5 & # 8242-fosforil de um nucleotídeo e o grupo 3-OH do vizinho imediato ao lado de um corte em uma fita de DNA, portanto, sela os cortes em uma fita de DNA.

As endonucleases, particularmente as endonucleases de restrição, também são importantes durante a replicação do DNA, bem como o reparo do DNA. Durante a replicação do DNA, uma endounclease pode produzir um corte na origem para iniciar a replicação ou pode induzir cortes para gerar um swivel para facilitar o desenrolamento do DNA.

Enzimas envolvidas na abertura da hélice de DNA:

As helicases de DNA são enzimas de desenrolamento dependentes de ATP que promovem a separação das duas fitas parentais e estabelecem bifurcações de replicação que se afastam progressivamente da origem. O desenrolamento da hélice de DNA molde em uma forquilha de replicação poderia, em princípio, ser catalisado por duas helicases de DNA, agindo em conjunto, uma correndo ao longo da fita principal e a outra ao longo da fita final.

Hélice de fita desestabilizadora (também chamada de proteínas de ligação ao DNA de fita simples ou SSBPs):

Atrás da bifurcação de replicação, as fitas simples de DNA são impedidas de se enrolarem umas nas outras (ou formarem laços de grampo de cabelo de fita dupla em cada fita simples) pela ação das proteínas SSB. As proteínas SSB ligam-se aos filamentos expostos do DNA sem cobrir as bases, que, portanto, permanecem disponíveis para o processo de modelagem.

Topoisomerases (girases de DNA):

A ação de uma helicase introduz uma supercoil positiva no DNA duplex antes da bifurcação de replicação. Enzimas, chamadas topoisomerases, relaxam o superenrolamento ligando-se ao duplex transitoriamente superenrolado, cortando uma das fitas e girando-a através da fita contínua. O nick é então selado novamente.

Um tipo de topoisomerase (ou seja, topoisomerase I) causa uma quebra de fita simples ou entalhe que permite que as duas seções da hélice de DNA em cada lado do entalhe girem livremente entre si, usando a ligação fosfodiéster na fita oposta ao entalhe como um ponto giratório. Um segundo tipo de topoisomerase (isto é, topoisomerase II) forma uma ligação covalente a ambas as fitas da hélice de DNA ao mesmo tempo, fazendo a quebra da fita dupla transitória na hélice.

Um replicon é a unidade de DNA na qual ocorrem atos individuais de replicação, ou seja, é capaz de replicação de DNA independente de outros segmentos de DNA. Portanto, cada replicon tem uma origem na qual a replicação é iniciada e pode ter um término no qual a replicação é interrompida.

Os cromossomos bacterianos e virais geralmente contêm um único replicon / cromossomo. Embora o fago T, tenha duas origens, uma primária e outra secundária, mas na presença de origem primária a origem secundária é, via de regra, não funcional. Em E. coli, o ponto de origem é identificado como locus genético oriC.

Uma origem procariótica completa suporta as seguintes três funções: (1) iniciação da replicação, (2) controle da frequência dos eventos de iniciação e (3) a segregação dos cromossomos replicados nas células filhas.

As origens foram identificadas em bactérias, leveduras, cloroplastos e mitocôndrias, sua característica geral significativa é que são ricos em A: T, o que pode ser importante para facilitar o desenrolamento durante a replicação. A origem bacteriana contém muitos locais curtos diferentes (& lt 10 bp) que são necessários para sua função, esses locais às vezes são separados por distâncias específicas, mas não por sequências específicas. Esses locais especificamente localizados são necessários para a ligação de diferentes proteínas envolvidas na replicação do DNA.

Vários replicons procarióticos têm locais específicos, chamados terminais, que interrompem o movimento do garfo de replicação e, portanto, encerram a replicação do DNA. O cromossomo de E. coli tem dois terminais, chamados T1 e T2 localizado a cerca de 100 Kb em cada lado do ponto onde os garfos de replicação se encontrariam. Cada terminal é específico para uma direção do movimento do garfo.

O T1 e T2 são organizadas de tal forma que cada bifurcação deve passar pela outra para alcançar o término específico a ela. A terminação da replicação requer o produto do gene tus, que provavelmente codifica para uma proteína que reconhece T e T2.

Em eucariotos, cada cromossomo tem vários replicons (por exemplo, levedura, 500 Drosophila, 3.500 camundongos 25.000 Viciafaba, 35.000). Em qualquer ponto durante a fase S, apenas alguns desses replicons sofrem replicação, cada replicon parece ser ativado em um momento específico em uma sequência específica. O comprimento de um replicon eucariótico pode variar de 40 Kb em levedura e Drosophila a cerca de 300 Kb em Vicia.

O número de replicons detectáveis ​​parece variar com o estágio de desenvolvimento e o tipo de célula ou tecido. Isso é explicado com base nas origens específicas do tecido, de modo que algumas origens são ativas em alguns tecidos, enquanto outras são ativas em alguns outros tecidos.

Isso é exemplificado pela Drosophila, onde as células embrionárias iniciais têm 10 vezes mais replicons do que as células somáticas adultas. A evidência disponível sugere que os replicons eucarióticos não têm terminais.

Fidelidade de replicação:

A taxa de erro da replicação do DNA é muito menor do que a da transcrição devido à necessidade de preservar o significado da mensagem genética de uma geração para a seguinte. Por exemplo, a taxa de mutação espontânea em E. coli é de cerca de um erro por 1010 bases incorporadas durante a replicação.

Isto é devido principalmente à presença das formas tautoméricas menores das bases que têm propriedades de emparelhamento de bases alteradas. A taxa de erro é minimizada por uma variedade de mecanismos. As DNA polimerases só incorporarão um nucleotídeo de entrada se formar o par de bases correto com o nucleotídeo molde em seu sítio ativo.

O erro ocasional é detectado pela exonuclease de revisão 3 & # 8217— & gt5 & # 8242 associada à polimerase. Isso remove o nucleotídeo incorreto da extremidade 3 e # 8242 antes de qualquer incorporação adicional, permitindo que a polimerase insira a base correta. Para que a exonuclease de revisão funcione corretamente, ela deve ser capaz de distinguir um par de bases correto de um incorreto.

A maior mobilidade dos pares de bases & # 8216não ancorados & # 8217 na extremidade 5 & # 8242 dos fragmentos de fita de DNA recém-iniciados significa que eles nunca podem parecer corretos e, portanto, não podem ser revisados. Conseqüentemente, os primeiros poucos nucleotídeos são ribonucleotídeos (RNA), de modo que subsequentemente podem ser identificados como material de baixa fidelidade e substituídos por DNA alongado (e revisado) do fragmento adjacente. Os erros que escapam à revisão são corrigidos por um mecanismo de reparo de incompatibilidade.

Mecanismo de replicação de DNA em procariontes:

A replicação de DNA in vitro foi extensivamente estudada em E. coli e nos fagos e plasmídeos de E. coli. Em E. coli, o processo de replicação do DNA envolve as seguintes três etapas principais:

1. Início da replicação do DNA:

Este processo compreende três etapas: (i) reconhecimento da origem (O), (ii) abertura do duplex de DNA para gerar uma região de DNA de fita simples e (iii) captura da proteína Dna B (ou seja, 5 & # 8242 3 & # 8242 helicase também atua como o ativador de primase). Assim, o complexo Dna-A (ou proteína iniciadora) ATP se liga a regiões de repetição invertida de 9 bp (R ,, R ,, Rv R4) de ori C de E. coli e promove a abertura do duplex de DNA em uma região de três repetições diretas da sequência de 13 pb (denominadas 13-meros).

A abertura ocorre do 13-mer direito para a esquerda e requer DNA superenrolado negativamente e proteínas iniciadoras HU ou IHF. O DNA B (-helicase) é transferido para o DNA de fita simples exposto e causa o desenrolamento do DNA na presença de A TP, proteína SSB e DNA girase (uma topoisomerase).

Isso resulta no desenrolamento do duplex de DNA e a replicação de ori C prossegue em ambas as direções (bidirecional). A ligação de SSB ocorre em regiões de fita simples e dois complexos de Dna B (= primosomes) são carregados um em cada fita.

2. Alongamento da cadeia de DNA:

Esta etapa requer a presença das seguintes enzimas e fatores: 1. Dna B ou helicase (também chamado de promotor móvel) 2. primase (Dna G) 3. Holoenzima da DNA polimerase (ou DNA pol III HE) 4. Proteína SSB 5. RNAase H que remove os primers de RNA 6. DNA polimerase I que é usada para preencher a lacuna criada devido aos primers de RNA e 7. DNA ligase (que converte fragmentos de okazaki sem primer em fita contínua). Durante a transição de iniciação para alongamento, os seguintes eventos ocorrem:

(i) Conforme a helicase (ou Dna B) viaja na direção 5 & # 8242 - & gt 3 & # 8242, ela gera uma bifurcação de replicação ao abrir o duplex de DNA.

(ii) A fita de DNA com helicase torna-se a fita retardada. DNA primase associa-se à helicase Dna B, formando o primossoma que sintetiza múltiplos primers para a fita retardada e primer de RNA único para a fita principal.

(iii) Para a síntese da fita retardada, o DNA pol III HE tem que trabalhar na mesma fita à qual a helicase Dna B está ligada, mas viaja na direção oposta.

(iii) DnaB helicase, Dna Gprimase e DNA pol III FIE trabalham juntos no alongamento da fita. A montagem da helicase e da DNA polimerase permanece processiva, ou seja, elas permanecem fortemente ligadas ao garfo e permanecem ligadas durante toda a reação.

Síntese (- alongamento) de fios posteriores e principais ocorre por métodos um tanto diferentes, é muito mais complexa para o fio retardado do que para o fio principal:

(UMA) Síntese descontínua na fita em atraso:

1. A primase é retirada da solução e é ativada pela helicase (DnaB) para sintetizar o primer aRNA (10 a 20 nt ou nucleotídeos de comprimento) na fita retardada.

2. Os primers de RNA são reconhecidos por DNA pol III HE na fita retardada e são utilizados para a síntese de precursores ou fragmentos de okazaki. Na verdade, cada novo primer de RNA é reconhecido pela subunidade gama (y) do DNA pol III HE e carregado com a subunidade p da mesma polimerase. Essa subunidade p pré-carregada pode então capturar o núcleo do DNA poli III HE quando ele se torna disponível após terminar seu trabalho sintético no fragmento de okazaki anterior.

3. Após a conclusão dos fragmentos de okazaki, os primers de RNA são excisados ​​pela DNA polimerase 1, que então preenche as lacunas resultantes com DNA.

4. Após a DNA polimerase I adicionar os desoxirribonucleotídeos finais na lacuna deixada pelo primer excisado, a enzima DNA ligase forma a ligação fosfodiéster que liga a extremidade livre 3 & # 8242 da substituição do primer à extremidade 5 & # 8242 do fragmento de okazaki.

(B) Síntese contínua na fita principal:

1. Na replicação bidirecional do DNA, a fita principal é iniciada uma vez em cada uma das fitas parentais.

2. O primer de RNA da fita principal é sintetizado pela enzima RNA polimerase.

3. O DNA pol III HE causa o alongamento da fita principal e, finalmente, a DNA pol 1 e as enzimas ligase dão o toque final à fita principal, como no caso da fita retardada.

Replicação de DNA em eucariotos:

A replicação do DNA eucariótico requer duas enzimas diferentes da DNA polimerase, a saber, DNA polimerase a e DNA polimerase δ. A DNA polimerase δ sintetiza o DNA na fita principal (síntese contínua de DNA), enquanto a DNA polimerase a sintetiza o DNA na fita final (síntese descontínua de DNA). Além dessas duas enzimas, replicação de DNA: (1) antígeno T (2) fator de replicação A ou RF-A (também chamado de RP-A ou SSB eucariótico) (3) topoisomerase I (4) topoisomerase II (5) proliferando & # 8211 antígeno nuclear celular (PCNA, também chamado de ciclina) e (6) fator de replicação Cor RF-C.

O processo de replicação do DNA eucariótico envolve as seguintes etapas:

1. Antes do início da síntese de DNA, há um estágio pré-sintético de 8 a 10 minutos de duração para a formação do complexo de DNA desenrolado. Esta etapa precisa de apenas três proteínas purificadas, a saber, antígeno T (T-ag ou antígeno tumoral), RF-A e topiosomerases I e II.

2. O antígeno T, usando seu domínio de ligação ao DNA, forma um complexo de múltiplas subunidades com o local I e ​​o local II na presença de A TP e causou o desenrolamento local.

3. O desenrolamento duplex mais extenso ocorre devido à associação de RF-A e uma topoisomerase com & # 8211 com a ajuda do componente helicase do DNA de T-ago Topoisomerases ajudam no desenrolamento do DNA alterando a topologia do DNA na forquilha de replicação.

4. As proteínas RF-A ou SSB ligam-se ao DNA de fita simples desenrolado.

5. A síntese de RNA primer é realizada por primase, que está fortemente associada à DNA polimerase ex.

6. A DNA polimerase a ajuda na síntese de um fragmento de okazaki na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242.

7. O fator de replicação C (ou RF-C) e o PCNA (ciclina) ajudam na troca de polimerases de DNA de modo que pol a seja substituído por pol 5, que então sintetiza continuamente o DNA na fita principal.

8. Outro fragmento de okazaki é então sintetizado a partir do garfo de replicação na fita retardada pelo complexo pol a & # 8211 primase e esta etapa é repetida várias vezes, até que toda a molécula de DNA seja coberta.

9. Os primers de RNA são removidos e as lacunas são preenchidas como na replicação do DNA procariótico.

Recentemente, o papel da DNA polimerase e na replicação do DNA foi enfatizado, de modo que três DNA polimerases (a, δ e ε) são agora conhecidas por estarem envolvidas na replicação do DNA eucariótico. A. Sugino e colegas de trabalho propuseram que a DNA polimerase a pode funcionar tanto nas fitas principais quanto nas fitas posteriores (uma vez que a polimerase a tem atividade α primase), enquanto a polimerase e e a polimerase 5 estão envolvidas no alongamento das fitas principais e posteriores, respectivamente.

Mecanismo de dano e reparo de DNA

1. Lesões de DNA:

Uma alteração na estrutura química ou física normal do DNA é chamada de lesões de DNA. Muitos agentes exógenos, como produtos químicos e radiação, podem causar mudanças nas posições dos átomos de nitrogênio e carbono nos sistemas de anéis heterocíclicos das bases e alguns dos grupos funcionais exocíclicos (isto é, os grupos ceto e amino das bases).

Isto pode levar à perda de emparelhamento de base ou emparelhamento de base alterado (por exemplo, um A alterado pode emparelhar com C em vez de T). Se essa lesão permanecer no DNA, uma mutação pode se fixar no DNA por mutagênese direta ou indireta.

Alternativamente, a mudança química pode produzir uma distorção física no DNA que bloqueia a replicação e / ou transcrição, causando e evitando a morte celular. Assim, as lesões de DNA podem ser mutagênicas e / ou letais. Algumas lesões são espontâneas e tímidas e ocorrem devido à reatividade química inerente do DNA e à presença de espécies químicas reativas normais dentro da célula.

Por exemplo, a base citosina sofre desaminação hidrolítica espontânea para dar uracila. Se não for reparado, o uracilo resultante formará um par de bases com a adenina durante a replicação subsequente, dando origem a uma mutação pontual. A despurinação é outra reação hidrolítica espontânea que envolve a clivagem da ligação N-glicosílica entre N-9 das bases purinas A e G e C-1 & # 8217 do açúcar desoxirribose e, portanto, perda das bases purinas do DNA. A estrutura de açúcar-fosfato do DNA permanece intacta. O sítio apurínico resultante é uma lesão não codificadora, pois a informação codificada nas bases purinas é perdida.

2. Dano oxidativo:

Isso ocorre em condições normais devido à presença de espécies reativas de oxigênio e oxigênio (ROS) em todas as células aeróbicas, por exemplo, superóxido, peróxido de hidrogênio e, o mais importante, o radical hidroxila (OH). Este radical pode atacar o DNA, I em vários pontos, produzindo uma gama de produtos de oxidação com propriedades II alteradas, por exemplo 8-oxoguanina, 2-oxoadenina e 5-formiluracil. Os níveis destes podem ser aumentados pelos radicais hidroxila da radiólise da água causada pela radiação ionizante.

3. Alquilação:

Os agentes alquilantes são produtos químicos eletrofílicos que adicionam prontamente grupos alquil (por exemplo, metil) a várias posições em ácidos nucléicos distintos daqueles metilados por enzimas de metilação normais. Exemplos comuns são metilmetanossulfonato (MMS) e etilnitrosoureia (ENU).

Exemplos típicos de bases metiladas são 7-metilguanina, 3-metil-adenina, 3-metilguanina e 0 6 -metilguanina. Algumas dessas lesões são potencialmente letais, pois podem interferir no desenrolamento do DNA durante a replicação e a transcrição. A maioria também é indiferentemente mutagênica; entretanto, 0 6 -metilguanina é uma lesão diretamente mutagênica, pois pode emparelhar com a timina durante a replicação.

4. Adutos volumosos:

Dímeros de ciclobutano pirimidina são formados por luz ultravioleta de pirimidinas adjacentes em uma fita por ciclização dos átomos de carbono C5 e C6 de ligação dupla de cada base para dar um anel ciclobutano. A perda resultante do emparelhamento de bases com a fita oposta causa desnaturação localizada do DNA, produzindo uma lesão volumosa que interromperia a replicação e a transcrição. Outro tipo de dímero de pirimidina, o fotoproduto 6,4, resulta da formação de uma ligação entre C6 de uma base pirimidina e C4 da base adjacente.

Quando o carcinógeno do alcatrão de carvão benzo [a] pireno é metabolizado pelo citocromo P-450 no fígado, um de seus metabólitos (um diol epóxido) pode se ligar covalentemente ao grupo 2-amino dos resíduos de guanina. Muitos outros agentes de arilação aromáticos formam adutos covalentes com o DNA. O carcinógeno hepático aflatoxina B, também se liga covalentemente ao DNA.

Reparo de DNA:

Os sistemas de reparo reconhecem uma variedade de mudanças no DNA para iniciar a ação. Uma célula pode ter vários sistemas para lidar com danos ao DNA. Esses sistemas incluem o seguinte: (1) Reparo direto, (2) Reparo por excisão (3) Reparo incompatível, (4) Sistemas tolerantes e (5) Sistemas de recuperação.

1. Reparo direto:

A reversão ou simples remoção do dano ao DNA é conhecida como reparo direto, por exemplo, remoção das ligações covalentes entre os dois carbonos 4 e dois 5 dos dois resíduos de timina que participam na formação de dímeros de timina.

Dímeros de timina são geralmente formados devido à irradiação UV e interferem com a replicação e transcrição. Kelner (1949) observou que um grande número de bactérias poderia sobreviver a grandes doses de radiação UV se fossem expostas a uma fonte tímida de luz visível.

Este fenômeno é denominado fotoreativação.Posteriormente, foi demonstrado que, durante a irradiação UV, uma determinada enzima é seletivamente ligada ao DNA bacteriano. Durante o processo de fotoreativação, a enzima é ativada pela luz visível. Ele cliva os dímeros de timina, restaurando-os assim à sua forma original. Este processo de reparo é mediado por enzimas e dependente da luz.

2. Reparo de excisão:

Nesse mecanismo de reparo, o segmento danificado ou alterado do filamento de DNA é excisado e um novo fragmento de DNA é sintetizado e sintetizado em seu lugar. Embora os sistemas e tímidos de reparo por excisão variem em sua especificidade, a via principal envolve as três etapas a seguir:

(i) Reconhecimento e Incisão:

A seção danificada / alterada de uma fita de DNA é reconhecida por uma endonuclease, esta enzima então corta a fita afetada em ambos os lados do dano.

Uma exonuclease 5 & # 8242 & # 8211 & gt 3 & # 8242 (DNA polimerase I) digere a seção danificada / alterada, o que gera uma região de fita simples na dupla hélice do DNA.

Nesta etapa, a região de fita simples produzida por excisão serve como um molde para uma DNA polimerase que sintetiza a substituição do segmento excisado. A DNA ligase então sela o corte que permanece após a síntese da substituição para a seção excisada.

Em E. coli, a excisão é mais provavelmente devido à atividade de exonuclease 3 & # 8242 & # 8211 & gt 5 & # 8242 da DNA polimerase I, enquanto a síntese é realizada pela atividade da polimerase 5 & # 8242 & # 8211 & gt 3 & # 8242 da mesma enzima. Os sistemas de reparo por excisão são bastante comuns em procariotos e eucariotos. Alguns desses sistemas reconhecem danos gerais ao DNA, enquanto outros são muito específicos, por exemplo, as endonucleases AP removem os resíduos de ribose dos locais de depurinação. O reparo por excisão envolve diferentes comprimentos de DNA e é agrupado nas seguintes três classes:

(a) Reparo de patch muito curto (VSP):

Este sistema trata da reparação de desencontros entre bases específicas.

Nesse sistema, uma fita de DNA de cerca de 20 bases é excisada e os danos são reparados por meio de genes uvr (uvr, A, B, C, de E. coli), que codificam componentes de uma endonuclease de reparo. Outra enzima uvr D também é necessária para a atividade da helicase.

Este sistema envolve a excisão de segmentos de comprimento de cerca de 1500 bases, mas às vezes o segmento excisado pode ter & gt 9000 bases. É muito menos comum e deve ser induzido por danos que bloqueiam a replicação. Em E. coli, este sistema também envolve os genes uvr e a DNA polimerase I.

3. Reparo de incompatibilidade:

Envolve a correção de incompatibilidades ou emparelhamento entre bases que não são complementares. As incompatibilidades podem surgir (a) durante a replicação ou (b) devido a alterações de base (por exemplo, desaminação de citosina em uracila) e resulta em distorções estruturais na dupla hélice do DNA. Essas alternâncias são tratadas em E. coli pelo sistema de reparo por excisão de patch muito curto, que é descrito abaixo.

Sistema de reparo de incompatibilidade em E. coli:

Quando há uma incompatibilidade em um par de bases como em GC - & gt GT, então, teoricamente, pode se reparar para dar origem a um tipo selvagem (GC) ou a um tipo mutante (AT). Portanto, o sistema de reparo deve distinguir entre os fios novos e antigos e reparar apenas o novo para restaurar o tipo selvagem.

Isso é feito por um sistema de reparo por excisão muito curto e requer quatro proteínas, nomeadamente Mut L, Mut S, Mut U e Mut H codificadas em E. coli, respectivamente, pelos genes mut L, mut S, mut U e mut H. Os erros de incompatibilidade produzidos durante a replicação são corrigidos pelo sistema de reparo de barragens.

O gene dam de E. coli produz uma metilase que metilase a adenina da sequência GATC em ambas as fitas de DNA. A replicação de uma sequência GATC totalmente metilada produz uma sequência hemimetilada na qual os resíduos A nas novas cadeias sintetizadas são não metiladas.

O estado não metilado desta sequência alvo é usado para identificar a nova fita, as bases ao redor do local de incompatibilidade na nova fita são excisadas e uma substituição é sintetizada. O sistema envolve os produtos dos genes mut L, mut S, mut H e uvr D.

Reparos de sistemas de recuperação:

Esses sistemas também são conhecidos como & # 8216reparo pós-replicação & # 8217 ou & # 8216reparo de recombinação & # 8217. Em E. coli, este sistema de reparo é baseado no gene rec A, que produz a proteína Rec A. A proteína Rec A atua na troca de fitas entre moléculas de DNA durante a recombinação genética e também na troca de fita única durante o reparo de recombinação. Parece haver duas vias rec A, uma envolvendo os genes rec B, C e a outra envolvendo rec F.

Este sistema de reparo opera quando uma distorção estrutural bloqueia a replicação no local danificado. Por exemplo, mutantes de E. coli deficientes em reparo por excisão serão incapazes de remover dímeros de timina. Em tal situação, a replicação prossegue normalmente até os locais danificados, a DNA polimerase interrompe a replicação da fita afetada e reinicia a replicação, saltando para além do local danificado.

A fita complementar é replicada normalmente no local danificado na outra fita. Portanto, a replicação produz uma progênie normal da molécula de DNA e uma molécula com o dímero de timina em uma fita e uma longa lacuna em sua fita complementar. A molécula de DNA descendente com dímero de timina seria perdida, a menos que fosse reparada preenchendo a lacuna em uma de suas fitas.

Isso é conseguido por meio da troca de fita simples entre as duas moléculas de DNA da progênie, a região de troca preenche a lacuna e é induzida pela proteína Rec A. Como resultado dessa troca, a molécula de progênie normal tem uma região de fita simples que tem uma lacuna. Essa lacuna é corrigida pela síntese de DNA.

Esses sistemas lidam com os danos que bloqueiam a replicação normal no site danificado, possivelmente permitindo a replicação dos sites danificados com uma alta frequência de erros. Esses sistemas podem ser particularmente importantes nos eucariotos, onde o tamanho do genoma é muito grande e, portanto, um reparo completo do dano é bastante improvável.


Biologia Estrutural do Reparo de DNA: Organização Espacial dos Complexos Multicomponentes de Junção de Extremidade Não-homóloga

A união de extremidades não homólogas (NHEJ) desempenha um papel importante no reparo de quebra de DNA de fita dupla, que envolve uma série de etapas mediadas por complexos multiproteicos. Um heterodímero Ku70 / Ku80 em forma de anel se forma primeiro nas extremidades quebradas do DNA, a subunidade catalítica da proteína quinase dependente do DNA (DNA-PKcs) se liga para mediar a sinapsis e as nucleases processam as saliências do DNA. A DNA ligase IV (LigIV) é recrutada como um complexo com XRCC4 para ligação, com XLF / Cernunnos, desempenhando um papel no aumento da atividade de LigIV. Descrevemos como uma combinação de métodos - cristalografia de raios-X, microscopia eletrônica e espalhamento de raios-X de pequeno ângulo - pode fornecer insights sobre os complexos multicomponentes transitórios que medeiam o NHEJ. Primeiro, consideramos a organização do complexo DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA (DNA-PK) e, em seguida, discutimos as evidências emergentes sobre LigIV / XRCC4 / XLF / DNA e complexos de ordem superior. Concluímos discutindo os papéis dos sistemas multiproteicos na manutenção de alto sinal-ruído e o valor dos estudos estruturais no desenvolvimento de novas terapias em oncologia e em outros lugares.

1. Introdução

A união de extremidades não homólogas (NHEJ) e a recombinação homóloga (HR) compreendem os dois principais modos de reparo de quebra de fita dupla de DNA (DSB) em células humanas. Embora HR seja dominante nas fases S / G2 tardias, quando uma cromátide irmã está disponível [1], NHEJ, que não requer um modelo [2], desempenha um papel importante na fase G1 / fase S inicial [1]. Prevê-se que em humanos cerca de 50 DSBs endógenos por célula durante cada ciclo celular podem ocorrer [3]. Estes são gerados principalmente por radiação ionizante, espécies reativas de oxigênio e replicação de DNA através de um nick [2]. DSBs não reparados podem causar perda catastrófica de genes durante a divisão celular, levando a translocações cromossômicas, aumento das taxas de mutação e carcinogênese [4]. O sistema NHEJ também é responsável por DSBs programados em recombinação V (D) J [5] e recombinação de troca de classe [6] durante o desenvolvimento da diversidade imunológica. NHEJ tem uma via alternativa de união de extremidade, que é principalmente a união de extremidade mediada por microhomologia [7] e é independente dos componentes NHEJ [8]. Aqui, NHEJ implica a via principal de NHEJ.

A via do NHEJ compreende três etapas principais: sinapsis, processamento final e ligadura [9]. A sinapse é realizada por proteína quinase dependente de DNA (DNA-PK) que consiste em Ku70, Ku80, subunidade catalítica de DNA-PK (DNA-PKcs) e DNA. Ku70 e Ku80 formam um heterodímero em forma de anel em torno das extremidades quebradas do DNA e os mantêm próximos [10, 11]. DNA-PKcs, uma proteína muito grande pertencente à família da quinase relacionada à fosfatidilinositol-3-OH quinase (PI3K) (PIKKs) [12], é recrutada por meio da interação com o terminal C de Ku80 [13, 14] e causa o heterodímero Ku70 / 80 para se mover cerca de uma volta helicoidal para dentro a partir do final [15] para criar espaço para DNA-PKcs para se ligar ao DNA. Dois conjuntos de DNA-PK são provavelmente necessários para manter as duas extremidades do DNA próximas uma da outra [16]. O DNA-PKcs ativado fosforila a si mesmo e a várias proteínas, incluindo os outros componentes do NHEJ [17, 18]. A sinapsis induz a autofosforilação de DNA-PKcs e permite que outras proteínas NHEJ acessem as extremidades do DNA [19, 20].

O processamento final envolve nucleases como Artemis [21], que é capaz de cortar uma série de saliências de DNA e é considerada suficiente como uma nuclease, embora outras nucleases em particular PNK, aprataxina (APTX) e PNK-APTX-like fator (PALF), a

exonuclease, não pode ser descartada [22]. Artemis interage com DNA-PKcs e abre grampos de DNA no processo de recombinação V (D) J [23]. Mutações em Artemis gene causa Imunodeficiência Combinada Grave Radiossensível (RS-SCID) [21]. Polimerases Pol

usam seus domínios BRCT para se ligar a complexos Ku / DNA e a desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) é exclusivamente expressa em células linfóides iniciais para se envolver em NHEJ do processo de recombinação V (D) J [24-26]. Além disso, como recentemente mostrado Ku em seu papel como uma liase também participa no processamento final do DNA de corte em locais abásicos, indicando que esta proteína, como seu parceiro DNA-PKcs, tem propriedades enzimáticas e, portanto, cumpre uma série de funções na via NHEJ [ 27].

A etapa de ligação final de reintegração é mediada por DNA ligase IV (LigIV), que está associada ao grupo 4 de complementação cruzada de raios-X dimérico (XRCC4) [28]. Essas proteínas formam um complexo muito estável, que é mantido em NaCl 2 M ou ureia 7 M [29]. O XRCC4 estimula a adenilação e a atividade da ligase [30-32]. Knockouts desses genes em camundongos resultam na letalidade embrionária tardia da maneira dependente de p53 [33-36], enquanto mutações em lig4 O gene resulta na síndrome LIG4 caracterizada por radiossensibilidade, características faciais incomuns, microcefalia, atraso no desenvolvimento e crescimento, pancitopenia e anormalidade da pele [37]. O Fator semelhante ao XRCC4 (XLF) / Cernunnos (XLF), cujas mutações em humanos causam imunodeficiência combinada severa, também interage com o XRCC4 e aumenta a ligação por LigIV [38, 39].

Aqui, revisamos o que é conhecido das arquiteturas dos complexos multicomponentes transitórios que medeiam a união de extremidades não homólogas. A Figura 1 é uma tentativa de construir um diagrama de interação que resume nosso conhecimento atual das interações da proteína NHEJ e da fosforilação por DNA-PKcs, indicando onde as informações estruturais estão disponíveis. Embora a existência de DNA-PK - o complexo entre DNA-PKcs, Ku heterodimérico e DNA - seja claramente definida, assim como o complexo estreito entre XRCC4 e LigIV, a organização temporal e espacial dos complexos de ordem superior não é clara. Existem subcomplexos que permitem que Ku saia do DNA antes da ligação ou existe um supercomplexo em que DNA-PK, LigIV / XRCC4 e XLF coexistem para obter a ligação? Nesse caso, como Ku sai quando as pontas são ligadas? Neste artigo, primeiro consideramos o que se sabe sobre a estrutura da enorme cadeia única de DNA-PKcs e como isso pode levar a uma melhor compreensão do alvo para uso na descoberta de drogas guiadas por estrutura. Em seguida, discutimos a organização do complexo DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA (conhecido como DNA-PK), a fim de esclarecer os eventos iniciais que ocorrem na via NHEJ. Discutimos as evidências emergentes relativas às estruturas 3D dos complexos LigIV / XRCC4 / XLF / DNA, que devem fornecer pistas sobre a ligação e o mecanismo funcional de LigIV / XRCC4 e XLF em NHEJ. Finalmente, consideramos o arranjo espacial dos complexos de ordem superior para dar uma imagem do sistema de reparo NHEJ como um todo.


Diagrama esquemático das interações da máquina NHEJ. Formas coloridas indicam as proteínas e complexos com estruturas 3D conhecidas. Setas sólidas indicam confirmados, enquanto as setas tracejadas são interações plausíveis. Os eventos de fosforilação são indicados pela letra “p”.

2. Biologia Estrutural de Componentes Individuais

Avanços consideráveis ​​foram feitos na biologia estrutural de componentes individuais e complexos da maquinaria de reparo NHEJ, mas mais trabalho é necessário para compreender a organização espacial deste processo complicado e dinâmico. Aqui, discutimos o que se sabe sobre cada componente antes de discutir os complexos multiproteicos que medeiam suas funções no NHEJ.

2.1. Ku70 / 80

A atividade de ligação final de DNA de fita dupla (ds) de Ku70 e Ku80 requer sua associação para formar um heterodímero [40]. A estrutura cristalina do heterodímero Ku70 / Ku80 revela uma topologia e organização de domínio semelhantes, compreendendo um terminal amino

domínio, um domínio de barra central e um braço helicoidal C-terminal [10]. Essas proteínas, quando associadas, formam uma estrutura pseudo-simétrica, na qual os resíduos que contribuem para a interface do dímero apresentam baixo nível de identidade de sequência (aproximadamente 15% Figura 2), favorecendo a formação de heterodímero em relação à homodimerização Ku70-Ku70 ou Ku80-Ku80.


Ku70 e Ku80 alinharam as sequências com base em suas estruturas. Eles mostram uma organização de domínio semelhante, apesar da identidade de sequência baixa. O alinhamento foi criado com ClustalW2 [41] e visualizado com ESPript [42]. Muitos resíduos são conservados (caixa preta) ou semiconservado / semelhante (caixa cinza).

A estrutura cristalina do heterodímero Ku70 / 80 em complexo com um fragmento de DNA em forma de Y de 55 nucleotídeos mostra que o heterodímero Ku70 / 80 adota a forma de um anel que circunda o DNA duplex (Figura 3). Não ocorrem grandes mudanças conformacionais na ligação do DNA a Ku heterodimérico, exceto para os domínios C-terminais de Ku70 e Ku80. Na verdade, nenhum contato com bases de DNA e apenas algumas interações com a estrutura de açúcar-fosfato são feitas. O duplex de DNA é englobado através do anel pré-formado Ku70 / 80 de tal forma que uma face do DNA é relativamente acessível ao solvente e, portanto, exposta a enzimas de processamento que removem os nucleotídeos danificados e preenchem as lacunas antes da ligação. Esses recursos podem fornecer suporte estrutural para as extremidades quebradas do DNA e colocar a hélice do DNA em fase através da junção durante o processamento da extremidade e a ligação. Embora o heterodímero Ku70 / 80 mostre baixa afinidade para DNA circularizado [43] e não se ligue a nenhum substrato de DNA menor que 14 bp, ele se liga a fragmentos de dsDNA de comprimento e estrutura semelhantes de uma forma independente da sequência de DNA e independentemente de o DNA terminar são rombos, com loops em gancho, ou


(uma)
(b)
(uma)
(b) A heterodimerização de Ku70 / 80 define uma forma de anel que se liga ao DNA. Estruturas cristalinas do heterodímero Ku70 / 80 na ausência de DNA (a) e na forma ligada ao DNA (b). Adaptado de [10].
2.2. DNA-PKcs

A estrutura do DNA-PKcs se mostrou bastante elusiva. Alguns belos trabalhos realizados usando microscopia crioeletrônica, reconstrução de partícula única de DNA-PKcs [44-47] deram uma boa impressão da estrutura geral (ver Figura 4 (a)). Isso agora foi complementado pelo trabalho em nosso laboratório. Mostramos que os cristais de DNA-PKcs podem crescer e difratar para resolução de cerca de 8,5 Å, mas a difração é melhor para os complexos com fragmentos C-terminais de Ku80, presumivelmente devido a uma estabilização do DNA-PKcs no complexo levando a uma melhor encomenda da embalagem de cristal. Recentemente, usamos a dispersão anômala de múltiplos comprimentos de onda com o

cluster de metais pesados ​​[48] para resolver a estrutura de DNA-PKcs em complexo com domínio C-terminal de Ku80 em resolução de 6,6 Å (Figura 4 (b)).


(a) Microscopia crioeletrônica
(b) Cristalografia de raios-X
(a) Microscopia crioeletrônica
(b) Cristalografia de raios-X Visualizações equivalentes de DNA-PKcs, conforme definido por (a) microscopia crioeletrônica e (b) cristalografia de proteínas de raios-X. Referências às publicações e resoluções dos modelos são fornecidas acima. A codificação por cores dessas estruturas EM são as fornecidas em suas respectivas publicações [44-47]. O mapa de densidade eletrônica experimental de cristalografia de raios-X é definido por Sibanda et al. [48].

Muito da cadeia polipeptídica DNA-PKcs é construída a partir de unidades repetidas HEAT (Figura 5) para formar vários domínios separados. A estrutura terciária do DNA-PKcs mede 160 Å de altura e 120 Å de largura, conforme visto na Figura 6 (a). A partir do terminal N, os motivos HEAT repetidos compreendendo cerca de 66 hélices se dobram em uma estrutura circular oca, que quando vista de lado se assemelha a um berço (Figura 6 (b)). A corrente muda de direção antes que o círculo se complete, deixando uma lacuna (Figura 6 (a)). Dentro dessa estrutura circular, a regularidade das repetições de HEAT se quebra em certos pontos, conforme indicado na Figura 6 (a) com setas azuis. Esses pontos de irregularidade podem desempenhar um papel nas mudanças conformacionais que têm sido implicadas na função desta molécula [16]. É possível que essas mudanças conformacionais possam ter influência no tamanho da lacuna (Figura 6 (a)), que pode ter um papel na liberação de DNA-PKcs das extremidades do DNA quando NHEJ está completo. A estrutura do anel provavelmente atua como uma plataforma para proteínas que se envolvem no reparo do DNA quebrado e, junto com Ku, mantém o DNA no lugar enquanto ele está sendo reparado.



Estrutura cristalina do DNA-PKcs. Superfície molecular da estrutura do DNA-PKcs mostrando (a) vistas frontais e (b) laterais. Também mostrado em (a), está o tamanho geral do DNA-PKcs com os potenciais locais flexíveis indicados nas setas azuis. A molécula é codificada por cores da seguinte forma: a estrutura do anel que é predominantemente repetições HEAT é verde a testa que faz parte da estrutura do anel é verde claro o domínio de ligação ao DNA putativo é magenta a parte maior do terminal C que inclui os domínios FAT e FATC é vermelho e o domínio da quinase é amarelo.

Na segunda parte da estrutura, a cadeia polipeptídica explora repetições de HEAT para se dobrar em um pequeno domínio de ligação ao DNA, globular, putativo dentro da estrutura circular. Sabe-se que o DNA-PKcs se liga ao DNA de fita dupla e de fita simples. Williams et al. (2008) propuseram que “a protrusão” em sua estrutura crio-EM se liga ao DNA [47], e essa protusão é equivalente ao pequeno domínio globular localizado dentro da região circular da estrutura cristalina. Este continua sendo o melhor candidato para reconhecimento de DNA de fita simples e dupla, mas trabalhos adicionais em cristais de DNA-PK (DNA-PKcs, Ku, complexo de DNA) em uma estrutura de resolução mais alta de DNA-PKcs serão necessários para confirmar isso. Em terceiro lugar, a região C-terminal dobra na cabeça / coroa que está empoleirada bem no topo da estrutura circular em forma de berço e se estende ainda mais para trás. Esta parte contém o FAT, domínio quinase, FATC e várias partes onde outras proteínas, conforme indicado por estudos bioquímicos, podem se ligar para formar complexos com DNA-PKcs (Figura 7).


Diagrama esquemático das implicações da função de sequência de DNA-PKcs.São mostradas quatro regiões altamente conservadas (HCR) [49] Quinase, FAT e locais de domínios FATC para sinais de localização nuclear (NLSs) [49] Locais de autofosforilação PQR [50], ABCDE [19], S3205 [51], S3821, S4026, T4102 [52] e T3950 [53] locais de clivagem para a protease apoptótica caspase-3 [49, 54-56] locais de ligação para Lyn tirosina quinase [57], proteína C1D que interage no motivo leucina-zipper de DNA- PKcs [58], proteína fosfatase-5 (PP5) que se liga, usando sua repetição tetratricopeptídica (TPR), para desfosforilar DNA-PKcs em S2056 e T2609 [59], Ku70 / 80 que se liga para apresentar as extremidades da fita dupla de DNA danificada para DNA-PKcs [60], a proteína de interação da quinase (KIP) [61], e c-Abl que se liga usando seu SH3 uma ligação que é desencadeada por danos ao DNA [60].

O núcleo da estrutura da quinase de PI (3) K

, um dos membros da família foi sobreposto a esta região da Cabeça / Coroa resultando em um ajuste plausível para as fitas N e as hélices do lobo C (Figura 8). Neste local, a quinase é exposta e facilmente acessível aos substratos (Figura 8). A partir da localização do domínio da quinase, as posições das regiões FAT e FATC podem ser inferidas (Figura 7), pois o domínio da quinase provavelmente “se acomoda” entre essas duas regiões [62].


Domínio da quinase DNA-PKcs. A figura mostra um desenho da estrutura geral do DNA-PKcs representando a posição do domínio da quinase. O código de cores é mostrado na Figura 6. A modelagem do domínio catalítico DNA-PKcs foi baseada na estrutura cristalina de um de seus membros da família, o PI (3) K

quinase (código PDB: 1E8X). Também é mostrado um close do domínio catalítico DNA-PKcs. Hélices de DNA-PKcs marcadas (a) e (b) podem ser ocupadas por hélices do lóbulo N de PI (3) K

O tamanho do monômero de DNA-PKcs é previsto por espalhamento de raios X de pequeno ângulo (SAXS) em cerca de 155 Å [63], amplamente de acordo com o da estrutura cristalográfica. DNA-PKcs se dimeriza sem DNA de maneira dependente da concentração. Os dados SAXS indicam uma grande mudança conformacional entre DNA-PKcs autofosforilados e não fosforilados. A dimensão e o raio de giração de DNA-PKcs fosforilados aumentaram 25 e 2 Å, respectivamente, em comparação com DNA-PKcs simulados. Além disso, a reconstrução da forma do DNA-PKcs fosforilado mostra uma fenda mais ampla entre os domínios da cabeça e da palma do que na enzima não fosforilada.

2.3. DNA ligase IV

O LigIV humano também se mostrou difícil de estudar isoladamente devido à instabilidade e flexibilidade, mas é estabilizado pela interação com XRCC4 [28]. Em humanos, LigIV é uma das três DNA ligases dependentes de ATP, I, III e IV, e desempenha um papel central no NHEJ eucariótico. LigIV pode ser dividido em regiões catalíticas e de interação. Existem excelentes análises sobre a comparação de estruturas de DNA e RNA ligases e enzimas capeadoras de RNA em outros lugares [64-67].

LigIV pertence à superfamília da nucleotidiltransferase e realiza uma reação de transferência de nucleotidil de três etapas: a formação do intermediário covalente enzima-nucleotídeo monofosfato (NMP) (etapa 1), a transformação do NMP em um -fosfato de polinucleotídeo (etapa 2), e a união do -fosfato com -hidroxil para selar dois polinucleotídeos (etapa 3) [68]. Essas enzimas têm quatro motivos comuns (I, III, IV, V) e, além disso, mais dois motivos (III e VI), que são conservados entre as enzimas de capeamento do vírus ASF e as ligases de DNA dependentes de ATP eucarióticas [69]. Um motivo recentemente encontrado, Va, está bem conservado entre as ligases de DNA humano [70]. O motivo I KX (D / N) G tem a lisina catalítica que forma o intermediário NMP-covalente. Os motivos I-V estão localizados no domínio da nucleotidiltransferase (NTase) (Figura 9), cujo núcleo compreende três camadas principalmente antiparalelas flanqueadas por seis hélices [64]. Os motivos Va e VI pertencem ao domínio de ligação de oligonucleotídeo / oligossacarídeo (OBD) (Figura 9), que tem o barril de chave grego de cinco fitas coberto por uma hélice [64, 71]. NTase e OBD são conservados entre enzimas de capeamento e DNA ligases [64]. A maioria das mutações da síndrome LigIV são encontradas em NTase e OBD [72] (Figura 9).


Diagrama esquemático da DNA ligase IV humana. Os limites do domínio mostrados na figura são baseados na estrutura cristalográfica da DNA ligase I humana [73] e nos domínios BRCT do LigIV [94]. Os motivos conservados (I, III, IIIa, IV, V, Va e VI) são mostrados em retângulos laranja [69, 70]. A lisina catalítica conservada é indicada na linha verde. Os locais de fosforilação relatados são indicados por linhas vermelhas [81, 99]. As mutações da síndrome LigIV são mostradas nos domínios [72, 100]. As regiões de interação Ku e XRCC4 são indicadas com colchetes pretos [29, 84, 94].

Muitas enzimas na superfamília das nucleotidiltrasferases têm domínios extras além dos domínios do núcleo catalítico conservados. N-terminal para a NTase, por exemplo, as ligases de DNA humano têm domínio de ligação de DNA (DBD), cuja estrutura tridimensional foi descoberta pela primeira vez por Pascal et al. (2004) com os domínios catalíticos da ligase I humana (LigI) complexada com um fragmento de DNA cortado não ligável [73]. Este domínio também é encontrado em ligases de DNA arquea [74-76] e possivelmente outras ligases de DNA eucariótica, Poxvírus e arquea [77]. Pascal et al. (2004) mostraram que DBD é essencial para LigI para se ligar ao DNA e realizar a ligação de nicks de DNA [73]. No entanto, este não parece ser o caso da DNA ligase III [78], embora a maior parte da afinidade de ligação ao DNA do LigIV pareça vir de seu DBD (T Ochi e TL Blundell, resultados não publicados). Esses resultados sugerem que o DBD de cada DNA ligase humano tem diferentes propriedades de ligação ao DNA, embora sejam prováveis ​​de ter estruturas semelhantes [79]. Duas mutações da síndrome de LigIV são graves apenas quando combinadas com R278H e parecem ter pouco impacto na atividade de LigIV [37]. Com base nas semelhanças estruturais das regiões catalíticas de LigI e LigIV, é provável que se liguem ao DNA de maneira semelhante.

Além da região catalítica, as ligases de DNA humano têm domínios extras [79]. LigIV tem um domínio BRCT em tandem com um ligante previsto para ser principalmente desordenado. Este ligante parece ser importante para a atividade catalítica de LigIV [80] e tem um local de fosforilação em T650 por DNA-PKcs, cuja fosforilação estabiliza LigIV [81]. O domínio BRCT, que normalmente tem quatro cadeias paralelas rodeadas por três hélices [82], é comum em proteínas de checkpoint do ciclo celular que respondem a danos no DNA [83]. LigIV interage com XRCC4 principalmente através do linker entre os dois BRCT [80]. Como observado acima, além da interação com XRCC4, o primeiro domínio BRCT (BRCT1) mostrou interagir com Ku70 / 80 [84].

Estruturas de domínios BRCT em tandem de BRCA1 e MDC1 humanos, Crb2 de levedura, Nbs1 e Brc1, foram resolvidas com diferentes fosfopeptídeos. Quatro resíduos-chave que formam a bolsa de ligação da fosfo-serina - o motivo (S / T) G no final da primeira fita (1) e o motivo (S / T) XK no início da segunda hélice (2) [85-93] foram identificados, os resíduos são conservados no domínio BRCT em tandem de LigIV, exceto que o segundo motivo é substituído por NXR. Assim, BRCT1 pode se ligar a fosfoserinas [94], embora as interações com os dois domínios BRCT proximais encontrados em BRCA1, MDC1, Crb2, Nbs1 e Brc1 sejam improváveis ​​de ocorrer em LigIV, pois os domínios BRCT em tandem estão provavelmente posicionados separados [94, 95 ] De fato, em vitro as experiências de ligação de fosfopéptidos mostraram que os domínios BRCT de LigIV se ligam a fosfopéptidos [96, 97]. No entanto, a sequência precisa de um fosfopeptídeo que se liga aos domínios BRCT ainda não foi determinada.

Uma vez que os domínios BRCT em tandem têm um arranjo globular comum dos domínios BRCT, os domínios do LigIV podem interagir quando o LigIV está na forma livre. A principal interface de dimerização do domínio BRCT em tandem é 2 em BRCT1, e a primeira e terceira hélices 1 e 3 no segundo domínio BRCT (BRCT2) [98]. Curiosamente, a superfície de interação desses domínios BRCT e XRCC4 é semelhante à de outros domínios BRCT em tandem (como discutido abaixo). É possível que um domínio BRCT de outra proteína interaja com 2 de BRCT1, que é exposto ao solvente. Assim, embora os domínios BRCT em tandem de LigIV tenham um linker longo, eles têm características em comum com outros domínios BRCT em tandem.

2.4. XRCC4

Em solução, XRCC4 existe como um equilíbrio dependente de sal de dímeros e tetrâmeros [102] ver Figura 10. Tetramerização cauda a cauda foi observada em cristais de proteína XRCC4 [103]. Ligação de LigIV com o terminal C XRCC4 α-helical coiled-coil estabiliza a formação de dímero XRCC4. A região de ligação entre XRCC4 e LigIV se sobrepõe à região de tetramerização de XRCC4, o que pode explicar por que LigIV funciona para mudar XRCC4 para a forma de dímero em solução [102]. Ainda não se sabe se o XRCC4 tetramérico tem uma função durante a via de reparo do NHEJ.


Dímero XRCC4, tetrâmero e ligação com o peptídeo DNA ligase IV. O equilíbrio é deslocado para dímero quando o peptídeo DNA ligase IV se liga a XRCC4.

A sequência da proteína de XRCC4 após o resíduo 213 não está incluída nas estruturas de cristal de XRCC4 devido à esperada estrutura altamente desordenada e flexível do domínio C-terminal de XRCC4 [103]. No entanto, estudos de EM revelaram que a estrutura do terminal C de XRCC4 de camundongo é um domínio globular [104]. Este domínio inclui sequências de localização nuclear putativas [105]. Esses autores também sugeriram que um grupo de aminoácidos ácidos 229-238 é importante para a atividade de autotranscrição. Além disso, o domínio C-terminal XRCC4 é o alvo para proteínas regulatórias NHEJ. O DNA-PKcs fosforila o XRCC4 e regula sua ligação com o DNA [31]. Os resíduos S260 e S318 na região C-terminal de XRCC4 foram identificados como os principais locais de fosforilação por DNA-PKcs [106]. XRCC4 também é fosforilado por CK2, resíduo T233 e a fosforilação por CK2 recruta PNK, que provavelmente participa de NHEJ [107]. De fato, a estrutura do domínio associado a ForkHead (FHA) de PNK com um fosfopeptídeo derivado de XRCC4 foi resolvida [108]. O resíduo K210 de XRCC4 também foi relatado como importante para a modificação do pequeno modificador semelhante à ubiquitina (SUMO), que regula a localização celular de XRCC4 [109]. A região do terminal C do XRCC4, junto com a região do terminal N (resíduos 1–28) e a região central (resíduos 168–200), pode facilitar a ligação cooperativa ao DNA [31]. Assim, a definição da estrutura da região C-terminal irá contribuir para a compreensão de como o XRCC4 se liga ao LigIV e ao DNA para cumprir sua função.

2,5. XLF

O XLF foi identificado por meio de um estudo de clonagem de complementação funcional de cDNA do paciente 2BN após a descoberta de um grupo de pacientes com deficiência de NHEJ (2BN) [38, 110]. Também foi identificado de forma independente por meio de triagem de dois híbridos de levedura para interatores de XRCC4 [39]. O XLF é evolutivamente conservado em uma ampla gama de eucariotos, como vertebrados, insetos e até mesmo em fungos filamentosos [111]. O XLF humano de comprimento total contém 299 resíduos. Em seu extremo C-terminal, um pequeno aglomerado básico conservado constitui a sequência de localização nuclear. Usando coloração de imunofluorescência, XLF foi observado localizando-se no núcleo de células humanas [39].

A estrutura cristalina de XLF com truncamento C-terminal, resolvida independentemente em resolução de 2,3 Å por Andres et al. [112] e em nosso laboratório [101], existe como um homodímero contendo um domínio de cabeça N-terminal globular e cauda helicoidal de bobina estendida, que é dobrada para trás em torno da bobina (Figura 11). O domínio da cabeça N-terminal começa com uma única hélice 1, que é seguida por uma estrutura antiparalela de sete fitas ensanduichando um motivo de hélice-volta-hélice entre 4 e 5. A estrutura da cauda contém três hélices 4, 5 e 6. Enquanto 4 se estende para longe do domínio principal do N-terminal em torno de 60 Å, 5 e 6 dobre para trás e faça contato com o domínio principal. As 4 hélices dos dois protômeros interagem como uma estrutura de bobina enrolada enterrando resíduos altamente conservados e hidrofóbicos na interface. Esta dimerização de XLF é ainda melhorada através do dobramento das hélices 5 e 6 para circundar as 4 hélices do outro protômero para formar uma braçadeira, levando ao enterramento de uma área de superfície de

6500 Å 2. A filtração em gel, a reticulação de proteínas e a ultracentrifugação analítica também são consistentes com uma forma homodimérica estável de XLF em solução [101]. XLF foi encontrado para ter formação de complexo de ordem superior dependente da concentração durante experimentos de filtração em gel [112]. O homodímero de XLF, no entanto, é a menor unidade funcional estável.


Estrutura cristalina de XLF / Cernunnos. Diagrama da fita do dímero XLF / Cernunnos. Um protômero é a cor do arco-íris que vai do terminal N (azul) ao terminal C (vermelho). Adaptado de Li et al. [101].

Devido à estrutura desordenada prevista para a região do terminal C do XLF após o resíduo 245, cerca de 70 resíduos foram removidos do terminal C do XLF nas análises da estrutura cristalina [101, 112]. A localização aproximada da região C-terminal XLF, no entanto, pode ser prevista para estar perto da região de domínio principal N-terminal de acordo com a direção da hélice 6.

Embora XLF e XRCC4 tenham arquiteturas semelhantes, grandes diferenças estruturais da cabeça à cauda ocorrem entre essas duas proteínas. Para o domínio principal, ambas as proteínas contêm a mesma estrutura antiparalela de sete cadeias ensanduichando um motivo de hélice-volta-hélice, mas o XLF contém uma hélice extra no N-terminal. Como vimos, a estrutura da cauda de XLF contém hélices distintas dobrando-se para trás, enquanto a estrutura de cauda em espiral estendida de XRCC4 contém a região de ligação de LigIV perto do C-terminal. As diferenças na sequência e estrutura entre as caudas XLF e XRCC4 explicam por que LigIV não se liga a XLF da mesma forma que XRCC4.

As funções e mecanismos de ação do XLF em NHEJ ainda não são totalmente compreendidos. XLF não apenas estabiliza LigIV / XRCC4 em extremidades de DNA quebradas, mas também aumenta o processo de união de extremidades de LigIV / XRCC4. XLF também foi considerado essencial para reparar saliências incompatíveis e o processo de preenchimento de lacunas junto com a polimerase de DNA pol e pol [113, 114]. Compreender como o XLF funciona no NHEJ através do estudo de sua interação com outras proteínas NHEJ estruturalmente ajudará a desvendar o papel exato do XLF. Isso contribuirá para a nossa compreensão atual do reparo do DNA em NHEJ e também pode levar a uma futura aplicação terapêutica para pacientes com defeitos de NHEJ.

3. Biologia Estrutural de Complexos

3.1. DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / Complexo Ternário de DNA (DNA-PK)

A estrutura cristalina do heterodímero Ku70 / 80 não inclui o domínio de interação C-terminal DNA-PKcs de Ku80 (Ku80CTD), que é dispensável para a ligação de Ku70 / 80 ao DNA, mas é necessário para o recrutamento de DNA-PK para os locais de DNA danificado [13, 14]. A análise de ressonância magnética nuclear de Ku80CTD de 19 kDa (resíduos 545-732) define uma estrutura em hélice [115, 116]. Outros estudos estruturais de Ku70 / 80 de comprimento total com e sem DNA foram conduzidos usando microscopia eletrônica de partícula única (EM) [117] e SAXS combinada com imagens de células vivas [63]. A posição de Ku80CTD foi proposta como estando sob o domínio / de Ku70 por EM, mas o domínio foi considerado flexível no estudo SAXS. Simulações de dinâmica molecular do Ku80CTD produziram um conjunto de conformações, apoiando a ideia de Ku80CTD ser uma região de alta flexibilidade [63]. Tomados em conjunto, os estudos mostram que a associação de Ku70 e Ku80 para formar um heterodímero é necessária para as extremidades de dsDNA de ligação, que a ligação de DNA dependente de Ku conduz o recrutamento de DNA-PKcs e que a última interação envolve o domínio helicoidal localizado no C- terminal de Ku80. Embora Ku80CTD tenha sido incluído na estrutura cristalina do DNA-PKcs, sua posição não pôde ser definida de forma inequívoca, presumivelmente devido ao domínio de estruturas helicoidais alfa semelhantes no próprio DNA-PKcs [48].

Insights sobre as estruturas da holoenzima DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 e possíveis complexos sinápticos foram obtidos usando microscopia crioeletrônica e SAXS. Boskovic et al. (2003) usaram microscopia eletrônica em baixa resolução (30 Å) para demonstrar grandes mudanças conformacionais no DNA-PKcs humano quando o DNA de fita dupla se liga, e sugeriu que isso pode se correlacionar com a ativação da quinase [118]. Posteriormente, Spagnolo et al. (2006) usaram microscopia eletrônica de partícula única com resolução de 25 Å para estudar a holoenzima DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 humana montada no DNA [16]. Eles novamente encontraram evidências de mudanças conformacionais na ligação de Ku e DNA ao DNA-PKcs. Eles identificaram partículas diméricas compreendendo duas holoenzimas DNA-PKcs / Ku70 / Ku80, que eles consideram serem complexos sinápticos, mantendo pontas quebradas e fornecendo uma plataforma para outros componentes necessários para o processamento final e ligação. Um estudo SAXS de DNA-PK revelou que ele tinha dois modos diferentes de dimerização, conforme observado anteriormente com DNA-PKcs [63]. Dependendo da presença de DNA em gancho de 40 pb ou de DNA em forma de Y de 40 pb, o DNA-PK formou o dímero cabeça-a-cabeça ou palma-a-palma. Muito recentemente, Perry et al. (2010) estudaram a holoenzima DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 mais detalhadamente, analisando seus estudos anteriores de SAXS à luz da estrutura cristalina do DNA-PKcs [119]. Eles demonstraram de forma impressionante que a fosforilação do DNA-PK causa uma grande mudança conformacional, suficiente para abrir a lacuna no anel e fornecer acesso ou liberação do DNA. Ku80CTD mostrou ser flexível e se estender em solução para o benefício do recrutamento de DNA-PKcs. É possível que Ku80 interaja com DNA-PKcs em ambos os lados do BSB [63].

3.2. Complexos de DNA ligase IV / XRCC4

LigIV é estabilizado formando um complexo compacto com XRCC4 [28]. Cerca de 99% do LigIV é pré-adenilado quando purificado junto com XRCC4 e é difícil de readenilar após ligação de níquel único [120], o que implica que o complexo LigIV / XRCC4 está pronto para ligar o DNA. Ao contrário de outras ligases de DNA humano, LigIV / XRCC4 pode ligar eficientemente um dos cortes de um DSB, embora o outro não seja ligase [26], e pode ligar fitas de DNA através de lacunas e extremidades totalmente incompatíveis [121]. Além disso, foi demonstrado que o LigIV pode ligar o DNA poli-T de fita simples [122]. Curiosamente, a eficiência da ligação é maior com substratos de DNA longos

53 bp [123]. Isso pode estar relacionado à observação de que um único LigIV / XRCC4 liga duas extremidades de DNA [124].

As estruturas cristalinas do dímero XRCC4 complexado com o domínio BRCT em tandem de LigIV mostram que o ligante entre os dois domínios BRCT está bem ordenado e forma um grampo de hélice-alça-hélice (HLH) em torno da espiral [29, 94] ( Figuras 12 (a) e 12 (b)). O mesmo modo de interação e arranjo de estrutura secundária são observados no complexo de levedura ortóloga entre XRCC4 (Lif1p) e LigIV (Lig4p) [95] (Figura 12 (c)). Os dois domínios BRCT nos complexos humano e de levedura estendem o grampo, circundando o domínio da bobina enrolada. o

-hélice em BRCT1 está localizado perto da região de interação conservada XRCC4 do ligante (XIR: resíduo 748-784) entre dois domínios BRCT. A hélice correspondente em BRCT1 de 53BP1 participa da superfície de interação de p53 [125, 126]. A interação de XRCC4 com LigIV produz uma torção em uma hélice da bobina enrolada do dímero XRCC4 e muda a repetição do heptal canhoto em uma bobina não-decadente destra como resultado, a superfície de interação de LigIV torna-se plana [29, 94]. A torção dobra na direção oposta no complexo entre XRCC4 com XIR ​​e com o domínio BRCT em tandem [94]. A primeira estrutura pode ser um estado intermediário de interação LigIV / XRCC4.Nesse caso, essa mudança conformacional dinâmica pode ter um papel biológico na Vivo. Esta torção não aparece em Lif1p / Lig4p, embora o refinamento da estrutura contra um novo conjunto de dados de difração de 3,5 Å tenha sido realizado (ver [127], T Ochi e TL Blundell, resultados não publicados). Assim, a torção pode ser exclusiva do ser humano e de alguns outros organismos superiores.


Estruturas cristalinas de LigIV / XRCC4 e Lif1p-Lig4p. A região de interação conservada de XRCC4 ou Lif1 de LigIV (XIR) ou Lig4p (LIR) são indicadas com setas azuis. (a) XRCC4 (resíduos 1–213) (azul) e XIR (violeta) (código PDB: 1IK9). (b) XRCC (resíduos 1-203) (azul) e domínios BRCT de LigIV (resíduos 654-911) (violeta) (código PDB: 3II6) (c) Lif1p (resíduos 1-246) (azul) e domínios BRCT de Lig4p (resíduos 680-944) (violeta).

A segunda hélice em HLH medeia uma interação hidrofóbica com o lado oposto da superfície plana do XRCC4 para onde XIR interage [94] e uma interação hidrofóbica extensa semelhante é observada em Lif1p / Lig4 (resíduos 827-839) [95]. LigIV adicionalmente interage com a bobina enrolada de XRCC4 via 1 e 3 de BRCT2, de uma maneira que se assemelha à interação entre BRCT1 e BRCT2 de outros domínios BRCT em tandem. A superposição de LigIV / XRCC4 e Lif1p / Lig4p com base em XIR ​​e a região correspondente de Lig4p (LIR) mostra que, além da torção descrita acima, ocorre outra alteração na posição de BRCT1 (Figura 13). Este pode ser um artefato cristalográfico porque BRCT1 está intimamente empacotado com BRCT2 pertencente a outra molécula em estruturas humanas e de levedura. No entanto, a estrutura de NMR de BRCT1 (código PDB: 2E2W) tem a mesma conformação que a cristalográfica, sugerindo que pelo menos BRCT1 humano e o ligante a seguir é provável que tenha a mesma conformação em solução.


Comparação das posições de BRCT1 entre LigIV / XRCC4 e Lif1p / Lig4p. Estruturas de LigIV / XRCC4 (violeta / prata) e Lifp1 / Lig4p (verde / ouro) foram sobrepostas com base em XIR ​​e LIR. A figura é uma vista da direção dos terminais C para N das bobinas de XRCC4 e Lif1p. Os terminais N e as hélices de BRCT1 de LigIV e Li4p são marcados com violeta e verde, respectivamente.

Uma estrutura EM publicada recentemente do complexo LigIV / XRCC4 mostra o terminal N de LigIV próximo ao domínio principal de XRCC4 [128]. Os autores compararam dois construtos LigIV / XRCC4, um com as sequências completas e o outro com um LigIV completo e um XRCC4 truncado (resíduos 1–213). A partir das diferenças das duas imagens EM, eles determinaram a posição do terminal C de XRCC4 e, marcando a etiqueta hexahistidina com ouro, identificaram o terminal N de LigIV. Embora os autores tenham reconstruído imagens 2D médias de LigIV / XRCC4, a reconstrução 3D falhou parcialmente devido à heterogeneidade da conformação LigIV / XRCC4. Assim, eles propuseram que a região catalítica de LigIV está conectada à região C-terminal por um ligante flexível e isso pode ter importância funcional (ver também Perry et al. (2010) [119]).

Realizamos estudos SAXS do domínio BRCT em tandem de LigIV / XRCC4 mutado (BmX4) e LigIV / XRCC4 mutado (LmX4) a fim de investigar a conformação da região catalítica em solução (Figura 14 (a)) [129]. Aqui, o XRCC4 mutado é idêntico ao usado para resolver a estrutura do XIR / XRCC4 [29]. A linearidade dos respectivos gráficos de Guinier confirmou que as soluções de proteína eram homogêneas e monodispersas (Figura 14 (b)). O raio de giração deduzido e a dimensão molecular máxima de LmX4 são 9 Å e 43 Å maiores, respectivamente, do que os de BmX4. O perfil de espalhamento simulado usando a estrutura cristalográfica de BmX4 (código PDB: 3II6) se ajustou bem à curva SAXS medida (

, dados não mostrados). Além disso, o ab initio A restauração da forma 3D de BmX4 reproduziu uma conformação geral consistente com a estrutura do cristal (Figura 14 (c)). o ab initio a reconstrução da forma de LmX4 revelou que a região catalítica pode contribuir com densidade adicional para o domínio principal de XRCC4 ou o domínio BRCT em tandem de LigIV quando comparado com a conformação de BmX4 (Figura 14 (c)). Uma vez que a conformação aberta estendida da região catalítica em solução também foi observada em uma ligase de DNA arquea [74], a densidade extra pode corresponder a uma conformação semelhante da região catalítica de LigIV à conformação fechada observada em outras ligases de DNA arquea [75, 76]. Como as restaurações de forma de LmX4 produziram uma conformação reproduzível (também indicada pelo valor de discrepância espacial normalizada (NSD) após o cálculo da média de forma), esse achado pode implicar em interações entre a região catalítica e BmX4. No entanto, o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética e a análise de protease (dados não mostrados) indicam que é improvável que a região catalítica tenha fortes interações com BmX4. Assim, embora a maioria de LmX4 em solução possa ter a conformação aberta estendida, a região catalítica é flexivelmente ligada a BmX4. Nossas observações concordam com o estudo EM [128].


. (b) Gráficos Guinier de LmX4 e BmX4 com ajustes de revestimento (linha vermelha)

3.3. Complexos XLF / XRCC4

A interação entre o XLF e o XRCC4 é sensível ao sal, não depende do DNA [39, 133] e as interações ocorrem através das regiões da cabeça, conforme mostrado pelo estudo de dois híbridos de levedura de vários mutantes [134]. XLF ligado aos grânulos em seu C-terminal ainda foi capaz de puxar para baixo LigIV / XRCC4, o que implica que o C-terminal de XLF não é importante para a interação com LigIV / XRCC4 [135].

Estudos de mutagênese indicam que o resíduo XLF estruturalmente exposto L115 (Figura 16 mostrado em verde) localizado na alça 6-7 é importante para a interação XLF / XRCC4 [112]. Os resíduos K63, K65 e K99 (Figura 15 mostrada em verde) de XRCC4 são essenciais para a interação e estão localizados na região do domínio da cabeça perto da cauda helicoidal [112]. Os resíduos de interação não essenciais de XLF estão localizados principalmente fora da região de domínio principal, enquanto os resíduos de ligação não essenciais de XLF / XRCC4 em XRCC4 estão localizados principalmente na parte superior do domínio principal N-terminal e na estrutura da cauda helicoidal antes da região de ligação LigIV (Figuras 15 e 16 mostrado em cinza) [112]. Esses estudos são consistentes com um modelo de interação lado a lado linear, no qual os domínios da cabeça XLF deslizam para o espaço criado pelos domínios da cabeça XRCC4 e parte do terminal N da estrutura da cauda [112] (Figura 17). No entanto, não podemos excluir um modelo para XLF / XRCC4, envolvendo XLF e XRCC4 que se ligam lado a lado, mas com um grau de curvatura introduzindo torção e possivelmente um complexo circular. Isso teria a vantagem de formar um complexo finito e discreto. Outros experimentos de espalhamento de pequeno ângulo de raios-X podem ser a melhor abordagem para resolver isso, especialmente se os complexos são dinâmicos, como sugerem os experimentos de filtração em gel. No entanto, algum encorajamento de que complexos bem definidos podem ser identificados é encontrado na observação de que os complexos XLF / XRCC4 foram cristalizados e dados de raios-X coletados, embora em baixa resolução (Q Wu, TL Blundell dados não publicados).




3.4. Arranjo espacial de complexos de ordem superior

A fim de dar uma imagem da organização espacial e temporal do sistema de reparo NHEJ como um todo, uma compreensão da ordem das interações durante a montagem do complexo ternário DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA e do LigIV / XRCC4 / O complexo quaternário XLF / DNA será essencial.

Ku70 / 80 e DNA-PKcs, que têm maior afinidade de ligação ao DNA em comparação com LigIV / XRCC4 / XLF, muito provavelmente formam o complexo ternário DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 / DNA primeiro. Para a seguinte formação do complexo LigIV / XRCC4 / XLF / DNA, a ordem e a dinâmica da montagem da proteína ainda precisam ser determinadas. A interação entre XRCC4 e XLF é relativamente fraca em comparação com a forte ligação entre XRCC4 e LigIV. Não está claro se as interações XLF-dímero com XRCC4-dímero são mantidas quando a ligase é recrutada. Ensaios de interação de proteínas confirmaram o recrutamento de XLF independente de XRCC4 para as extremidades de DSBs por meio da interação com Ku70 / 80 apenas na presença de DNA. Isso pode implicar que o XLF pode atuar independentemente sem o XRCC4.

Técnicas de imagem de células vivas identificaram o recrutamento imediato de XLF para DSBs induzidos por laser com ligação à proteína Ku70 / 80 [136]. XRCC4 é dispensável para recrutamento de XLF para as extremidades do DNA, mas sua presença pode estabilizar a interação XLF / DNA [136]. Ensaios de interação de proteínas confirmaram a interação entre Ku70 / 80 e XLF, e essa interação só ocorre na presença de DNA [136].

Tanto o XRCC4 quanto o XLF requerem um longo pedaço de DNA para a ligação. Como o DNA está estruturalmente envolvido em todos os complexos de proteínas de ordem superior é de interesse fundamental. A fosforilação de LigIV, XRCC4 e XLF por DNA-PKcs não interfere muito com as funções centrais dessas proteínas, mas pode alterar as afinidades de ligação relativas de várias interações proteína-proteína ou proteína-DNA, que são importantes para o arranjo espacial correto dos complexos de ordem superior. Toda essa incerteza sublinha a necessidade de mais estudos para caracterizar os complexos tanto temporal quanto espacialmente.

4. Discussão

Os desafios da caracterização estrutural de sistemas multiproteicos dinâmicos claramente exigem uma combinação de SAXS, EM, cristalografia de raios-X e outras abordagens. Todos serão beneficiados por métodos de estabilização e fixação dos complexos. Construções modificadas, por exemplo, mutação e truncagem que imitam fosfo, bem como pós-modificação, por exemplo, fosforilação e metilação, precisam ser exploradas a fim de identificar complexos estáveis. Para estudos de crio-EM de partícula única, GraFix foi introduzido com sucesso para estabilizar macromoléculas [137]. Isso explora a centrifugação de gradiente de glicerol em concentrações crescentes de reagente de fixação química para estabilizar macromoléculas individuais e prevenir agregação oportunista. Uma abordagem semelhante pode ser usada para outros estudos estruturais, incluindo cristalografia de raios-X, embora aqui a modificação da superfície molecular dos complexos possa prevenir a formação de cristais ordenados.

Cristais de grandes conjuntos multiproteicos adequados para difração de raios-X de alta resolução permanecem um desafio. Portanto, o desenvolvimento de métodos para analisar dados de difração de raios X de baixa resolução é essencial. A este respeito, as fontes de luz de laser de elétrons livres (FEL) podem permitir imagens de FEL de raios-X de partícula única (XFEL). A cristalografia de raios X com nanocristais também é um método promissor.

A cristalografia de raios X ainda é a única técnica a dar resolução atômica de grandes estruturas e alta resolução é essencial para estudar a ligação de pequenas moléculas. Na verdade, as ferramentas químicas que permitem uma intervenção específica no NHEJ devem permitir a dissecação das funções dos vários componentes. Essas ferramentas provavelmente também contribuiriam para a descoberta de compostos líderes e candidatos pré-clínicos para intervenção terapêutica em locais de interação alostérica e outros reguladores em oncologia e para pacientes com defeitos na via de NHEJ.

O interesse imediato, que se desenvolve a partir da estrutura emergente do DNA-PKcs, é o aprimoramento do design de inibidores que se ligam ao local ATP da porção da proteína quinase. Tais inibidores não apenas informam o desenvolvimento de agentes terapêuticos úteis, mas também devem ser de valor imediato na investigação da possibilidade de melhorar a estabilidade do domínio da quinase e a qualidade e resolução dos cristais.

Eventualmente, esperamos buscar uma abordagem guiada por estrutura para otimizar o projeto de tais inibidores. Abordagens semelhantes podem ser feitas com o sítio ativo da ligase. Em nossa opinião, uma abordagem mais empolgante e aventureira seria projetar novas entidades químicas que se ligam a locais alostéricos, modelos ou locais de ligação de adaptador - chamados de alo-direcionamento - que são críticos para a ativação, colocalização e / ou especificidade da regulação de NHEJ. O uso de métodos baseados em fragmentos [138-140] neste contexto é atraente. Alvos prováveis ​​seriam as interações frente a frente de XRCC4 e XLF, as interações de domínios BRCT e a interação de Ku70 / 80 e o DNA-PKcs.

Em conclusão, uma compreensão espacial e temporal de NHEJ deve fornecer insights sobre o mecanismo deste processo celular crítico e também sugerir abordagens para projetar ferramentas químicas úteis. Na verdade, o projeto de pequenos agentes químicos que modulam não covalentemente as interações provavelmente também contribuiria para a descoberta de compostos principais que permitem a intervenção terapêutica em oncologia e no tratamento de pacientes com defeitos na via de NHEJ.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. J. Günter Grossmann pelas discussões e comentários úteis sobre os dados SAXS. B. L. Sibanda e D. Y. Chirgadze foram apoiados pelo Wellcome Trust Program Grant: 079281 / Z / 06 / Z. T. Ochi foi apoiado pela Overseas Research Studentship (ORS). Gráficos moleculares, exceto para as Figuras 4 e 14, foram preparados usando PyMOL [141].

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Direito autoral

Copyright & # xa9 2010 Takashi Ochi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


Biologia de células-tronco com respeito aos aspectos da carcinogênese da proteção radiológica

Citação recomendada
ICRP, 2015. Stem Cell Biology with Respect to Carcinogenesis Aspects of Radiological Protection. Publicação 131 da ICRP. Ann. ICRP 44 (3/4).

Autores em nome do ICRP
O. Niwa, M.H. Barcellos-Hoff, R.K. Globus, J.D. Harrison, J.H. Hendry, P. Jacob, M.T. Martin, T.M. Seed, J.W. Shay, M.D. Story, K. Suzuki, S. Yamashita

Resumo - Este relatório fornece uma revisão das células-tronco / células progenitoras e suas respostas à radiação ionizante em relação a questões relevantes aos efeitos estocásticos da radiação que formam uma parte importante do sistema de proteção radiológica da Comissão Internacional de Proteção Radiológica. Informações atuais sobre as características das células-tronco, manutenção e renovação, evolução com a idade, localização em nichos de células-tronco e radiossensibilidade a exposições agudas e prolongadas são apresentadas em uma série de revisões substanciais como anexos relativos ao tecido hematopoiético, glândula mamária, tireoide, digestivo trato, pulmão, pele e osso. Essa base de conhecimento das células-tronco é usada no texto principal do relatório para fornecer uma visão biológica sobre questões como o modelo linear sem limite (LNT), risco de câncer entre tecidos, efeitos da taxa de dose e mudanças no risco da carcinogênese da radiação por idade na exposição e idade atingida.
O conhecimento da biologia e da biologia de radiação associada de células-tronco e células progenitoras é mais desenvolvido em tecidos que se renovam com bastante rapidez, como tecido hematopoiético, mucosa intestinal e epiderme, embora todos os tecidos considerados aqui possuam populações de células-tronco.
Características importantes da manutenção, renovação e resposta das células-tronco são os sinais microambientais que operam na residência do nicho, para os quais uma localização espacial bem definida foi identificada em alguns tecidos. A identidade da célula-alvo para a carcinogênese continua a apontar para a população de células-tronco mais primitivas que é principalmente quiescente e, portanto, capaz de acumular a sequência prolongada de mutações necessárias para resultar em malignidade. Além disso, existe algum potencial para as células progenitoras filhas serem células-alvo em casos particulares, como no tecido hematopoiético e na pele. Vários processos biológicos podem contribuir para proteger as células-tronco do acúmulo de mutações: (a) reparo preciso do DNA (b) morte induzida rapidamente de células-tronco lesadas (c) retenção da fita modelo parental do DNA durante as divisões em alguns sistemas de tecido, de modo que as mutações são passou para as células de diferenciação filhas e não retidas na célula parental e (d) competição de células-tronco, por meio da qual as células-tronco não danificadas competem com as células-tronco danificadas para a residência no nicho. O reparo do DNA ocorre principalmente alguns dias após a irradiação, enquanto a competição com células-tronco leva semanas ou muitos meses, dependendo do tipo de tecido.
Os processos mencionados podem contribuir para as diferenças nos valores de risco de radiação carcinogênica entre os tecidos e podem ajudar a explicar por que um tecido que se replica rapidamente, como o intestino delgado, é menos sujeito a esse risco. Os processos também fornecem uma visão mecanicista relevante para o modelo LNT e os modelos de risco relativo e absoluto. O conhecimento radiobiológico também fornece uma visão científica das discussões sobre a dose e o fator de eficácia da taxa de dose atualmente usado nas diretrizes de proteção radiológica. Além disso, as informações biológicas contribuem com motivos potenciais para a sensibilidade dependente da idade à carcinogênese da radiação, incluindo os efeitos da exposição intra-útero.


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Os fundamentos tecnológicos da engenharia do genoma

A engenharia do genoma é possibilitada pelo aproveitamento das vias de reparo do DNA da célula (revisado em [5]). A maioria das técnicas de engenharia de genoma direcionam o reparo de quebras de fita dupla de DNA (DSBs), que são introduzidas no genoma no local ou próximo a ele onde uma modificação da sequência de DNA é desejada. DSBs direcionados são alcançados usando nucleases específicas de sequência (SSNs) - enzimas que reconhecem e clivam o locus alvo com alta especificidade. O reparo da quebra pode ser direcionado para criar uma variedade de modificações de sequência de DNA direcionadas, variando de deleções de DNA à inserção de grandes matrizes de transgenes.

Existem atualmente quatro classes principais de SSNs: endonucleases homing projetadas ou meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) e repetições palindrômicas curtas intercaladas regularmente agrupadas (CRISPR) / reagentes Cas9 (Figura 1). Meganucleases são enzimas de ocorrência natural que se ligam e clivam grandes sequências de DNA alvos (de 12 a 40 pb) (Figura 1A) [6], [7]. As meganucleases podem ser projetadas para reconhecer novos locais, no entanto, as mudanças na especificidade do local alvo são difíceis de alcançar e frequentemente resultam em uma redução da atividade catalítica, o que tem dificultado seu uso generalizado [7]. As ZFNs, em contraste, ligam o DNA por meio de uma matriz de proteínas de dedo de zinco projetadas, que são fundidas ao domínio catalítico da endonuclease FokI (Figura 1B) [8], [9]. FokI funciona como um dímero e, portanto, a clivagem ocorre quando duas ZFNs ligam seus alvos e trazem os monômeros FokI em estreita proximidade. TALENs são semelhantes a ZFNs no sentido de que têm um domínio de ligação de DNA fundido a FokI; no entanto, o reconhecimento de DNA por TALENs é obtido por meio de matrizes do motivo efetor TAL (Figura 1C) [10], [11]. O motivo do efetor TAL é altamente modular e virtualmente qualquer sequência de DNA pode ser direcionada com TALENs de alta eficiência, tornando-os mais fáceis de projetar do que ZFNs. A adição mais recente ao arsenal SSN é o sistema CRISPR / Cas9. Com CRISPR / Cas9, o direcionamento é alcançado por meio de um RNA guia que emparelha bases com uma sequência alvo cromossômica específica (Figura 1D) [12], [13]. O complexo RNA / DNA resultante é então clivado pela nuclease Cas9. O direcionamento do DNA por meio do emparelhamento de base evita a necessidade de projetar um dedo de zinco específico de sequência ou matriz efetor TAL e, consequentemente, os reagentes CRIPSR / Cas9 estão emergindo rapidamente como o SSN de escolha. Considerando que a capacidade de projetar SSNs com a especificidade de DNA necessária foi por muito tempo um gargalo para a engenharia de genoma, o direcionamento de DNA agora pode ser alcançado com muito mais eficiência. Certamente, muitos desafios permanecem em termos de entrega de reagentes de engenharia do genoma para células vegetais, mas o progresso nesta frente também está avançando em um ritmo rápido [14], [15].

(A) A meganuclease, I-SceI, é mostrada ligada ao seu alvo de DNA. O domínio catalítico, que também determina a especificidade da sequência de DNA, é mostrado em vermelho. (B) Um dímero ZFN é ilustrado ligado ao DNA. Os alvos ZFN são ligados por dois domínios de ligação ao DNA de dedo de zinco (azul escuro) separados por uma sequência espaçadora de 5–7 bp. A clivagem de FokI ocorre dentro do espaçador. Cada dedo de zinco normalmente reconhece 3 bp. (C) Retratado é um dímero TALEN ligado ao DNA. Os domínios de ligação ao DNA estão em azul escuro. Os dois locais alvo TALEN são normalmente separados por uma sequência espaçadora de 15-20 bp. Como ZFNs, as matrizes de repetição efetoras TAL são fundidas a FokI. Cada motivo do efetor TAL reconhece uma base. (D) O sistema CRISPR / Cas9 reconhece o DNA por meio do emparelhamento de bases entre as sequências de DNA no local alvo e um RNA guia baseado em CRISPR (gRNA). Cas9 tem dois domínios de nuclease (mostrados por setas vermelhas) que clivam cada uma fita de DNA de fita dupla.

Como os DSBs direcionados permitem modificações precisas do genoma? Depois que as quebras são introduzidas no cromossomo, um mecanismo para o reparo da quebra é a junção de extremidade não homóloga (NHEJ) (Figura 2A) [16], [17]. Embora o NHEJ seja frequentemente preciso, pequenas deleções ou, mais raramente, inserções podem ser introduzidas na junção do cromossomo recém-reunido. Se a modificação da sequência causar uma mutação de frameshift ou alterar os resíduos de aminoácidos principais no produto do gene alvo, uma mutação de nocaute (perda de função) pode ser criada. As extremidades dos cromossomos quebrados também podem ser unidas a outras moléculas de DNA que são introduzidas na célula simultaneamente com o SSN. A captura de sequências de DNA heterólogas pode ser usada para conseguir um knock-in de gene direcionado (inserção direcionada) (Figura 2A). Finalmente, se duas quebras são introduzidas no cromossomo simultaneamente, podem ocorrer deleções de genes direcionados ou outros rearranjos (Figura 2B). O reparo do DNA por meio de NHEJ é claramente um meio poderoso de obter modificações de sequência de DNA direcionadas.

(A) O reparo mediado por NHEJ pode resultar em pequenas deleções ou inserções nos locais alvo que podem interromper a função do gene (nocautes, à esquerda). Fragmentos de DNA podem ser inseridos por meio de ligação mediada por NHEJ para criar inserções direcionadas (knock-ins, direita). (B) Quando dois cortes são feitos por SSNs, o reparo mediado por NHEJ pode resultar em deleções ou inversões de grandes regiões genômicas (esquerda) ou deleções de genes direcionados ou translocações cromossômicas (direita). (C) O reparo mediado por HR, envolvendo um molde de DNA homólogo, leva à substituição ou inserção do gene.

A recombinação homóloga (HR) é um meio alternativo para reparar um cromossomo quebrado. Em HR, um modelo de reparo é usado como uma fonte de informações da sequência de DNA que é copiada para o cromossomo quebrado para restaurar sua integridade (Figura 2C) [18], [19]. HR pode ser aproveitado para obter modificações de sequência de DNA direcionadas, introduzindo na célula um SSN e um modelo de reparo de DNA com semelhança de sequência com o local de quebra (este processo é referido como direcionamento de gene). A variação da sequência que é transportada pelo modelo de reparo é copiada pelo HR para o cromossomo, conseguindo, assim, a modificação da sequência de DNA direcionada. Como o usuário especifica o tipo de variação de sequência nos modelos de reparo, o HR oferece inúmeras possibilidades para a manipulação de genomas de plantas. Por exemplo, knock-ins de genes direcionados podem ser alcançados usando modelos de reparo de DNA com um ou mais transgenes flanqueados por sequências homólogas ao local alvo. Modificações de sequência de DNA mais sutis também podem ser obtidas, incluindo alterações em resíduos de aminoácidos chave dentro da sequência de codificação de um gene, ou mudanças em elementos promotores ou outros motivos de ação cis que controlam a expressão do gene. Assim, o reparo do DNA por HR fornece uma capacidade sem precedentes de manipular o genótipo de uma planta e, conseqüentemente, seu fenótipo.


3.4: Reparo de DNA - Biologia

O objetivo deste local é ser um ponto de encontro aberto para os interessados ​​em estudos que envolvam a função e a dinâmica dos genomas. É cuidado pelos Laboratórios de Pesquisa e Unidades da CABIMER trabalhando nos fatores e mecanismos que conformam a Biologia do Genoma. Abrange tópicos de pesquisa como replicação de DNA, reparo de DNA, recombinação de DNA, segregação de cromossomos, transcrição, epigenética, genômica funcional e estrutural, controle do ciclo celular e resposta a danos de DNA com ênfase em abordagens dedicadas a compreender o envelhecimento, câncer e doenças genéticas.

Todos os interessados ​​na área, com especial atenção para Alunos de Licenciatura em Ciências da Vida (Biologia, Biomedicina, Biotecnologia, Bioquímica, Medicina, Farmácia, Química, Veterinária, etc.) e Profissionais que desejam ampliar ou atualizar seus conhecimentos ou pretendem iniciar ou seguir uma carreira científica em Biologia do Genoma são bem-vindos a fazer parte deste projeto.

-2014. Junho. 2º Encontro de Biologia do Genoma da CABIMER. CABIMER, Sevilha, ES


Como funciona o DNA

O DNA carrega as informações para fazer todas as proteínas da célula. Essas proteínas implementam todas as funções de um organismo vivo e determinam as características do organismo. Quando a célula se reproduz, ela precisa passar todas essas informações para as células-filhas.

Antes que uma célula possa se reproduzir, ela deve primeiro replicar, ou fazer uma cópia de seu DNA. Onde ocorre a replicação do DNA depende se as células são procarióticas ou eucariotas (veja a barra lateral de RNA na página anterior para mais informações sobre os tipos de células). A replicação do DNA ocorre no citoplasma dos procariotos e no núcleo dos eucariotos. Independentemente de onde ocorre a replicação do DNA, o processo básico é o mesmo.

A estrutura do DNA se presta facilmente à replicação do DNA. Cada lado da dupla hélice corre em direção oposta (antiparalelo) instruções. A beleza dessa estrutura é que ela pode ser descompactada no meio e cada lado pode servir como um padrão ou modelo para o outro lado (chamado replicação semiconservativa) No entanto, o DNA não é descompactado inteiramente. É descompactado em uma pequena área chamada de bifurcação de replicação, que então desce por todo o comprimento da molécula.

  1. Uma enzima chamada Girase de DNA faz um corte na dupla hélice e cada lado separa
  2. Uma enzima chamada helicase desenrola o DNA de fita dupla
  3. Várias pequenas proteínas chamadas proteínas de ligação de fita simples (SSB) ligam-se temporariamente a cada lado e os mantêm separados
  4. Um complexo enzimático chamado DNA polimerase "caminha" pelas fitas de DNA e adiciona novos nucleotídeos a cada fita. O par de nucleotídeos com os nucleotídeos complementares no estande existente (A com T, G com C).
  5. Uma subunidade da DNA polimerase revisões o novo DNA
  6. Uma enzima chamada DNA ligase sela os fragmentos em uma longa fita contínua
  7. As novas cópias automaticamente terminar de novo

Diferentes tipos de células replicaram seu DNA em taxas diferentes. Algumas células se dividem constantemente, como as do cabelo e das unhas e as células da medula óssea. Outras células passam por várias rodadas de divisão celular e param (incluindo células especializadas, como as do cérebro, músculos e coração). Finalmente, algumas células param de se dividir, mas podem ser induzidas a se dividir para reparar lesões (como células da pele e células do fígado). Em células que não se dividem constantemente, os sinais para a replicação / divisão celular do DNA vêm na forma de substâncias químicas. Esses produtos químicos podem vir de outras partes do corpo (hormônios) ou do meio ambiente.

O DNA de todos os organismos vivos tem a mesma estrutura e código, embora alguns vírus usem o RNA como transportador de informações, em vez do DNA. A maioria dos animais possui duas cópias de cada cromossomo. Em contraste, as plantas podem ter mais de duas cópias de vários cromossomos, que geralmente surgem de erros na distribuição dos cromossomos durante a reprodução celular. Em animais, esse tipo de erro geralmente causa doenças genéticas que costumam ser fatais. Por algumas razões desconhecidas, esse tipo de erro não é tão devastador para as plantas.


Assista o vídeo: Biologia Molecular- Aula 05- Mecanismos de Reparo do DNA (Agosto 2022).