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Por que a atividade da nuclease de dsDNA por CRISPR / Cas9 é mostrada apenas indiretamente?

Por que a atividade da nuclease de dsDNA por CRISPR / Cas9 é mostrada apenas indiretamente?



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Em Jinek et al., Os autores mostram a atividade de nuclease de seu sistema CRISPR / Cas9 usando o chamado Ensaio de agrimensor método. Este ensaio reconhece pequenas incompatibilidades em dsDNA que são introduzidas por junção de extremidade não homóloga propensa a erros após quebras de dsDNA foram introduzidas por algum agente estranho (como Cas9). O ensaio Surveyor então -novamente- quebra o DNA nos pontos onde ele reconhece incompatibilidades. Os fragmentos de DNA recém-quebrados podem ser analisados ​​e, assim, pode-se identificar a posição da quebra inicial dependente de Cas9.

Minha pergunta é: para demonstração direta da atividade de Cas9 na posição programada, por que não silenciar primeiro os mecanismos de reparo de união de extremidade não homóloga na célula e depois analisar diretamente o lisado? Isso não é tecnicamente viável? Ou não é feito para não introduzir outra mudança na célula para a qual não haveria controle?


Edição de genoma: uma perspectiva sobre a aplicação de CRISPR / Cas9 para estudar doenças humanas (revisão)

1 Universidad Aut & # x000f3noma de Nuevo Le & # x000f3n, Departamento de Bioquímica e Medicina Molecular, Faculdade de Medicina e Hospital Universitário & # x02018Dr. Jos & # x000e9 E. Gonz & # x000e1lez & # x02019, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64460, M & # x000e9xico

Ramiro Ram & # x000edrez-Sol & # x000eds

2 Institutional Core Laboratories, University of Texas Health Science Center em San Antonio, San Antonio, TX, EUA

Mario Alberto Garza-Elizondo

3 Universidad Aut & # x000f3noma de Nuevo Le & # x000f3n, Serviço de Reumatologia, Faculdade de Medicina e Hospital Universitário & # x02018Dr. Jos & # x000e9 E. Gonz & # x000e1lez & # x02019, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64460

Mar & # x000eda De Lourdes Garza-Rodr & # x000edguez

1 Universidad Aut & # x000f3noma de Nuevo Le & # x000f3n, Departamento de Bioquímica e Medicina Molecular, Faculdade de Medicina e Hospital Universitário & # x02018Dr. Jos & # x000e9 E. Gonz & # x000e1lez & # x02019, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64460, M & # x000e9xico

Hugo Alberto Barrera-Salda & # x000f1a

1 Universidad Aut & # x000f3noma de Nuevo Le & # x000f3n, Departamento de Bioquímica e Medicina Molecular, Faculdade de Medicina e Hospital Universitário & # x02018Dr. Jos & # x000e9 E. Gonz & # x000e1lez & # x02019, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64460, M & # x000e9xico

4 Vitag & # x000e9nesis, SA de CV, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64630

5 Tecnologico de Monterrey, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Monterrey, Nuevo Le & # x000f3n 64710, M & # x000e9xico


Fundo

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) é o sistema imunológico adaptativo bacteriano para defender infecções bacteriófagas [1,2,3]. Durante a infecção, o DNA invasor é capturado e integrado ao genoma bacteriano como matriz CRISPR. As sequências da matriz CRISPR são transcritas e processadas em RNAs CRISPR (crRNAs), que direcionam proteínas associadas a CRISPR (Cas) para ácidos nucleicos estranhos [1, 2]. Os sistemas CRISPR-Cas do tipo II funcionam com componentes simplificados que compreendem uma única proteína de nuclease, como Cas9 [4]. Os recursos modulares e programáveis ​​tornam o CRISPR-Cas9 uma das ferramentas mais utilizadas para aplicações de engenharia de genoma [5,6,7,8]. No entanto, CRISPR-Cas9 está associado a clivagem fora do alvo [9], rearranjo cromossômico [10] e genotoxicidade [11]. Esses efeitos colaterais surgem principalmente da expressão excessiva ou prolongada de CRISPR-Cas9 [12,13,14]. Como um agente terapêutico, CRISPR-Cas9 é frequentemente expresso constitutivamente em células hospedeiras [15], tornando a elevada atividade desativada uma grande preocupação de segurança. O controle temporal da atividade de SpCas9 foi investigado como uma abordagem para melhorar sua especificidade em células humanas. As tecnologias que permitem o controle temporal de CRISPR-Cas9 incluem ferramentas optogenéticas, sistema de splicing de intein, pequenos indutores ou inibidores de moléculas [16,17,18,19,20] e proteínas anti-CRISPR (Acrs) [21, 22].

Os inibidores CRISPR-Cas mais investigados são os Acrs derivados de fago de ocorrência natural. Os bacteriófagos podem usar Acrs para antagonizar a imunidade CRISPR-Cas em bactérias [23, 24]. Vários Acrs foram identificados para sistemas tipo I [23, 25,26,27,28], tipo II [29,30,31,32] e tipo V [28, 33] CRISPR-Cas. Acrs pode ser adaptado para regular as atividades CRISPR-Cas em bactérias [34], leveduras [35] e células de mamíferos [29, 31, 34, 36,37,38]. Biossensores [39] e circuitos sintéticos [40] podem ser concebidos com base em sistemas CRISPR-Cas acoplados a Acr. Além disso, Acrs pode ser aproveitado para permitir o controle responsivo à temperatura [41] e optogenético [42] da atividade CRISPR-Cas. É importante ressaltar que Acrs pode aprimorar a edição [38] e as especificidades do tipo de célula [43] e reduzir a citotoxicidade [11] da edição do genoma mediada por CRISPR-Cas. Também foi relatado que Acrs pode facilitar a produção de vetores virais portadores de CRISPR, restringindo a autoclivagem de CRISPR [44].

Os Acrs atualmente conhecidos inibem os sistemas CRISPR-Cas interferindo na vigilância ou clivagem do DNA mediada pela proteína Cas [21]. Por exemplo, AcrIIA4 imita o DNA de fita dupla (dsDNA) e ocupa o local de reconhecimento do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) de SpCas9, evitando assim que a proteína Cas9 se ligue ao DNA alvo [38, 45, 46]. Usando um mecanismo diferente, AcrIIC3 perturba a ligação ao DNA induzindo a dimerização da proteína Cas9 [36]. Uma estratégia alternativa de inativação de Cas por Acrs é interagir com proteínas Cas ligadas ao DNA e bloquear a clivagem de DNA subsequente, como visto com AcrF3 [47, 48] e AcrIIC1 [36]. Além disso, alguns Acrs podem funcionar como acetiltransferase e inativar a atividade CRISPR-Cas por modificações pós-tradução [49]. Acrs diferentes podem inativar CRISPR-Cas através de mecanismos idênticos, embora possuindo semelhanças de sequência baixas [21]. Os Acrs caracterizados até o momento não compartilham motivos de sequência comuns, exceto por um elemento transcricional putativo referido como genes associados a anti-CRISPR (Acas), que são comumente encontrados a jusante dos genes Acr no genoma do bacteriófago [26]. A relação sequência-estrutura-atividade mal compreendida dificulta em grande parte a descoberta sistêmica de novos Acrs. Além dos inibidores baseados em proteínas, os inibidores CRISPR-Cas de moléculas pequenas foram desenvolvidos usando uma plataforma de triagem de alto rendimento [20]. Essas pequenas moléculas são permeáveis ​​às células e podem interromper reversamente a interação SpCas9-DNA, permitindo assim o controle da dose e do tempo de SpCas9. No entanto, concentrações relativamente altas de 10 μM ou acima são necessárias para que as moléculas pequenas alcancem uma inibição eficiente [20].

Junto com pequenas moléculas e proteínas, os peptídeos representam uma classe alternativa de agentes inibidores de CRISPR com características bioquímicas distintas. Neste estudo, relatamos a descoberta de peptídeos inativadores de Cas9 de bacteriófagos inoviridae. Em uma tentativa de desenvolver anticorpos anti-CRISPR usando tecnologia de exibição de fago bem estabelecida [50], estamos surpresos ao descobrir que a cepa de bacteriófago M13 comumente usada em laboratório serviu como uma fonte de agente de inativação de Cas9. As análises subsequentes mostraram que o domínio periplasmático da principal proteína de revestimento G8P (G8PPD) de vários bacteriófagos inoviridae, que contêm o fago M13, inibiram a atividade in vitro e in vivo de SpCas9 de maneira alostérica. Nosso estudo, portanto, expande a caixa de ferramentas do inibidor para o controle temporal da atividade CRISPR-Cas.


Mecanismo Cas9

A etapa chave na edição do genoma de um organismo é o direcionamento seletivo de uma sequência específica de DNA. Duas macromoléculas biológicas, a proteína Cas9 e o RNA guia, interagem para formar um complexo que pode identificar sequências alvo com alta seletividade.

A proteína Cas9 é responsável pela localização e clivagem do DNA alvo, tanto em sistemas CRISPR / Cas naturais quanto artificiais. A proteína Cas9 tem seis domínios, REC I, REC II, Bridge Helix, PAM Interacting, HNH e RuvC (Figura 1) (Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014).

O domínio Rec I é o maior e é responsável pela ligação do RNA guia. O papel do domínio REC II ainda não é bem compreendido. A ponte de hélice rica em arginina é crucial para iniciar a atividade de clivagem após a ligação do DNA alvo (Nishimasu et al. 2014). O domínio de interação PAM confere especificidade de PAM e é, portanto, responsável por iniciar a ligação ao DNA alvo (Anders et al. 2014 Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014 Sternberg et al. 2014). Os domínios HNH e RuvC são domínios de nuclease que cortam o DNA de fita simples. Eles são altamente homólogos aos domínios HNH e RuvC encontrados em outras proteínas (Jinek et al. 2014 Nishimasu et al. 2014).

Figura 1: Proteína Cas9. A proteína Cas9 é composta por seis domínios: Rec I, Rec II, Bridge Helix, RuvC, HNH e PAM Interacting. Os domínios são mostrados em forma esquemática, de cristal e de mapa. (figura original) (imagem de cristal renderizada do PDB: 4CMP Jinek et al. 2014.)

A proteína Cas9 permanece inativa na ausência de RNA guia (Jinek et al. 2014). Em sistemas CRISPR projetados, o RNA guia é composto por uma única fita de RNA que forma uma forma de T composta por um tetraloop e dois ou três loops de haste (Figura 2) (Jinek et al. 2012 Nishimasu et al. 2014). O RNA guia é projetado para ter uma extremidade 5 & # 8242 que é complementar à sequência de DNA alvo.

Figura 2: RNA de guia projetado. O RNA-guia projetado é uma única fita de RNA. Ele forma um tetraloop e dois ou três loops de haste (três mostrados). A região complementar alvo é mostrada em vermelho. (figura original) (imagem de cristal renderizada de PDB: 4UN3 Anders et al. 2014.)

Este RNA guia artificial se liga à proteína Cas9 e, ao se ligar, induz uma mudança conformacional na proteína (Figura 3). A mudança conformacional converte a proteína inativa em sua forma ativa. O mecanismo da mudança conformacional não é completamente compreendido, mas Jinek e colegas levantam a hipótese de que as interações estéricas ou a ligação fraca entre as cadeias laterais de proteínas e as bases de RNA podem induzir a mudança (Jinek et al. 2014).

Figura 3: Ativação da proteína Cas9 pela ligação do RNA guia. A ligação do RNA guia induz uma mudança conformacional na proteína Cas9. A mudança conformacional causa a ativação da atividade da nuclease Cas9 (Jinek et al. 2014). (figura original) (imagem de cristal renderizada do PDB: 4UN3 Anders et al. 2014)

Uma vez que a proteína Cas9 é ativada, ela busca estocasticamente o DNA alvo ligando-se a sequências que correspondem à sequência do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) (Sternberg et al. 2014). Um PAM é uma sequência de duas ou três bases localizada dentro de um nucleotídeo a jusante da região complementar ao RNA guia. Os PAMs foram identificados em todos os sistemas CRISPR, e os nucleotídeos específicos que definem os PAMs são específicos para a categoria particular do sistema CRISPR (Mojica et al. 2009). O PAM em Streptococcus pyogenes é 5 & # 8242-NGG-3 & # 8242 (Jinek et al. 2012). Quando a proteína Cas9 encontra uma sequência alvo potencial com o PAM apropriado, a proteína irá derreter as bases imediatamente a montante do PAM e emparelhá-las com a região complementar no RNA guia (Sternberg et al. 2014). Se a região complementar e a região alvo emparelharem corretamente, os domínios de nuclease RuvC e HNH irão cortar o DNA alvo após a terceira base de nucleotídeo a montante do PAM (Anders et al. 2014) (Figura 4).

Figura 4: Ligação ao DNA alvo e clivagem por Cas9. 1) Cas9 faz a varredura de DNA alvo potencial para o PAM apropriado (estrelas amarelas). (2) Quando a proteína encontra o PAM, o complexo proteína: RNA guia derreterá as bases imediatamente a montante do PAM e as emparelhará com a região complementar alvo no RNA guia (Sternberg et al. 2014). (3) Se a região complementar e a região alvo parearem corretamente, os domínios RuvC e HNH irão cortar o DNA alvo após a terceira base de nucleotídeo a montante do PAM. (figura original) (imagens de cristal: Inferior esquerdo e direito renderizados de PDB: 4UN3 Anders et al. 2014 Superior esquerdo renderizado de PDB: 4CMP Jinek et al. 2014)


Conteúdo

Editar sequências repetidas

A descoberta de repetições de DNA agrupadas ocorreu de forma independente em três partes do mundo. A primeira descrição do que mais tarde seria chamado de CRISPR é do pesquisador da Universidade de Osaka Yoshizumi Ishino e seus colegas em 1987. Eles acidentalmente clonaram parte de uma sequência CRISPR junto com o "gene iap " (conversão de isozima de fosfatase alcalina) do genoma de Escherichia coli [14] [15] esse era seu alvo. A organização das repetições era incomum. Sequências repetidas são tipicamente organizadas consecutivamente, sem sequências diferentes intercaladas. [15] [11] Eles não conheciam a função das repetições agrupadas interrompidas.

Em 1993, pesquisadores de Mycobacterium tuberculosis na Holanda publicou dois artigos sobre um agrupamento de repetições diretas interrompidas (RD) nessa bactéria. Eles reconheceram a diversidade das sequências que intervinham nas repetições diretas entre diferentes cepas de M. tuberculosis [16] e usou esta propriedade para projetar um método de digitação que foi nomeado spoligotipagem, que ainda está em uso hoje. [17] [18]

Francisco Mojica, da Universidade de Alicante, na Espanha, estudou as repetições observadas nos organismos arqueanos de Haloferax e Haloarcula espécies e sua função. O supervisor de Mojica supôs na época que as repetições agrupadas tinham um papel na segregação correta do DNA replicado em células-filhas durante a divisão celular, porque plasmídeos e cromossomos com matrizes de repetição idênticas não poderiam coexistir em Haloferax volcanii. A transcrição das repetições interrompidas também foi observada pela primeira vez, esta foi a primeira caracterização completa do CRISPR. [18] [19] Em 2000, Mojica realizou uma pesquisa na literatura científica e um de seus alunos realizou uma pesquisa em genomas publicados com um programa desenvolvido por ele mesmo. Eles identificaram repetições interrompidas em 20 espécies de micróbios como pertencentes à mesma família. [20] Em 2001, Mojica e Ruud Jansen, que estavam procurando por repetições interrompidas adicionais, propuseram a sigla CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para aliviar a confusão decorrente das numerosas siglas usadas para descrever as sequências na literatura científica. [19] [21] Em 2002, Tang, et al. mostraram evidências de que regiões repetidas CRISPR do genoma de Archaeoglobus fulgidus foram transcritos em moléculas de RNA longas que foram subsequentemente processadas em pequenos RNAs de comprimento unitário, além de algumas formas mais longas de 2, 3 ou mais unidades de repetição espaçadora. [22] [23]

Em 2005, o pesquisador de iogurte Rodolphe Barrangou, descobriu que Streptococcus thermophilus, após desafios iterativos de fago, desenvolve resistência aumentada de fago e esta resistência aumentada é devido à incorporação de sequências espaçadoras CRISPR adicionais. [24] A empresa alimentícia dinamarquesa Danisco, para a qual Barrangou trabalhava naquela época, desenvolveu resistência a fagos S. thermophilus cepas para uso na produção de iogurte. Mais tarde, a Danisco foi comprada pela DuPont, que "detém cerca de 50 por cento do mercado global de cultura de laticínios", e a tecnologia se tornou dominante. [25]

Sistemas associados a CRISPR Editar

Um grande acréscimo à compreensão do CRISPR veio com a observação de Jansen de que o agrupamento de repetições procariontes foi acompanhado por um conjunto de genes homólogos que compõem os sistemas associados ao CRISPR ou cas genes. Quatro cas genes (cas 1–4) foram inicialmente reconhecidos. As proteínas Cas apresentaram motivos de helicase e nuclease, sugerindo um papel na estrutura dinâmica dos locos CRISPR. [26] Nesta publicação, o acrônimo CRISPR foi usado como o nome universal desse padrão. No entanto, a função CRISPR permaneceu enigmática.

Em 2005, três grupos de pesquisa independentes mostraram que alguns espaçadores CRISPR são derivados de DNA de fago e DNA extracromossômico, como plasmídeos. [30] [31] [32] Na verdade, os espaçadores são fragmentos de DNA coletados de vírus que anteriormente tentaram atacar a célula. A origem dos espaçadores era um sinal de que o CRISPR /cas sistema pode ter um papel na imunidade adaptativa em bactérias. [27] [33] Todos os três estudos propondo esta ideia foram inicialmente rejeitados por periódicos de alto perfil, mas eventualmente apareceram em outros periódicos. [34]

A primeira publicação [31] propondo um papel de CRISPR-Cas na imunidade microbiana, por Mojica e colaboradores da Universidade de Alicante, previu um papel para a transcrição de RNA de espaçadores no reconhecimento de alvo em um mecanismo que poderia ser análogo à interferência de RNA sistema utilizado por células eucarióticas. Koonin e colegas estenderam esta hipótese de interferência de RNA, propondo mecanismos de ação para os diferentes subtipos CRISPR-Cas de acordo com a função prevista de suas proteínas. [35]

O trabalho experimental de vários grupos revelou os mecanismos básicos da imunidade CRISPR-Cas. Em 2007, foi publicada a primeira evidência experimental de que o CRISPR era um sistema imunológico adaptativo. [11] [4] Uma região CRISPR em Streptococcus thermophilus espaçadores adquiridos do DNA de um bacteriófago infectante. Os pesquisadores manipularam a resistência de S. thermophilus para diferentes tipos de fago adicionando e eliminando espaçadores cuja sequência correspondeu às encontradas nos fagos testados. [36] [37] Em 2008, Brouns e Van der Oost identificaram um complexo de proteínas Cas (chamado Cascade) que em E. coli corte o precursor de RNA CRISPR dentro das repetições em moléculas de RNA contendo espaçadores maduros, chamadas RNA CRISPR (crRNA), que permaneceram ligadas ao complexo de proteínas. [38] Além disso, descobriu-se que Cascade, crRNA e uma helicase / nuclease (Cas3) eram necessários para fornecer imunidade a um hospedeiro bacteriano contra a infecção por um vírus de DNA. Ao projetar um CRISPR antivírus, eles demonstraram que duas orientações do crRNA (sentido / antisense) forneciam imunidade, indicando que os guias de crRNA tinham como alvo o dsDNA. Naquele ano, Marraffini e Sontheimer confirmaram que uma sequência CRISPR de S. epidermidis DNA direcionado e não RNA para evitar a conjugação. Esta descoberta estava em desacordo com o mecanismo de interferência de RNA proposto de imunidade CRISPR-Cas, embora um sistema CRISPR-Cas que visa RNA estranho tenha sido encontrado posteriormente em Pyrococcus furiosus. [11] [36] Um estudo de 2010 mostrou que CRISPR-Cas corta ambas as fitas de DNA de fago e plasmídeo em S. thermophilus. [39]

Cas9 Edit

Os pesquisadores estudaram um sistema CRISPR mais simples de Streptococcus pyogenes que depende da proteína Cas9. A endonuclease Cas9 é um sistema de quatro componentes que inclui duas pequenas moléculas: crRNA e RNA CRISPR transativador (tracrRNA). [40] [41] Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier reprojetaram a endonuclease Cas9 em um sistema de dois componentes mais gerenciável fundindo as duas moléculas de RNA em um "RNA de guia único" que, quando combinado com Cas9, poderia encontrar e cortar o alvo de DNA especificado pelo RNA guia. Essa contribuição foi tão significativa que foi reconhecida pelo Prêmio Nobel de Química em 2020. Ao manipular a sequência de nucleotídeos do RNA guia, o sistema Cas9 artificial poderia ser programado para direcionar qualquer sequência de DNA para clivagem. [42] Outro grupo de colaboradores compreendendo Virginijus Šikšnys juntamente com Gasiūnas, Barrangou e Horvath mostrou que Cas9 do S. thermophilus O sistema CRISPR também pode ser reprogramado para atingir um local de sua escolha, alterando a sequência de seu crRNA. Esses avanços alimentaram os esforços para editar genomas com o sistema CRISPR-Cas9 modificado. [18]

Grupos liderados por Feng Zhang e George Church publicaram simultaneamente descrições de edição de genoma em culturas de células humanas usando CRISPR-Cas9 pela primeira vez. [11] [43] [44] Desde então, tem sido usado em uma ampla gama de organismos, incluindo fermento de padeiro (Saccharomyces cerevisiae), [45] [46] [47] o patógeno oportunista Candida albicans, [48] [49] peixe-zebra (Danio rerio), [50] moscas da fruta (Drosophila melanogaster), [51] [52] formigas (Harpegnathos saltator [53] e Ooceraea biroi [54]), mosquitos (Aedes aegypti [55]), nematóides (Caenorhabditis elegans), [56] plantas, [57] camundongos, [58] [59] macacos [60] e embriões humanos. [61]

O CRISPR foi modificado para fazer fatores de transcrição programáveis ​​que permitem aos cientistas direcionar e ativar ou silenciar genes específicos. [62]

O sistema CRISPR-Cas9 demonstrou fazer edições de genes eficazes em zigotos tripronucleares humanos, descritos pela primeira vez em um artigo de 2015 dos cientistas chineses P. Liang e Y. Xu. O sistema fez uma clivagem bem-sucedida da beta-hemoglobina mutante (HBB) em 28 de 54 embriões. 4 dos 28 embriões foram recombinados com sucesso usando um modelo de doador fornecido pelos cientistas. Os cientistas mostraram que durante a recombinação do DNA da fita clivada, a sequência endógena homóloga HBD compete com o molde doador exógeno. O reparo do DNA em embriões humanos é muito mais complicado e particular do que em células-tronco derivadas. [63]

Cas12a (anteriormente Cpf1) Editar

Em 2015, a nuclease Cas12a (anteriormente conhecida como Cpf1 [64]) foi caracterizada no sistema CRISPR / Cpf1 da bactéria Francisella Novicida. [65] [66] Seu nome original, de uma definição da família de proteínas TIGRFAMs construída em 2012, reflete a prevalência de seu subtipo CRISPR-Cas no Prevotella e Francisella linhagens. Cas12a mostrou várias diferenças importantes de Cas9, incluindo: causar um corte 'escalonado' no DNA de fita dupla em oposição ao corte 'contundente' produzido por Cas9, contando com um PAM 'T rico' (fornecendo locais de direcionamento alternativos para Cas9) e exigindo apenas um RNA CRISPR (crRNA) para direcionamento bem-sucedido. Em contraste, Cas9 requer crRNA e um crRNA de transativação (tracrRNA).

Essas diferenças podem dar ao Cas12a algumas vantagens sobre o Cas9. Por exemplo, os pequenos crRNAs de Cas12a são ideais para edição de genoma multiplexado, pois mais deles podem ser empacotados em um vetor do que os sgRNAs de Cas9. Da mesma forma, as saliências 5 'pegajosas deixadas por Cas12a podem ser usadas para a montagem de DNA que é muito mais específica do alvo do que a clonagem de Enzima de Restrição tradicional. [67] Finalmente, Cas12a cliva DNA 18-23 pares de bases a jusante do local PAM. Isso significa que não há interrupção na sequência de reconhecimento após o reparo e, portanto, o Cas12a permite várias rodadas de clivagem de DNA. Por outro lado, uma vez que Cas9 corta apenas 3 pares de bases a montante do local PAM, a via NHEJ resulta em mutações indel que destroem a sequência de reconhecimento, evitando assim novas rodadas de corte. Em teoria, rodadas repetidas de clivagem de DNA deveriam causar uma oportunidade maior para a edição genômica desejada ocorrer. [68] Uma característica distintiva de Cas12a, em comparação com Cas9, é que depois de cortar seu alvo, Cas12a permanece ligado ao alvo e, em seguida, cliva outras moléculas de ssDNA de forma não discriminatória. [69] Essa propriedade é chamada de atividade de "clivagem colateral" ou "transclivagem" e tem sido explorada para o desenvolvimento de várias tecnologias de diagnóstico. [70] [71]

Cas13 (anteriormente C2c2) Editar

Em 2016, a nuclease Cas13a (anteriormente conhecida como C2c2) da bactéria Leptotrichia shahii foi caracterizado. Cas13 é uma endonuclease de RNA guiada por RNA, o que significa que ela não cliva o DNA, mas apenas o RNA de fita simples. Cas13 é guiado por seu crRNA para um alvo de ssRNA e se liga e cliva o alvo. Semelhante ao Cas12a, o Cas13 permanece ligado ao alvo e, em seguida, cliva outras moléculas de ssRNA de forma não discriminatória. [72] Essa propriedade de clivagem colateral foi explorada para o desenvolvimento de várias tecnologias de diagnóstico. [73] [74] [75]

Repete e edita espaçadores

A matriz CRISPR é composta por uma sequência líder rica em AT seguida por repetições curtas que são separadas por espaçadores exclusivos. [76] As repetições CRISPR normalmente variam em tamanho de 28 a 37 pares de bases (bps), embora possa haver apenas 23 bp e até 55 bp. [77] Alguns mostram simetria da díade, implicando na formação de uma estrutura secundária, como um stem-loop ('hairpin') no RNA, enquanto outros são projetados para serem não estruturados. O tamanho dos espaçadores em diferentes matrizes CRISPR é normalmente de 32 a 38 bp (faixa de 21 a 72 bp). [77] Novos espaçadores podem aparecer rapidamente como parte da resposta imune à infecção por fago. [78] Geralmente, há menos de 50 unidades da sequência do espaçador de repetição em uma matriz CRISPR. [77]

Editar estruturas de RNA CRISPR

Genes Cas e subtipos CRISPR Editar

Pequenos grupos de cas os genes geralmente estão localizados próximos a matrizes de espaçadores de repetição CRISPR. Coletivamente, o 93 cas os genes são agrupados em 35 famílias com base na similaridade de sequência das proteínas codificadas. 11 das 35 famílias formam o cas core, que inclui as famílias de proteínas Cas1 a Cas9. Um locus CRISPR-Cas completo tem pelo menos um gene pertencente ao cas essencial. [79]

Os sistemas CRISPR-Cas dividem-se em duas classes. Os sistemas de Classe 1 usam um complexo de várias proteínas Cas para degradar ácidos nucléicos estranhos. Os sistemas de Classe 2 usam uma única proteína Cas grande para o mesmo propósito. A classe 1 é dividida nos tipos I, III e IV, a classe 2 é dividida nos tipos II, V e VI. [80] Os 6 tipos de sistema são divididos em 19 subtipos. [81] Cada tipo e a maioria dos subtipos são caracterizados por um "gene de assinatura" encontrado quase exclusivamente na categoria. A classificação também é baseada no complemento de cas genes que estão presentes. A maioria dos sistemas CRISPR-Cas tem uma proteína Cas1. A filogenia das proteínas Cas1 geralmente concorda com o sistema de classificação. [79] Muitos organismos contêm vários sistemas CRISPR-Cas, sugerindo que eles são compatíveis e podem compartilhar componentes. [82] [83] A distribuição esporádica dos subtipos CRISPR / Cas sugere que o sistema CRISPR / Cas está sujeito à transferência horizontal de genes durante a evolução microbiana.

A imunidade CRISPR-Cas é um processo natural de bactérias e arquéias. [98] CRISPR-Cas evita infecção bacteriófago, conjugação e transformação natural pela degradação de ácidos nucléicos estranhos que entram na célula. [36]

Edição de aquisição espaçadora

Quando um micróbio é invadido por um bacteriófago, o primeiro estágio da resposta imune é capturar o DNA do fago e inseri-lo em um locus CRISPR na forma de um espaçador. Cas1 e Cas2 são encontrados em ambos os tipos de sistemas imunológicos CRISPR-Cas, o que indica que eles estão envolvidos na aquisição do espaçador. Estudos de mutação confirmaram essa hipótese, mostrando que a remoção de cas1 ou cas2 interrompeu a aquisição do espaçador, sem afetar a resposta imune CRISPR. [99] [100] [101] [102] [103]

Várias proteínas Cas1 foram caracterizadas e suas estruturas resolvidas. [104] [105] [106] As proteínas Cas1 têm diversas sequências de aminoácidos. No entanto, suas estruturas cristalinas são semelhantes e todas as proteínas Cas1 purificadas são nucleases / integrases dependentes de metal que se ligam ao DNA de uma maneira independente da sequência. [82] Proteínas Cas2 representativas foram caracterizadas e possuem (fita simples) ssRNA- [107] ou (fita dupla) dsDNA- [108] [109] atividade específica de endoribonuclease.

No sistema I-E de E. coli Cas1 e Cas2 formam um complexo onde um dímero Cas2 liga dois dímeros Cas1. [110] Neste complexo, Cas2 desempenha um papel de andaime não enzimático, [110] ligando-se a fragmentos de fita dupla de DNA invasor, enquanto Cas1 liga os flancos de fita simples do DNA e catalisa sua integração em matrizes CRISPR. [111] [112] [113] Novos espaçadores geralmente são adicionados no início do CRISPR ao lado da sequência líder, criando um registro cronológico de infecções virais. [114] Em E. coli uma proteína semelhante à histona chamada fator de integração do hospedeiro (IHF), que se liga à sequência líder, é responsável pela precisão dessa integração. [115] IHF também aumenta a eficiência de integração no sistema tipo I-F de Pectobacterium atrosepticum. [116] mas em outros sistemas diferentes fatores de host podem ser necessários [117]

Motivos adjacentes do Protospacer Editar

A análise bioinformática de regiões de genomas de fago que foram excisados ​​como espaçadores (denominados protoespaçadores) revelou que eles não foram selecionados aleatoriamente, mas em vez disso foram encontrados adjacentes a sequências de DNA curtas (3-5 bp) denominadas motivos adjacentes de protoespaçador (PAM). A análise dos sistemas CRISPR-Cas mostrou que os PAMs são importantes para os tipos I e II, mas não os sistemas do tipo III durante a aquisição. [32] [118] [119] [120] [121] [122] Em sistemas tipo I e tipo II, os protoespaçadores são excisados ​​em posições adjacentes a uma sequência PAM, com a outra extremidade do espaçador cortado usando um mecanismo de régua, mantendo assim a regularidade do tamanho do espaçador na matriz CRISPR. [123] [124] A conservação da sequência PAM difere entre os sistemas CRISPR-Cas e parece estar evolutivamente ligada ao Cas1 e à sequência líder. [122] [125]

Novos espaçadores são adicionados a uma matriz CRISPR de uma maneira direcional, [30] ocorrendo preferencialmente, [78] [118] [119] [126] [127], mas não exclusivamente, adjacente [121] [124] à sequência líder. Análise do sistema tipo I-E de E. coli demonstraram que a primeira repetição direta adjacente à sequência líder é copiada, com o espaçador recém-adquirido inserido entre a primeira e a segunda repetições diretas. [102] [123]

A sequência PAM parece ser importante durante a inserção do espaçador em sistemas do tipo I-E. Essa sequência contém um nucleotídeo final fortemente conservado (nt) adjacente ao primeiro nt do protoespaçador. Este nt se torna a base final na primeira repetição direta. [103] [128] [129] Isso sugere que a máquina de aquisição do espaçador gera saliências de fita simples na penúltima posição da repetição direta e no PAM durante a inserção do espaçador. No entanto, nem todos os sistemas CRISPR-Cas parecem compartilhar este mecanismo, pois os PAMs em outros organismos não apresentam o mesmo nível de conservação na posição final. [125] É provável que, nesses sistemas, uma extremidade cega seja gerada no final da repetição direta e do protoespaçador durante a aquisição.

Variantes de inserção Editar

Análise de Sulfolobus solfataricus Os CRISPRs revelaram complexidades adicionais ao modelo canônico de inserção do espaçador, já que um de seus seis loci CRISPR inseriu novos espaçadores aleatoriamente em toda a sua matriz CRISPR, em oposição à inserção mais próxima da sequência líder. [124]

Vários CRISPRs contêm muitos espaçadores para o mesmo fago. O mecanismo que causa esse fenômeno foi descoberto no sistema tipo I-E de E. coli. Um aprimoramento significativo na aquisição do espaçador foi detectado onde os espaçadores já têm como alvo o fago, mesmo incompatibilidades com o protoespaçador. Este ‘priming’ requer que as proteínas Cas envolvidas na aquisição e interferência interajam umas com as outras. Espaçadores recém-adquiridos que resultam do mecanismo de escorva são sempre encontrados na mesma fita que o espaçador de escorva. [103] [128] [129] Essa observação levou à hipótese de que a máquina de aquisição desliza ao longo do DNA estranho após o priming para encontrar um novo protoespaçador. [129]

Biogenesis Edit

CRISPR-RNA (crRNA), que mais tarde guia a Cas nuclease para o alvo durante a etapa de interferência, deve ser gerado a partir da sequência CRISPR. O crRNA é inicialmente transcrito como parte de uma única transcrição longa que abrange grande parte da matriz CRISPR. [28] Este transcrito é então clivado pelas proteínas Cas para formar crRNAs. O mecanismo de produção de crRNAs difere entre os sistemas CRISPR / Cas. Em sistemas tipo I-E e tipo I-F, as proteínas Cas6e e Cas6f, respectivamente, reconhecem laços de haste [130] [131] [132] criados pelo emparelhamento de repetições idênticas que flanqueiam o crRNA. [133] Essas proteínas Cas clivam o transcrito mais longo na borda da região emparelhada, deixando um único crRNA junto com um pequeno remanescente da região de repetição emparelhada.

Os sistemas do tipo III também usam Cas6, no entanto, suas repetições não produzem loops de haste. Em vez disso, a clivagem ocorre pelo transcrito mais longo envolvendo o Cas6 para permitir a clivagem logo a montante da sequência de repetição. [134] [135] [136]

Type II systems lack the Cas6 gene and instead utilize RNaseIII for cleavage. Functional type II systems encode an extra small RNA that is complementary to the repeat sequence, known as a trans-activating crRNA (tracrRNA). [40] Transcription of the tracrRNA and the primary CRISPR transcript results in base pairing and the formation of dsRNA at the repeat sequence, which is subsequently targeted by RNaseIII to produce crRNAs. Unlike the other two systems the crRNA does not contain the full spacer, which is instead truncated at one end. [91]

CrRNAs associate with Cas proteins to form ribonucleotide complexes that recognize foreign nucleic acids. CrRNAs show no preference between the coding and non-coding strands, which is indicative of an RNA-guided DNA-targeting system. [5] [39] [99] [103] [137] [138] [139] The type I-E complex (commonly referred to as Cascade) requires five Cas proteins bound to a single crRNA. [140] [141]

Interference Edit

During the interference stage in type I systems the PAM sequence is recognized on the crRNA-complementary strand and is required along with crRNA annealing. In type I systems correct base pairing between the crRNA and the protospacer signals a conformational change in Cascade that recruits Cas3 for DNA degradation.

Type II systems rely on a single multifunctional protein, Cas9, for the interference step. [91] Cas9 requires both the crRNA and the tracrRNA to function and cleaves DNA using its dual HNH and RuvC/RNaseH-like endonuclease domains. Basepairing between the PAM and the phage genome is required in type II systems. However, the PAM is recognized on the same strand as the crRNA (the opposite strand to type I systems).

Type III systems, like type I require six or seven Cas proteins binding to crRNAs. [142] [143] The type III systems analysed from S. solfataricus e P. furiosus both target the mRNA of phages rather than phage DNA genome, [83] [143] which may make these systems uniquely capable of targeting RNA-based phage genomes. [82] Type III systems were also found to target DNA in addition to RNA using a different Cas protein in the complex, Cas10. [144] The DNA cleavage was shown to be transcription dependent. [145]

The mechanism for distinguishing self from foreign DNA during interference is built into the crRNAs and is therefore likely common to all three systems. Throughout the distinctive maturation process of each major type, all crRNAs contain a spacer sequence and some portion of the repeat at one or both ends. It is the partial repeat sequence that prevents the CRISPR-Cas system from targeting the chromosome as base pairing beyond the spacer sequence signals self and prevents DNA cleavage. [146] RNA-guided CRISPR enzymes are classified as type V restriction enzymes.

The cas genes in the adaptor and effector modules of the CRISPR-Cas system are believed to have evolved from two different ancestral modules. A transposon-like element called casposon encoding the Cas1-like integrase and potentially other components of the adaptation module was inserted next to the ancestral effector module, which likely functioned as an independent innate immune system. [147] The highly conserved cas1 and cas2 genes of the adaptor module evolved from the ancestral module while a variety of class 1 effector cas genes evolved from the ancestral effector module. [148] The evolution of these various class 1 effector module cas genes was guided by various mechanisms, such as duplication events. [149] On the other hand, each type of class 2 effector module arose from subsequent independent insertions of mobile genetic elements. [150] These mobile genetic elements took the place of the multiple gene effector modules to create single gene effector modules that produce large proteins which perform all the necessary tasks of the effector module. [150] The spacer regions of CRISPR-Cas systems are taken directly from foreign mobile genetic elements and thus their long term evolution is hard to trace. [151] The non-random evolution of these spacer regions has been found to be highly dependent on the environment and the particular foreign mobile genetic elements it contains. [152]

CRISPR/Cas can immunize bacteria against certain phages and thus halt transmission. For this reason, Koonin described CRISPR/Cas as a Lamarckian inheritance mechanism. [153] However, this was disputed by a critic who noted, "We should remember [Lamarck] for the good he contributed to science, not for things that resemble his theory only superficially. Indeed, thinking of CRISPR and other phenomena as Lamarckian only obscures the simple and elegant way evolution really works". [154] But as more recent studies have been conducted, it has become apparent that the acquired spacer regions of CRISPR-Cas systems are indeed a form of Lamarckian evolution because they are genetic mutations that are acquired and then passed on. [155] On the other hand, the evolution of the Cas gene machinery that facilitates the system evolves through classic Darwinian evolution. [155]

Coevolution Edit

Analysis of CRISPR sequences revealed coevolution of host and viral genomes. [156] Cas9 proteins are highly enriched in pathogenic and commensal bacteria. CRISPR/Cas-mediated gene regulation may contribute to the regulation of endogenous bacterial genes, particularly during interaction with eukaryotic hosts. Por exemplo, Francisella novicida uses a unique, small, CRISPR/Cas-associated RNA (scaRNA) to repress an endogenous transcript encoding a bacterial lipoprotein that is critical for F. novicida to dampen host response and promote virulence. [157]

The basic model of CRISPR evolution is newly incorporated spacers driving phages to mutate their genomes to avoid the bacterial immune response, creating diversity in both the phage and host populations. To resist a phage infection, the sequence of the CRISPR spacer must correspond perfectly to the sequence of the target phage gene. Phages can continue to infect their hosts given point mutations in the spacer. [146] Similar stringency is required in PAM or the bacterial strain remains phage sensitive. [119] [146]

Rates Edit

A study of 124 S. thermophilus strains showed that 26% of all spacers were unique and that different CRISPR loci showed different rates of spacer acquisition. [118] Some CRISPR loci evolve more rapidly than others, which allowed the strains' phylogenetic relationships to be determined. A comparative genomic analysis showed that E. coli e S. enterica evolve much more slowly than S. thermophilus. The latter's strains that diverged 250 thousand years ago still contained the same spacer complement. [158]

Metagenomic analysis of two acid-mine-drainage biofilms showed that one of the analyzed CRISPRs contained extensive deletions and spacer additions versus the other biofilm, suggesting a higher phage activity/prevalence in one community than the other. [78] In the oral cavity, a temporal study determined that 7–22% of spacers were shared over 17 months within an individual while less than 2% were shared across individuals. [127]

From the same environment a single strain was tracked using PCR primers specific to its CRISPR system. Broad-level results of spacer presence/absence showed significant diversity. However, this CRISPR added 3 spacers over 17 months, [127] suggesting that even in an environment with significant CRISPR diversity some loci evolve slowly.

CRISPRs were analysed from the metagenomes produced for the human microbiome project. [159] Although most were body-site specific, some within a body site are widely shared among individuals. One of these loci originated from streptococcal species and contained ≈15,000 spacers, 50% of which were unique. Similar to the targeted studies of the oral cavity, some showed little evolution over time. [159]

CRISPR evolution was studied in chemostats using S. thermophilus to directly examine spacer acquisition rates. In one week, S. thermophilus strains acquired up to three spacers when challenged with a single phage. [160] During the same interval the phage developed single nucleotide polymorphisms that became fixed in the population, suggesting that targeting had prevented phage replication absent these mutations. [160]

Outro S. thermophilus experiment showed that phages can infect and replicate in hosts that have only one targeting spacer. Yet another showed that sensitive hosts can exist in environments with high phage titres. [161] The chemostat and observational studies suggest many nuances to CRISPR and phage (co)evolution.

CRISPRs are widely distributed among bacteria and archaea [87] and show some sequence similarities. [133] Their most notable characteristic is their repeating spacers and direct repeats. This characteristic makes CRISPRs easily identifiable in long sequences of DNA, since the number of repeats decreases the likelihood of a false positive match. [162]

Analysis of CRISPRs in metagenomic data is more challenging, as CRISPR loci do not typically assemble, due to their repetitive nature or through strain variation, which confuses assembly algorithms. Where many reference genomes are available, polymerase chain reaction (PCR) can be used to amplify CRISPR arrays and analyse spacer content. [118] [127] [163] [164] [165] [166] However, this approach yields information only for specifically targeted CRISPRs and for organisms with sufficient representation in public databases to design reliable polymerase chain reaction (PCR) primers. Degenerate repeat-specific primers can be used to amplify CRISPR spacers directly from environmental samples amplicons containing two or three spacers can be then computationally assembled to reconstruct long CRISPR arrays. [166]

The alternative is to extract and reconstruct CRISPR arrays from shotgun metagenomic data. This is computationally more difficult, particularly with second generation sequencing technologies (e.g. 454, Illumina), as the short read lengths prevent more than two or three repeat units appearing in a single read. CRISPR identification in raw reads has been achieved using purely de novo identification [167] or by using direct repeat sequences in partially assembled CRISPR arrays from contigs (overlapping DNA segments that together represent a consensus region of DNA) [159] and direct repeat sequences from published genomes [168] as a hook for identifying direct repeats in individual reads.

Another way for bacteria to defend against phage infection is by having chromosomal islands. A subtype of chromosomal islands called phage-inducible chromosomal island (PICI) is excised from a bacterial chromosome upon phage infection and can inhibit phage replication. [169] PICIs are induced, excised, replicated and finally packaged into small capsids by certain staphylococcal temperate phages. PICIs use several mechanisms to block phage reproduction. In first mechanism PICI-encoded Ppi differentially blocks phage maturation by binding or interacting specifically with phage TerS, hence blocks phage TerS/TerL complex formation responsible for phage DNA packaging. In second mechanism PICI CpmAB redirect the phage capsid morphogenetic protein to make 95% of SaPI-sized capsid and phage DNA can package only 1/3rd of their genome in these small capsid and hence become nonviable phage. [170] The third mechanism involves two proteins, PtiA and PtiB, that target the LtrC, which is responsible for the production of virion and lysis proteins. This interference mechanism is modulated by a modulatory protein, PtiM, binds to one of the interference-mediating proteins, PtiA, and hence achieving the required level of interference. [171]

One study showed that lytic ICP1 phage, which specifically targets Vibrio cholerae serogroup O1, has acquired a CRISPR/Cas system that targets a V. cholera PICI-like element. The system has 2 CRISPR loci and 9 Cas genes. It seems to be homologous to the I-F system found in Yersinia pestis. Moreover, like the bacterial CRISPR/Cas system, ICP1 CRISPR/Cas can acquire new sequences, which allows phage and host to co-evolve. [172]

Certain archaeal viruses were shown to carry mini-CRISPR arrays containing one or two spacers. It has been shown that spacers within the virus-borne CRISPR arrays target other viruses and plasmids, suggesting that mini-CRISPR arrays represent a mechanism of heterotypic superinfection exclusion and participate in interviral conflicts. [166]

CRISPR gene editing Edit

CRISPR technology has been applied in the food and farming industries to engineer probiotic cultures and to immunize industrial cultures (for yogurt, for instance) against infections. It is also being used in crops to enhance yield, drought tolerance and nutritional value. [173]

By the end of 2014 some 1000 research papers had been published that mentioned CRISPR. [174] [175] The technology had been used to functionally inactivate genes in human cell lines and cells, to study Candida albicans, to modify yeasts used to make biofuels and to genetically modify crop strains. [175] Hsu and his colleagues state that the ability to manipulate the genetic sequences allows for reverse engineering that can positively affect biofuel production [176] CRISPR can also be used to change mosquitos so they cannot transmit diseases such as malaria. [177] CRISPR-based approaches utilizing Cas12a have recently been utilized in the successful modification of a broad number of plant species. [178]

In July 2019, CRISPR was used to experimentally treat a patient with a genetic disorder. The patient was a 34-year-old woman with sickle cell disease. [179]

In February 2020, progress was made on HIV treatments with 60-80% of the DNA removed in mice and some being completely free from the virus after edits involving both LASER ART, a new anti-retroviral therapy, and CRISPR. [180]

In March 2020, CRISPR-modified virus was injected into a patient's eye in an attempt to treat Leber congenital amaurosis. [181]

In the future, CRISPR gene editing could potentially be used to create new species or revive extinct species from closely related ones. [182]

CRISPR-based re-evaluations of claims for gene-disease relationships have led to the discovery of potentially important anomalies. [183]

CRISPR as diagnostic tool Edit

CRISPR associated nucleases have shown to be useful as a tool for molecular testing due to their ability to specifically target nucleic acid sequences in a high background of non-target sequences. In 2016, the Cas9 nuclease was used to deplete unwanted nucleotide sequences in next-generation sequencing libraries while requiring only 250 picograms of initial RNA input. [184] Beginning in 2017, CRISPR associated nucleases were also used for direct diagnostic testing of nucleic acids, down to single molecule sensitivity. [185] [186]

By coupling CRISPR-based diagnostics to additional enzymatic processes, the detection of molecules beyond nucleic acids is possible. One example of a coupled technology is SHERLOCK-based Profiling of IN vitro Transcription (SPRINT). SPRINT can be used to detect a variety of substances, such as metabolites in patient samples or contaminants in environmental samples, with high throughput or with portable point-of-care devices. [187] CRISPR/Cas platforms are also being explored for detection [188] [189] [190] [191] [192] and inactivation of SARS-CoV-2, the virus that causes COVID-19. [193]


Informação sobre o autor

Present address: Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Afiliações

Innovative Genomics Institute, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Chris D. Richardson, Katelynn R. Kazane, Sharon J. Feng, Elena Zelin, Nicholas L. Bray & Jacob E. Corn

Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Chris D. Richardson, Katelynn R. Kazane, Sharon J. Feng, Elena Zelin, Nicholas L. Bray, Axel J. Schäfer, Stephen N. Floor & Jacob E. Corn

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Contribuições

C.D.R. and J.E.C. designed the experiments. C.D.R., A.J.S. and S.N.F. performed the pooled screens. C.D.R., K.R.K. and S.J.F. performed the follow-up experiments. C.D.R., N.L.B. and J.E.C. analyzed the data. E.Z. and K.R.K. generated the knockout clones. C.D.R. and J.E.C. escreveu o manuscrito.

Autor correspondente


Conclusions and perspectives

The continuous identification and characterization of highly useful new CRISPR proteins reveal the enormous potential behind CRISPR/Cas. While CRISPR/Cas9 initially allowed the guidance of one specific enzymatic activity to one or, by the use of multiple sgRNAs, to various target sites, it is now possible to realize multidimensional approaches that enable the parallel employment of a number of activities [98] . This was recently demonstrated through the simultaneous application of different Cas9 orthologues either for imaging or GT experiments [23, 61] . The establishment of aptamer-based sgRNAs that can recruit a variety of potential RBPs allows considerable flexibility for employment of different enzymatic activities simultaneously (e.g. [99] ). The constantly increasing set of applicable CRISPR proteins expands the possible number and flexibility of parallel genomic manipulations even further. In particular, the availability of Cas12a opens up new target sites and Cas13 now enables the manipulation of RNA on several levels. New CRISPR based methods enabling often unexpected new applications are continuously being developed, as recently evidenced by SHERLOCK and DETECTR using CRISPR for highly sensitive nucleic acid detection (Fig. 3E) [83, 100] . Through the combination of DNA and RNA editing systems, the cellular transcriptome can now be manipulated on the transcriptional and posttranscriptional level simultaneously, allowing delicate and also reversible fine-tuning of gene expression. Previous experiments only indicated the possibilities to edit genomes or influence cell metabolism, and current applications merely give us a hint of the amount of further discoveries that await to change molecular biology.


1 INTRODUCTION

Genome editing is a type of genetic engineering where DNA is manipulated at the single-base level. It is revolutionizing the biomedical research field and holds promise to treat or prevent many human genetic disorders. The perfect genome-editing tool has to be able to alter a genomic sequence efficiently, showing high DNA sequence specificity, and minimal off-target effects. 1 Genome-editing strategies were first developed in yeast 2, 3 and then in mammalian cells, 4, 5 in which small portions of the genome were substituted with exogenous donor DNA sequences via the endogenous homologous recombination repair pathway. In the late 80s, this same natural homologous recombination-based approach was used in mouse embryonic stem cells to generate mice with a specific genotype. 6 Since then, this technique has enabled the study of human diseases in mouse and other animal models and contributed considerably in the process of drug discovery and development.

Nevertheless, this approach has several limitations, such as its low editing efficiency and unwanted genome-editing events where the donor DNA template is more frequently inserted into the genome randomly than at the desired location. 7 To overcome these limitations, several groups have developed tools that allowed the introduction of site-specific double-stranded breaks (DSBs) into a genomic locus of interest using ‘meganucleases’. This refers to endonucleases with an extremely rare recognition site that recognizes and cleaves specific DNA sequences in order to stimulate homology-directed repair (HDR) mechanism. 8-11 This approach requires that a DNA donor template with ends homologous to the break site is delivered and used by the polymerase to copy information along the break site. 9, 10 However, besides HDR, non-homologous end joining (NHEJ) also occurs at the sites of DSBs. 11 NHEJ is able to unify the two ends of the break by introducing a random nucleotide insertion or deletion (indels). While NHEJ repair mechanism is exceptionally successful in obtaining functional gene knockouts, the generation of indels emerges as an undesired side effect. 12 Therefore, the generation of site-specific DSBs that specifically trigger HDR and simultaneously blunt NHEJ activity is still a current challenge in the field.

Alternatively, site-directed zinc finger nucleases (ZFs) 13-15 and transcription-activator-like effector nucleases (TALENs) 16, 17 are two approaches that use the principles of DNA-protein recognition. Both ZFs and TALENs are fusion proteins made up of an engineered DNA binding domain fused to a non-specific nuclease domain from the FokI restriction enzyme. Unlike DNA-binding proteins, ZF and TALEN amino acid sequences can be designed to cleave virtually any target sequence in the genome with high specificity. 17-22 However, the routine use of these editing tools in the laboratory has been impaired by difficulties in protein design, synthesis and validation. 23

The development of the CRISPR/Cas9 system has proven to be a major scientific breakthrough and made gene editing more accessible. Distinct from the protein-guided DNA cleavage used by TALENs and ZFs, CRISPR/Cas9 depends on a small RNA to introduce a site-specific DSB. 24-26 The requirements of the endonuclease Cas9 to match a DNA target sequence are elegant and simple: It only requires a 20-nucleotide ‘guideRNA’ (sgRNA) that base pairs with the target DNA and the presence of a DNA ‘protospacer-adjacent motif’ (PAM), a short DNA sequence adjacent to the complementary region that varies according to the bacterial species of the Cas9 protein being used. 23-29 This two-pronged system in which the sgRNA guides the Cas9 nuclease to target any DNA sequence of interest has replaced the laborious protein design procedure associated with ZFs and TALENs. 1, 24-26

The simplicity of CRISPR/Cas9 technology coupled with a unique DNA cleaving mechanism, the ability to target multiple regions, and the existence of different type II CRISPR-Cas system variants, has enabled notable progresses using this cost-effective and user-friendly technology to precise and efficiently modify the genomic DNA of a wide collection of cells and organisms. 23 Although the CRISPR/Cas9 system has been widely adopted as the preferred genetic editing tool for most researches worldwide, the use of this technology in pre-clinical and clinical setting is now bursting with new and exciting studies. In this review, we summarize some of the recent disease-focused studies that have applied the CRISPR/Cas9 system and explore the advantages of this technology as well as discuss the major obstacles involved in translating it to the clinic.


Resumo

Several plant pathogens severely affect crop yield and quality, thereby threatening global food security. In order to cope with this challenge, genetic improvement of plant disease resistance is required for sustainable agricultural production, for which conventional breeding is unlikely to do enough. Luckily, genome editing systems that particularly clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) has revolutionized crop improvement by enabling robust and precise targeted genome modifications. It paves the way towards new methods for genetic improvement of plant disease resistance and accelerates resistance breeding. In this review, the challenges, limitations and prospects for conventional breeding and the applications of CRISPR/Cas9 system for the development of transgene-free disease-resistant crops are discussed.


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