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Choque térmico vs eletroporação

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Tenho transformado E. coli por choque térmico para inserir oligonucleotídeos (cerca de 50 nt); no entanto, nenhum de meus experimentos deu resultados positivos até agora. Começo a questionar a eficiência da transformação química, especialmente para fragmentos curtos de DNA. Existe uma diferença tão notável entre transformação química e eletrotransformação?

EDITAR: Estou verificando a expansão da matriz CRISPR, portanto, meus oligos têm um comprimento e uma estrutura de protoespaçador. Estou usando células BL21 (DE3) que têm um T7 induzível por IPTG que estou transformando primeiro com um plasmídeo Cas1-Cas2. Então, eu induzo as células a fim de expressar essas proteínas, torná-las competentes, e as transformo mais uma vez, mas com os oligos e um plasmídeo eGFP (para algum tipo de seleção). Para verificar se há resultados positivos, estou amplificando a junção líder-repetição do arranjo CRISPR e comparo seu comprimento (via eletroforese) com um arranjo normal que não tem integrantes.


Como você detecta uma transfecção potencialmente positiva? Fragmentos curtos podem ter estruturas terciárias adequadas, o que pode fazer com que se comportem de maneira diferente do que você esperaria. Além disso, o DNA e o RNA não circulares são direcionados muito mais rapidamente para degradação na maioria das células se os sinais da cabeça direita ou da cauda estiverem ausentes.

Para sua pergunta: eletroporação pulsada com bactérias bem preparadas (estado, tampão, ...) é geralmente 5-100 vezes mais eficiente do que bactérias quimicamente competentes.


Diluir a reação de ligação para eletroporação - (18 / jun / 2008)

Eu faço tantas vezes a eletroporação para BL21 E.coli por ligadura direta de 1ul, mas no eletroporador sempre vem o flash, então é importante diluir a reação de ligação e qual a melhor maneira de diluí-la.

Sim, dilua com ddH20 10 vezes e use 1ul.

A eletroporação é um método muito eficiente (vs. choque térmico), portanto, usar a reação de ligação diluída não será um problema. Na verdade, na minha experiência, isso compromete a eficiência.

Sim, dilua com ddH20 10 vezes e use 1ul.

A eletroporação é um método muito eficiente (vs. choque térmico), portanto, usar a reação de ligação diluída não será um problema. Na verdade, na minha experiência, isso compromete a eficiência.

obrigado pela sua ideia hoje fiz transformação com mistura diluída e sem flash e amanhã vou verificar o não. da colônia obrigado

Sim, dilua com ddH20 10 vezes e use 1ul.

A eletroporação é um método muito eficiente (vs. choque térmico), portanto, usar a reação de ligação diluída não será um problema. Na verdade, na minha experiência, isso compromete a eficiência.

obrigado pela sua ideia hoje fiz transformação com mistura diluída e sem flash e amanhã vou verificar o não. da colônia obrigado

contador de células daer
não estou feliz porque mesmo na placa de controle nenhuma colônia o que posso fazer

Uma sugestão. Flutue um pequeno papel de filtro Milipore na água-dd em uma placa de petri ... e simplesmente coloque 5-10uL de sua mistura de ligadura neles por uma hora ou mais. Depois disso, recupere a mistura de ligadura com uma pipeta. e vá para a transformação. O princípio, como você já deve ter adivinhado, é a diálise & quotmicro & quot para dessalinização ... espero que funcione. deixe-me saber..

1. Existem várias outras coisas que podem estar dando errado, portanto, você também precisa solucionar outros aspectos. Começando com a cepa bacteriana, mídia, antibióticos, eletroporador, cubetas, tempos de incubação, etc. cada eventualidade.

É uma péssima ideia tentar transformar cepas BL21 diretamente com um produto de ligação. Você economizará tempo e sofrimento ao se transformar primeiro em DH5a, DH10B ou outra cepa de clonagem, fazendo um miniprep e transformando o BL21 com o DNA do plasmídeo. BL21 tem uma eficiência de transformação muito baixa.


Efeitos biológicos de choque elétrico e desnaturação por calor e oxidação de moléculas, membranas e funções celulares

A exposição direta de células em suspensão a pulsos elétricos intensos é conhecida por produzir danos às membranas celulares e organizações supramoleculares das células, e desnaturação de macromoléculas, bem como lesões e rupturas observadas em pacientes com trauma elétrico. Assim, o sistema tem sido usado como um modelo de laboratório para investigar as bases bioquímicas da lesão elétrica. Um pulso elétrico intenso pode produzir dois efeitos principais nas células - um causado pelo campo, ou potencial elétrico, e outro pela corrente, ou energia elétrica. O potencial transmembrana induzido por campo pode produzir mudanças eletroconformacionais de canais iônicos e bombas de íons e, quando o potencial excede a resistência dielétrica da membrana celular (aproximadamente 500 mV para uma largura de pulso de alguns ms), danos eletroconformacionais e eletroporações de proteínas de membrana e bicamadas lipídicas. Esses eventos levam à passagem de corrente elétrica através das células porosas da membrana e ao aquecimento das membranas celulares e do conteúdo citoplasmático. A subseqüente desnaturação das membranas celulares e macromoléculas citoplasmáticas ocasiona muitas reações bioquímicas complexas, incluindo a oxidação de proteínas e lipídios. Os efeitos combinados podem paralisar as células além do reparo. Esta comunicação se concentrará nos efeitos térmicos do choque elétrico. Após uma breve revisão do estado atual do conhecimento sobre desnaturação térmica de enzimas solúveis e proteínas musculares, este artigo irá descrever experimentos sobre a desnaturação térmica de componentes e funções celulares, como nucleossomos, e a cadeia de transporte de elétrons e enzimas sintéticas de ATP do membranas internas mitocondriais. Os dados mostrarão que a peroxidação lipídica e a subsequente perda da capacidade de transdução de energia das células podem ocorrer mesmo em temperaturas moderadas entre 40 graus C e 45 graus C. No entanto, a peroxidação lipídica pode ser evitada com reagentes redutores, como mercaptoetanol, ditiotreitol, e ácido ascórbico. A reativação de proteínas celulares desnaturadas e funções também pode ser possível e uma estratégia para fazê-lo é discutida.


Transformação de DNA de plasmídeo em E. coli usando o método de choque térmico

A transformação do DNA de plasmídeo em E. coli usando o método de choque térmico é uma técnica básica da biologia molecular. Consiste na inserção de um plasmídeo estranho ou produto de ligação nas bactérias. Este protocolo de vídeo descreve o método tradicional de transformação usando bactérias quimicamente competentes disponíveis comercialmente da Genlantis. Após uma curta incubação em gelo, uma mistura de bactérias quimicamente competentes e DNA é colocada a 42 graus C por 45 segundos (choque térmico) e então colocada de volta no gelo. O meio SOC é adicionado e as células transformadas são incubadas a 37 graus C durante 30 min com agitação. Para garantir o isolamento das colônias, independentemente da eficiência da transformação, duas quantidades de bactérias transformadas são colocadas em placas. Este protocolo tradicional pode ser usado com sucesso para transformar a maioria das bactérias competentes disponíveis comercialmente. As turbocélulas da Genlantis também podem ser usadas em um novo protocolo de transformação de 3 minutos, descrito no manual de instruções.


Transformação de DNA de plasmídeo em E. coli usando o método de choque térmico

A transformação do DNA de plasmídeo em E. coli usando o método de choque térmico é uma técnica básica da biologia molecular. Consiste na inserção de um plasmídeo estranho ou produto de ligação nas bactérias. Este protocolo de vídeo descreve o método tradicional de transformação usando bactérias quimicamente competentes disponíveis comercialmente da Genlantis. Após uma curta incubação em gelo, uma mistura de bactérias quimicamente competentes e DNA é colocada a 42 & # x000b0C por 45 segundos (choque térmico) e então colocada de volta no gelo. O meio SOC é adicionado e as células transformadas são incubadas a 37 & # x000b0C durante 30 min com agitação. Para garantir o isolamento das colônias, independentemente da eficiência da transformação, duas quantidades de bactérias transformadas são colocadas em placas. Este protocolo tradicional pode ser usado com sucesso para transformar a maioria das bactérias competentes disponíveis comercialmente. As turbocélulas da Genlantis também podem ser usadas em um novo protocolo de transformação de 3 minutos, descrito no manual de instruções.


Métodos de transferência de genes: 6 métodos

Este artigo lança luz sobre os seis métodos de transferência de genes. Os seis métodos são: (1) Transformação (2) Conjugação (3) Eletroporação (4) Transferência de gene mediada por lipossomas (5) Transdução e (6) Transferência direta de DNA.

Método # 1. Transformação:

A transformação é o método de introdução de DNA estranho em células bacterianas (por exemplo, E. coli). A captação de DNA de plasmídeo por E. coli é realizada em CaCl gelado2 (0-5 ° C), e um choque térmico subsequente (37-45 ° C por cerca de 90 segundos). Por esta técnica, a frequência de transformação, que se refere à fração da população de células que pode ser transferida, é razoavelmente boa, e. aproximadamente uma célula para 1000 (10 -3) células.

Eficiência de transformação:

Refere-se ao número de transformantes por micrograma de DNA adicionado. Para E. coli, transformação por plasmídeo, a eficiência de transformação é de cerca de 107 a 108 células por micrograma de DNA de plasmídeo intacto. As células bacterianas que podem absorver DNA são consideradas competentes. A competência pode ser aprimorada alterando as condições de crescimento.

O mecanismo do processo de transformação não é totalmente compreendido. Acredita-se que o CaCI2 afeta a parede celular, quebra em regiões localizadas e também é responsável pela ligação do DNA à superfície celular. Um breve choque térmico (ou seja, o aumento repentino na temperatura de 5 ° C a 40 ° C) estimula a absorção de DNA. Em geral, DNAs de grande porte são menos eficientes na transformação.

Outros métodos químicos para transformação:

Fosfato de cálcio (no lugar de CaCl2) é preferido para a transferência de DNA para células em cultura. Às vezes, o fosfato de cálcio pode resultar em precipitado e toxicidade para as células. Alguns trabalhadores usam dietilaminoetil dextran (DEAE -dextran) para transferência de DNA.

Método # 2. Conjugação:

A conjugação é um processo de recombinação microbiana natural. Durante a conjugação, duas bactérias vivas (um doador e um receptor) se unem, unem-se por pontes citoplasmáticas e transferem o DNA de fita simples (do doador para o receptor). Dentro da célula receptora, o novo DNA pode se integrar ao cromossomo (bastante raro) ou pode permanecer livre (como é o caso dos plasmídeos).

A conjugação pode ocorrer entre as células de diferentes gêneros de bactérias (por exemplo, células de Salmonella e Shigella). Isso contrasta com a transformação que ocorre entre as células de um gênero bacteriano. Assim, por conjugação, a transferência de genes de duas bactérias diferentes e não relacionadas é possível.

O fenômeno natural da conjugação é explorado para a transferência de genes. Isto é conseguido através da transferência de DNA de inserção de plasmídeo de uma célula para outra. Em geral, os plasmídeos não possuem funções conjugativas e, portanto, eles não são capazes de transferir DNA para as células receptoras. No entanto, alguns plasmídeos com propriedades conjugativas podem ser preparados e usados.

Método # 3. Eletroporação:

A eletroporação é baseada no princípio de que pulsos elétricos de alta voltagem podem induzir a fusão das membranas plasmáticas das células. Assim, a eletroporação é uma técnica que envolve a permeabilização de membrana mediada por campo elétrico. Choques elétricos também podem induzir a captação celular de DNA exógeno (que se acredita ser através dos poros formados por pulsos elétricos) da solução de suspensão.

A eletroporação é uma técnica simples e rápida para introduzir nas células genes de vários organismos (microrganismos, plantas e animais).

A técnica básica de eletroporação para a transferência de genes para células de mamíferos é ilustrada na Fig. 6.11. As células são colocadas em uma solução contendo DNA e submetidas a choques elétricos para causar buracos nas membranas. Os fragmentos de DNA estranhos entram pelos orifícios no citoplasma e, em seguida, no núcleo.

A eletroporação é uma forma eficaz de transformar células de E. coli contendo plasmídeos com DNAs de inserção com mais de 100 kb. A eficiência de transformação é de cerca de 109 transformantes por micrograma de DNA para plasmídeos pequenos (cerca de 3 kb) e cerca de IO6 para plasmídeos grandes (cerca de 130 kb).

Método # 4. Transferência de genes mediada por lipossomas:

Os lipossomas são moléculas lipídicas circulares, que têm um interior aquoso que pode transportar ácidos nucleicos. Várias técnicas foram desenvolvidas para encapsular DNA em lipossomas. A transferência gênica mediada por lipossomas, conhecida como lipofecção, é ilustrada na Fig. 6.12.

No tratamento do fragmento de DNA com lipossomas, os pedaços de DNA são encapsulados dentro dos lipossomas. Esses lipossomas podem aderir às membranas celulares e se fundir com elas para transferir fragmentos de DNA. Assim, o DNA entra na célula e depois no núcleo. Os lipossomas carregados positivamente complexam muito eficientemente com o DNA, ligam-se às células e transferem o DNA rapidamente.

A lipofecção é uma técnica muito eficiente e é utilizada para a transferência de genes para células bacterianas, animais e vegetais. T

Método # 5. Transdução:

Às vezes, o DNA estranho pode ser embalado dentro de vírus animais. Esses vírus podem infectar as células naturalmente e introduzir o DNA nas células hospedeiras. A transferência de DNA por esta abordagem é conhecida como transdução.

Método # 6. Transferência direta de DNA:

É possível transferir diretamente o DNA para o núcleo da célula. Microinjeção e bombardeio de partículas são as duas técnicas comumente utilizadas para esse fim.

A transferência de DNA por microinjeção é geralmente usada para células em cultura. Essa técnica também é útil para introduzir DNA em células grandes, como oócitos, ovos e células de embriões em estágio inicial. O termo transfecção é usado para a transferência de DNA para células eucarióticas, por vários meios físicos ou químicos.


Choque térmico vs eletroporação - Biologia

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ELETROPORAÇÃO DE PROTOPLASTOS EMBRIOGÊNICOS DE LARANJA DOCE (CITRUS SINENSIS (L.) OSBECK) E REGENERAÇÃO DE PLANTAS TRANSFORMADAS

RANDALL P. NIEDZ, 1,2 W. L. McKENDREE, 1 R. G. SHATTERS Jr. 1

1 Agricultural Research Service, US Horticultural Research Laboratory, 2001 South Rock Road, Ft. Pierce, FL 34945-3030
2 Autor para quem a correspondência deve ser enviada: [email protected]

Inclui PDF e HTML, quando disponível

Este artigo está disponível apenas para assinantes.
Não está disponível para venda individual.

As condições de eletroporação foram otimizadas para a transfecção de protoplastos isolados de uma linha celular embriogênica de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Hamlin]. Força do campo elétrico (375-450 V cm −1), concentração de DNA vetorial (100 μg ml −1), concentração de DNA portador (100 μg ml −1), tampão de eletroporação (pH 8) e choque térmico pré-eletroporação de protoplastos (5 min a 45 ° C) foram otimizados. O vetor plasmídeo pBI221 contendo a sequência de codificação da β-glucuronidase (GUS) sob o controle do promotor CaMV 35S foi usado e a atividade de GUS foi medida 24 h após a eletroporação. Todas as variáveis ​​afetaram significativamente a eficiência de transfecção e quando as condições ideais para cada uma foram combinadas, a atividade de GUS foi 7714 pmol 4-metilumbeliferona (MU) mg −1 (proteína) min −1. Os protoplastos foram então eletroporados na presença de vetores de expressão de proteína fluorescente verde (GFP) pARS101 ou pARS108. Embriões fluorescentes verdes foram selecionados, as plantas regeneradas e a integração do transgene foi confirmada por análise de Southern blot. Ambos os plasmídeos foram construídos usando EGFP, uma variante GFP 35 vezes mais brilhante do que wtGFP, tendo um único pico de excitação desviado para o vermelho e otimizado para uso de códon humano. pARS101 foi construído colocando EGFP sob o controle de um promotor 35S – 35S contendo 33 pb da sequência líder não traduzida do vírus do mosaico da alfafa. pARS108 foi construído de forma semelhante, exceto sequências foram adicionadas para transporte e retenção de EGFP no lúmen do retículo endoplasmático.

RANDALL P. NIEDZ, WL McKENDREE, e RG SHATTERS Jr. "ELETROPORAÇÃO DE PROTOPLASTOS EMBRIOGÊNICOS DE LARANJA DOCE (CITRUS SINENSIS (L.) OSBECK) E REGENERAÇÃO DE PLANTAS TRANSFORMADAS," In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 39 (6) 586-594, (1 de novembro de 2003). https://doi.org/10.1079/IVP2003463

Recebido: 4 de fevereiro de 2003 Aceito: 1 de maio de 2003 Publicado: 1 de novembro de 2003

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Não está disponível para venda individual.


Ensaio: técnicas de transferência de genes & # 8211 prós e contras

A transferência de genes é uma técnica para introduzir de forma estável e eficiente genes funcionais (que geralmente são clonados) nas células-alvo. A transferência genética é o mecanismo pelo qual o DNA é transferido de um doador para um receptor. Uma vez que o DNA do doador está dentro do receptor, o cruzamento pode ocorrer. O resultado é uma célula recombinante que possui um genoma diferente do doador ou do receptor. Um evento de recombinação deve ocorrer após a transferência para que a mudança no genoma seja hereditária (passada para a próxima geração). Os genes são os projetos essenciais para gerar todas as proteínas em nossos corpos que eventualmente desempenham todas as funções biológicas. Portanto, quando um gene é eficientemente introduzido em uma célula-alvo do hospedeiro, a proteína que é codificada por esse gene é produzida.
As tecnologias de transferência de genes foram desenvolvidas inicialmente como uma ferramenta de pesquisa para estudar a expressão gênica e sua função. Uma variedade de técnicas e processos de ocorrência natural são utilizados para a transferência de genes.
Técnicas estão disponíveis para a introdução de DNA em muitos tipos diferentes de células em cultura, seja para estudar a função e regulação do gene ou para produzir grandes quantidades de proteína recombinante.
As culturas de células, portanto, têm sido usadas em escala comercial para sintetizar produtos como anticorpos, hormônios, fatores de crescimento, citocinas e proteínas de revestimento viral para imunização. A aplicação mais importante desta tecnologia é a terapia gênica in vivo, ou seja, a introdução de DNA no células de animais vivos para tratar doenças. O extraordinário potencial da molécula de DNA alterada é dar origem a novas formas de vida que são mais bem adotadas para a sobrevivência. A mudança na sequência de bases do DNA leva à mudança na proteína que causa a condição de doença que pode ser corrigida pela manipulação do gene. Muita ênfase tem sido dada à manipulação de genes em doenças cardiovasculares, doença de parkinson & # 8217s, distúrbios lisossomais, terapia gênica ocular e osteoartrite.
Visão geral das estratégias de transferência de genes:
A transferência de genes pode ser realizada essencialmente por meio de três rotas. A mais direta é a transferência direta de DNA, a introdução física de DNA estranho diretamente na célula. Por exemplo, em células cultivadas, isso pode ser feito por microinjeção, enquanto para células in vivo, a transferência direta é frequentemente realizada por bombardeio com minúsculas partículas de metal revestidas de DNA. A segunda via é chamada de transfecção e abrange uma série de técnicas, algumas químicas e outras físicas, que podem ser usadas para persuadir as células a captar DNA de seus arredores. A terceira é embalar o DNA dentro de um
vírus animal, uma vez que os vírus desenvolveram mecanismos para infectar células naturalmente e introduzir seu próprio ácido nucléico. A transferência de DNA estranho para uma célula por essa via é denominada transdução.
A escolha dos métodos de transferência de DNA depende das células-alvo nas quais a transformação será realizada. Também depende dos objetivos da manipulação de genes. A transfecção pode ser estável ou transitória. Embora a escolha do método de transferência de DNA seja muito importante, as outras etapas importantes são a seleção do gene, o isolamento do gene, a preparação do DNA recombinante e a seleção das células transformadas. A regeneração do organismo com novas características também é igualmente importante. A entrega de genes in vitro pode ser feita tratando as células com vírus, tais como retrovírus ou adenovírus, fosfato de cálcio, lipossomas, bombardeamento de partículas, injeção de DNA nu com agulha fina, eletroporação ou qualquer combinação destes métodos. Essas são ferramentas poderosas para pesquisa e têm possíveis aplicações em terapia gênica.
FATORES A CONSIDERAR AO SELECCIONAR UM MÉTODO DE ENTREGA DO GENE
O avanço de novas tecnologias tornou a entrega de genes mais eficiente e ainda mais confusa, dada a formidável variedade de reagentes e métodos agora disponíveis. Determinar a melhor abordagem de entrega de gene para qualquer experimento particular requer consideração cuidadosa de uma série de fatores diferentes, conforme declarado abaixo.
1. Contexto celular ou ambiente & # 8211 O contexto ou ambiente das células (ou seja, in vivo vs. em
vitro vs. ex vivo) para o qual os ácidos nucleicos serão entregues é o primeiro fator a considerar quando
decidir sobre um método de transferência de genes. Os obstáculos e desafios colocados pela entrega em
culturas de células vitro são muito diferentes daquelas apresentadas por células in vivo ou ex vivo, e requerem
diferentes ferramentas e técnicas para superá-los. Por exemplo, direcionar ácidos nucleicos para
células específicas, evitando outras células, é geralmente uma grande preocupação para a transferência de genes in vivo
aplicações, às vezes uma preocupação para aplicações ex vivo, mas geralmente não uma preocupação para aplicações in vitro
formulários.
Outra questão importante que deve ser abordada ao planejar o gene in vivo (mas não in vitro)
estudos de entrega é a imunogenicidade do sistema de transferência de genes. Isso é particularmente importante quando se considera o uso de certos vetores virais discutidos anteriormente, que podem ser altamente imunogênicos. Também relacionado à imunogenicidade está a questão da segurança geral, tanto para o experimentador quanto para o sujeito de qualquer estudo utilizando transfecção. Quase sempre, o uso de vetores virais requer precauções de segurança muito extensas do que o uso de métodos de transfecção sintéticos.
2. Tipo de célula ou tecido & # 8211 A origem das células ou tecido para o qual os ácidos nucleicos serão
transferido é normalmente o segundo parâmetro considerado ao selecionar uma entrega de gene
método. Por uma série de razões diferentes, a dificuldade de entrega de ácido nucleico celular varia
de tipo de célula para tipo de célula. Por causa disso, é sempre importante revisar a literatura para
determinar se o tipo de célula de interesse foi anteriormente utilizado para experimentos de transferência de genes,
quais métodos exatos foram usados ​​e quais eficiências de entrega foram alcançadas, ou seja, quais
percentagens de células realmente transfectadas ou transduzidas, com cada método.
Certos tipos de células são frequentemente descritos como & # 8216 notoriamente difíceis de transfectar & # 8217.
Isso inclui culturas de células primárias de muitas variedades. Transferência de genes bem-sucedida para tais células
geralmente requer muita pesquisa antes de selecionar qualquer método específico de entrega de genes.
3. Eficiência de entrega & # 8211 Para a maioria das aplicações, transfecção ou transdução de tantas células quanto
possível é preferido, especialmente quando é necessário detectar a presença de transgene raro
produtos. Assim, é importante determinar o nível de eficiência de entrega necessário para um determinado
aplicação antes de decidir sobre um determinado método de transferência de genes. Na maioria dos casos, verifica-se que
os vetores virais fornecem as mais altas eficiências de entrega. Para algumas linhas de células comumente usadas e facilmente transfectadas, os lipídios catiônicos quase correspondem aos vetores virais em sua eficiência de transferência de genes, ao mesmo tempo que fornecem procedimentos mais seguros e mais rápidos.
4. Entrega de gene estável vs. transiente e procedimentos de transferência de gene # 8211 são frequentemente categorizados
pelo fato de o gene entregue permanecer separado do cromossomo da célula hospedeira ou se ele está integrado no cromossomo da célula hospedeira. No primeiro caso, conhecido como entrega transiente de gene, a expressão do transgene normalmente se dissipa após um determinado período de tempo & # 8211 geralmente dentro de
vários dias & # 8211 porque o vetor de expressão é degradado ou expelido da célula hospedeira.
No segundo caso, conhecido como entrega de gene estável, a expressão do gene transferido é
prolongado ou estável, porque o vetor está integrado no cromossomo da célula hospedeira. Obviamente,
diferentes aplicações requerem diferentes períodos de tempo de expressão do transgene. Assim, um cuidadoso
comparação entre diferentes metodologias de entrega de genes permitirá uma escolha adequada para
gerar a expressão transitória ou estável desejada.
No caso de vetores virais, determinar se um determinado vírus é adequado para uso estável ou transitório
a transdução é simplesmente uma questão de aprender as características gerais do vetor. Dentro do estojo
de transferência de genes químicos ou físicos / mecânicos, determinando se um determinado método é
adequado para entrega transitória vs. estável pode ser tão fácil quanto ler a literatura de vendas do
fabricante ou verificando a literatura de pesquisa primária.
5. Tipo de molécula entregue & # 8211 Outro fator a considerar ao selecionar a entrega de um gene
método é o tipo de ácido nucleico ou outra molécula que está sendo transfectada ou transduzida. Para
exemplo, um reagente que entrega plasmídeos de maneira eficiente pode não entregar DNA de maneira eficiente
oligonucleotídeos. Freqüentemente, é mais fácil simplesmente revisar a literatura para saber quais métodos foram usados ​​com sucesso e entrar em contato com outros pesquisadores com experiência na entrega da molécula de interesse.
6. Citotoxicidade & # 8211 Outro problema que surge frequentemente ao escolher entre diferentes genes
métodos de entrega é a citotoxicidade dos vários métodos e reagentes. Alguns métodos, como
como eletroporação e armas genéticas, podem ser extremamente duras para as células e muitas vezes resultar na morte
de uma maioria de células. Além disso, o DEAE-dextran pode ser bastante agressivo em alguns tipos de células, especialmente
quando uma etapa de choque de DMSO ou glicerol é usada como parte do procedimento. Em alguns aplicativos,
como quando um pequeno número de transfectantes é necessário de um tipo de célula recalcitrante, isso é
não é um problema. Na maioria das aplicações, no entanto, uma alta porcentagem de morte celular é simplesmente
não aceitável. A abundância de lipídios catiônicos disponíveis e reagentes de polímero têm
graus de toxicidade com diferentes tipos de células e suas concentrações durante a transfecção podem ser
otimizado conforme necessário para minimizar a morte celular.
7. Suspensão vs. células aderentes & # 8211 As células mais comumente transfectadas crescem & # 8211 e são
transfectado & # 8211 enquanto anexado a algum tipo de suporte, seja esse suporte o tecido de
da qual eles são derivados, alguma membrana inerte ou andaime, ou a superfície de uma cultura de tecido
placa. Menos comuns são as células que crescem suspensas no meio, como as derivadas de
sangue e outros fluidos corporais. As células de suspensão são geralmente mais difíceis de transfectar
portanto, pode ser necessário contar com métodos mais severos de entrega de genes, como
eletroporação, armas gênicas, microinjeção ou vetores virais para níveis de transfecção aceitáveis.
Além disso, alguns lipídios catiônicos podem efetivamente transfectar células em suspensão e devem ser tentados quando
possível devido à sua simplicidade e custo-benefício.
8. Expertise & # 8211 O grau de dificuldade em realizar as várias técnicas de transfecção pode
variam significativamente e, portanto, a especialização e experiência do pesquisador é geralmente um
fator importante a considerar. Por exemplo, métodos como microinjeção e métodos de transfecção viral amp são invariavelmente mais complexos do que lipídios catiônicos e reagentes de polímero. Além disso, dos métodos químicos, a co-precipitação de fosfato de cálcio pode ser bastante complicada devido à sua sensibilidade a pequenas mudanças nas condições experimentais.
9. Tempo & # 8211 Outro fator importante a considerar é o tempo necessário para a entrega do gene. Viral
Os métodos, embora altamente eficientes, podem consumir muito tempo, normalmente levando de duas semanas a um mês para serem concluídos. Em contraste, os métodos químicos e físicos / mecânicos geralmente podem ser concluídos em poucos dias, mas freqüentemente fornecem eficiências de transfecção mais baixas. Portanto, não é incomum ter de pesar os benefícios de resultados mais rápidos e menos trabalho em comparação com o benefício de maior eficiência.
10 Custo & # 8211 Finalmente, o custo pode ser um fator importante ao decidir sobre a melhor entrega de gene
método para uma determinada aplicação. Os métodos mais caros tendem a ser o
métodos físicos / mecânicos, como eletroporação e armas genéticas, devido à especialidade
o equipamento de que necessitam. A entrega do gene viral é talvez o segundo método mais caro, uma vez que requer os reagentes do vetor, muito tempo e mão de obra para completar os longos procedimentos de preparação do vetor, bem como o descarte adequado dos resíduos virais.
O terceiro método de entrega de genes mais caro utiliza polímeros e lipídios catiônicos, que não requerem nenhum equipamento especializado ou etapas de preparação de vetor viral demoradas. Esses reagentes custam normalmente centenas de dólares, dependendo do número de transfecções a serem concluídas. Finalmente, os métodos menos caros utilizam fosfato de cálcio, que é um mineral barato e abundante, e DNA puro, que obviamente não requer nenhum custo de reagente de transfecção, mas pode ser altamente ineficiente.
TÉCNICAS DE TRANSFERÊNCIA DE GENE
TRANSFORMAÇÃO
A transformação é o processo natural de transferência de genes que envolve a absorção do material genético por uma célula através da membrana celular, causando a fusão do DNA estranho com o DNA nativo, resultando na expressão genética do DNA recebido. A transformação envolve a absorção de DNA & # 8220naked & # 8221 (DNA não incorporado em estruturas como os cromossomos) por células bacterianas competentes. As células são competentes (capazes de absorver DNA) apenas em um determinado estágio de seu ciclo de vida, aparentemente antes da conclusão da síntese da parede celular.
A transformação é geralmente um método natural de transferência de genes, mas como resultado do avanço tecnológico originou a transformação artificial ou induzida. Assim, existem dois tipos chamados de transformação natural e transformação artificial ou induzida. Na transformação natural, o DNA estranho se liga ao receptor de DNA da célula hospedeira e, com a ajuda da proteína DNA translocase, entra na célula hospedeira. A presença de nucleases restringe a entrada de duas fitas do DNA, destruindo uma única fita, permitindo assim que apenas uma fita entre na célula hospedeira. Qualquer DNA que não esteja integrado ao cromossomo será degradado. Este DNA de fita simples se mistura com o material genético do hospedeiro com sucesso.
O método de transformação artificial ou induzido é feito em condições de laboratório, que é uma transferência de genes mediada por produtos químicos ou feito por eletroporação. Os engenheiros genéticos são capazes de induzir competência colocando células em certas soluções, normalmente contendo sais de cálcio. No local de entrada, as endonucleases cortam o DNA em fragmentos de 7.000-10.000 nucleotídeos, e o DNA de fita dupla se separa em fitas simples. O DNA de fita simples pode se recombinar com o cromossomo do hospedeiro & # 8217s uma vez dentro da célula. Esta recombinação substitui o gene no hospedeiro por um gene variante & # 8211 embora homólogo & # 8211.
Desvantagens:
O DNA de um gênero intimamente relacionado pode ser adquirido, mas, em geral, o DNA não é trocado entre micróbios distantemente relacionados.
Nem todas as bactérias podem se tornar competentes.
CONJUGAÇÃO
A conjugação é um meio de transferência de genes em muitas espécies de bactérias. O contato célula a célula por um apêndice especializado, conhecido como F-pilus (ou sex pilus), permite que uma cópia de um plasmídeo F (plasmídeo de fertilidade) seja transferida para uma célula que não contém o plasmídeo. Em raras ocasiões, um plasmídeo F pode se integrar no cromossomo de seu hospedeiro bacteriano, gerando o que é conhecido como uma célula Hfr (alta frequência de recombinação). Essa célula também pode direcionar a síntese de um pilus sexual. À medida que o cromossomo da célula Hfr se replica, ele pode começar a cruzar o pilus para que o plasmídeo e o DNA cromossômico sejam transferidos para a célula receptora. Esse DNA pode se recombinar com o de seu novo hospedeiro, introduzindo novas variantes de genes. Plasmídeos que codificam genes para fatores de virulência e resistência a antibióticos são passados ​​através de populações de bactérias e entre várias espécies de bactérias por conjugação.
No laboratório, a conjugação pode ser usada para transferir genes interrompidos em um plasmídeo autotransmissível, para desenvolver uma cepa mutante. Um gene de interesse de uma cepa receptora de E. coli é clonado em um vetor autotransmissível e mantido em uma cepa doadora para manipulação genética. A construção do gene excluído é então transferida por conjugação da cepa doadora de volta para a cepa receptora.
TRANSDUÇÃO
Transduction is another method for transferring genes from one bacterium to another the transfer is mediated by bacteriophages. A bacteriophage infection starts when the virus injects its DNA into a bacterial cell. The bacteriophage DNA may then direct the synthesis of new viral components assembled in the bacterium. Bacteriophage DNA is replicated and then packaged within the phage particles. Early in the infective cycle the phage encodes an enzyme that degrades the DNA of the host cell. Some of these fragments of bacterial DNA are packaged within the bacteriophage particles, taking the place of phage DNA. As the number of phages increases it breaks open (lyse) the cell. When released from the infected cell, a phage that contains bacterial genes can continue to infect a new bacterial cell, transferring the bacterial genes.
Sometimes genes transferred in this manner become integrated into the genome of their new bacterial host by homologous recombination. Such transduced bacteria are not lysed because they do not contain adequate phage DNA for viral synthesis and these phages can enter an alternate life cycle called lysogeny. In this cycle, all the virus’s DNA becomes integrated into the genome of the host bacterium. The integrated phage, called a prophage, can confer new properties to the bacterium.
Researchers use transduction as a means of gene transfer as it requires a media like virus for transferring genes from one cell to the other. Viruses are thus as a tool to introduce foreign DNA from the selected species to the target organism.
There are two types of transduction called as generalized transduction in which any of the bacterial gene is transferred via the bacteriophage to the other bacteria and specialized transduction involves transfer of limited or selected set of genes.
Viral vectors for gene transfer:
The use of viruses as vectors for transduction, i.e. the introduction of genes into animal cells by exploiting the natural ability of the virus particle, within which the transgene is packaged, to adsorb to the surface of the cell and gain entry is being employed . Due to the efficiency with which viruses can deliver their nucleic acid into cells and the high levels of replication
and gene expression it is possible to achieve, viruses have been used as vectors not only for gene expression in cultured cells but also for gene transfer to living animals. Four classes of viral vector have been developed for use in human gene therapy and have reached phase 1 clinical trials. These are the retrovirus, adenovirus, herpesvirus and adenoassociated virus (AAV) vectors . Before introducing the individual vector systems,we discuss some general properties of viral transduction vectors. Transgenes may be incorporated into
viral vectors either by addition to the whole genome or by replacing one or more viral genes. This is generally achieved either by ligation (many viruses have been modified to incorporate unique restriction sites) or homologous recombination.
For many applications, it is favourable to use vectors from which all viral coding sequences have been deleted.These amplicons (also described as ‘gutless vectors’) contain just the cis-acting elements required for packaging and genome replication. The advantage of such vectors is their high capacity for foreign DNA and the fact that, since no viral gene products are made, the vector has no intrinsic cytotoxic effects. The choice of vector depends on the particular properties of the virus and the intended host, whether transient or stable expression is required and how much DNA needs to be packaged. For example, icosahedral viruses such as adenoviruses and retroviruses package their genomes into preformed capsids, whose volume defines the maximum amount of foreign DNA that can be accommodated. Conversely, rod-shaped viruses such as the baculoviruses form the capsid around the genome, so there are no such size constraints. There is no ideal virus for gene transfer ‘ each has its own advantages and disadvantages. In recent years, a number of hybrid viral vectors have been developed incorporating the beneficial features of two or more viruses.
Vantagens:
1) viral vectors that especially efficient at transducing the intended cell type but not other cell types.
2) retroviruses are particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
Limitations:
1) cannot deliver genes to terminally differentiated cells
2) viral vectors may be highly immunogenic
TRANSFECTION BY CHEMICAL METHODS
One of the methods of gene transfer where the genetic material is deliberately introduced into the animal cell in view of studying various functions of proteins and the gene is transfection. This mode of gene transfer involves creation of pores on the cell membrane enabling the cell to receive the foreign genetic material. When transformation is carried out in eukaryotic cells it is termed as transfection.
1) Calcium phosphate mediated DNA transfer
The process involves a mixture of isolated DNA (10-100ug) with solution of
calcium chloride and potassium phosphate. . When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface .Cells are then incubated with precipitated DNA either in solution or in tissue culture dish. A fraction of cells will take up the calcium phosphate DNA precipitate by a process not entirely understood but thought to be endocytosis.
Transfection efficiencies using calcium phosphate can be quite low, in the range of 1-2 % . Pode
be increased if very high purity DNA is used and the precipitate allowed to form slowly.
Limitações
1. Frequency is very low.
2. Integrated genes undergo substantial modification.
3. Many cells do not like having the solid precipitate adhering to them
and the surface of their culture vessel.
4. Integration with host cell chromosome is random.
5, Due to above limitations transfection applied to somatic gene therapy
é limitado.
Formulários:
This technique is used for introducing DNA into mammalian cells. This process has been a preferred method of identifying many oncogenes.
2)DNA transfer by DAE-Dextran method:
DNA can be transferred with the help of DAE Dextran also. DAE-Dextran may be used in the
transfection medium in which DNA is present. This is a polycationic, high molecular weight substance and is convenient for transient assays. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis.
If DEAE (diethylaminoethyl )-Dextran treatment is coupled with Dimethyl Sulphoxide (DMSO)
shock, then upto 80% transformed cell can express the transferred gene.
Vantagens:
The advantage of this method is that, it is cheap, simple and can be used for transient cells
which cannot survive even short exposure of calcium phosphate.
The major advantages of the technique are its relative simplicity and speed, limited expense, and remarkably reproducible interexperimental and intraexperimental transfection efficiency.
Limitations:
Disadvantages include inhibition of cell growth and induction of heterogeneous morphological changes in cells.
Furthermore, the concentration of serum in the culture medium must be transiently reduced during the transfection.
It does not appear to be efficient for the production of stable transfectants.
For cells that grow in suspension, electroporation or lipofection is usually preferred, although DEAE-dextran-mediated transfection can be used.
Transfer of DNA by polycation-DMSO:
As calcium phosphate method of DNA transfer is reproducible and efficient but there is narrow range of optimum conditions. DNA transfer by
Another polycationic chemical,the detergent Polybrene is carried out to increase the adsorption of DNA to the cell surface followed by a brief treatment with 25-30% DMSO to increase membrane permeability and enhance uptake of DNA. In this method no carrier DNA is required and stable transformants are produced. This method works with mouse fibroblast and chick embryo.
LIPOSOME MEDIATED GENE TRANSFER
Liposomes are spheres of lipids which can be used to transport molecules into the cells. These are artificial vesicles that can act as delivery agents for exogenous materials including transgenes. They are considered as spheres of lipid bilayers surrounding the molecule to be transported and promote transport after fusing with the cell membrane.
Liposomes for use as gene transfer vehicles are prepared by adding an appropriate mix of bilayer constituents to an aqueous solution of DNA molecules. In this aqueous environment, phospholipid hydrophilic heads associate with water while hydrophobic tails self-associate to exclude water from within the lipid bilayer. This self-organizing process creates discrete spheres of continuous lipid bilayer membrane enveloping a small quantity of DNA solution. The liposomes are then ready to be added to target cells. Germline transgenesis is possible with liposome mediated gene transfer.Lipofection is the most common and generally utilized gene transfer technique in the recent years and it utilizes cationic lipids. The combined DNA and cationic lipids act instantaneously to form structures called as lipoplexes that are more complex in structure than the simple liposomes. Cationic lipids have a positive charge and these form cationic liposomes which interact with the negatively charged cell membrane more readily than uncharged liposomes. This leads to a fusion between cationic liposome and the cell surface resulting in quick entry by endocytosis and the delivery of the DNA directly across the plasma membrane. Cationic liposomes can be produced from a number of cationic lipids that are commercially available and sold as an in vitro-transfecting agent, termed lipofectin.
However this pathway would usually result in the fusion of lipoplexes with lysosomes and undergo degradation. This problem is overcome by utilizing the neutral helper lipids, which are generally included along with the cationic lipid. This allows entrapped DNA to escape the endosomes, reach the nucleus and get access to the cell’s transcriptional machinery.The endosomal structure is destroyed by increasing the osmotic pressure created by the lipids’ buffering action within the endosomes and by the fusion of the lipid with the endosomal membrane. The ability of a lipid to destroy endosomes is one of the main characteristics of a transfection reagent.
Vantagens
1. Simplicity.
2. Long term stability.
3. Low toxicity.
4. Protection of nucleic acid from degradation.
5. particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
6. cationic lipids effectively transfect suspension cells.
Limitations:
1) Cannot deliver genes to terminally differentiated cells
ELECTROPORATION
A rapid and simple technique for introducing genes into a wide variety of microbial, plant and animal cells, including E. coli, is electroporation. Electroporation uses electrical pulse to produce transient pores in the plasma membrane thereby allowing macromolecules into the cells. These pores are known as electropores which allow the molecules, ions and water to pass from one side of the membrane to another. The electropores reseal spontaneously and the cell can recover. The pores can be recovered only if a suitable electric pulse is applied .The formation of electropores depends upon the cells that are used and the amplitude and duration of the electric pulse that is applied to them. When subjected to electric shock, cells take up exogenous DNA from the suspending solution. Once inside the cell, the DNA is integrated and the foreign gene will express. A proportion of these cells become stably transformed and can be selected if a suitable marker gene is carried on the transforming DNA. The most critical parameters are the intensity and duration of the electric pulse, and these must be determined empirically for different cell types. Electric currents can lead to dramatic heating of the cells that can results in cell death. Heating effects are minimized by using relatively high amplitude, a short duration pulse or by using two very short duration pulses. However, once optimal electroporation parameters have been established, the method is simple to carry out and highly reproducible.
Many different factors affect the efficiency of electroporation, including temperature,
various electric-field parameters (voltage, resistance and capacitance), topological form of the DNA,
and various host-cell factors (genetic background, growth conditions) and post-pulse treatment.
General applications of electroporation.
1. Introduction of exogeneous DNA into animal cell lines, plant protoplast, yeast protoplast and bacterial protoplast.
2. Electroporation can be used to increase efficiency of transformation or transfection of bacterial cells.
3. Wheat, rice, maize, tobacco have been stably transformed with frequency upto 1% by this method.
4. Genes encoding selectable marker may be used to introduce genes using electroporation.
5. To study the transient expression of molecular constructs.
6. Electroporation of early embryo may result in the production of transgenic animals.
7. Hepatocytes, epidermal cells, haematopoietic stem cells, fibroblast, mouse T and B lymphocytes can be transformed by this technique.
8. Naked DNA may be used for gene therapy by applying electroporation device on animal cells.
Advantages of electroporation.
1. Method is fast.
2. Less costly.
3. Applied for a number of cell types.
4. Simultaneously a large number of cell can be treated.
5. High percentage of stable transformants can be produced.
DRAWBACKs
1)Limited effective range of

1 cm between the electrodes.
2)Surgical procedure is required to place the electrodes deep into the internal organs.
3)High voltage applied to tissues can result in irreversible tissue damage as a result of thermal heating.
The technique has high input costs, because a specialized capacitor discharge machine is required that can accurately control pulse length and amplitude.
4) Larger numbers of cells may be required than for other methods because, in many cases, the most efficient electroporation occurs when there is up to 50% cell death.
ULTRASONICATION
Sonication is the act of applying sound energy to agitate particles in a sample. Ultrasonic frequencies (>20 kHz) are usually used, leading to the process also being known as ultrasonication . Sonoporation, or cellular sonication, is the use of these ultrasonic frequencies for modifying the permeability of the cell plasma membrane. This technique is usually used in molecular biology and non-viral gene therapy in order to allow uptake of large molecules such as DNA into the cell, in a cell disruption process called transfection or transformation. Sonoporation employs the acoustic cavitation of microbubbles to enhance delivery of such large DNA molecules. Although the early results could achieve only 10- to 30-fold increases in transfection efficiency in vitro, technical refinements have lead to enhancements of up to several thousand fold in vitro ,sufficient to encourage ultrasonication mediated gene transfer in vivo.
Vantagens:
1) It is non-invasive and well tolerated,
2)extraordinary safety record over a wide range of frequency and intensity
3)high levels of public acceptability and understanding.
there are highly sophisticated, flexible, cost-effective and readily available diagnostic and therapeutic systems that can achieve site-specific transfer of ultrasound energy almost anywhere in the body, except perhaps the lung.
4) The bioactivity of this technique is similar to, and in some cases found superior to, electroporation.
5) in vivo is relatively nontoxic.
Limitations:
1)Extended exposure to low-frequency (<MHz) ultrasound has been demonstrated to result in complete cellular death (rupturing) as well as microvascular hemorrhage and disruption of tissue structure, thus cellular viability must also be accounted for when employing this technique.
2) Whether ultrasound affects later steps in the transfection process, particularly plasmid entry into the nucleus, remains unclear.
Formulários:
Sonoporation is under active study for the introduction of foreign genes in tissue culture cells, especially mammalian cells. Sonoporation is also being studied for use in targetedGene therapy in vivo, in a medical treatment scenario whereby a patient is given modified DNA, and an ultrasonic transducer might target this modified DNA into specific regions of the patient’s body.
MICROINJECTION
In microinjection DNA can be introduced into cells or protoplast with the help of very fine needles or
glass micropipettes having the diameter of 0.5 to 10 micrometer. The DNA may be directly delivered into the nucleus or in the cytoplasm. Some of the DNA injected may be taken up by the nucleus. The desired gene in the form of plasmid or alone is injected directly into the plant protoplast.
Injection into the nucleus is more efficient than that into the cytoplasm. Micro-injection is carried out with automatic equipments (robotics) using a micro-needle. Computerized control of holding pipette, needle, microscope stage and video technology has improved the efficiency of this technique.
Advantages of microinjection.
1. Frequency of stable integration of DNA is far better as compare to other methods.
2. Method is effective in transforming primary cells as well as cells in established cultures.
3. The DNA injected in this process is subjected to less extensive modifications.
4. Mere precise integration of recombinant gene in limited copy number can be obtained.
Limitações
1. Costly.
2. Skilled personal required.
3.Has not been successful for many plant cells .
4. Embryonic cells preferred for manipulation.
5. Knowledge of mating timing, oocyte recovery is essential.
6. Method is useful for protoplasts and not for the walled cells.
7. Process causes random integration.
8. Rearrangement or deletion of host DNA adjacent to site of integration are common.
9. The technique is laborious, technically difficult, and limited to the number of cells actually injected.
Applications of microinjection.
1. Process is applicable for plant cell as well as animal cell but more common for animal cells.
2. Technique is ideally useful for producing transgenic animal quickly.
3. Procedure is important for gene transfer to embryonic cells.
4. Applied to inject DNA into plant nuclei.
5. Method has been successfully used with cells and protoplast of
tobacco, alfalfa etc.
Fig: microinjection in mouse egg.
BIOLISTICS
(MICROPROJECTILE/GENE GUN)
Biolistics or particle bombardment is a physical method that uses accelerated microprojectiles to
deliver DNA or other molecules into intact tissues and cells. Biolistics transformation is relatively new and novel method amongst the physical methods for artificial transfer of exogenous DNA. The nucleic acid is delivered through membrane penetration at a high velocity, usually connected to microprojectiles like microscopic particles of tungsten or gold coated into cells using an electrostatic pulse, air pressure, or gunpowder percussion. As the particles pass through the cell, the DNA becomes free to integrate into the plant-cell genome.
The gene gun is a device that literally fires DNA into target cells . The DNA to be transformed
into the cells is coated onto microscopic beads made of either gold or tungsten. Beads are carefully
coated with DNA. The coated beads are then attached to the end of the plastic bullet and loaded into
the firing chamber of the gene gun. An explosive force fires the bullet down the barrel of the gun
towards the target cells that lie just beyond the end of the barrel. When the bullet reaches the end of
the barrel it is caught and stopped, but the DNA coated beads continue on toward the target cells.
Some of the beads pass through the cell wall into the cytoplasm of the target cells. Here the bead and
the DNA dissociate and the cells become transformed. Once inside the target cells, the DNA is
solubilised and may be expressed.
Applications
1. Biolistics technique has been used successfully to transform soyabean,
cotton, spruce, sugarcane, papaya, corn, sunflower, rice, maize, wheat,
tobacco etc.
2. Genomes of subcellular organelles have been accessible to genetic
manipulation by biolistic method.
3. Mitochondria of plants and chloroplast of chlamydomonas have been
transformed.
4. Method can be applied to filamentous fungi and yeast (mitochondria).
5. The particle gun has also been used with pollen, early stage
embryoids, meristems somatic embryos, plant cells, root section, seeds and pollen.
6. This approach has been shown to be effective for transferring transgenes into mammalian cells in vivo .
Vantagens
1. Requirement of protoplast can be avoided. Unlike electroporation and microinjection, this technique does not require protoplasts or even single-cell isolations and is applicable to even intact plant tissue
2. Walled intact cells can be penetrated.
3. Manipulation of genome of subcellular organelles can be achieved.
4. This is also a highly mechanized or robotic mediated technique in which the
speed of the micro-projectile particles is controlled by foolproof mechanisms
5) It is also gaining in use as a method for transferring DNA construct into whole animals.
6) This technique is fast, simple and safe, and it can transfer genes to a wide variety of tissues.
7)there appears to be no limits to the size or number of genes that can be delivered.
Limitações
1. Integration is random.
2. Requirement of equipments.
3.It can be a challenge to obtain a sufficient number of cells modified by this method to see a biologically significant effect.
MICROLASER
A new technique is presented to incorporate exogeneous gene materials (DNA) into cells with a microbeam irradiation from an uv pulsed laser. A frequency-multiplied Laser, 355 m wavelength, 5 ns pulse duration, punches a self-healing hole of submicrometer aperture in cell membrane under selected irradiation conditions. At the site of the beam impact, due probably to local temperature changes, the cell membrane modifies its permeability. As a consequence of the hit, circular areas, whose radius may be apparently regulated by changing the irradiation time and/or the radiation intensity (energy), appear on the wall, last for a short time and fade spontaneously . It takes a fraction of a second for the aperture to close, long enough to allow the foreign DNA, contained in the medium, to slip into the cell.
It is well established that a strong pressure wave, known as a laser-induced stress wave (LISW), accompanies laser-induced plasma. We have extended their method to deliver macromolecules, such as genes. Plasmid DNA (circular DNA residing in bacterial cytoplasm) is used as a vector of the gene of interest. We inject the plasmid into target tissue, on which a laser target is placed, and subject the target to irradiation with a high-intensity, nanosecond laser pulse to induce plasma and hence an LISW. By placing optically transparent material on the target, the plasma is confined, resulting in an increase in the LISW’s impulse. Interaction of tissue cells with the LISW allows plasmid to enter the cytoplasm
Vantagens
1) it only takes advantage of the presence of phenol-red, a normal cell medium component, with no need of addition of extraneous substances
(2) it is a very mild treatment virtually suitable for any cell type and
(3) it allows transfection of selected cells even in the presence of cells of different type (providing that they are morphologically distinguishable).
4) . it is rapidly replacing virus mediated techniques as they have serious side effects caused by immune response and limited targeting characteristics rendering them inappropriate for clinical application
5) The method offers a clear advantage over existing methods: increases the success rate of DNA transfection as well as the efficiency of cell modification by orders of magnitude.
6) . It enables minimally invasive tissue interaction.
CONCLUSÃO
Thus there are a number of ways by which the genes can be introduced into the cells. With the advent of molecular tools and technologies it is now comparatively easy to introduce gene into cells without losing its integrity and biological activity. Moreover the recent development in molecular biology has made the transfer of gene with great accuracy to the target cell. The transfer of gene through different gene transfer technologies has cured a number of diseases. Research is on progress to cure those diseases which cannot be cured by using drugs. Moreover the treatment of diseases by gene transfer provides better result for a prolong period of time. It is the need of hour to discover new and cheap method of gene transfer technologies so to make the treatment of the diseases a little easier and affordable. Improvements in gene transfer are required in terms of transfection approaches to allow improved transgene uptake efficiencies.
REFERENCES
1)Society of Applied Sciences.
Gene Transfer Technologies and their Applications: K.H.KHAN
Medical Biotechnology Division, School of Biosciences and Technology,
VIT University, Vellore-632014, Tamil Nadu, India.
2)Principles of gene manipulation: R.W.Old ,S.B. Primrose and R.M.Twymann ‘ sixth edition,chapter 10 and 11.
3) BIOTECHNOLOGY 2020-From the Transparent Cell to
the Custom-Designed Process–Prof. Gerhard Kreysa Dr.-Ing. E.h. Dr.h.c. & Dr. R??diger Marquardt
4) INTRODUCTION TOBIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING
-A.J. NAIR, PH.D.
5)From genes to genomes- concepts and applications of DNA technology–Jeremy W Dale, Malcom von Schantz
6) http://www.nature.com
7)www.learner.org

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About this essay:

If you use part of this page in your own work, you need to provide a citation, as follows:


Heat shock vs electroporation - Biology

Resumo do artigo:

Definition:-
Electroporation is the process of biotechnology to pass the electric current through the living surface fro example, a cell or a molecule. Through this way, pores appear in the surface of the living structure and biological material can pass through it easily. This method is usually used to enter the viruses or plasmids in the form of vectors or plasmids into the cell through pores in the cell membrane.

What is Electroporation:-
The technique of Electroporation is mostly used in the field of molecular biology. When this technique is applied on any cell by using electrical current from an external source, the cell membrane becomes more permeable allowing foreign objects enter into it. When the scientists have to insert a molecular probe, small piece of DNA or any drug which can change the function of the cell, they use this technique.

It is not easy to make pores in the cell membrane until it is exposed to proper electric field which can allow the plasma membrane to cross its dielectric strength. If the whole experiment is well controlled then after sometime, the pores of the plasma membrane can reseal, but during that time the molecules or foreign objects can enter the cell's cytoplasm. It is harmful for the cell if it is exposed to the electric current for long period of time. It results in the cell death or apoptosis.

Process of Electroporation is used mostly for the transformation of bacteria, plant protoplasts and yeast. Bacterial cell wall is made up of peptidoglycan and its derivatives. It has pores in its cell wall naturally, so when the plasmids have to enter into the bacterial cell, a small amount of electric current is used for this purpose just to let the plasmid enter into the bacterial cell. The whole process should be well controlled so that it can be observed that the bacterial cells can divide into new daughter cells containing the plasmids. This process is more effective than the chemical Electroporation. This process can also be used for the tissue culture cells to enter the foreign genes into the mammalian cells mainly.

How does process of Electroporation works?
Special kinds of devices are used for performing the process of Electroporation called as electroporators. This device is passed through the solution of the cell which contains usually bacteria but other call types can also be used for this purpose. The cell solution is put into the glass or plastic cuvette. A glass or plastic cuvette is a small circular tube which is specially designed to keep the samples for experiments of spectroscopic. It contains two aluminum electrodes one on each side. If the bacterial cell is used in the process of Electroporation then the suspension used must be of 50 microliters. Plasmids are placed in the suspension before the process starts and the whole suspension is inserted into the glass cuvette. The voltage is set to 240 volts in the electroporators and cuvette is placed inside the elctroporator. Before incubation, I milliliter of liquid medium is inserted into the cuvette and then incubation is started. After an hour of incubation, the whole solution is placed on the agarose gel. If the plasmid solution id pure then there are chances of getting better results of the experiment, otherwise bacterial cells might die due to the over explosion and process might be started once again.

Applications:-
Electroporation process of Electroporation is applicable in the field of medicine to treat the cancer and heart diseases by inserting new genes into the cancerous cell. Some other diseases can also be cured with the help of Electroporation in which there is need of tissue removal.

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Princípio

Transformation process allows a bacterium to take up genes from its surrounding environment that is transformation involves the direct uptakes of fragments of DNA by a recipient cell and the acquisition of new genetic characteristics. There are two major parameters involved in efficiently transforming a bacterial organism. The first is the method used to induce competence for transformation. The second major parameter is the genetic constitution of the host strain of the organism being transformed. Competent cells are capable of uptaking DNA from their environment and expressing DNA as functional proteins. If a bacterium is said to be competent, it has to maintain a physiological state in which it can take up the donor DNA. Calcium chloride treatment is one of the best methods for the preparation of competent cells. Competence results from alterations in the cell wall that makes it permeable to large DNA molecules. This is a naturally occurring process and through this bacteria can transfer advantageous characteristics, such as antibiotic resistance. Bacteria can take DNA from the environment in the form of plasmid. Most of them are double stranded circular DNA molecules and many can exist at very high copy numbers within a single bacterial cell. Many naturally occurring plasmids carry an antibiotic resistant gene referred to as a marker.

In the process of transformation, the competent cells are incubated with DNA in ice. Then it is placed in a water bath at 42ºC and further plunging them in ice. This process will take up the DNA into the bacterial cell. Then it is plated in an agar plate containing appropriate antibiotic. The presence of an antibiotic marker on the plasmid allows for rapid screening of successful transformants. Blue &ndashwhite selection (Alpha complementation) can be used to determine which plasmids carry an inserted fragment of DNA and which do not. These plasmids contain an additional gene (lac Z) that encodes for a portion of the enzyme &beta &ndash galactosidase. When it transformed into an appropriate host, one containing the gene for the remaining portion of &beta &ndashgalactosidase, the intact enzyme can be produced and these bacteria form blue colonies in the presence of X &ndash gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) and a gratuitous inducer called IPTG (Isopropyl &beta-D- Thiogalactopyronoside). These plasmids contains a number of cloning sites within the lac Z gene, and any insertion of foreign DNA into this region results in the loss of the ability to form active &beta &ndashgalactosidase. Therefore colonies that carry the plasmid with the insert, ie, Transformants will remain white and the colonies without the foreign DNA (Non-Transformants) will remain Blue. We can also calculate the efficiency of transformation by using the concentration of DNA and number of transformed colonies.


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