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Quantidade mínima de RNA para conversão de cDNA e qPCR

Quantidade mínima de RNA para conversão de cDNA e qPCR



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Pesquisei vários protocolos de transcrição reversa de RNA e todos sugerem o uso de concentrações de RNA de 1ug. Uma quantidade menor poderia resultar em representação de transcrição inferior e, portanto, diminuição da qualidade dos resultados de qPCR?

Usamos o kit SensiFAST SYBR Lo-ROX da BIOLINE. Eu estava pensando em usar 500 ng em vez dos 1000 ng sugeridos. Para acomodar o protocolo, eu usaria 0,5ul de RTase para manter a proporção de 1: 1 (m / v). As concentrações de tampão, DNase, água e mistura de RT para a reação I manteriam as mesmas. Para a diluição final do cDNA, eu diluiria 5x em vez de 10x para manter concentrações iguais.

Alguém tem experiência com isto? A representação da transcrição sofre? As adaptações de protocolo sugeridas parecem razoáveis?

Obrigado pela ajuda antecipadamente.


Seguem duas respostas:

  1. Experiência técnica de muitos: não deve ser problema ter o mesmo protocolo com uma concentração inicial duas vezes menor, sem fazer quaisquer ajustes. O 1ug sugerido é muito mais seguro, duas vezes menos transcrições quase não faz diferença. Talvez em 1 ou 2 ordens de magnitude (10 a 100s) a menos você terá problemas ou a necessidade de corrigir suas reações.

  2. Ortodoxia científica: o conselho mais científico que alguém pode oferecer é tentar das duas maneiras e comparar seus resultados usando qRT-PCR. Estou supondo que ambas as abordagens mostrarão resultados muito semelhantes.


Quantidade mínima de RNA para conversão de cDNA e qPCR - Biologia

Diretrizes de tamanho de reação para qPCR

PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica poderosa para analisar amostras para quantificar sequências alvo ou expressão gênica. qPCR é normalmente realizada usando reações contendo o modelo de amostra, master mix, primers direto e reverso e, muitas vezes, corante de referência ROX, diluído em água de grau de PCR. O volume de cada reação depende das condições experimentais, particularmente do tamanho do reservatório na placa ou sistema que está sendo usado. Por exemplo, placas de 96 poços normalmente utilizam reações de 20 e mul, placas de 384 poços normalmente utilizam reações de 10 e mul, placas de 1.536 poços normalmente utilizam reações de 2 e mul e sistemas de alto rendimento, como o sistema de PCR em tempo real SmartChip , utilize volumes tão baixos quanto 100 nl.

Normalmente, os kits e misturas principais relatam o tamanho do produto com base no número de reações. No entanto, como discutido acima, os volumes de reação podem variar, resultando em diferentes números de reações de um determinado kit com base no volume de reação utilizado. Isso pode ser ainda mais complicado, dependendo da concentração da mixagem principal de partida (por exemplo, 2X, 5X, etc.). Para ajudar a esclarecer exatamente quantas reações podem ser obtidas de um determinado kit, fornecemos as tabelas abaixo (separadas com base no tipo geral de produto). Cada um lista o número de catálogo específico, o volume total e a concentração da mistura principal incluída e o número de reações obtidas com os volumes de reação frequentemente utilizados.


QUALIDADE DE RNA

Aquisição de amostra e purificação de seu RNA marcam a etapa inicial de cada ensaio de qRT-PCR, e a qualidade do modelo é indiscutivelmente o determinante mais importante da reprodutibilidade e relevância biológica dos resultados subsequentes de qRT-PCR. Quaisquer problemas que afetem a reprodutibilidade e, portanto, a relevância dos resultados, provavelmente se originaram aqui. 7 Muitas amostras, especialmente biópsias de tecido humano, são únicas, portanto, uma preparação de ácido nucleico desperdiçada significa que a oportunidade de registrar os dados dessa amostra é irremediavelmente perdida. Uma consideração separada diz respeito ao desperdício de dinheiro, já que uma das características distintivas dos testes de PCR em tempo real é seu custo de operação exorbitante. Portanto, é prudente despender grandes esforços para obter todos os estágios desse processo absolutamente corretos, começando com a consistência ao coletar, transportar e armazenar as amostras. Isso continua com a adesão rigorosa aos protocolos ao extrair os ácidos nucléicos e com o armazenamento apropriado do material purificado, deve-se tomar cuidado contínuo sempre que a amostra for retirada do armazenamento para análise.

Ao contrário do DNA, que é tão resistente quanto botas velhas, o RNA é extremamente delicado uma vez removido de seu ambiente celular. Portanto, sua purificação é muito mais complicada do que a de DNA e um modelo adequado para inclusão em um ensaio de RT-PCR deve cumprir os seguintes critérios:

Deve ser da mais alta qualidade para que os resultados quantitativos sejam relevantes.

Ele deve estar livre de DNA, especialmente se o alvo for um gene sem íntron.

Não deve haver copurificação de inibidores da etapa RT.

Deve estar livre de nucleases para armazenamento prolongado.

O problema mais óbvio diz respeito à degradação do RNA e é melhor abordado insistindo que cada preparação de RNA é rigorosamente avaliada quanto à qualidade. A avaliação da integridade do RNA pela inspeção das bandas de RNA ribossômico 28S e 18S usando eletroforese em gel é um método complicado de baixo rendimento e requer quantidades significativas de RNA precioso. Recomendamos o uso de um sistema como Agilent & # x02019s (Palo Alto, CA) RNA LabChip e 2100 Bioanalyzer (Fig. 1 & # x200B 1). ) Certamente, em termos de análise rotineira de um grande número de preparações de RNA, é de longe a maneira mais conveniente e objetiva de avaliar a qualidade do RNA. Claramente, não faz sentido observar diferenças significativas entre as amostras se essas diferenças forem simplesmente devidas à degradação de uma amostra. A importância do uso de RNA de alta qualidade é demonstrada pelos resultados mostrados na Figura 2 & # x200B 2.

Avaliação da qualidade do RNA. Esses gráficos e eletroferograma mostram 12 preparações de RNA extraídas de biópsias de cólon humano frescas. A qualidade dessas preparações, avaliada pela ausência de outras bandas além do 28S, 18S e 5S rRNA, é muito alta.

Importância do ensaio de RNA de alta qualidade. UMA: O RNA foi extraído de 19 biópsias de cólon frescas usando colunas Qiagen RNeasy (Crawley, Reino Unido) e analisado no Agilent Bioanalyzer usando o RNA LabChip. A preparação de RNA intacta no deixou mostra os picos de rRNA 18S e 28S, bem como uma pequena quantidade de RNA 5S. Degradação da amostra de RNA no direito produz uma mudança na distribuição do tamanho do RNA em direção a fragmentos menores e uma diminuição no sinal de fluorescência conforme os locais de intercalação do corante são destruídos. Quando tal análise revelou degradação, o RNA foi reextraído da mesma amostra. Ensaios de RT-PCR em tempo real foram realizados para sete genes alvo e para cada amostra o número de cópias obtido do RNA intacto foi dividido pelo número de cópias obtido do RNA degradado. Se a qualidade do RNA fosse irrelevante, seria de se esperar que a proporção dos dois fosse próxima de 1, uma vez que se trata de amostras idênticas. Se a qualidade do RNA for importante, a proporção deve ser maior que 1, uma vez que o número de cópias calculado a partir do RNA intacto deve ser maior do que o número de cópias do RNA degradado. B: O resultado mostra claramente que a qualidade do RNA importa, para alguns genes (por exemplo, IGF-I) mais do que para outros (IGF-IR). O resultado anômalo obtido para o GH pode ser devido à estrutura secundária do seu mRNA, que é reduzido pela degradação, tornando-o mais acessível ao priming. GAPDH, Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase PCNA, antígeno nuclear de proliferação celular GH, hormônio do crescimento IGF-1, fator de crescimento semelhante à insulina-1 1 & # x003b1-OH, 1 & # x003b1-hidroxilase IGF-1R, fator de crescimento semelhante à insulina- 1receptor.

Uma segunda questão refere-se à presença de inibidores em preparações de RNA modelo. Existem vários componentes no sangue e no tecido que podem inibir os ensaios de RT-PCR. Sangue de mamífero, especialmente o composto heme, 8 é bem conhecido por conter inibidores do ensaio de PCR, 9, 10 com tão pouco quanto 1% v / v de inibição do sangue Taq polimerase. 11 O ácido húmico é um inibidor das reações de PCR realizadas em amostras extraídas do solo, 12 e os inibidores estão presentes nos alimentos, 13 sendo o cálcio um importante culpado. 14 Um aspecto importante de qualquer inibição do ensaio de PCR é que isso pode comprometer a PCR como ferramenta diagnóstica. Por exemplo, drogas de terminação de cadeia, como o aciclovir usado no tratamento de retrovírus, inibem Taq DNA polimerase, produzindo um resultado falso negativo em alguns pacientes. 15 Altos níveis de RNA copurificado também podem resultar em falha do ensaio de PCR. 16 Meios de cultura, componentes de reagentes de extração de nucléicos, 13 e até mesmo o uso de palitos de dente de madeira para colher colônias bacterianas têm sido relatados como inibidores da reação de PCR. 17 Por último, mas não menos importante, os inibidores podem ser seletivos: o músculo esquelético contém inibidores que inibem uma polimerase.& # x02014por exemplo., Taq, mas não Thermus thermophilus polimerase. 18 A Figura 3 & # x200B 3 mostra um exemplo de inibição de um ensaio de RT-PCR por DNA.

Avaliação de inibidores em preparações de RNA. Um mastermix de teste foi preparado usando o mastermix qRT-PCR de 1 etapa Brilliant (Stratagene), para o qual um amplicon de fita com sentido de gene de planta, iniciadores (200 nM) e sonda TaqMan marcada com FAM-BHQ (500 nM) (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, Reino Unido) foram adicionados. O RNA total foi preparado a partir de biópsias do cólon frescas (5 mg) usando colunas Qiagen RNeasy e ressuspenso em 80 & # x003bcL de tampão Tris-Cl / EDTA. RNA (100 ng) foi adicionado ao mastermix de teste e um ensaio de RTPCR de um tubo (volume final 25 & # x003bcL, 10 h RT a 50 & # x000b0C, 40 ciclos de 30 min a 70 & # x000b0C) foi realizado em um Stratagene Instrumento de PCR em tempo real MX-4000 (barras brancas). Sete amplificações de controle contendo água em vez de RNA (barras pretas) foram configurados e executados ao mesmo tempo. A maioria das amostras de RNA registrou o mesmo Ct valores como os controles de água, e todos, exceto três, estavam dentro de 1 Ct do controle. No entanto, uma amostra registrou um C significativamente maiort, sugerindo que esta preparação continha um contaminante. Após a diluição, esta amostra registrou o mesmo Ct como as amostras de controle (não mostradas). Ct, ciclo de limiar.

Claramente, há pouco sentido em registrar diferenças espúrias nos níveis de mRNA que se baseiam simplesmente na presença de inibidores nos diferentes modelos que afetam o ensaio de RT ou PCR. Uma maneira de evitar isso é testar cada preparação de RNA para inibidores pela amplificação de um conjunto de amplicons que não tem identidade de sequência com qualquer sequência conhecida dentro do RNA alvo. Por exemplo, se alguém está investigando a expressão do gene humano, uma planta ou amplicons artificiais podem ser usados ​​para testar cada preparação de RNA para inibidores. Praticamente, isso envolve a preparação de um mastermix que inclui a planta ou amplicon artificial, ambos os primers e o conjunto de sondas específico. Um benchmark Ct (ciclo de limiar) que é característico para esse ensaio na ausência de qualquer inibidor é registrado adicionando água a essa mastermix (o & # x0201cno modelo adicionado & # x0201d controle). Isso atua como um ponto de referência para Ct valores obtidos quando a água é substituída por RNA preparado a partir de células, biópsias ou fluidos corporais. Na ausência de inibidor, o Ct permanece o mesmo na presença do inibidor, o Ct aumenta. Isso é ilustrado na Figura 3 & # x200B 3.

Pode-se pensar que o uso de um gene de referência como controle endógeno também pode identificar a presença de inibidores. Isso pode muito bem ser possível para experimentos envolvendo RNA extraído de células de cultura de tecidos, embora seja necessário mostrar que o gene de referência específico usado não é afetado pelas condições experimentais. No entanto, para experimentos envolvendo biópsias, o problema com essa abordagem é que os níveis de mRNA dos genes de referência variam significativamente entre diferentes indivíduos e tecidos. Sem o conhecimento a priori dos níveis de mRNA em um tecido específico, não é possível determinar se um C particularmente baixot é causada por um inibidor ou por baixos níveis desse mRNA particular nessa amostra. Portanto, não recomendamos o uso de genes de referência para esse fim.

Historicamente, os chamados genes de manutenção, que se acredita serem expressos constitutivamente e minimamente regulados, têm sido amplamente usados ​​como referências de RNA interno para Northern blotting, proteção de RNAse e análises qualitativas de RT-PCR. Eles permanecem amplamente usados ​​como genes de referência (controles endógenos) para análise quantitativa em ensaios de RT-PCR em tempo real, geralmente sem qualquer investigação real sobre quão invariantes seus níveis de mRNA são nas condições experimentais que estão sendo investigadas. Uma análise sistemática recente e comparação de sua utilidade em biópsias de tecido in vivo concluiu que um único gene de manutenção não deve ser usado para normalização. 19 Parece razoável supor que a maioria dos genes é regulada e que isso causará diferenças imprevisíveis significativas em seus padrões de expressão entre e até dentro do mesmo indivíduo. Se os genes de manutenção forem usados, eles devem ser validados para a configuração experimental específica e é provavelmente necessário escolher mais de um & # x02014 como foi feito, por exemplo, para perfil de expressão de diferenciação de células T auxiliares. 20 Os problemas associados à seleção de genes de referência apropriados foram descritos recentemente de maneira clara e confiável, em que os autores recomendaram o uso da média geométrica de vários genes de referência cuidadosamente selecionados para normalização. 21 Esses autores fornecem um programa que auxilia na seleção dos genes de referência mais adequados.


Introdução ao sequenciamento de RNA

A expressão gênica é um processo amplamente estudado e uma importante área de foco para a genômica funcional [1]. A expressão gênica está relacionada ao fluxo de informações genéticas do modelo de DNA genômico para produtos de proteínas funcionais (Fig. 1). O sequenciamento de RNA maciçamente paralelo (RNA-seq) se tornou um ensaio de expressão gênica padrão, particularmente para interrogar a abundância e diversidade relativa do transcrito. Vários estudos confirmaram que sua precisão de medição rivaliza com outros métodos bem estabelecidos, como microarrays e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) [2–4]. Foi relatado que 85% dos novos eventos de splicing e 88% dos exons expressos diferencialmente previstos por RNA-seq são validados por abordagens "padrão ouro", como a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) e qPCR [3].

O fluxo de informações genéticas do modelo de DNA genômico de fita dupla para proteínas modificadas pós-tradução é descrito com características moleculares críticas para cada estágio enumerado. O RNA-seq normalmente tem como alvo as moléculas de mRNA maduras. Abreviaturas: local de emenda do doador (D) local de emenda do aceitador (A) poliadenilação (poli (A)) região não traduzida (UTR) local de emenda (SS) intensificador de splicing exônico (ESE), intensificador de splicing exônico (ESS), intensificador de splicing intrônico (ISE ) silenciador de emenda intrônica (ISS).

O método de RNA-seq consiste tipicamente na identificação de amostras biológicas adequadas (e replicados), isolamento de RNA total, enriquecimento de RNAs não ribossômicos, conversão de RNA em cDNA, construção de uma biblioteca de fragmentos, sequenciamento em uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento, geração de leituras de extremidade única ou emparelhadas de 30-300 pares de bases em comprimento, alinhamento ou montagem dessas leituras e análise posterior (Fig. 2) [5,6]. Existem vários objetivos de análise downstream para os quais o RNA-seq é adequado. Estes incluem a descoberta do transcrito [7-11], anotação do genoma [8,12,13], estudo dos mecanismos de regulação do gene [14], análise da expressão diferencial do gene [15-17], análise da expressão alternativa [3], alelo-específico análise de expressão [18,19], detecção de edição de RNA [20-22], detecção viral [23-25], detecção de fusão gênica [26-30] e outros tipos de detecção de variantes [31-33]. A Tabela S1 fornece um resumo mais detalhado das aplicações de análise de RNA-seq, e a Tabela S2 lista as ferramentas relevantes para cada uma (citações adicionais para tabelas suplementares são fornecidas no Texto S1). Além dessas aplicações específicas, o RNA-seq permitiu descobertas importantes em vários campos de pesquisa. Essas descobertas incluem descobertas de fusão no câncer [34-36], uma maior compreensão da prevalência, mecanismos e regulação de splicing alternativo [37-39], melhor compreensão da prevalência e significado funcional de genes de RNA não codificantes [40,41] , uma estimativa aumentada (mas controversa) da prevalência de edição de RNA [21] e muito mais. O RNA-seq também está sendo ativamente transferido para aplicações clínicas em muitas doenças humanas [42,43]. Enquanto o RNA-seq é uma abordagem poderosa para muitas questões biológicas [44], as limitações e advertências bem conhecidas dos ensaios de expressão de RNA anteriores, como microarranjos, ainda são aplicáveis ​​[2]. Isso inclui as limitações de que um experimento de RNA-seq representa apenas um único instantâneo da saída de expressão em estado estacionário de uma população de células [45] e que a expressão de RNA nem sempre se correlaciona com a expressão de proteína, bem como outras limitações [46, 47].

Um fluxo de trabalho experimental típico de RNA-seq envolve o isolamento de RNA de amostras de interesse, geração de bibliotecas de sequenciamento, uso de um sequenciador de alto rendimento para produzir centenas de milhões de leituras curtas emparelhadas, alinhamento de leituras contra um genoma de referência ou transcriptoma e análise downstream para estimativa de expressão, expressão diferencial, descoberta de isoforma de transcrição e outras aplicações. Consulte a Tabela S1, a Tabela S3 e a Tabela S7 para obter mais detalhes sobre os conceitos descritos nesta figura.

Nesta peça educacional, exploramos conceitos de biologia molecular de RNA-seq que influenciam os fluxos de trabalho de análise de RNA-seq e interpretação de dados. Também fornecemos uma introdução detalhada aos conceitos de informática fundamentais de RNA-seq e questões de análise comuns. Esses conceitos são abordados aqui, nos Materiais Suplementares e palestras disponibilizados em www.rnaseq.wiki, e nos vídeos dessas palestras disponibilizados em http://bioinformatics.ca/workshops/. Finalmente, disponibilizamos tutoriais de acesso aberto que cobrem computação em nuvem para análise de RNA-seq, instalação de ferramentas, formatos de arquivo relevantes, genomas de referência, anotações de transcriptoma, controle de qualidade e pipelines completos para expressão, expressão diferencial e análise de splicing alternativo (Suplementar Tutoriais online em www.rnaseq.wiki). Os tutoriais representam um exemplo de fluxo de trabalho RNA-seq baseado no conjunto “smoking” [15] e outras ferramentas comumente usadas. Essas ferramentas representativas foram selecionadas a partir de muitas alternativas possíveis para introduzir os conceitos fundamentais de cada etapa de análise (Tabela S2). Os tutoriais são projetados para funcionar em ambientes Mac OS, Linux e Amazon Web Services (AWS) Elastic Compute (EC2) e são acompanhados por conjuntos de dados de teste disponibilizados para fins educacionais (www.rnaseq.wiki).


Discussão

Nossos dados indicam que os RNAs podem ser fisicamente transmitidos de um tecido somático em camundongos machos, neste caso o cérebro, para a linha germinativa e para os embriões subsequentes. O modo de transporte do RNA através da linfa e da corrente sanguínea provavelmente são as vesículas, o que proporcionaria um ambiente seguro para evitar a degradação e aumentar a estabilidade [32, 33]. Embora pudéssemos encontrar apenas um caso em que nosso sistema de detecção capturou o RNA nas frações contendo vesículas de sangue total ultracentrifugado (Arquivo adicional 10: Fig. S9), isso pode servir apenas para destacar as limitações de detecção atuais. Portanto, não podemos confirmar a ocorrência exata porque podemos não estar capturando todas as amostras positivas, uma vez que nosso desenho experimental impôs propositalmente um baixo nível de infecção viral para não inundar o sistema endógeno. No entanto, os dados combinados de ambos os machos 8 e 16 semanas após a injeção e seus respectivos embriões ainda mostraram uma taxa de herdabilidade de 33%. Além disso, nossa verificação completa e quantificação dos resultados de qPCR positivos de vários animais e períodos de tempo, combinados com a garantia de que o vírus não escape do cérebro, nos leva a concluir com segurança que esse processo de fato ocorre pelo menos no camundongo. Encontramos uma tendência de maior expressão geral nos locais de injeção no cérebro (em 8 semanas) e maiores taxas de herdabilidade (8 semanas - 50%, 16 semanas - 28% Arquivo adicional 11: Fig. S10), embora este seja apenas um correlação nesta fase. Nosso estudo foi limitado porque usamos apenas um sistema modelo e um pequeno RNA. Futuros experimentos devem investigar RNAs de diferentes tamanhos e sequências, juntamente com sistemas de detecção alternativos, como sequenciamento profundo e hibridização in situ. No entanto, se nossos resultados forem verificados em estudos subsequentes, a demonstração de que um terço dos embriões contém o transcrito MIR941 após 8 e 16 semanas após a injeção sugere que a transferência de RNA reflete um mecanismo significativo para efeitos epigenéticos intergeracionais e estabelece a base para medições diretas da extensão da herança somática baseada em RNA em diferentes espécies.


 Comprimento de leitura e profundidade de sequenciamento

MRNA padrão ou RNA-seq total: leituras de extremidade única de 50 ou 75 pb são usadas principalmente para perfis de expressão gênica geral. Para estudar variantes de splicing alternativas, leituras mais longas de extremidades emparelhadas (até 150 bp) são frequentemente solicitadas. Na profundidade de sequenciamento, 20-25 milhões de leituras por amostra são geralmente apropriadas para o perfil de expressão gênica geral, enquanto 40-50 milhões de leituras são sugeridas para detecção de variantes de splicing.

Seq de RNA de célula única: Para bibliotecas de seq de scRNA preparadas manualmente, recomendamos obter 1-2 milhões de leituras de 50-75 bp de extremidade única por célula. Essa profundidade geralmente é suficiente para identificar transcrições de baixa abundância. Para bibliotecas preparadas com o 10x Genomics Chromium System, a empresa sugere uma profundidade de sequenciamento de 50.000 leituras por célula e um comprimento de leitura de transcrição de 98 bp.

RNA-seq de baixa entrada ou ultra-baixa entrada: O comprimento de leitura permanece o mesmo que o mRNA padrão ou o RNA-seq total. A profundidade de sequenciamento pode ser reduzida até certo ponto com base na quantidade de material de partida.

Seq de RNA pequeno: NUSeq gera leituras de 50 ou 75 bp de extremidade única para seq de RNA pequeno. A profundidade de sequenciamento sugerida é de 4-5 milhões de leituras por amostra.

 Requisiçao de serviço

A consulta do projeto é gratuita. Os serviços RNA-seq podem ser solicitados através do NUcore.

 Envio de amostra

O NUSeq obtém o RNA total extraído para o RNA-seq (sem tecidos ou células, com exceção do RNA-seq de célula única - ver abaixo). A qualidade do RNA é o fator mais importante que determina o resultado final. Após a entrega da amostra, a equipe principal conduz o CQ da amostra, que inclui a medição da concentração de Qubit e a geração do número de integridade de RNA (RIN) baseado em Bioanalyzer, antes da construção da biblioteca. Um RIN de 7 é necessário para prosseguir com a construção da biblioteca de mRNA-seq. As amostras de RNA enviadas também precisam estar livres de DNA e sugerimos sempre incluir uma etapa de tratamento com DNase durante a extração de RNA. A presença de contaminação por DNA genômico é visível nos traços do Bioanalyzer na faixa de 4-10 kb.

Em situações em que a degradação do RNA é inevitável, como ao usar tecidos FFPE, sugere-se que o RNA-seq total é menos dependente da integridade do RNA.

Para RNA-seq de célula única, a equipe principal começa a partir das células-alvo para a construção da biblioteca. Consulte o núcleo antes de preparar a amostra para obter o melhor desempenho.

 Bioinformática

A análise de dados é fornecida mediante solicitação. O serviço de bioinformática RNA-seq padrão inclui dados de sequenciamento QC, alinhamento, normalização e análise de expressão diferencial. Saiba mais sobre os serviços de bioinformática.


Métodos

Preparação e cultura de células

Ilhotas pancreáticas foram preparadas a partir de camundongos fêmeas saudáveis ​​do National Maritime Research Institute (NMRI) com idades entre 3-4 meses (Bomholtgaard) e alimentados com uma dieta normal ad libitum. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical, e as ilhotas pancreáticas foram isoladas por digestão com colagenase P (Roche) seguida pela coleta manual das ilhotas [36]. Para preparar células isoladas dispersas, as ilhotas coletadas foram agitadas suavemente em baixa concentração extracelular de Ca 2+ para dissolver a estrutura da ilhota [37]. As células dispersas foram semeadas em placas de Petri de plástico de 35 mm (Nunc) em meio RPMI 1640 (SVA) suplementado com 10% de FCS, 100 U ml -1 de penicilina e 10 μgml -1 de estreptomicina (todos da Invitrogen) na presença de 5 mM glicose (Sigma-Aldrich). As células foram mantidas em cultura por 2 a 6 horas, permitindo que se fixassem na superfície do prato

Astrócitos primários foram preparados e cultivados conforme descrito [38]. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Sigma-Aldrich) contendo 10% de soro fetal de bezerro, 2 mmol / L de L-glutamina e penicilina-estreptomicina (todos Invitrogen).

Coleção de célula única

As células anexadas dispersas foram lavadas duas vezes com um tampão (referido como solução extracelular, EC) contendo NaCl 138 mM, KCl 5,6 mM, MgCl 1,2 mM2, CaCl 2,6 mM2, HEPES 5 mM (pH 7,4 com NaOH) e glicose 3, 6, 10 ou 20 mM para remover resíduos mortos e soltos antes da coleta de células com pipetas patch-clamp. O prato, contendo células aderidas e aproximadamente 1 ml de solução de EC, foi montado em um microscópio de luz invertido padrão (Zeiss Axiovert 135). Capilares de vidro de borosilicato (Hilgenberg GmbH) com diâmetro externo de 1,5-1,6 mm e espessura de parede de 0,16 mm foram puxados para pipetas usando um extrator de pipeta patch-clamp (Heka PIP5). O diâmetro da ponta era de aproximadamente 10 μm em média, substancialmente mais largo do que as pipetas patch-clamp padrão e grande o suficiente para permitir a passagem de uma célula intacta. A pipeta de vidro foi montada em um micromanipulador hidráulico (Narishige) no microscópio. Ao controlar manualmente a pressão dentro da pipeta, foi possível coletar células intactas ou quase intactas com volume mínimo de solução extracelular (& lt & lt0,1 μl). No total, 158 células foram coletadas e 126 (80%) foram identificadas como células β com base em sua expressão de insulina, enquanto a maioria das células restantes eram células α (16%). Seis amostras foram negativas para todos os genes medidos e foram categorizadas como falhas técnicas (taxa de sucesso de 96%).

Lise e purificação

Lise de cluster celular

Ilhotas pancreáticas únicas de aproximadamente o mesmo tamanho foram colocadas em 10 μl de vários tampões de lise. Foram utilizados os detergentes Nonidet P-40 (NP-40, também conhecido como Igepal CA-630, Sigma-Aldrich) e tiocianato de guanidina (GuSCN, Sigma-Aldrich). As amostras foram incubadas a 60 ° C ou 80 ° C por 15 minutos (60 ° C para amostras contendo 0,4 mg / ml de proteinase K (Invitrogen)) seguido por 5 min de incubação a 95 ° C e congeladas a -25 ° C para análise subsequente . As amostras foram diluídas 1:20 com água mQ (ELGA Labwater) antes da transcrição reversa.

Os astrócitos primários foram lavados duas vezes em PBS seguido por dissociação de célula única com tratamento com tripsina / EDTA 0,25% (Invitrogen) durante 3 min. A tripsina foi inativada pela adição de meio celular e lavada uma vez em PBS. As células foram filtradas usando um filtro de células de 40 μm (Becton Dickinson). As células foram distribuídas uniformemente entre os tubos de amostra e todo o líquido foi eliminado após uma curta centrifugação (3000 g por 1 min) seguida pela adição de 50 μl de tampão de lise. 2 U / μl RNaseOut (Invitrogen) foi usado como inibidor de RNase. As amostras foram incubadas a 80 ° C durante 5 minutos e congeladas a -25 ° C para análise subsequente. As amostras foram diluídas 1: 4 com água mQ antes da transcrição reversa.

Lise unicelular

Em experimentos de célula única, as pipetas de vidro foram esvaziadas em tubos de plástico de 0,2 ml contendo 2 μl de 0,5 M de GuSCN ou 1 μl de 1 M de GuSCN em água. O esvaziamento exigiu um dispositivo feito sob medida, consistindo de um porta-tubos alinhado com um micromanipulador grosso no qual a pipeta foi montada. A pipeta de vidro foi cuidadosamente enxaguada com solução de lise algumas vezes para garantir que a célula entrou no tubo. Na maioria dos casos, a ponta da pipeta foi quebrada suavemente no tubo facilitando o enxágue da pipeta. Os tubos foram então imediatamente congelados em gelo seco (-78 ° C) e armazenados a -80 ° C para subsequente transcrição reversa. O armazenamento de curto prazo em gelo úmido (0 ° C) não afetou a degradação ou o desempenho da reação subsequente.

Extração de RNA total

O RNA total foi purificado com GenElute Mammalian Total RNA Kit (Sigma-Aldrich) ou RNeasy Mini Kit (Qiagen) e as concentrações foram medidas com um espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (Nanodrop Technologies).

Transcrição in vitro

Um controle de RNA artificial foi gerado com o sistema de transcrição in vitro da T7 RNA Polimerase (Takara). Um ensaio de PCR para ciclofilina E (Ppie) foi usado como modelo para a transcrição in vitro. Ppie O produto de PCR foi gerado usando o protocolo para os ensaios de PCR em tempo real baseados em SYBR Green (ver abaixo), exceto que todos os fluoróforos foram excluídos e purificados usando o kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen). O produto de PCR foi então amplificado usando um primer de PCR direto estendido incluindo a sequência do promotor para T7 RNA polimerase. Todas as sequências de primer são encontradas no arquivo adicional 1: Tabela 3. O produto de PCR resultante (estendido) foi purificado como acima e usado na reação de transcrição in vitro, de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de reação continha: 50 U T7 RNA polimerase, 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 8 mM MgCl2, 2 mM de espermidina, 5 mM de ditiotreitol (todos Takara), 2 mM de NTP (Invitrogen), 20 U de RNaseOut (Invitrogen) e

DNA modelo de 40 ng. A reação foi realizada a 42 ° C durante 1 h.). Em amostras contendo

2.000 cópias do Ppie RNA, o coeficiente de variação intra-ensaio médio foi de 0,3% e a variação inter-ensaio foi de 1,2%.

RT-PCR quantitativo

Devido às flutuações estocásticas, relativo os níveis de expressão gênica fornecem pouca informação, deixando a quantificação absoluta usando curvas padrão como a melhor opção para comparar os níveis de transcrição dentro e entre as células. Para todos os ensaios, os produtos de PCR foram purificados (kit de purificação QIAquick PCR, Qiagen) e quantificados espectrofotometricamente (NanoDrop ND-1000) usando os seguintes valores de absortividade molar (em Moles -1 cm -1): dAMP, 15200 dTMP, 8400 dGMP, 12010 dCMP, 7050. Os produtos de PCR foram diluídos em série para gerar uma curva padrão variando de 10 a 10 6 cópias com eficiências de PCR de 77 a 95% (arquivo adicional 1: Figura 3). A análise de dados qPCR foi realizada essencialmente conforme descrito [9]. Uma vez que os produtos de PCR são de fita dupla e o cDNA é de fita simples, um ciclo foi subtraído dos valores de Ct de uma única célula para a quantificação absoluta correta.

A transcriptase reversa SuperScript III (Invitrogen) foi usada ao longo do estudo. 6,5 μl contendo RNA total ou células únicas lisadas, 0,5 mM de dNTP (Sigma-Aldrich), 2,5 μM de oligo (dT) (15 bp, Invitrogen), 2,5 μM de hexâmeros aleatórios (Invitrogen) foram incubados a 65 ° C por 5 min. Em seguida, adicionamos Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl 3 mM2, 5 mM de ditiotreitol, 20 U RNaseOut e 100, 40 ou 10 U (quantidade inferior para amostras de uma única célula) SuperScript III (todos Invitrogen) para um volume total de 10 μl. As concentrações finais da reação são mostradas. Os perfis de temperatura usados ​​foram 25 ° C por 5 min, 37 ° C por 10 min, 50 ° C por 80 min. Todas as reações foram terminadas a 70 ° C durante 15 min. Ao longo deste artigo, nos referimos aos números absolutos de cópias estimados por curvas padrão baseadas em DNA, assumindo uma eficiência de RT ≤ 100%, o número verdadeiro de cópias de mRNA é igual ou superior à nossa estimativa.

O sistema de detecção de sequência ABI PRISM 7900 HT (Applied Biosystems) e o LightCycler 480 (Roche Diagnostics) equipados com blocos de 384 poços foram usados ​​para medições qPCR. As reações (10 μl) com SYBR Green como repórter fluorescente continham Tris 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl 3 mM2, 0,3 mM dNTP, 1 U JumpStart Taq polimerase, 1 × Corante de Referência (todos Sigma-Aldrich), 0,5 × SYBR Verde I (Invitrogen) e 400 nM de cada iniciador (TAGC Copenhagen). O corante de referência foi excluído usando LightCycler 480. O iQ ™ SYBR ® Green Supermix (BioRad) foi usado para o Nes ensaio. As sequências de primer estão disponíveis no arquivo adicional 1: Tabela 3. Todos os ensaios qPCR foram projetados usando Primer3Plus http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi e abrangidos por pelo menos um íntron quando possível. Eles foram otimizados para não gerar produtos inespecíficos, como primer-dímeros, que pudessem interferir na quantificação do alvo desejado. A formação dos produtos de PCR esperados foi confirmada por eletroforese em gel de agarose (2%) para todos os ensaios e análise da curva de fusão para todas as amostras.

Para cálculos de ruído RT-qPCR, RT-qPCR de 24 plicatas em RNA de ilhota de camundongo purificado e diluído foi usado e reações de qPCR de 30 plicatas em cDNA de ilhota total.

Análise de ruído RT-qPCR

O modelo teórico é baseado em uma caracterização empírica do ruído nos experimentos. Primeiro, consideramos o ruído na reação qPCR apenas e determinamos como ele se dimensiona em função do número de cDNAs com base em réplicas que foram diluídas em diferentes graus. O ruído qPCR é considerado o mesmo para todos os genes. Para modelar o ruído RT, um parâmetro para a eficiência RT é ajustado a partir de réplicas que foram diluídas em diferentes graus. Usando nossos parâmetros determinados empiricamente para o modelo, podemos calcular as contribuições do RT e qPCRs e o ruído de medição total pode ser comparado à variação biológica em uma população de células. Uma descrição completa do modelo é fornecida no arquivo adicional 2.


PCR quantitativo em tempo real (qPCR) é uma técnica comumente usada para analisar o nível de expressão relativa do gene na pesquisa biomédica. Na maioria dos casos, experimentos em pequena escala são projetados para quantificar o nível de mRNA entre as condições experimentais. Some advanced machines and optimized protocols have simplified the experiments to a highly efficient one-step process, allowing the effective analysis of a large scale of qPCR data. However, all processes for assessing the quality of the data, performing the analysis and reporting the results are not done in the most uniform way across the literature (Bustin & Nolan, 2004). Different analysis models have been proposed and implemented in different software environments (Pabinger et al., 2014). Furthermore, requirements and guidelines for reporting qPCR data were independently introduced (Bustin et al., 2009).

In this report, we introduce an open source R package for performing quality assessment, modeling and testing for statistical significance of qPCR data in a uniform way. In its current version, the pcr package implement two methods for relative quantification of mRNA expression proposed originally by Livak & Schmittgen (2001), in addition to the necessary steps to check the assumption of these methods. Also, we implement a number of methods to check for statistical significance in qPCR data which were introduced in SAS by Yuan et al. (2006). Finally, the package provides unified interface to make the analysis accessible and the ability to make graphs of the different analysis steps for visual inspection and preparation of publication-level figures. We start by describing the process for generating the data in the original papers, briefly introduce the methods and apply them to the original data using the pcr.


SYNOPSIS

  • ‘CRISPR integrated gRNA and reporter sequencing’ (CIGAR-seq) is a new high-throughput method for unbiased screening of mRNA modification regulators.
  • The study presents the first pooled CRISPR screen with epitranscriptomic readout.
  • NSUN6 is discovered as a novel mRNA m 5 C methyltransferase.
  • NSUN6 and NSUN2 contribute to almost all the m 5 C modification in mRNA.


Assista o vídeo: How To Perform The Delta-Delta Ct Method In Excel (Agosto 2022).