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Competição na hibridização de DNA para RNA

Competição na hibridização de DNA para RNA



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Depois de separar as duas fitas de DNA, o que faz uma das duas fitas se combinar com a fita de mRNA marcada em vez da velha fita complementar?


Neste tipo de experimento, a concentração do mRNA será maior do que a concentração do DNA inicial.

Quando as fitas de DNA se separam, o DNA e o mRNA estarão em competição pela fita complementar. Usar concentrações realmente altas de mRNA em comparação com o DNA dará a vantagem de recombinar com uma frequência mais alta e fornecerá uma proporção mais alta da combinação DNA-mRNA.

É tudo uma questão de proporção.


Hibridização de ácido nucléico

Em biologia molecular, hibridização (ou hibridização) é um fenômeno no qual moléculas de ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA) se anelam com DNA ou RNA complementar. [1] Embora uma sequência de DNA de fita dupla seja geralmente estável em condições fisiológicas, alterar essas condições no laboratório (geralmente aumentando a temperatura ambiente) fará com que as moléculas se separem em fitas simples. Essas fitas são complementares entre si, mas também podem ser complementares a outras sequências presentes em seus arredores. Abaixar a temperatura circundante permite que as moléculas de fita simples se anelem ou "hibridizem" umas com as outras.

A replicação e a transcrição do DNA em RNA dependem da hibridização de nucleotídeos, assim como as técnicas de biologia molecular, incluindo Southern blots e Northern blots, [2] a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a maioria das abordagens de sequenciamento de DNA.


PADRÕES DE SÍNTESE DE RNA EM CÉLULAS INFECTADAS POR T5 I. COMO ESTUDADO PELA TÉCNICA DE HIBRIDIZAÇÃO-COMPETIÇÃO DE DNA-RNA *

Os padrões de marcação de RNA obtidos após a infecção por T5 de Escherichia coli F concorda com os padrões de rotulagem de proteínas publicados por McCorquodale e Buchanan. 1 Três classes distintas de RNA formadas sequencialmente durante o período de desenvolvimento viral podem ser reconhecidas pela técnica de competição por hibridização DNA-RNA. O RNA de classe I é formado 5 minutos após o início do metabolismo viral e corresponde ao RNA sintetizado em resposta à infecção com o segmento de 8 por cento do DNA T5. A síntese de proteínas dirigida por este segmento de 8 por cento é necessária em alguma capacidade para a cessação da síntese de classe I e o início da síntese de classe II 4 a 5 minutos após a infecção. A síntese de RNA de classe III começa entre 9 e 12 minutos. Seu aparecimento é evitado quando o cloranfenicol é adicionado imediatamente após a expressão completa das funções de classe I.


Sondas de DNA: aplicações dos princípios de hibridização de ácido nucleico

A hibridização de ácido nucleico com uma sonda marcada é a única maneira prática de detectar uma sequência alvo complementar em uma mistura de ácido nucleico complexa. A primeira seção deste artigo cobre aspectos quantitativos da termodinâmica e cinética da hibridização de ácido nucleico. As sondas consideradas são oligonucleotídeos ou polinucleotídeos, DNA ou RNA, de fita simples ou dupla, e naturais ou modificados, tanto nas bases de nucleotídeos quanto no esqueleto. Os produtos de hibridização são duplexes ou triplexes formados com alvos em solução ou em suportes sólidos. Tópicos adicionais incluem aceleração de hibridização e reações envolvendo migração de ramos. A segunda seção trata da síntese ou biossíntese e detecção de sondas marcadas, com uma discussão sobre seus limites de sensibilidade e especificidade. A etiquetagem direta é ilustrada com sondas radioativas. A discussão de rótulos indiretos começa com sondas biotiniladas como protótipos. Os grupos de repórteres considerados incluem nucleotídeos radioativos, fluorescentes e quimioluminescentes, bem como enzimas com substratos colorimétricos, fluorescentes e luminescentes.


Síntese de ácido ribonucléico durante a formação de microcistos em Myxococcus xanthus: caracterização por hibridização ácido desoxirribonucléico-ácido ribonucléico

A técnica de hibridização ácido desoxirribonucléico-ácido ribonucléico (RNA) foi utilizada para comparar o RNA sintetizado durante o crescimento vegetativo e a formação de microcistos em Myxococcus xanthus. Todas as classes de RNA, incluindo o RNA ribossomal, foram sintetizadas durante a formação do microcisto. Os resultados indicam que o RNA ribossomal sintetizado durante a formação do microcisto era indistinguível daquele feito durante o crescimento vegetativo. Experimentos de competição de hibridização demonstraram que certas espécies de RNA mensageiro são sintetizadas apenas durante o crescimento vegetativo, enquanto outras são sintetizadas apenas durante a formação de microcistos. A síntese de uma nova espécie de RNA polimerase não parece ser responsável pela transcrição diferencial durante a morfogênese em M. xanthus, uma vez que a sensibilidade da rifampicina na transcrição foi conservada durante a formação do microcisto.


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Métodos

Examine a evolução das moléculas de DNA e RNA autorreplicantes sob condições provavelmente presentes na Terra primordial.

Configuração (condições iniciais)

Nossa dinâmica evolutiva proposta ocorre em poças de maré, provavelmente comuns na Terra primordial. Poças de maré fornecem um ambiente líquido fracamente dispersivo e espacialmente restrito, contendo várias espécies de monômeros geradas por química prebiótica [40, 42,43,44]. Assumimos que os nucleotídeos foram sintetizados dentro do pool de marés por meio de reações inicialmente em equilíbrio. Assim, como produtos dessas reações foram consumidos na formação de polinucleotídeos, mais seriam sintetizados. Assim, na medida em que as vias de reação “competissem” pelo substrato, aquelas que gerassem o nucleotídeo mais favorável para a formação do polímero se tornariam os consumidores primários.

Em seguida, submetemos a piscina a ciclos diurnos regulares próximos às temperaturas de fusão dos polinucleotídeos. A temperatura média do oceano arqueano é estimada em 26-35 ° C, mas pode ter atingido 70 ° C em alguns locais [41, 45] e provavelmente variou no espaço e no tempo. Outras condições iniciais, como a atmosfera redutora, o pH, a salinidade e as concentrações de íons nos oceanos primordiais [27], podem ter contribuído para a dinâmica da química prebiótica e da autocatálise do polímero.

Nessas condições, o ciclo térmico diurno aplica perturbações regulares e previsíveis ao meio ambiente. O papel crítico das flutuações termodinâmicas cíclicas (em oposição às flutuações estocásticas ou um estado termodinamicamente constante) no desenvolvimento de informações e na conversão de energia em ordem (entropia diminuída) foi amplamente reconhecido [46].

Nossa hipótese é que as temperaturas diurnas mais altas, semelhantes às Reações em Cadeia da Polimerase (PCR), forneçam energia térmica suficiente para derreter as ligações de hidrogênio, causando a separação das fitas do polímero. Simultaneamente, a radiação ultravioleta diurna da luz solar pode promover a formação de nucleobases [4]. À medida que a energia térmica diminuía durante as horas da noite, cada fita simples poderia se replicar conforme os monômeros livres formavam ligações de hidrogênio com contrapartes na fita modelo, levando a ligações covalentes entre monômeros adjacentes e a síntese de uma fita filha [14].

A evolução por seleção natural requer variação fenotípica hereditária e restrições ambientais que limitam a proliferação de modo que o sucesso replicativo de um organismo seja governado por suas propriedades e as de organismos concorrentes. Propomos que essas condições sejam satisfeitas enquanto o RNA auto-replicante ou suas macromoléculas ancestrais, dentro da restrição física de uma piscina de maré, competem por monômeros disponíveis. Além disso, notamos que o ciclo diurno também impõe restrições à velocidade replicativa. Ou seja, a conclusão bem-sucedida de cada síntese de fita filha deve ocorrer antes do início das temperaturas diurnas e da separação da fita. Assim, essas dinâmicas evolutivas prebióticas imporiam seleção para fidelidade e velocidade de replicação, eficiência de utilização do substrato e estabilidade (persistência) sob as condições ambientais locais.

Finalmente, os níveis de água flutuantes em piscinas naturais permitiram o influxo de novos monômeros e o efluxo de replicadores. Este último resultou na dispersão de replicadores para que as variantes bem-sucedidas pudessem colonizar novos pools que não tinham espécies autorreplicantes ou foram povoadas por replicadores com propriedades inferiores. Este acoplamento fraco de subpopulações poderia acelerar e promover a seleção natural semelhante à teoria do equilíbrio inconstante de Wright [47].

Modelos matemáticos e simulações de computador

Os modelos matemáticos e detalhes de simulações de computador são discutidos em detalhes nas referências [26]. Todo o código usado nas simulações está disponível no link fornecido a seguir.


Competição na hibridização de DNA para RNA - Biologia

um Laboratório Estadual de Quimio / Bio-Sensoriamento e Quimetria, Faculdade de Química e Engenharia Química, Hunan University, Changsha 410082, P. R. China
O email: [email protected]

b Wallace H. Coulter Departamento de Engenharia Biomédica, Escola de Medicina da Emory University, Emory University, Atlanta, Geórgia 30322, EUA
O email: [email protected]

Resumo

A imagem de RNA em animais vivos ajuda a decifrar a biologia e cria novos teranósticos para o tratamento de doenças. Devido à sua baixa eficiência de entrega e alto fundo, no entanto, sondas de fluorescência para no local Imagens de RNA em camundongos vivos não foram relatadas. Nós desenvolvemos uma nova sonda fluorescente de segmentação celular que permite imagens de RNA em camundongos vivos através da um na Vivo reação em cadeia de hibridização (HCR). O design minimalista em forma de Y da sonda tripartida de DNA melhora seu desempenho em estudos com animais vivos e serve como uma estrutura modular para três motivos de DNA para o direcionamento de células e o circuito HCR. A sonda tripartida de DNA permite a síntese fácil com alto rendimento e demonstra detecção ultrassensível de RNA em vitro. A sonda também exibe internalização seletiva e eficiente em células superexpressas do receptor de folato (FA) através da um mecanismo de endocitose mediado por caveolar e produz sinais de fluorescência dinamicamente correlacionados com expressões alvo intracelulares. Além disso, a sonda exibe entrega específica em células tumorais e permite imagens de alto contraste de miR-21 em camundongos vivos. O projeto de DNA tripartido pode abrir a porta para imagens de RNA intracelular em animais vivos usando estruturas mínimas de DNA e sua estratégia de projeto pode ajudar no desenvolvimento futuro de sondas moleculares multifuncionais baseadas em DNA.


Vantagens da hibridização

(1) Duas espécies se combinam para formar o melhor do organismo.

(2) As plantas híbridas são fisicamente uniformes. Isso é muito vantajoso para os agricultores que colhem com máquinas, mas geralmente não é um grande problema para os pequenos jardineiros em estufas.

(3) A hibridização ajuda na obtenção de diferentes espécies de animais.

(4) Eles transmitem características favoráveis ​​e prolongam a sobrevivência de espécies ameaçadas ou em perigo de extinção.

(5) Eles (híbridos) costumam mostrar maior vigor e crescimento mais rápido

(6) Os híbridos podem ter rendimentos até 25 (vinte e cinco) por cento maiores.

(7) Eles resultam na formação de organismos que possuem várias qualidades, como resistência a doenças, resistência ao estresse e assim por diante.

(8) Em animais como humanos, a hibridização auxilia na detecção da presença de genes amplificados no câncer e no mapeamento de sua localização.

(9) A hibridação abre espaço para uma melhor adaptação de novas espécies.


Análise de RNA por hibridização Northern e Slot Blot

Sequências específicas em preparações de RNA podem ser detectadas por análise de blotting e hibridização usando técnicas muito semelhantes às originalmente desenvolvidas para DNA. O RNA fracionado é transferido de um gel de agarose para um suporte de membrana (Northern blotting). O RNA não fracionado é imobilizado por slot ou dot blotting. As manchas resultantes são estudadas por análise de hibridização com DNA marcado ou sondas de RNA. O Northern blotting difere amplamente do Southern blotting na etapa inicial de fracionamento do gel. Por serem de fita simples, a maioria dos RNAs são capazes de formar estruturas secundárias por emparelhamento de bases intramoleculares e, portanto, devem ser submetidos à eletroforese em condições desnaturantes para obter boas separações. A desnaturação é conseguida adicionando formaldeído ao gel e tampões de carregamento ou tratando o RNA com glioxal e dimetilsulfóxido (DMSO) antes do carregamento. O protocolo básico descreve o blotting e a hibridização do RNA fracionado em um gel de agarose-formaldeído. Protocolos alternativos descrevem o método de glioxal / DMSO para eletroforese em gel desnaturante e hibridização slot-blot de amostras de RNA. A remoção das sondas de hibridização de manchas pode ser feita sob três diferentes conjuntos de condições, esses métodos são descritos em um Protocolo de Suporte.


Assista o vídeo: Bio Mol Hibridização Parte 1 UFRA (Agosto 2022).