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Por que você misturaria polimerases em PCR?

Por que você misturaria polimerases em PCR?



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Eu estava lendo um manual de kit que exige que você amplifique DNA por PCR antes de analisá-lo no kit. O manual sugere a mistura de polimerases de revisão e não revisão:

Para produtos de PCR> 2500 bp de comprimento, use uma mistura de DNA polimerase contendo Taq DNA polimerase suplementada com uma DNA polimerase de revisão

Como isso melhoraria a amplificação de produtos longos? Ele sugere o uso de apenas uma polimerase de revisão para fragmentos abaixo de 2500 bases. A adição de uma polimerase sem revisão melhora a velocidade? Eu tenho TAQ e PFU Ultra, mas ambas as instruções dizem para usar um tempo de extensão de 1 minuto por kb.


A Taq polimerase é uma enzima bastante rápida (a taxa de síntese é de cerca de 1 kb / min), mas o retrocesso é que ela não tem atividade 3'-5'exonuclease que permitiria revisar o DNA recém-sintetizado. Isso leva à introdução de erros e a chance de obtê-los é maior quanto mais longo for o DNA que você deseja sintetizar.

As polimerases que são capazes de revisar (que têm a atividade de exonuclease) como Pfu têm uma taxa de erro muito menor, mas por outro lado também são muito mais lentas, normalmente em torno de 0,5 kb / min. O Pfu também é mais caro do que a Taq polimerase. Consulte a tabela 1 da referência 1 abaixo:

Para combinar as vantagens de ambas as polimerases, você normalmente usa uma mistura de Taq e Pfu. Então você obtém a alta processabilidade do Taq combinada com a capacidade de revisão do Pfu e obtém bons rendimentos de DNA com uma baixa quantidade de mutações. Consulte também a referência 2 para obter detalhes sobre este sistema.

Referências:

  1. Comparação da taxa de erro durante a reação em cadeia da polimerase por DNA polimerase
  2. Amplificação eficaz de alvos longos a partir de inserções clonadas e DNA genômico humano.

Escolha a polimerase de DNA correta para PCR

New England BioLabs tem muitas polimerases projetadas para uso em PCR. Como você decide qual você precisa? Isso dependerá principalmente do seu aplicativo. A primeira decisão que você provavelmente tomará é: você precisa de amplificação de alta fidelidade ou amplificação padrão? Se você planeja usar seu produto de PCR em experimentos subsequentes, como expressão ou sequenciamento de proteínas, você deseja minimizar a incorporação de erros e deve escolher uma polimerase de alta fidelidade. Se você só precisa ver se tem um produto de PCR ou não, por exemplo, se está confirmando que seu plasmídeo tem uma inserção, então o PCR padrão ou de colônia será apropriado.

Para amplificação de alta fidelidade, recomendamos começar com a DNA polimerase de alta fidelidade Q5, uma vez que tem a menor taxa de erro disponível e também foi otimizada para um desempenho realmente robusto em todo o espectro ATGC. Para PCR padrão ou PCR de colônia, recomendamos começar com a DNA polimerase OneTaq, que também foi otimizada para um ótimo desempenho, mesmo com modelos difíceis, como ricos em GC.

Em seguida, você precisa configurar suas reações à temperatura ambiente? A especificidade é um desafio? Nesse caso, uma versão de inicialização a quente da polimerase será ideal.

Sua próxima decisão será o formato da polimerase. Para facilidade de uso, temos master mixes que contêm a enzima, tampão e dNTPs, e também formatos de master mix de carregamento rápido que também contêm corante de carregamento para que você possa carregar seu PCR direto no gel. E, claro, também temos polimerases autônomas.


Revisão de DNA polimerase

Um domínio de exonuclease de revisão 3´ → 5´ é intrínseco à maioria das DNA polimerases. Ele permite que a enzima verifique cada nucleotídeo durante a síntese de DNA e excise os nucleotídeos incompatíveis na direção 3´ para 5´. O domínio de revisão também permite que uma polimerase remova nucleotídeos salientes 3´ desemparelhados para criar extremidades cegas. Protocolos como PCR de alta fidelidade, polimento de saliência 3´ e síntese de segunda fita de alta fidelidade requerem a presença de uma exonuclease 3´ → 5´.

Em contraste, algumas aplicações são aprimoradas pelo uso de polimerases sem atividade de revisão. Por exemplo, a eficiência da marcação de DNA é potencializada pela ausência de revisão, pois impede a excisão de bases incorporadas, permitindo o uso de menos da base modificada.

Ensaios de incorporação de base modificada, como análise multicolorida de expressão gênica, mapeamento gênico e no local a hibridização, que utiliza DNA que foi marcado com um nucleotídeo fluorescente para facilitar a detecção, são bem combinadas com as polimerases de DNA deficientes em exonuclease de NEB. Polimerases sem revisão também são indispensáveis ​​ao preencher parcialmente saliências 5´ com apenas dNTPs selecionados. A adição de um dNTP não modelado no terminal 3 'das extremidades cegas, um requisito para a clonagem de TA, também é promovida por enzimas de não revisão. Além de várias polimerases de tipo selvagem em cada uma dessas categorias, o NEB oferece versões geneticamente alteradas de várias polimerases de revisão, em que a atividade de exonuclease de revisão foi atenuada ou abolida.


Parâmetros que afetam o PCR

Componentes essenciais das reações em cadeia da polimerase:

    Uma polimerase de DNA termoestável para catalisar a síntese de DNA dependente de modelo:

Dependendo da capacidade, fidelidade e eficiência de sintetizar grandes produtos de DNA, uma ampla escolha de enzimas está agora disponível. Para PCRs de rotina, a polimerase Taq (0,5-2,5 unidades por reação padrão de 25-50 uL) permanece a enzima de escolha. A atividade específica da maioria das preparações comerciais de Taq é

80.000 unidades / mg de proteína. Uma vez que a eficiência da extensão do primer com Taq polimerase é geralmente

0,7, a enzima torna-se limitante quando 1,4 * 1012 a 7 * 1012 moléculas de produto amplificado se acumulam na reação.

O projeto do iniciador de oligonucleotídeo sendo o fator mais importante que influencia a eficiência e especificidade da reação de amplificação, o projeto cuidadoso de iniciadores é necessário para obter os produtos desejados em alto rendimento, para suprimir a amplificação de sequências indesejadas e para facilitar a manipulação subsequente do amplificado produtos. Uma vez que os primers influenciam fortemente o sucesso ou o fracasso dos protocolos de PCR, é irônico que as diretrizes para seu projeto sejam amplamente qualitativas e baseadas mais no bom senso do que em princípios termodinâmicos ou estruturais bem compreendidos.

Projeto de primers de oligonucleotídeo para PCR

Em certas situações, pode ser desejável amplificar vários segmentos de DNA alvo simultaneamente. Nestes casos, é usada uma reação de amplificação denominada "PCR multiplex" que inclui mais de um par de iniciadores na mistura de reação. As reações padrão contêm uma quantidade não limitante de primers, normalmente 0,1-0,5μM de cada primer (6 * 1012 a 3 * 1013 moléculas). Essa quantidade é suficiente para pelo menos 30 ciclos de amplificação de um segmento de DNA de 1 kb. Concentrações mais altas de primers favorecem o mispriming que pode levar à amplificação inespecífica.

Os PCRs padrão contêm quantidades equimolares de todos os quatro dNTPs. Concentrações de 200-250μM de cada dNTP recomendadas para a Taq polimerase em reações contendo 1,5 mM de MgCl2. Em uma reação de 50 uL, essas quantidades devem permitir a síntese de

6-6,5 μg de DNA que deve ser suficiente mesmo para a reação multiplex em que oito ou mais pares de primers são usados ​​ao mesmo tempo. Altas concentrações de dNTPs (& gt4mM) são inibitórias, talvez devido ao sequestro de Mg2 +. No entanto, uma quantidade satisfatória de produto amplificado pode ser produzida com concentrações de dNTP tão baixas quanto 20μM-0,5-1,0pM de um fragmento amplificado

1 kb de comprimento. Para evitar problemas, os estoques de dNTPs devem ser armazenados a -20 o C em pequenas alíquotas que devem ser descartadas após o segundo ciclo de congelamento ou descongelamento. Durante o armazenamento de longo prazo a -20 o C, pequenas quantidades de água evaporam e congelam nas paredes do frasco. Para minimizar as alterações na concentração, os frascos contendo soluções de dNTP devem ser centrifugados, após o descongelamento, por alguns segundos em uma microcentrífuga.

Todas as DNA polimerases termoestáveis ​​requerem cátions divalentes livres - geralmente Mg2 + para atividade. Algumas polimerases também funcionam, embora menos eficientemente com tampões contendo Mn2 +. Os íons de cálcio são bastante ineficazes. Como os dNTPs e os oligonucleotídeos se ligam ao Mg2 +, a concentração molar do cátion deve exceder a concentração molar dos grupos fosfato contribuídos pelos dNTPs e primers. Portanto, é impossível recomendar uma concentração de Mg2 + que seja opcional em todas as circunstâncias. Embora uma concentração de 1,5 mM de Mg2 + seja usada rotineiramente, o aumento da concentração de Mg2 + para 4,5 mM ou 6 mM foi relatado para diminuir o priming inespecífico em alguns casos e aumentá-lo em outros. A concentração ideal de Mg2 + deve, portanto, ser determinada empiricamente para cada combinação de primers e molde. As preparações de DNA molde não devem conter quantidade significativa de agentes quelantes (como EDTA ou íons carregados negativamente como PO43-), que podem sequestrar Mg2 +.

O Tris-Cl, ajustado a um pH entre 8,3 e 8,8 à temperatura ambiente, está incluído em PCRs padrão a uma concentração de 10 mM. Quando incubado a 72 o C (fase de extensão da PCR), o pH da mistura de reação cai em mais de uma unidade completa, produzindo um tampão cujo pH é

O tampão de PCR padrão contém KCl 50 mM e funciona bem para a amplificação de segmentos de DNA & gt500bp de comprimento. Aumentando a concentração de KCl para

70-100mM geralmente melhora o rendimento de segmentos de DNA mais curtos.

O DNA modelo contendo as sequências alvo pode ser adicionado ao PCR na forma de cadeia simples ou dupla. Os modelos de DNA circulares fechados são amplificados com um pouco menos de eficiência do que os DNAs lineares. Embora o tamanho do DNA modelo não seja crítico, a amplificação de sequências incorporadas no DNA de alto peso molecular (& gt10kb) pode ser melhorada digerindo o modelo com uma enzima de restrição que não cliva dentro da sequência alvo.

Quando funciona da melhor forma, o PCR requer apenas uma única cópia da sequência alvo como modelo. Mais tipicamente, no entanto, vários milhares de cópias do DNA alvo são semeados na reação. No caso do DNA genômico de mamíferos, até 1μg de DNA é utilizado por reação, uma quantidade que contém

3 * 105 cópias de um gene autossômico de cópia única. As quantidades típicas de DNAs de leveduras, bactérias e plasmídeos usadas por reação são 10μg, 1μg e 1pg, respectivamente.


Escolha de uma mistura principal de PCR

O uso de uma master mix de PCR para experimentos de PCR em tempo real fornece uma configuração mais rápida com menos pipetagem, redução da contaminação, menos variabilidade tubo a tubo e resultados mais reproduzíveis.

As master mixes Bio-Rad PCR são otimizadas para diferentes aplicações, por exemplo, quantificação de expressão gênica, genotipagem ou análise de fusão de alta resolução. Há uma série de considerações ao escolher a melhor mixagem mestre de PCR para sua aplicação, incluindo:

  • Tipo de triagem PCR e mdash, clonagem ou quantitativa
  • Tamanho do amplicon
  • Complexidade do modelo e conteúdo G-C, estrutura secundária, etc.
  • Velocidade, fidelidade e processabilidade da DNA polimerase
  • Tolerância do inibidor
  • Polimerase de inicialização a quente mediada por anticorpos
  • Tolerância a parâmetros de reação, como diferentes primer Tm valores
  • Escalabilidade
  • Custo por reação

Opções diyBio Thermocycler

Existem algumas opções disponíveis para o pessoal de diybio que deseja executar reações de PCR em casa. Tendo em mente que tudo o que os termocicladores realmente fazem é aquecer e resfriar amostras de DNA ao longo de uma série de ciclos, a diferença nas opções se resume ao preço, tamanho e grau de automação.

Aqui estão algumas das opções.

MiniPCR mini8

PocketPCR

BentoLab

era também OpenPCR, mas parece que o projeto foi descontinuado e substituído por uma máquina qPCR que começa em cerca de US $ 5.000. Vou pular esse, já que está fora do alcance da maioria dos biólogos DIY.

Então, qual termociclador acabei escolhendo?

Pesei todas as opções e fui em outra direção: comprar um termociclador usado no eBay!

Comprar no eBay é inerentemente arriscado, mas pode ser feito. Você precisa ter certeza de que a lista indica que a unidade foi testada e funciona. É absolutamente necessário certificar-se de que vem com o bloco de aquecimento (o grande pedaço de metal onde ficam os tubos), caso contrário, comprar um novo bloco pode custar mais do que a própria máquina.

Ouvi dizer que algumas pessoas têm sorte ao consertar unidades quebradas, mas não recomendaria essa abordagem se você for novo no diybio, pois já estará sobrecarregado com coisas para fazer e aprender.

Acabei comprando um Applied Biosystems GeneAmp PCR 9700 por cerca de US $ 300 (US $ 150 pela unidade + US $ 150 pelo frete).

Essa opção foi a mais barata para mim de todas as opções mencionadas acima, mesmo com os altos custos de envio. Embora não seja portátil e não possa ser controlado por meio de um aplicativo, ele funciona. Ele tem um bloco de aquecimento de 96 poços que é mais do que eu jamais precisarei para meu laboratório doméstico. Ele me permite programar e armazenar facilmente minhas rotinas de PCR. E, surpreendentemente, muitos dos descartáveis ​​e periféricos ainda são vendidos pela ThermoFisher.

Visão superior do termociclador em embalagem enviada Vista do visor do termociclador

Componentes adicionais necessários para executar PCR

Um termociclador é apenas uma peça do quebra-cabeça na amplificação de DNA. Existem outros procedimentos e ferramentas necessárias + reagentes de que você precisará para executar uma reação de PCR com êxito.

Minha experiência é extrair e amplificar o gene ITS de amostras de fungos, mas os mesmos requisitos gerais serão necessários para qualquer gene (s) que você deseja amplificar:

  • Extração de DNA & # 8211 você & # 8217 precisará de uma amostra, protocolo para extrair o dna, reagentes para quebrar o DNA de suas culturas & # 8217 células, centrífuga e tubos Eppendorf de 1,5ml ou 0,2ml.
  • Oligonucleotídeos (iniciadores) primers são pequenos filamentos de DNA que prefixam e sufixam o (s) gene (s) que você deseja amplificar. Depois de extrair seu DNA, você vai misturar os primers de acordo com seu protocolo antes de executar o PCR. Durante a PCR, os primers se anexarão ao gene de interesse, onde o próximo reagente abaixo funcionará para dobrar o gene de interesse.
  • TAQ Polimerase & # 8211 este reagente é adicionado com os primers e é uma enzima resistente ao calor especial que facilita a duplicação do (s) gene (s) de interesse entre cada ciclo de desnaturação / anelamento.
  • Amortecedor O tampão & # 8211 normalmente é apenas água e Tris-HCL pH 8,0 (às vezes com EDTA), mas seu papel é equilibrar e estabilizar o DNA extraído e / ou criar diluições de primer.

Depois de executar o PCR, a eletroforese em gel pode ser usada para testar se sua reação de PCR foi bem-sucedida ou não. Esta é uma etapa importante porque garante que você amplificou o gene correto antes de prosseguir com as próximas etapas caras, como o sequenciamento.

Para encerrar, direi que aprender PCR é uma ferramenta incrivelmente útil e versátil. Muitas das pessoas com quem conversei refletem sobre o tempo que gastaram aprendendo e executando reações de PCR com carinho. Muito do trabalho genético moderno não seria possível sem PCR. Então vá em frente e aprenda! Valerá a pena seu tempo.


QPCR e RT-qPCR

PCR de ponto final quantitativo

PCR e RT-PCR são geralmente usados ​​em um formato qualitativo para avaliar amostras biológicas. No entanto, uma ampla variedade de aplicações, como determinação de carga viral, medição de respostas a agentes terapêuticos e caracterização de expressão gênica, seria melhorada pela determinação quantitativa da abundância alvo. Teoricamente, isso deveria ser fácil de conseguir, dada a natureza exponencial da PCR, pois existe uma relação linear entre o número de ciclos de amplificação e o logaritmo do número de moléculas. Na prática, entretanto, a eficiência da amplificação é diminuída por causa de contaminantes (inibidores), reações competitivas, exaustão do substrato, inativação da polimerase e reanimação do alvo. Conforme o número de ciclos aumenta, a eficiência da amplificação diminui, resultando eventualmente em um efeito de platô.

Normalmente, a PCR quantitativa requer que as medições sejam feitas antes da fase de platô, de modo que a relação entre o número de ciclos e as moléculas seja relativamente linear. Este ponto deve ser determinado empiricamente para diferentes reações devido aos inúmeros fatores que podem afetar a eficiência da amplificação. Como a medição é feita antes do platô da reação, a PCR quantitativa usa menos ciclos de amplificação do que a PCR básica. Isso pode causar problemas na detecção do produto final porque há menos produto para detectar.

Para monitorar a eficiência da amplificação, muitos aplicativos são projetados para incluir um padrão interno no PCR. Uma tal abordagem inclui um segundo par de iniciadores que é específico para um gene & ldquohousekeeping & rdquo (ou seja, um gene que tem níveis de expressão constantes entre as amostras comparadas) na reação (Gaudette e Crain, 1991 Murphy et al. 1990). A amplificação dos genes de manutenção verifica se o ácido nucleico alvo e os componentes da reação eram de qualidade aceitável, mas não leva em conta as diferenças nas eficiências de amplificação devido às diferenças no tamanho do produto ou na eficiência de recozimento do primer entre o padrão interno e o alvo a ser quantificado.

O conceito de PCR competitivo e variação de mdasha de PCR quantitativo e mdashis uma resposta a esta limitação. Na PCR competitiva, uma quantidade conhecida de um modelo de controle é adicionada à reação. Este modelo é amplificado usando o mesmo par de iniciadores que a molécula alvo experimental, mas produz um produto distinguível (por exemplo, tamanho diferente, padrão de digestão de restrição, etc.). As quantidades de controle e produto de teste são comparadas após a amplificação. Embora essas abordagens controlem a qualidade do ácido nucleico alvo, componentes do tampão e eficiências de recozimento do primer, elas têm suas próprias limitações (Siebert e Larrick, 1993 McCulloch et al. 1995), incluindo o fato de que muitos dependem da análise final por eletroforese.

Existem numerosos ensaios fluorescentes e de fase sólida para medir a quantidade de produto de amplificação gerado em cada reação, mas muitas vezes falham em discriminar DNA amplificado de interesse de produtos de amplificação não específicos. Algumas dessas análises baseiam-se em técnicas de blotting, que introduzem outra variável devido às eficiências de transferência de ácido nucleico, enquanto outros ensaios foram desenvolvidos para eliminar a necessidade de eletroforese em gel e ainda fornecer a especificidade necessária. A PCR em tempo real, que fornece a capacidade de visualizar os resultados de cada ciclo de amplificação, é uma forma popular de superar a necessidade de análise por eletroforese.

PCR quantitativo em tempo real

O uso de sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência ou primers ou corantes fluorescentes de ligação a DNA para detectar e quantificar um produto de PCR permite que a PCR quantitativa seja realizada em tempo real. Instrumentos especialmente projetados executam ciclos térmicos para amplificar o alvo e detecção de fluorescência para monitorar o acúmulo de produto PCR. Os corantes de ligação ao DNA são fáceis de usar, mas não diferenciam entre produtos de PCR específicos e não específicos e não conduzem a reações multiplex. As sondas de ácido nucleico marcadas com fluorescência têm a vantagem de reagir apenas com produtos de PCR específicos, mas podem ser caras e difíceis de projetar. Algumas tecnologias qPCR empregam primers de PCR marcados com fluorescência em vez de sondas.

O uso de corantes fluorescentes de ligação ao DNA é uma das abordagens mais fáceis de qPCR. O corante é simplesmente adicionado à reação e a fluorescência é medida a cada ciclo de PCR. Como a fluorescência desses corantes aumenta dramaticamente na presença de DNA de fita dupla, a síntese de DNA pode ser monitorada como um aumento no sinal fluorescente. No entanto, muitas vezes o trabalho preliminar deve ser feito para garantir que as condições de PCR produzam apenas um produto específico. Em reações subsequentes, a amplificação específica pode ser verificada por uma análise da curva de fusão. As curvas de fusão térmica são geradas permitindo que todo o produto forme DNA de fita dupla a uma temperatura mais baixa (aproximadamente 60 ° C) e aumentando lentamente a temperatura para níveis desnaturantes (aproximadamente 95 ° C). O comprimento do produto e a sequência afetam a temperatura de fusão (Tm), então a curva de fusão é usada para caracterizar a homogeneidade do amplicon. A amplificação não específica pode ser identificada por amplos picos na curva de fusão ou picos com valores Tm inesperados. Ao distinguir produtos de amplificação específicos e não específicos, a curva de fusão adiciona um aspecto de controle de qualidade durante o uso rotineiro. A geração de curvas de fusão não é possível com ensaios que dependem da atividade de exonuclease 5 & prime & rarr3 & prime da Taq DNA polimerase, como a tecnologia TaqMan & reg baseada em sonda.

Algumas estratégias de qPCR empregam sondas de ácido nucléico complementares para quantificar o DNA alvo. Essas sondas também podem ser usadas para detectar polimorfismos de nucleotídeo único (Lee et al. Bernard de 1993 et al. 1998). Existem várias categorias gerais de sondas de PCR em tempo real, incluindo hidrólise, hairpin e sondas de hibridização simples. Essas sondas contêm uma sequência complementar que permite que a sonda se emparelhe com o produto de PCR acumulado, mas as sondas podem diferir no número e na localização dos repórteres fluorescentes.

As sondas de hidrólise são marcadas com um flúor na extremidade 5 & principal e um supressor na extremidade 3 & principal e, como os dois repórteres estão próximos, o sinal fluorescente é extinto. Durante a etapa de anelamento, a sonda hibridiza com o produto de PCR gerado em ciclos de amplificação anteriores. O híbrido sonda: alvo resultante é um substrato para a atividade de exonuclease 5 & prime & rarr3 & prime da DNA polimerase, que degrada a sonda recozida e libera o flúor (Holanda et al. 1991). O flúor é liberado dos efeitos do inibidor de absorção de energia, e o progresso da reação e o acúmulo do produto de PCR são monitorados pelo aumento resultante na fluorescência. Com esta abordagem, experimentos preliminares devem ser realizados antes dos experimentos de quantificação para mostrar que o sinal gerado é proporcional à quantidade do produto de PCR desejado e que a amplificação não específica não ocorre.

As sondas em gancho, também conhecidas como faróis moleculares, contêm repetições invertidas separadas por uma sequência complementar ao DNA alvo. As repetições se recozem para formar uma estrutura em grampo, onde o flúor na extremidade 5 ° e um supressor na extremidade 3 ° estão em estreita proximidade, resultando em pouco sinal fluorescente. A sonda em gancho é projetada de forma que a sonda se ligue preferencialmente ao DNA alvo em vez de reter a estrutura em gancho. À medida que a reação progride, quantidades crescentes da sonda recozem para o produto de PCR acumulado e, como resultado, o flúor e o inibidor tornam-se fisicamente separados. O flúor não é mais extinto e o nível de fluorescência aumenta. Uma vantagem desta técnica é que as sondas em gancho têm menos probabilidade de incompatibilidade do que as sondas de hidrólise (Tyagi et al. 1998). No entanto, experimentos preliminares devem ser realizados para mostrar que o sinal é específico para o produto de PCR desejado e que a amplificação não específica não ocorre.

A utilização de sondas de hibridação simples envolve duas sondas marcadas ou, alternativamente, uma sonda marcada e um iniciador de PCR marcado. Na primeira abordagem, a energia emitida pelo flúor em uma sonda é absorvida por um flúor na segunda sonda, que hibridiza nas proximidades. Na segunda abordagem, a energia emitida é absorvida por um segundo flúor que é incorporado ao produto de PCR como parte do primer. Ambas as abordagens resultam em fluorescência aumentada do aceitador de energia e fluorescência diminuída do doador de energia. O uso de sondas de hibridização pode ser simplificado ainda mais, de modo que apenas uma sonda marcada é necessária. Nesta abordagem, a extinção do flúor pela desoxiguanosina é usada para provocar uma mudança na fluorescência (Crockett e Wittwer, 2001 Kurata et al. 2001). A sonda marcada recoze-se de modo que o flúor esteja em estreita proximidade com os resíduos G dentro da sequência alvo e, à medida que o recozimento da sonda aumenta, a fluorescência diminui devido à extinção de desoxiguanosina. Com esta abordagem, a localização da sonda é limitada porque a sonda deve hibridizar para que o corante fluorescente esteja muito próximo de um resíduo G. A vantagem das sondas de hibridização simples é a capacidade de serem multiplexadas mais facilmente do que as sondas de hidrólise e em gancho por meio do uso de flúores de cores diferentes e sondas com temperaturas de fusão diferentes (revisado em Wittwer et al. 2001).

Algumas estratégias de qPCR empregam sondas de ácido nucléico complementares para quantificar o DNA alvo. Essas sondas também podem ser usadas para detectar polimorfismos de nucleotídeo único (Lee et al . Bernard de 1993 et al . 1998). Existem várias categorias gerais de sondas de PCR em tempo real, incluindo hidrólise, hairpin e sondas de hibridização simples. Essas sondas contêm uma sequência complementar que permite que a sonda se emparelhe com o produto de PCR acumulado, mas as sondas podem diferir no número e na localização dos repórteres fluorescentes.

Produtos e recursos qPCR

Os kits GoTaq & reg qPCR e RT-qPCR estão disponíveis para abordagens de PCR em tempo real baseadas em corante ou em sonda. Os sistemas GoTaq qPCR contêm BRYT Green Dye, que fornece máxima eficiência de amplificação e maior fluorescência do que SYBR Green.

Os sistemas de sonda GoTaq e reg são misturas master prontas para uso que simplificam a montagem da reação para detecção baseada em sonda de hidrólise.


Mutagênese in vitro

Mutagênese PCR de DNA circular

A mutagênese por PCR também pode ser usada para amplificar todo o plasmídeo contendo o gene de interesse. Um método simples, denominado PCR "invertido" ou "contador", usa iniciadores back-to-back (Figura 2B), um iniciador de PCR serve como o oligonucleotídeo mutagênico e o outro oligonucleotídeo inicia da fita oposta, adjacente ao iniciador mutagênico. O produto de PCR é um plasmídeo linear de comprimento total que é então fosforilado e ligado antes da transformação. Este método pode ser prontamente usado para fazer mutantes de deleção, criando uma lacuna entre os primers. Variantes deste método incluem PCR de "círculo recombinante" (Figura 2C) e PCR de "recombinação", ambas as quais dependem da recombinação de plasmídeos lineares. Nessas técnicas, dois PCRs inversos são realizados com primers com lacunas em locais diferentes. Esses dois plasmídeos mutantes são então recombinados em vitro por mistura e emparelhamento (PCR de círculo recombinante) ou na Vivo (PCR de recombinação). As lacunas são então reparadas pela maquinaria de reparo do DNA bacteriano.


Advantage HD Polymerase Mix

O Advantage HD Polymerase Mix fornece fidelidade máxima e comprimento de produto de PCR estendido, tornando-o particularmente útil para aplicações que requerem alta precisão, como clonagem de cDNA, mutagênese dirigida ao local e genotipagem de mutação (isto é, análise de SNP).

A Advantage HD Polymerase Mix consiste em uma nova DNA polimerase com um anticorpo hot-start e vem com um tubo de tampão 5X (com Mg 2+).

O Advantage HD Polymerase Mix fornece fidelidade máxima e comprimento de produto de PCR estendido, tornando-o particularmente útil para aplicações que requerem alta precisão, como clonagem de cDNA, mutagênese dirigida ao local e genotipagem de mutação (isto é, análise de SNP).

A Advantage HD Polymerase Mix consiste em uma nova DNA polimerase com um anticorpo hot-start e vem com um tubo de tampão 5X (com Mg 2+).

O Advantage HD Polymerase Mix oferece excelente precisão devido à presença de atividade de exonuclease 3 '& rarr 5' que resulta em uma taxa de erro extremamente baixa. Ele também tem um desempenho extremamente bom em modelos ricos em GC e em outros modelos mais complexos. O Advantage HD Polymerase Mix amplifica alvos de até 8,5 kb de DNA genômico humano, 10 kb de E. coli DNA genômico e 22 kb de DNA lambda. A eficiência de amplificação da Advantage HD Polymerase Mix é maior do que a do tipo selvagem Taq polimerase.


PrimeSTAR Max DNA Polymerase — PCR rápido e de alta fidelidade

PrimeSTAR Max DNA Polymerase tem a maior fidelidade e taxa de extensão mais rápida de qualquer enzima Takara Bio. A formulação é baseada na polimerase de DNA PrimeSTAR HS exclusiva e de alta fidelidade da Takara combinada com um fator de alongamento para fornecer priming e extensão eficientes, o que reduz muito o tempo necessário para as etapas de recozimento e extensão. Como resultado, a PrimeSTAR Max DNA Polymerase pode ser usada para PCR excepcionalmente rápida. É formulado como uma pré-mistura 2X contendo tampão otimizado e dNTPs, que permite a preparação rápida de reações para aplicações de alto rendimento.

PrimeSTAR Max DNA Polymerase tem a maior fidelidade e taxa de extensão mais rápida de qualquer enzima Takara Bio. A formulação é baseada na polimerase de DNA PrimeSTAR HS exclusiva e de alta fidelidade da Takara combinada com um fator de alongamento para fornecer priming e extensão eficientes, o que reduz muito o tempo necessário para as etapas de recozimento e extensão. Como resultado, a PrimeSTAR Max DNA Polymerase pode ser usada para PCR excepcionalmente rápida. É formulado como uma pré-mistura 2X contendo tampão otimizado e dNTPs, que permite a preparação rápida de reações para aplicações de alto rendimento.

Além disso, a padronização do tempo da etapa de extensão torna a PrimeSTAR Max DNA Polimerase adequada para reações com ácidos nucleicos em excesso que normalmente seriam difíceis de amplificar devido à ligação não específica. A processabilidade superior da PrimeSTAR Max DNA Polymerase evita a inibição por ácidos nucléicos excessivos, resultando em uma taxa de sucesso muito maior para PCR com otimização mínima necessária. O recurso de início quente mediado por anticorpos fornece especificidade aprimorada, evitando eventos de iniciação falsa durante a montagem da reação.


Assista o vídeo: Endpoint PCR, quantitative PCR and digital PCR (Agosto 2022).