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Atividade de exonuclease da DNA polimerase I

Atividade de exonuclease da DNA polimerase I



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A DNA polimerase I em bactérias usa atividade de exonuclease direta ou reversa para remover primers de RNA? Um dos meus livros diz que usa de 5 'a 3', mas outro diz que usa de 3 'a 5' atividade de exonuclease.

Atualização: eu sei que RNase H pode remover os primers, mas a atividade de exonuclease de pol I também pode removê-los.


Da wikipedia:

No processo de replicação, a RNAse H remove o primer de RNA (criado pela Primase) da fita retardada e, em seguida, a Polimerase I preenche os nucleotídeos necessários entre os fragmentos de Okazaki (ver replicação de DNA) na direção 5 '-> 3' ...

E em outro lugar no mesmo artigo:

Pol I possui quatro atividades enzimáticas:

  1. Uma atividade de DNA polimerase dependente de DNA 5 '-> 3' (direta), exigindo um sítio de iniciador 3 'e uma fita modelo
  2. Uma atividade de exonuclease 3 '-> 5' (reversa) que medeia a revisão
  3. Uma atividade de exonuclease 5 '-> 3' (direta) mediando a tradução de nick durante o reparo de DNA.
  4. Uma atividade 5 '-> 3' (direta) da DNA polimerase dependente de RNA. Pol I opera em modelos de RNA com eficiência consideravelmente mais baixa (0,1-0,4%) do que modelos de DNA, e esta atividade é provavelmente apenas de significado biológico limitado.

Portanto, a resposta à sua pergunta é nenhuma. A RNAse H remove os primers, e a atividade de exonuclease do DNA Pol I é irrelevante para a remoção do primer, embora possa operar em qualquer direção dependendo do contexto.


Googling sua pergunta mostrou que é RNAse H que remove o primer de RNA. DNA Pol I tem tanto atividade de exonuclease 3'-5 'quanto 5'-3' para atividades de revisão e reparo de entalhe, respectivamente. Veja a wiki em Pol I


Modulação da atividade 3 '-> 5'-exonuclease da endonuclease apurínica humana (Ape1) por seu produto de DNA abásico com incisão 5'

A principal endonuclease abásica de células humanas, a proteína Ape1, é uma enzima multifuncional com papéis críticos no reparo por excisão de base (BER) do DNA. Além de sua atividade primária como uma endonuclease apurínica / apirimidínica em BER, Ape1 também possui funções 3'-fosfodiesterase, 3'-fosfatase e 3 '- & gt5'-exonuclease específicas para os terminais 3' de nicks internos e lacunas em DNA. A atividade de exonuclease é aumentada em 3 'incompatibilidades, o que sugere um possível papel em BER para Ape1 como uma atividade de revisão para a relativamente imprecisa DNA polimerase beta. Para elucidar esse papel com mais precisão, investigamos a capacidade de Ape1 de degradar substratos de DNA que imitam intermediários de BER. Descobrimos que a exonuclease Ape1 é ativa em ambos os terminais 3 'incompatíveis e combinados corretamente, com preferência para incompatibilidades. Em nossas mãos, a atividade exonuclease de Ape1 era mais ativa em lacunas de um nucleotídeo do que em cortes no DNA, embora este último devesse representar o produto da síntese de reparo pela polimerase beta. No entanto, a atividade de exonuclease foi inibida pela presença de resíduos abásicos com incisão 5 'próximos, que resultam da atividade de endonuclease apurínica / apirimidínica de Ape1. O mesmo foi verdadeiro para a atividade exonuclease recentemente descrita da endonuclease IV de Escherichia coli. A exonuclease III, o homólogo de E. coli de Ape1, não discriminou entre os diferentes substratos. A remoção do resíduo 5 'abásico pela polimerase beta aliviou a inibição da atividade da exonuclease Ape1. Estes resultados sugerem papéis para a exonuclease Ape1 durante a BER após a síntese de reparo de DNA e excisão do desoxirribose-5-fosfato abásico pela polimerase beta.


O que é uma endonuclease

Uma endonuclease é uma classe de hidrolase que cliva os ácidos nucléicos no meio. A ação das endonucleases pode resultar em dois ou mais fragmentos de ácidos nucléicos. As endonucleases são capazes de atuar tanto no DNA quanto no RNA. A clivagem de algumas endonucleases como as desoxirribonucleases (DNases) não é específica. No entanto, muitas endonucleases clivam as sequências de nucleotídeos alvo de uma maneira específica. Este tipo de endonucleases específicas são chamadas endonucleases de restrição. Eles são capazes de reconhecer uma sequência específica da fita de ácido nucleico. Assim, essas endonucleases de restrição passam por um período de latência antes de sua ação sobre o ácido nucleico, fazendo a varredura para a sequência de nucleotídeos específica. Esta sequência de nucleotídeos específica é chamada de sítio de restrição.

Figura 1: A ação de Hind III

Um local de restrição típico é uma sequência palindrômica de quatro a seis nucleotídeos. Muitas endonucleases de restrição clivam as fitas de DNA, deixando as extremidades de fita simples chamadas pontas pegajosas. Em engenharia genética, este tipo de endonucleases de restrição é amplamente utilizado para produzir DNA recombinante ligando diferentes fitas de DNA desejadas. A metilação do DNA em organismos superiores impede a ação das endonucleases sobre seu genoma. No entanto, o DNA procariótico carece de metilação. Portanto, o DNA procariótico dentro de um hospedeiro eucariótico pode ser facilmente direcionado para clivagem. A formação da extremidade pegajosa pela ação da endonuclease de restrição, Hind III é mostrado em figura 1.


Outras versões deste artigo

Polimerase I de DNA bacteriano

Polimerase I de DNA bacteriano

University College London e Birkbeck, Instituto de Biologia Estrutural e Molecular, Londres, Reino Unido

Universidade de Washington, St. Louis, Missouri, EUA

University College London e Birkbeck, Instituto de Biologia Estrutural e Molecular, Londres, Reino Unido

University College London e Birkbeck, Instituto de Biologia Estrutural e Molecular, Londres, Reino Unido

Universidade de Washington, St. Louis, Missouri, EUA

University College London e Birkbeck, Instituto de Biologia Estrutural e Molecular, Londres, Reino Unido

Resumo

O ácido desoxirribonucléico (DNA) bacteriano polimerase I é uma família de enzimas envolvidas na síntese do DNA bacteriano e no reparo de lesões. Essas enzimas têm uma estrutura de múltiplos domínios, consistindo em uma única cadeia polipeptídica que abrange um domínio de polimerase distinto, uma exonuclease 3′ – 5 ′ de revisão e / ou uma atividade de exonuclease 5′ – 3 ′. Os membros da família da polimerase I foram investigados extensivamente, tanto por causa de seu papel vital na replicação e manutenção de cromossomos bacterianos, quanto por sua importância como ferramentas em biologia molecular, em particular para a reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de DNA. Estudos sobre o Escherichia coli A polimerase I do DNA, em particular, proporcionou percepções significativas sobre o mecanismo de polimerização do DNA, que é compartilhado por quase todas as outras polimerases de nucleotídeos.

Conceitos chave:

As enzimas bacterianas da DNA polimerase I são proteínas de múltiplos domínios com funções separadas de polimerização, revisão e exonuclease 5′ – 3 ′.

Eles desempenham uma função vital nas bactérias, realizando o reparo do DNA e alguns aspectos da replicação cromossômica.

As polimerases incorporam um nucleotídeo de cada vez na extremidade 3 'da fita de DNA do primer de maneira direcionada a um modelo.

Os membros da família da DNA polimerase I são capazes de replicar o DNA com uma precisão muito maior do que o pareamento de bases sozinho.

A reação de polimerização é um processo de várias etapas durante o qual a enzima alterna entre a ligação ao substrato e as conformações de incorporação de nucleotídeos.

A exonuclease 5′ – 3 ′ permite que a polimerase degrade os primers de RNA e auxilie no reparo do DNA.

As DNA polimerases termoestáveis ​​da família I são amplamente utilizadas na reação em cadeia da polimerase para amplificar o DNA e para o sequenciamento do DNA.


Uma nova DNA polimerase I de Geobacillus caldoxylosilyticus TK4: clonagem, caracterização e análise mutacional de dois resíduos aromáticos

O gene da DNA polimerase I foi clonado e sequenciado da bactéria termofílica Geobacillus caldoxylosilyticus TK4. O gene tem 2.634 bp de comprimento e codifica uma proteína de 878 aminoácidos de comprimento. A enzima tem massa molecular de 99 kDa e apresenta homologia de sequência com a DNA polimerase I da espécie Bacillus (89% de identidade). O gene foi superexpresso em Escherichia coli e a enzima purificada foi caracterizada bioquimicamente. Possui todos os elementos estruturais primários necessários para a DNA polimerase e atividade de exonuclease 5 '- & gt 3', mas não possui os motivos necessários para a atividade de exonuclease 3 '- & gt 5'. Os ensaios de 5 'nuclease e 3' - & gt 5 'exonuclease confirmaram que a Gca polimerase I tem uma atividade de nuclease 5' - & gt 3 'dependente de DNA de fita dupla, mas nenhuma atividade de exonuclease 3' - & gt 5 '. Observou-se que sua atividade específica era de 495.000 U / mg de proteína e K (D) (DNA), K (D) (dNTP) e K (pol) eram 0,19 nM, 22,64 microM e 24,99 nucleotídeos (- 1), respectivamente. A enzima mostrou atividade de transcriptase reversa (RT) significativa com Mn (2+), mas muito pouca atividade de RT com Mg (2+). Sua taxa de erro foi encontrada para ser 2,5 x 10 (-5), que é comparável à taxa de erro relatada anteriormente para a polimerase I. de DNA de E. coli. Dois resíduos aromáticos necessários para a sensibilidade ao didesoxirribonucleotídeo trifosfato (F712Y) e atividade de deslocamento da fita ( Y721F) foram identificados.


5'-3 'Exonuclease

A atividade de exonuclease 5'-3 'é o único componente ativo do fragmento N-terminal da DNA Polimerase I. O principal dever da atividade de exonuclease 5'-3' é remover os primers de RNA nas extremidades 5 'do recém-sintetizado DNA para que a atividade da polimerase possa preencher as lacunas resultantes.

Também é importante notar que a DNA Polimerase I é a única E. coli DNA polimerase que possui o sítio ativo da exonuclease 5'-3 '. Ambos Pol. II e Pol. III pode polimerizar DNA e extirpar fragmentos na direção 3'-5 ', mas nenhum deles é capaz dessa funcionalidade.

O fragmento N-terminal é um fragmento muito menor do que o fragmento Klenow. Na verdade, constitui os resíduos 1-323, enquanto os resíduos 324-928 compõem a seção maior (10). Proteases como a substilina e a tripsina podem clivar o Pol. Eu nesses dois fragmentos. Assim, apesar do fato de que geralmente discutimos Pol. I de acordo com diferentes fragmentos, no entanto, é uma enzima de uma subunidade com três atividades diferentes. Pol. III, por outro lado, tem um núcleo que consiste em 7 subunidades que funcionam como parte de uma enzima multissubunidade complexa, Pol. III holoenzima, que consiste em pelo menos 10 tipos de subunidades (9).

Abaixo está um exemplo da atividade da exonuclease 5'-3 '. Geralmente excisa oligômeros curtos entre 1 e 10 nucleotídeos de comprimento:

Fig. 2: Este é um diagrama básico e indesculpável da atividade da exonuclease na direção 5'-3 '. As fitas de DNA são encurtadas pela remoção dos nucleotídeos da extremidade 5 'da molécula. Pelo menos é colorido.


Papel fisiológico da DNA polimerase I

Embora os estudos da DNA polimerase I tenham fornecido muitas informações sobre o mecanismo de síntese do DNA, a análise genética mostrou que a função da polimerase dessa enzima não é necessária para a replicação do DNA. A DNA polimerase I é codificada pelo polAgene em E. coli.No entanto, nenhum alelo mutante de polAfoi isolado em rastreios de mutantes condicionais defeituosos na replicação do DNA. O argumento mais convincente de que esta polimerase não é necessária para a replicação veio de um exame de milhares de E. colimutantes, testando-os quanto à atividade da DNA polimerase I. Um mutante polA cepa foi isolada (Figura 5.16). Este alelo mutante, chamado polA1, continha um códon sem sentido, levando à terminação prematura da síntese do polipeptídeo produto e, portanto, a uma perda da função de polimerase. No entanto, a cepa mutante cresceu a uma taxa normal, o que mostra que a DNA polimerase I é nãonecessário para a síntese de DNA. O fenótipo mais marcante do polA1mutante era sua capacidade fortemente reduzida de reparar danos no DNA. Uma investigação mais aprofundada levou ao isolamento de alelos letais condicionais do polAgene. As proteínas DNA polimerase I mutantes codificadas por estes alelos letais condicionais são defeituosas na atividade de exonuclease 5 'para 3', demonstrando que esta atividade é necessária para a viabilidade celular. A atividade de exonuclease 5 'para 3' remove os primers de RNA durante a síntese da fita retardada na forquilha de replicação e é usada no reparo de DNA.

Figura 5.16. Extrai de um polA1 cepas mutantes são defeituosas na atividade da DNA polimerase. Polimerização de DNA em extratos de E. colias células foram medidas pela incorporação de dTTP radiomarcado no DNA. A cepa de tipo selvagem (linha marcada W) mostrou alta atividade. Mutantes desta cepa foram sistematicamente selecionados para a perda desta atividade de polimerização de DNA, e um foi encontrado (linha marcada P observe a mudança na escala do painel superior). Esta cepa mutante tem menos de 1% da atividade de tipo selvagem, como mostrado pela mistura de 1 parte do extrato de tipo selvagem com 99 partes do extrato mutante (uma diluição de 100 vezes os resultados são mostrados como linha PW). A mutação foi mapeada para polA, que codifica a DNA polimerase I. A cepa mutante cresce tão bem quanto a selvagem, mostrando que a DNA polimerase I não é necessária para a replicação do DNA. Esta figura é de De Lucia e Cairns (1969) Nature 224: 1164-1166.

A DNA polimerase III é uma polimerase replicativa altamente processual

A conclusão de que a DNA polimerase I não é a polimerase replicativa para E. colilevou à questão óbvia de qual enzima é realmente usada durante a replicação. A investigação dos genes isolados em telas de mutantes que são condicionalmente deficientes na replicação levou à resposta. A polimerase replicativa em E. colié DNA polimerase III.

A DNA polimerase I é mais abundante do que outras polimerases em E. colie obscurece sua atividade. Assim, a depleção da atividade da DNA polimerase I em polA1as células mutantes (Figura 5.17) proporcionaram a oportunidade de observar as outras DNA polimerases. As polimerases de DNA II e III foram isoladas de extratos de polA1células, nomeadas na ordem de sua descoberta.

DNA polimerase IIé uma única cadeia polipeptídica cuja função é incerta. Cepas com um gene mutado para DNA polimerase II (polB1) não apresentam defeitos de crescimento ou replicação. No entanto, a atividade da DNA polimerase II é aumentada durante o reparo induzido do DNA, e pode funcionar para sintetizar o DNA oposto a uma base deletada na fita molde.

A evidência genética mostra claramente que DNA polimerase IIIé usado para replicar o E. coli cromossoma. Esta enzima é composta por múltiplas subunidades polipeptídicas. Vários dos genes que codificam essas subunidades polipeptídicas foram identificados em rastreios para mutantes letais condicionais defeituosos na replicação do DNA. Perda de função destes DNAgenes bloqueiam a replicação, mostrando que seus produtos são necessários para a replicação.


Polimerases de DNA

As enzimas que catalisam a síntese de DNA em um modelo de DNA são Polimerases de DNA. Eles desempenham duas funções primárias na célula: a síntese de DNA durante a replicação do genoma e a re-síntese do DNA ausente após dano de recombinação e após a excisão do primer da fita retardada.

Tanto em procariotos quanto em eucariotos, as DNA polimerases especializadas são dedicadas às funções de replicação e reparo, sendo as primeiras às vezes denominadas Réplicas de DNA. Todas as DNA polimerases possuem um 5 & ​​# 8242- & gt3 & # 8242 polimerase atividade. e pirofosforólise atividade, que juntos facilita a síntese de DNA.


Polimerases de DNA procarióticas

Em procariotos, DNA pol-I, II e III são os três tipos importantes que discutiremos a seguir.

DNA polimerase I

É a primeira enzima polimerase, descoberta por Arthur Kornberg em 1958. Consiste em uma única cadeia polipeptídica. Inicialmente, acreditava-se que o DNA pol-I é uma enzima de replicação. Em estudos posteriores, foi evidenciado que é mais uma enzima de reparo de DNA do que uma enzima de replicação. Na pol-I, há um átomo de zinco presente por cadeia, devido ao qual também é conhecido como “Metaloenzimas”.

Atividades de DNA pol-I: Mostra tanto polimerases quanto atividade de exonuclease.

  • Atividade da polimerase 5'-3 ' envolve a adição de bases de nucleotídeos para a síntese de uma nova fita de DNA.
  • Atividade de exonuclease 3'-5 ' envolve a deleção de bases de nucleotídeos incompatíveis ou ajuda na tradução de nick.
  • Atividade de exonuclease 5'-3 ' envolve a deleção de primers de RNA da extremidade 5 'da fita de DNA complementar.

Estrutura: A estrutura de Pol-I se assemelha à mão direita do humano. A estrutura consiste nas seguintes três regiões:

  • Região da palma: É o sítio ativo catalítico que possui sequências conservadas. Ele atua como um site ativo da pol-I. A região da palma é feita de folha β-pregueada. Sua função primária é processar a adição de trifosfato de desoxirribonucleotídeo.
  • Região de dedo: É o local do modelo, onde, uma vez feito o emparelhamento de bases, ele engloba o trifosfato de desoxirribonucleotídeo. Sua função principal é catalisar a síntese de nucleotídeos de entrada com a ajuda de um catalisador conhecido como íons metálicos.
  • Região do polegar: É a região que liga o DNA e mantém a posição correta do primer e do sítio ativo.


DNA polimerase II

Thomas Kornberg descobriu em 1970. Sua eficiência de polimerização é mais lenta do que a pol-I. Também consiste em uma única cadeia polipeptídica. Pol-II atua como enzima de reserva ou alternativa ao processo de replicação, pois na ausência de pol-I pode alongar os fragmentos de Okazaki.

Atividades de DNA pol-II:

  • Atividade da polimerase 5'-3 ' envolve a adição de bases de nucleotídeos para a síntese de uma nova fita de DNA.
  • Atividade de exonuclease 3'-5 ' envolve a deleção de bases de nucleotídeos incompatíveis ou ajuda na tradução de nick.

Estrutura: A estrutura do pol-II é bastante desconhecida.

DNA polimerase III

É a holoenzima primária que participa principalmente do processo de replicação. Consiste em duas cadeias polipeptídicas. Pol-III contém subunidade de muitas enzimas que desempenham funções diferentes, e também chamado de “enzima heteromultimérica”. Pol-III contém 10 subunidades em sua estrutura que tornam a pol-III uma enzima completa, ou seja, "holoenzima".

Atividades encontradas no DNA pol-III:

  • Atividade da polimerase 5'-3 ' envolve a adição de bases de nucleotídeos para a síntese de uma nova fita de DNA.
  • Atividade de exonuclease 3'-5 ' envolve a deleção de bases de nucleotídeos incompatíveis ou ajuda na tradução de nick.

Estrutura: A estrutura da pol-III consiste em 10 subunidades, como:

  • α: codifica o gene E do DNA e auxilia na síntese do DNA.
  • Ɛ: Códigos para o gene DNA Q e ajuda na atividade de revisão 3'-5 '.
  • Ɵ: Codifica o gene hol E, atua como uma proteína acessória e também participa do mecanismo de revisão.
  • Ʈ: Codifica o gene DNA X e promove a dimerização do complexo protéico central.
  • Ƴ: Codifica o gene DNA Y.
  • δ: Codifica o gene holA.
  • δ ’: Códigos para o gene hol B.
  • χ: codifica o gene hol C.
  • Ψ: codifica o gene hol D.
  • β: codifica o gene N do DNA. Atua como um proteína de grampo que detém a molécula de DNA e é responsável pelo fator de processabilidade. Ƴ, δ, δ ’, χ e Ψ todos atuam como um complexo carregador de grampo e ajudam a proteína carregadora de grampo β a se ligar ao DNA.

Gráfico de comparação entre as funções de DNA polimerases procarióticas

PropriedadesDNA pol-IDNA pol- IIDNA pol-III
Atividade da polimerase 5'-3 'PresentePresentePresente
Atividade de exonuclease 3'-5 'PresentePresentePresente
Atividade de exonuclease 5'-3 'PresenteAusenteAusente
Polimerização dependente de RNAPode realizar polimerização dependente de RNAEu não possoEu não posso
Características de reparo de DNAPresentePresenteAusente
Propriedade de ligaduraPresenteAusenteAusente
Envolvimento na replicaçãoParticipa Não participaDesempenha um papel importante

Características

A DNA-polimerase tem algumas características específicas como:

  1. Atividade de polimerização
  2. Fidelidade, ou seja, capacidade de revisão
  3. Processividade, ou seja, processamento de DNA e suas bases
  4. Termoestabilidade, ou seja, estabilidade em alta temperatura
    Exemplo: Taq- DNA polimerase de Thermus bactéria aquaticus.

Todas essas propriedades o tornam útil em tecnologias moleculares como PCR, sequenciamento de DNA, etc.


DNA polimerase I

& ltp> A pontuação da anotação fornece uma medida heurística do conteúdo da anotação de uma entrada UniProtKB ou proteoma. Esta pontuação & ltstrong> não pode & lt / strong> ser usada como uma medida da precisão da anotação, pois não podemos definir a 'anotação correta' para qualquer proteína. & Ltp> & lta href = '/ help / annotation_score' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> - Evidência experimental no nível de proteína i & ltp> Isso indica o tipo de evidência que apóia a existência da proteína. Observe que a evidência de 'existência de proteína' não fornece informações sobre a precisão ou correção da (s) sequência (s) exibida (s). & Ltp> & lta href = '/ help / protein_existence' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p>

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