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12.9: Motilidade Celular - Biologia

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Existem várias maneiras pelas quais uma célula pode se mover de um ponto a outro no espaço. Em um meio líquido, esse método pode ser algum tipo de natação, utilizando o movimento ciliar ou flagelar para impulsionar a célula. Em superfícies sólidas, esses mecanismos claramente não funcionam com eficiência e a célula passa por um processo de rastreamento. Nesta seção, começamos com uma discussão sobre o movimento ciliar / flagelar e, a seguir, consideramos os requisitos mais complicados do rastreamento celular.

Cílios e flagelos, que diferem principalmente em comprimento ao invés de construção, são organelas baseadas em microtúbulos que se movem para frente e para trás. Isso se traduz em "remar" pelos cílios relativamente curtos, mas nos flagelos mais longos, a flexibilidade da estrutura faz com que o movimento para trás e para a frente seja propagado como uma onda, então o movimento flagelar é mais ondulante ou semelhante a um chicote (considere o que acontece quando você balança uma mangueira de jardim rapidamente de um lado para o outro, em comparação com um pequeno pedaço da mesma mangueira). O núcleo de cada estrutura é chamado de axonema, que é composto por 9 microtúbulos duplos conectados uns aos outros por dineína ciliar proteínas motoras e circundando um núcleo central de dois microtúbulos separados.

Isso é conhecido como formação “9 + 2”, embora os nove dupletos não sejam os mesmos que os dois microtúbulos centrais. O túbulo A é composto por 13 protofilamentos completos, mas o túbulo B fundido a ele contém apenas 10 protofilamentos. Cada um dos microtúbulos centrais é um total de 13 protofilamentos. O axonema 9 + 2 estende o comprimento do cílio ou flagelo da ponta até atingir a base e se conecta ao corpo celular por meio de um corpo basal, que é composto por 9 tripletos de microtúbulos dispostos em um barril curto, muito parecido com os centríolos dos quais são derivados.

Esta seção se refere apenas a eucariotos. Alguns procariotos também têm apêndices móveis chamados flagelos, mas são completamente diferentes tanto na estrutura quanto no mecanismo. Os próprios flagelos são longos polímeros helicoidais da proteína flagelina, e a base das fibras da flagelina está conectada a uma proteína motora de rotação, não a um motor de translação. Este motor (Figura ( PageIndex {18} )) utiliza íon (H+ ou Na+ dependendo da espécie) abaixo de um gradiente eletroquímico para fornecer a energia para girar até 100.000 rotações por minuto. Pensa-se que a rotação é impulsionada por mudanças conformacionais no anel do estator, aninhado na membrana celular.

As dineínas ciliares fornecem a capacidade motora, mas também existem duas outras proteínas de ligação no axonema. Existem Nexins que unem o túbulo A de um dupleto ao túbulo B de seu dupleto adjacente, conectando assim o anel externo. E há raios radiais que se estendem do túbulo A de cada dupleto ao par central de microtúbulos no núcleo do axonema. Nenhum deles tem atividade motora. No entanto, eles são cruciais para o movimento dos cílios e flagelos porque ajudam a transformar um movimento de deslizamento em movimento de flexão. Quando a dineína ciliar (muito semelhante às dineínas citoplasmáticas, mas tem três cabeças em vez de duas) é ativada, ela liga um microtúbulo A de um lado, um microtúbulo B do dubleto adjacente e move um em relação ao outro. Uma linha desses dyneins movendo-se em conjunto, assim, deslizaria um gibão em relação ao outro, se (e é um grande "se") os dois gibões tivessem completa liberdade de movimento. No entanto, uma vez que os dupletos são interconectados pelas proteínas nexinas, o que acontece quando um dupleto tenta deslizar é que ele entorta a estrutura conectada (Figura ( PageIndex {17} )). Essa curvatura explica o movimento de remo dos cílios, que são relativamente curtos, bem como o movimento de chicotada dos flagelos longos, que propagam o movimento de curvatura para baixo do axonema.

Embora pensemos nos movimentos ciliares e flagelares como métodos de propulsão de uma célula, como o nado flagelar do esperma em direção a um óvulo, também há vários lugares importantes nos quais a célula está estacionária e os cílios são usados ​​para se mover fluido passando pela célula. Na verdade, existem células com cílios na maioria dos principais órgãos do corpo. Várias discinesias ciliares foram relatadas, das quais a mais proeminente, discinesia ciliar primária (PCD), que inclui a síndrome de Kartagener (KS), é devido à mutação do gene DNAI1, que codifica uma subunidade (cadeia intermediária 1) do axonemal (ciliar ) dineína. PCD é caracterizada por dificuldade respiratória devido a infecção recorrente, e o diagnóstico de SK é feito se houver também situs inversus, uma condição na qual a assimetria normal esquerda-direita do corpo (por exemplo, estômago à esquerda, fígado à direita) é revertida. O primeiro sintoma é devido à inatividade dos numerosos cílios das células epiteliais nos pulmões. Sua função normal é manter o muco nas vias respiratórias em movimento constante. Normalmente, o muco ajuda a manter os pulmões úmidos para facilitar a função, mas se o muco ficar estacionário, torna-se um terreno fértil para bactérias, além de se tornar um irritante e obstáculo para a troca gasosa adequada.

Situs inversus é uma malformação interessante porque surge no desenvolvimento embrionário e afeta apenas 50% dos pacientes com DCP porque a função ciliar prejudicada causa randomização da assimetria esquerda-direita, não reversão. Em termos muito simples, durante o desenvolvimento embrionário inicial, a assimetria esquerda-direita se deve em parte ao movimento de sinais moleculares em um fluxo para a esquerda através do nó embrionário. Esse fluxo é causado pelo batimento coordenado dos cílios, portanto, quando eles não funcionam, o fluxo é interrompido e ocorre a randomização.

Outros sintomas de pacientes com DCP também apontam para a atuação dos cílios e flagelos no corpo. A infertilidade masculina é comum devido aos espermatozoides imóveis. A infertilidade feminina, embora menos comum, também pode ocorrer, devido à disfunção dos cílios do oviduto e da trompa de Falópio, que normalmente movem o óvulo do ovário para o útero. Curiosamente, há também uma baixa associação de hidrocefalia interna (enchimento excessivo dos ventrículos do cérebro com líquido cefalorraquidiano, causando seu aumento que comprime o tecido cerebral ao seu redor) com PCD. Isso provavelmente se deve à disfunção dos cílios nas células ependimárias que revestem os ventrículos e que ajudam a circular o LCR, mas aparentemente não são completamente necessários. Uma vez que se acredita que o fluxo volumoso do LCR seja impulsionado principalmente pela mudança de sístole / diástole na pressão sanguínea no cérebro, alguns levantam a hipótese de que os cílios podem estar envolvidos principalmente no fluxo através de alguns dos canais mais estreitos do cérebro.

O rastreamento celular (Figura ( PageIndex {19} )) requer o rearranjo coordenado da rede de microfilamentos de ponta, estendendo-se (por polimerização e filamentos deslizantes) e, em seguida, formando aderências no novo ponto mais à frente. Isso pode assumir a forma de filópodes ou lamelipódios e, freqüentemente, os dois simultaneamente. Filopodia são projeções longas e muito finas com feixes centrais de microfilamentos paralelos e altas concentrações de receptores de superfície celular. Seu objetivo é principalmente sentir o ambiente. Lamelipodia frequentemente se estendem entre dois lópodes e têm mais babados do que um dedo. Internamente, a actina se forma mais em malhas do que em feixes, e a borda mais larga permite que mais aderências sejam feitas ao substrato. A rede de microfilamentos então se reorganiza novamente, desta vez abrindo um espaço no citoplasma que atua como um canal para o movimento dos microtúbulos em direção à frente da célula. Isso coloca a rede de transporte no lugar para ajudar a mover o material a granel intracelular para frente. À medida que isso ocorre, as velhas aderências na extremidade da cauda da célula são liberadas. Essa liberação pode ocorrer por meio de dois mecanismos primários: endocitose do receptor ou desativação do receptor por sinalização / alteração conformacional. É claro que essa simplificação exagerada desmente as complexidades de coordenar e controlar todas essas ações para realizar o movimento direcionado de uma célula.

Um modelo de geração de força de microfilamento, o Elastic Brownian Ratchet Model (Mogilner e Oster, 1996), propõe que, devido ao movimento browniano da membrana celular resultante da flutuação térmica contínua e minuto, os filamentos de actina que se projetam em direção às bordas da membrana são flexionado em vários graus. Se a flexão for grande o suficiente, um novo monômero de actina pode caber entre a membrana e a ponta do filamento e, quando o filamento agora mais longo flexionar para trás, ele pode exercer um impulso maior na membrana. Obviamente, um único filamento não gera muita força, mas a extensão coordenada de muitos filamentos pode empurrar a membrana para a frente.

Uma vez que uma célula recebe um sinal para se mover, a resposta inicial do citoesqueleto é polimerizar a actina, construindo mais microfilamentos para incorporar na borda de ataque. Dependendo do sinal (atrativo ou repulsivo), a polimerização pode ocorrer no mesmo lado ou no lado oposto da célula a partir do ponto de ativação do receptor de sinal. Significativamente, a polimerização da nova f-actina sozinha pode gerar força suficiente para mover a membrana para frente, mesmo sem envolvimento dos motores da miosina! Modelos de geração de força estão sendo debatidos, mas geralmente começam com a incorporação de uma nova g-actina em um filamento em sua ponta; ou seja, na interface filamento-membrana. Mesmo que isso possa ser tecnicamente suficiente, em uma célula viva, as miosinas estão envolvidas e ajudam a empurrar e organizar os filamentos direcionalmente para estabelecer a nova borda de ataque. Além disso, alguns filamentos e redes devem ser rapidamente cortados e novas conexões feitas, tanto entre os filamentos quanto entre os filamentos e outras proteínas, como moléculas de adesão ou microtúbulos.

Como a polimerização e o rearranjo da actina são controlados? Os receptores que sinalizam a locomoção celular podem iniciar caminhos um tanto diferentes, mas muitos compartilham alguns pontos em comum na ativação de um ou mais membros da família Ras de pequenas GTPases. Essas moléculas de sinalização, como Rac, Rho e cdc42, podem ser ativadas por tirosina quinases receptoras (ver vias de ativação RTK-Ras, Capítulo 14). Cada um deles tem um papel ligeiramente diferente na motilidade celular: a ativação de cdc42 leva à formação de filópodes, Rac ativa uma via que inclui Arp2 / 3 e cofilina para a formação de lamelipódios e Rho ativa a miosina II para controlar a adesão focal e a formação de fibras de estresse. Um tipo diferente de cascata de receptor, a cascata de sinalização da proteína G (também Capítulo 14), pode levar à ativação do PLC e subsequente clivagem do PIP2 e aumento do Ca citosólico2+. Essas mudanças, conforme observado anteriormente, também podem ativar a miosina II, bem como as enzimas de remodelação gelsolina, cofilina e profilina. Isso quebra as estruturas de actina existentes para tornar a célula mais fluida, ao mesmo tempo que contribui com mais g-actina para formar o novo citoesqueleto de ponta.

Em vitro experimentos mostram que, conforme a membrana avança, novos contatos adesivos são feitos por meio de moléculas de adesão ou receptores que se ligam ao substrato (frequentemente lâminas ou placas de cultura de células são revestidas com colágeno, filaminina ou outras proteínas da matriz extracelular). Os contatos então recrutam elementos do citoesqueleto para maior estabilidade para formar uma adesão focal (Figura ( PageIndex {20} )). No entanto, a formação de aderências focais parece ser um artefato de cultura de células e não está claro se os tipos de aderências que se formam in vivo recrutam os mesmos tipos de componentes do citoesqueleto.

O terceiro passo para a locomoção celular é o movimento em massa do conteúdo celular para a frente. Os mecanismos para esta fase não são claros, mas há algumas evidências de que usando ligações entre o citoesqueleto de actina na borda de ataque e as partes dianteiras do citoesqueleto dos microtúbulos, os microtúbulos são reorganizados para formar um caminho de transporte eficiente para o movimento em massa. Outro aspecto para isso pode ser um efeito de “encurralamento” pelas redes de actina, que abrem espaço direcionalmente para a borda de ataque. Os microtúbulos então entram naquele espaço mais facilmente do que trabalhando através de uma malha de actina apertada, forçando o fluxo na direção correta.

Grande parte do trabalho sobre as interações microtúbulo-actina na motilidade celular foi feito por meio de pesquisas sobre o cone de crescimento neuronal, que às vezes é referido como uma célula na coleira, porque atua quase independentemente como uma célula rastejante, em busca do caminho adequado para conduzir seu axônio do corpo celular para sua conexão sináptica adequada (AW Schaefer et al, Dev. Cell 15: 146-62, 2008).

Finalmente, a célula deve desfazer suas antigas adesões na borda posterior. Isso pode acontecer de várias maneiras diferentes. Em vitro, células rastejantes foram observadas se desprendendo do substrato, deixando para trás minúsculos pedaços de membrana e proteínas de adesão associadas no processo. Presume-se que a força gerada seja proveniente das fibras de estresse de actina-miosina, originadas das aderências focais mais avançadas. No entanto, existem mecanismos menos destrutivos disponíveis para as células. Em alguns casos, a adesividade do receptor celular para o substrato extracelular pode ser regulada internamente, talvez por fosforilação ou desfosforilação de um receptor. Outra possibilidade é a endocitose do receptor, retirando-o da superfície celular. Ele poderia simplesmente reciclar até a borda de ataque, onde é necessário (ou seja, transcitose), ou se não for mais necessário ou danificado, pode ser decomposto em um lisossoma.


Dinâmica de microtúbulos em fuso mitótico exibida por microscopia de luz polarizada

A primeira sequência mostra uma célula de endosperma do lírio sanguíneo africano, Haemanthus katherinae, em mitose (Figura 1). Esta sequência, capturada por A.S. Bajer e J. Molé-Bajer usando microscopia de contraste de fase, foi observada em células que foram achatadas entre uma camada de ágar e gelatina para melhorar sua visibilidade (Bajer e Molè-Bajer, 1956, 1986). A sequência exibe vividamente os cromossomos conforme eles se condensam e se alinham na placa metafásica (Figura 1b). Nesse ínterim, os três grandes nucléolos escuros (Figura 1a) desaparecem. Em seguida, os cromossomos se dividem e se separam em anáfase (Figura 1c). Finalmente, os cromossomos tornam-se descondensados ​​à medida que são empacotados em dois núcleos filhos na telófase (Figura 1d). Entre os núcleos, pequenas vesículas dançantes aparecem (Figura 1c), se alinham e se fundem entre si para formar a placa de células (Figura 1d). A placa celular eventualmente dá origem às paredes celulares e separa a célula vegetal em duas.

Fig. 1. Mitose e formação de placa celular em uma célula de endosperma achatada do lírio sanguíneo africano, Haemanthus katherinae, observada com microscopia de contraste de fase.

Na próxima sequência, vemos a célula-mãe de pólen de um lírio da Páscoa,Lilium longiflorum, em mitose e divisão celular (Figura 2). Essas células sofrem sincronicamente a primeira de suas duas divisões para formar quatro grãos de pólen quando o botão da flor tem exatamente 22,4 mm de comprimento (Figura 3). Um botão deste comprimento foi coletado e centrifugado a ∼1800 × g por 3 min para deslocar os grânulos de alta dispersão de luz e para tornar os outros conteúdos da célula mais visíveis. Depois de excisar uma antera do botão de flor centrifugado em solução de Ringer de rã com sete oitavos de força, as células foram observadas entre polarizadores cruzados na presença de um compensador (Figura 4). Observadas com um microscópio de polarização desta maneira, regiões da célula onde as moléculas estão regularmente alinhadas, isto é, regiões birrefringentes, tornam-se realçadas (Figuras 2, 5 e 6).

Fig. 2. Mitose e formação de placa celular em célula-mãe de pólen centrifugada do lírio da Páscoa, Lilium longiflorum, observada com microscopia de polarização. Reproduzido de The Journal of Cell Biology, vol 130, 687-700, 1995, com permissão de copyright da The Rockefeller University Press.

Fig. 3. Comprimento do botão de flor de Lilium longiflorum em que as células-mãe do pólen sofrem sua primeira divisão (após Erickson, 1948).

Fig. 4. Esquema de um microscópio de polarização com polarizadores cruzados e um compensador. Reproduzido de The Journal of Cell Biology, vol 139, 985-994, 1997, por permissão de copyright da The Rockefeller University Press.

Tal como acontece com a série de células de endosperma de Bajer, esta série sobre a mitose da célula-mãe do pólen foi inicialmente registrada em filme ciné de 16 mm. O tempo decorrido desde a quebra do envelope nuclear até a formação da placa de células foi de ~ 2 h. Os cinérecords foram transferidos para vídeo cerca de 40 anos depois.

A visão do microscópio de polarização das células-mãe do pólen mostra distintamente as fibras do fuso que não eram visíveis com microscopia de contraste de fase (para imagens de microscópio de polarização de Haemanthuscélulas de endosperma, ver Inoué e Bajer, 1961 Inoué, 1964). A microscopia de contraste de fase mostra claramente o cromossomo e os nucléolos por causa de seu índice de refração mais alto, mas não as fibras do fuso que separam os cromossomos dos pólos do fuso ou as fibras do fragmoplasto que trazem os vacúolos para a placa celular. O índice de refração dessas fibras é muito próximo ao do citoplasma circundante. No entanto, eles se mostram claramente em um microscópio de polarização bem ajustado, porque as fibras são birrefringentes, sendo constituídas por um feixe de filamentos moleculares regularmente alinhados. Esta seqüência, feita por Inoué em 1950, demonstrou, pela primeira vez, a realidade das fibras fusiformes e fibrilas em células vivas (Inoué, 1953,1964), bem como a natureza altamente dinâmica e lábil dos filamentos moleculares (posteriormente identificados como microtúbulos).

Os microtúbulos se desmontaram reversivelmente quando as células foram expostas ao frio, à alta pressão hidrostática ou a drogas antimitóticas como a colchicina (revisado em Inoué, 1964,1981). Durante a despolimerização lenta dos microtúbulos por esses agentes, os cromossomos presos por metafase foram puxados para um pólo do fuso ancorado à superfície da célula. Após a remoção do agente despolimerizante, o crescimento das fibras do fuso empurrou os cromossomos em direção à placa metafásica. Assim, surgiu a noção de que o movimento do cromossomo em direção à placa metafásica estava associado com (e alimentado por) montagem e crescimento de microtúbulos, enquanto o movimento dos cromossomos em direção aos pólos do fuso estava associado com (e alimentado por) desmontagem e encurtamento dos microtúbulos ligados a o cinetocoro de cada cromossomo irmão (evidências e discussões recentes resumidas em Inoué e Salmon, 1995).

Esses estudos de microscopia de luz polarizada sobre a birrefringência de células em divisão demonstraram as propriedades de montagem dos microtúbulos e sua função dinâmica em células vivas muito antes que os próprios microtúbulos fossem descobertos ou suas propriedades de montagem fossem caracterizadas in vitro (revisado em Inoué, 1981).

Os microtúbulos que compõem as fibras do fuso e seu encurtamento na anáfase podem ser vistos de forma mais distinta na sequência de imagens de alta resolução de um espermatócito de gafanhoto (Pardalophora apiculata Figura 5) tirada por Nicklas (1971) com um microscópio de polarização retificado. A retificação fornece uma imagem de alta resolução, restaurando a extinção necessária e corrigindo o erro de imagem encontrado em microscópios de polarização convencionais quando lentes de alta abertura numérica são usadas (Inoué e Hyde, 1957).

Fig. 5. Espermatócitos primários de Pardalophora apiculata observado com um microscópio polarizador retificado (de Nicklas, 1971). Reproduzido de Avanços na Biologia Celular, vol 2, 225-298, copyright 1971 Appleton-Century-Crofts.

A sequência de vídeo final mostra uma salamandra se dividindo (Taricha granulosa) célula epitelial pulmonar (Figura 6) registrada por R. Oldenbourg, P.T. Tran e E.D. Salmon com o novo Pol-Scope. Com o Pol-Scope, cada imagem é gerada por um computador de processamento de imagem a partir de quatro imagens de vídeo obtidas em rápida sucessão em diferentes configurações de dois compensadores de cristal líquido acionados eletronicamente. Nas imagens assim exibidas pelo computador, o brilho de cada pixel é estritamente proporcional à birrefringência do ponto da amostra e independente da orientação do eixo de birrefringência (Oldenbourg, 1996). Assim, além de fornecer monitores com resolução e definição excepcionalmente alta, o novo Pol-Scope de Oldenbourg fornece informações de imagem dinâmica e altamente sensível sobre o alinhamento molecular que é estritamente quantitativo.

Fig. 6. Mitose em células pulmonares cultivadas em tecido de uma salamandra,Taricha granulosa, gravado com o novo Pol-Scope. Reproduzido de The Journal of Cell Biology, vol 139, 985-994, 1997, por permissão de copyright da The Rockefeller University Press.

Além de ser de interesse histórico, o uso considerado de microscopia de luz polarizada deve continuar a revelar muito sobre o comportamento da dinâmica estrutural molecular e fina, de forma não invasiva, na divisão, desenvolvimento e funcionamento ativo de células vivas (Oldenbourg, 1998).


O componente 1 da membrana do receptor da progesterona (P4) (PGRMC1) é um citocromo b5proteína de ligação ao heme relacionada com múltiplas funções, incluindo interação com enzimas do citocromo P450. Resumidamente, (o leitor é encaminhado para revisões anteriores) funções PGRMC1 não abrangentes incluem tráfego de membrana, responsividade P4 e esteroidogênese, fertilidade, transporte de lipídios, migração de axônio neural, função sináptica e anti-apoptose. Sua localização subcelular pode ser citoplasmática, nuclear / nucleolar, mitocondrial, retículo endoplasmático, vesículas citoplasmáticas ou extracelular [1,2,3]. Ele está envolvido nos processos do ciclo celular no ponto de verificação G1 e durante a mitose [4,5,6,7,8,9], e a expressão elevada de PGRMC1 foi associada a um mau prognóstico em vários tipos de câncer [2, 10,11, 12,13,14,15].

Motivos de sítio de ligação previstos para proteínas de homologia Src 2 (SH2) e homologia Src 3 (SH3) em PGRMC1 podem ser potencialmente regulados negativamente por fosforilação em sítios de consenso de caseína quinase 2 (CK2) adjacentes [2, 16, 17]. No entanto, enquanto o knockdown de CK2 leva à fosforilação reduzida do local CK2 C-terminal correspondente de PGRMC2, a fosforilação de PGRMC1 em S181 não foi afetada pelo knockout de CK2 em células de mioblastos de camundongo C2C12 [18]. Estes e Y180 podem ser fosforilados in vivo e constituem um módulo de sinalização regulado potencial [19].

Nossa hipótese é que PGRMC1 é uma proteína hub de sinal com ampla gama de efeitos na biologia celular [2, 19,20,21]. O motivo altamente conservado na fosforilação Y180 / S181 surgiu no início da evolução animal simultaneamente com o organizador embriológico da gastrulação (por exemplo, organizador de Spemann-Mangold) e antes da evolução dos deuterostômios [20, 22]. Uma vez que todos os descendentes do organismo que primeiro adquiriu S181 exibem simetria corporal bilateral, essa mutação é anterior às regras que regem o crescimento e a divisão celular, levando ao plano corporal bilateral e a mais tipos de tecidos. Os mecanismos que geram e mantêm os estados de diferenciação do tipo célula e tecido são frequentemente perturbados no câncer [23]. Portanto, a fosforilação da tirosina PGRMC1 pode influenciar fortemente a função e o status de diferenciação das células de mamíferos.

O presente estudo foi motivado por nossa descoberta do status diferencial de fosforilação de PGRMC1 entre cânceres de mama positivos e negativos para receptor de estrogênio [24]. PGRMC1 foi induzido na zona de hipóxia de lesões mamárias in situ de carcinoma ductal precisamente no momento e local em que as células requerem uma mudança para o metabolismo glicolítico conhecido como efeito Warburg, levando-nos a prever um papel mediador de Warburg para PGRMC1. Além disso, um mutante de local duplo CK2 PGRMC1 S57A / S181A (DM, Fig. 1a) permitiu a sobrevivência do tratamento com peróxido [24]. Sabbir [25] relatou recentemente que PGRMC1 induziu uma mudança metabólica dependente de P4 semelhante ao efeito Warburg em células HEK293, que foi associada a mudanças na estabilidade de PGRMC1, modificações pós-translacionais e localizações subcelulares. A regulação de PGRMC1 do metabolismo da glicose é apoiada por sua mediação implicada da mudança placentária dependente de P4 de aeróbio para anaeróbio no metabolismo da glicose no diabetes gestacional [26], associação com o receptor de insulina e transportadores de glicose [27], e provável envolvimento (com base em AG -205 sensibilidade) no aumento mediado por P4 na glicólise neuronal [28].

A morfologia das células cancerosas pancreáticas MIA PaCa-2 é afetada pelo estado de fosforilação de PGRMC1. uma Proteínas PGRMC1-HA construídas para esta figura. TMH: hélice transmembranar. HA: a etiqueta de hemaglutinina 3x C-terminal. b Detecção de níveis de expressão exógena de PGRMC1 por western blot (painel superior). O carregamento igual é controlado pela quantificação da beta-actina (painel inferior). Os resultados mostram três linhas celulares transfectadas de forma estável totalmente independentes por plasmídeo de (A). Seta aberta: PGRMC1-HA exógeno (Ex.). Seta sombreada: PGRMC1 endógeno (End.). Seta a cheio: beta actina. A escada de peso molecular é Bio-Rad 1610377 Dual Xtra Standards. c Quantificação de boxplots de géis replicados de (B) com sinais normalizados para beta actina das mesmas vias respectivas. n = 4 pistas para MP e n = 6 para WT, DM e TM (réplicas das respectivas linhas 1-3 por condição). Não houve diferenças significativas (ns), exceto para a banda exógena em MP (ANOVA, post-hoc Dunnet T3). d Quantificação de Western blot de PGRMC1 exógeno marcado com HA, após B, mas detectando PGRMC1 com anticorpo anti-HA. A escada de peso molecular é Abcam ab116028 Prestained Protein Ladder. e A expressão da proteína mutante PGRMC1 altera a morfologia das células MIA PaCa-2. Células estáveis ​​que expressam PGRMC1-HA (respectivas linhas 1 de B) ou células MP foram coradas com um anticorpo anti-HA marcado com FITC (Anti-HA) e fotografadas por microscopia confocal. O DNA foi corado com DAPI. As células também foram fotografadas no modo de microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC). Os respectivos painéis à esquerda mostram imagens mescladas de todos os 3 canais. f O fenótipo arredondado do mutante duplo e triplo (E) foi revertido para o fenótipo alongado após a adição de 125 μM de ROCKI, mas não por adição de controle de veículo DMSO

Observamos anteriormente que as células de câncer pancreático (MP) MIA PaCa-2 [29,30,31,32] exibiram alterações morfológicas e metabólicas marcantes quando a proteína DM foi expressa [33]. As células MP existem em cultura como uma população aderente mista de morfologia "em forma de fibroblasto" alongada, uma população minoritária de morfologia arredondada com protrusões semelhantes a bolhas e alguns aglomerados multicelulares, bem como algumas células em suspensão arredondadas. Eles sofreram transição epitelial-mesenquimal [34], e podem ainda sofrer transição mesenquimal-amebóide (MAT), que requer Rho quinase- (ROCK) - mudança morfológica dependente de células mesenquimais "alongadas" para células amebóides arredondadas [35].

Aqui, examinamos mutagenicamente os efeitos do status alterado de fosforilação de PGRMC1 em células MP para obter informações sobre a sinalização dependente de PGRMC1 in vitro, revelando um papel importante para Y180. Nossos objetivos foram inicialmente caracterizar os efeitos das mutações nos dois sítios de fosforilação regulatória negativa putativos do DM, S57 e S181, na biologia celular, bem como a mutação de Y180 que forma o centro de um motivo alvo SH2 putativo para testar a hipótese de que o DM efeito necessário Y180. É importante ressaltar que esta investigação foi estendida a um sistema in vivo, especificamente um modelo de tumorigênese de xenoenxerto de camundongo subcutâneo, a fim de abordar o requisito de Y180 para o desenvolvimento de tumor em um ambiente complexo. Em uma publicação complementar [36], descrevemos diferenças no metabolismo, taxas de mutação genômica e níveis de metilação CpG genômica epigenética associados aos mutantes de fosforilação PGRMC1 descritos neste estudo.


MATERIAIS E MÉTODOS

Geração de linhas celulares

Fibroblastos Rat1 foram transfectados com o uso de LipofectAMINE PLUS (Life Technologies, Rockville, MD) com 1,05 μg de pPUR (Clontech, Palo Alto, CA) apenas ou co-transfectados com 0,05 μg de pPUR e 1,0 μg de pKH3-p190RhoGAP ou pKH3-p190RhoGAP ou pKH3-p190RhoGAP R1283A (Tatsis et al., 1998) e, em seguida, selecionado em puromicina 10 μg / ml (Sigma, St. Louis, MO). As linhas clonais foram estabelecidas e pesquisadas quanto à expressão por imunotransferência com anticorpos monoclonais contra o epítopo da hemaglutinina (HA Covance, Richmond, CA) e p190RhoGAP (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY). Dez clones pPUR (simulado), cinco clones HA-p190RhoGAP R1283A (p190-RA) e três clones HA-p190RhoGAP (wt-p190) de níveis de expressão semelhantes foram reunidos. As células foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (Life Technologies), antibióticos e puromicina 10 μg / ml.

Para todos os experimentos, as células foram replantadas na ausência de puromicina no dia anterior aos experimentos, tripsinizadas, lavadas duas vezes em DMEM e, em seguida, suspensas antes do plaqueamento por 1 h em DMEM e albumina de soro bovino sem ácido graxo 0,5% (Sigma). As superfícies de revestimento foram revestidas com 20 μg / ml de fibronectina (Life Technologies) durante a noite a 4 ° C, seguido por bloqueio por 1 h com 0,5% de albumina de soro bovino sem ácido graxo. A inibição de RhoA foi alcançada pela introdução de C3 transferase conforme descrito anteriormente (Renshaw et al., 1996). Resumidamente, 12 μg (ensaios de disseminação) ou 34 μg (ensaios RhoA) de C3 transferase ou glutationa S-transferase (GST como um controle negativo) foram misturados com 25 μl de LipofectAMINE e 200 μl de DMEM por 15 min e, em seguida, adicionados a um prato de 10 cm de células subconfluentes em 5 ml de DMEM por 90 min. RhoA foi ativado por transfecção de células com 0,5 μg de PAX142-LscD4-HA (Whitehead et al., 1996), um vetor de expressão que codifica um mutante constitutivamente ativo do fator de troca RhoA, Lsc. Como controle negativo para a transfecção, as células foram transfectadas com pEGFP-C1 (Clontech).

Ensaio de atividade RhoA

A atividade RhoA foi medida com o uso de uma técnica semelhante ao método descrito por Ren et al. (1999). Resumidamente, as células foram lisadas em 300 μl de Tris 50 mM, pH 7,4, MgCl 10 mM2, 500 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato, 10 μg / ml de cada de aprotinina e leupeptina, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 200 μM de vanadato. Os lisados ​​(500-750 μg) foram depurados em 16.000 × g por 5 min, e o sobrenadante foi girado por 30 min com 30 μg de GST-RBD (proteína de fusão GST contendo o domínio de ligação de RhoA [aminoácidos 7–89] de Rhotekin) ligado a grânulos de glutationa-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). As amostras foram lavadas três vezes em Tris 50 mM, pH 7,4, MgCl 10 mM2, NaCl 150 mM, Triton X-100 a 1% e inibidores e depois imunotransferidos com anticorpos monoclonais RhoA (BD Transduction Laboratories). Os lisados ​​de células inteiras também foram imunotransferidos para RhoA como controles de carregamento.

Imunofluorescência

As células em lamínulas foram fixadas por 15 min em formaldeído 3,7% e, em seguida, permeabilizadas por 5 min em 0,5% Triton X-100. Texas Red-phalloidin e Hoechst 33342 da Molecular Probes (Eugene, OR) foram usados ​​para marcar F-actina e núcleos, respectivamente. Foram usados ​​anticorpos monoclonais contra HA (Covance) ou GM130 (BD Transduction Laboratories), seguido de incubação com isotiocianato de fluoresceína-anticorpo anti-rato de burro (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). As imagens foram obtidas em um microscópio Axiophot (Zeiss, Thornwood, NY) com o uso de uma câmera de dispositivo acoplado por carga resfriada de 5 MHz MicroMAX (Princeton Instrument, Trenton, NJ) e software Metamorph Image (Universal Imaging, West Chester, PA) .

Ensaio de espalhamento

Suspended cells were plated on fibronectin-coated coverslips for 10, 20, 30, 45, 60, and 180 min. Coverslips were fixed and stained with Coomassie blue (2% Brilliant Blue [Sigma], 45% methanol, and 10% acetic acid) for 10 min and then washed with water and mounted. The relative areas of individual cells from Metamorph images were quantified with the use of National Institutes of Health Image software. Data from these and all other experiments were considered significantly different if the p values, as determined by two-tailedt-tests, were <0.05.

Migration Assay

The top and bottom surfaces of 8-μm pore, 6.5-mm polycarbonate Transwell filters (Corning Costar, Corning, NY) were coated with fibronectin. Cells (2.0 × 10 4 ) were seeded on the upper surface of the filters and migration was allowed to proceed for 3 h. Cells were fixed, stained with Coomassie blue, and the number of cells per 25× field on the lower surface of the filters was counted. For some experiments Rho kinase was inhibited with 3 μM Y-27632 (Uehata et al., 1997b Welfide, Osaka, Japan).

Monolayer Wound Healing and Polarity Assay

Cells (4.0 × 10 5 ) in serum-free medium were seeded on fibronectin-coated coverslips in 24-well plates and allowed to adhere for 1 h. The monolayer was then wounded with a rubber policeman. Cells were washed once, fresh serum-free media was added, and the cells were allowed to invade the wound for 2 h (polarity assay) or 3 h (morphology assay) before fixation. Nuclei, F-actin, and the Golgi were labeled as described above with Hoechst 33342, phalloidin, and GM130 antibodies, respectively. Cells bordering the wound were considered polarized if the Golgi was orientated toward the wound-side of the nucleus (Kupfer et al., 1982).


Novel insights into how autophagy regulates tumor cell motility

Metastasis requires tumor cells to overcome a series of challenges to successfully travel to and colonize new microenvironments. As an adaptive (or maladaptive) response to stress, macroautophagy/autophagy has garnered increasing interest with respect to cancer metastasis, supported by clinical observations of increased autophagic flux in distant metastases relative to primary tumors. Recently, we identified a new role for autophagy in tumor cell motility through the turnover of focal adhesions, large multi-protein structures that link extracellular matrix-bound integrins to the cytoskeleton. The disassembly of focal adhesions at the cell rear is critical to forward movement and successful migration/invasion. We demonstrated that the focal adhesion protein PXN (paxillin), which serves as a crucial scaffolding and signal integrator, binds directly to LC3B through a conserved LC3-interacting region (LIR) motif to stimulate focal adhesion disassembly and metastasis and that this interaction is further promoted by oncogenic SRC.

We identified a specific requirement for autophagy in cell motility during metastasis that is independent of effects on proliferation or viability using an orthotopic murine model of metastatic mammary cancer. Unlike in many other models, the inhibition of autophagy has no effect on primary tumor growth, possibly due to the highly aggressive nature of the tumor model employed. However, autophagy-deficient cells are unable to metastasize from the primary tumor due to the inability to disassemble focal adhesions as the result of increased levels of PXN. Reducing PXN levels restores both focal adhesion morphology and motility, demonstrating that the motility defects in autophagy-deficient cells are due to the inability to degrade PXN and thus properly regulate focal adhesion dynamics.

The interaction of cargo destined for autophagic degradation with LC3/Atg8-related molecules at the elongating phagophore is mediated through LIR motifs characterized by the conserved sequence [W/F/Y]-xx-[L/I/V]. We have added to the ever-growing list of LIR-containing proteins with the identification of an evolutionarily conserved LIR motif at residues 40� (YQEI) in the N-terminal region of PXN. In vitro binding assays demonstrated a direct interaction between LC3B and PXN, and the PXN LIR motif is required for LC3B-PXN colocalization and co-immunoprecipitation in metastatic cells. Contrary to other reports, we observed no requirement for the SQSTM1/p62 or NBR1 cargo receptors in PXN degradation.

Given the utility of autophagy for degrading large macromolecular structures and PXN's role as a scaffolding protein within focal adhesions, our work suggests that PXN acts as an autophagy cargo receptor for focal adhesions, forming a bridge between phagophore-bound processed LC3B and focal adhesion proteins. Indeed, other groups have also observed elongating phagophores at focal adhesions. Alternatively, autophagy may siphon PXN from focal adhesions to promote focal adhesion disassembly, although ongoing work in our lab suggests that PXN localization at focal adhesions is required for interaction with LC3B, possibly because of additional direct or receptor-mediated interactions between phagophores and other focal adhesion proteins, including autophagy-regulated proteins such as SRC. Whether autophagic degradation of PXN represents a unique method of regulation in metastatic cells or a general requirement in cell motility remains to be determined.

Interactions of LIR-containing proteins with LC3 can be regulated by post-translational modifications, including phosphorylation both around (e.g., in the cases of OPTN and BNIP3) and within (e.g., in the case of FUNDC1) the LIR motif. The +1 residue of the PXN LIR motif, Y40, is an experimentally validated but previously uncharacterized target of SRC, a known modulator of PXN and focal adhesion turnover. We demonstrated that oncogenic SRC strongly promotes the PXN-LC3B interaction in a manner dependent on Y40 but independent of canonical SRC phosphorylation at Y31 and Y118. In conjunction with observations that the interaction is dependent on SRC kinase activity, these data suggest that phosphorylation of the LIR Y40 residue promotes the PXN-LC3B interaction, in contrast to negative SRC regulation of the FUNDC1-LC3 interaction. Interestingly, we observed that a Y40E phosphomimetic PXN mutant is highly unstable in cells, consistent with increased autophagic turnover of PXN phosphorylated on Y40. However, we cannot exclude the possibility that the SRC effect on focal adhesion disassembly involves the phosphorylation of other sites or proteins. Most intriguingly, the ability of oncogenic SRC to promote migration/invasion was completely abrogated in the absence of intact autophagy, which represents the first suggestion that autophagy may be critical to SRC-mediated motility ( Fig. 1 ).

Novel role for autophagy downstream of oncogenic SRC in promoting focal adhesion disassembly and tumor cell motility. Analyses from primary human cancers and data from genetically engineered mouse models link autophagy to tumor progression to metastasis. However, the molecular mechanisms by which autophagy promotes metastasis are relatively unknown. Our work contributes to a greater understanding of how autophagy promotes metastasis by identifying a critical role for autophagy in metastatic breast and melanoma cells in stimulating focal adhesion disassembly and tumor cell motility. This was achieved through autophagic targeting and degradation of PXN, a critical focal adhesion protein that we show interacts directly with LC3B at the phagophore. Significantly in terms of tumorigenesis, this direct protein-protein interaction between PXN and LC3B is strongly enhanced by oncogenic SRC and, indeed, we also showed that functional autophagy is required for SRC-induced migration and invasion by metastatic tumor cells.

SRC is frequently activated or overexpressed in solid tumors. Although not a primary driver of tumorigenesis, SRC has been suggested to play a critical role in bone metastases in breast cancer. Thus, SRC inhibitors such as dasatinib may represent an effective means of halting metastasis of breast and other cancers, and improved SRC inhibitors with increased selectivity and efficacy are currently being developed. Although clinical trials indicate that SRC inhibitor monotherapy may be ineffective in cancer therapy, our work suggests that autophagy inhibitors may potentiate SRC therapy by targeting a specific requirement for autophagy in SRC-regulated focal adhesion turnover. The potential to prevent tumor cell metastasis could prove to be highly useful within the context of ductal carcinoma in situ (DCIS) and other isolated primary tumors.

Our work has focused on the role of autophagy in focal adhesion turnover in metastatic cells ( Fig. 1 ). There is a growing body of work linking autophagy to different stages of the metastatic cascade, including the secretion of pro-migratory factors, epithelial-to-mesenchymal acquisition, and anoikis resistance. With respect to migration, autophagy exhibits reciprocal regulation of the RHO family of GTPases and cytoskeletal dynamics, and may be involved in the intracellular degradation of extracellular matrix components. As in primary tumor growth, the effect of autophagy on motility is likely to differ among cell types, and our work indicates that SRC status may dictate which cells rely on autophagy for turnover of focal adhesions. It will be interesting to determine whether autophagic focal adhesion turnover and the requirement for intact autophagy in SRC-stimulated motility are required during nonpathological wound healing or immune cell migration. Indeed, autophagy is well-positioned to act as a key regulatory node that allows cells to respond to extracellular or intracellular conditions by balancing cell movement to nutrient-replete areas or metastatic niches with motility arrest, and prosurvival autophagy or cellular death. Future work exploring autophagy in the context of physiological and pathological cell migration will likely reveal many more connections between autophagy and cell motility.


Informação sobre o autor

Afiliações

Howard Hughes Medical Institute, Children's Hospital, Harvard Medical School, Enders 1309, 320 Longwood Avenue, Boston, 02115, Massachusetts, USA

Dejian Ren, Betsy Navarro, Alexander C. Jackson, Shyuefang Hsu, Qing Shi & David E. Clapham

Massachusetts General Hospital and Department of Obstetrics, Vincent Center for Reproductive Biology, Gynecology and Reproductive Biology, Harvard Medical School, Boston, 02114, Massachusetts, USA


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Interferon-Inducible Protein 9 (CXCL11)-Induced Cell Motility in Keratinocytes Requires Calcium Flux-Dependent Activation of μ-Calpain

FIGO. 1 IP-9expressed in wounded keratinocytes induces motility of undifferentiatedkeratinocytes (HEKn cells) (a) and immortalized keratinocytes(HaCaT cells) (b) expressing both calpain isoforms (c). (a)Early-passage human keratinocytes were tested for induced motility inan in vitro wound healing assay. Cells were treated with EGF (1 nM) orIP-9 (50 ng/ml) and a pharmacological inhibitor of calpain, calpaininhibitor 1 (5 μM), throughout the assay. The values are shownas the ratio of EGF (1 nM)-induced cell motility. The values are means±standard error of the mean of three independent studies eachperformed in triplicate. Statistical analysis was performed byStudent's t teste. (b) Human immortalized keratinocytes,HaCaT cells, were treated with EGF (1 nM) or IP-9 (50 ng/ml)and calpain inhibitor 1 (5 μM) throughout the assay. The valuesare mean ± standard error of the mean of three independentstudies, each performed in triplicate. Statistical analysis wasperformed by Student's t teste. (c) Casein zymographydemonstrates that both HEKn and HaCaT keratinocytes possesspotential calpain activity from both ubiquitous isoforms. Proteins(approximately 40 μg) from both HEKn and HaCaTkeratinocytes were electrophoresed into a casein gel and subsequentlyincubated in buffer containing 20 mM MOPS, pH 7.5-5 mM2-mercaptoethanol and calcium (5 mM). Shown here are the Coomassieblue-stained casein gels. Purified porcine M- and μ-calpains (1μg each) served as controls. Images are representative of threeseparate experiments. The data presented in part a are independentlyderived but similar to those publishedbefore(42) the data areprovided herein forcontext. FIGO. 2 IP-9and EGF activate calpain in undifferentiated keratinocytes.Undifferentiated keratinocytes (HEKn cells) (a) and immortalizedkeratinocytes (HaCaT cells) (b) were tested for calpainactivity following stimulation by IP-9 (50 ng/ml) for 120 min or EGF (1nM) for 10 min by intracellular cleavage of the synthetic substrateBoc-LM-CMAC and subsequent fluorescence, as shown by a representativeexperiment of three to five experiments. (a) The calpain inhibitorcalpain inhibitor 1 (5 μg/ml) and the second calpain inhibitorZ-LLY-FMK (10 μM) were added for 30 min prior to the additionof ligand. (c) The involvement of calpain was confirmed by ex vivo MAP2cleavage in HEKn cells as described. Shown is MAP2 fluorescence overunstimulated cells of two experiments performed in triplicate.Statistical analysis was performed by Student's t test.The Boc-LM-CMAC fluorescence is not cell size dependent, and theaddition of the substrate Boc-LM-CMAC to the cells does not change cellsize or shapesignificantly. FIGO. 3 Molecularinterventions downregulate ubiquitous calpains in an isoform-specificmanner. siRNAs targeted against either μ-calpain (a)or M-calpain (b) were transfected into HaCaT cells, and theprotein level of the isoforms was determined 48 h later byisoform-specific immunoblotting. Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) staining demonstrates equal cell loading. Shownis one of up to four similar immunoblots for eachanalysis. FIGO. 4 IP-9requires μ-calpain for calpain activity. (a and b)IP-9 activates μ-calpain, whereas EGF triggers M-calpain.Undifferentiated primary keratinocytes (HEKn cells) were treated withIP-9 (50 ng/ml) or/and EGF (1 nM) in the presence or absence ofantisense oligonucleotides (20 μM) to M- and μ-calpainor a scrambled oligonucleotide for 8 h to deplete endogenouscalpain (17). IP-9 andEGF were removed, and the oligonucleotides were replenished for anadditional 12 h. Cells were then again stimulated with IP-9or EGF for 120 min and 10 min, respectively, and calpain cleavage ofthe substrate Boc-LM-CMAC was observed. Representative experimentimages (of three experiments) are shown in a and quantified in b.Values are means ± standard errors of the means of twoindependent studies, each performed in duplicate. Statistical analysiswas performed by Student's t teste. (c) siRNAelimination of μ-calpain limits IP-9 induction of BOCfluorescence in HaCaT cells 48 h after transfectionwith isoform-specific siRNA or GFP-targeted siRNA,HaCaT cells were exposed to IP-9 or EGF for 120 min and 10min, respectively, and calpain cleavage of the substrate Boc-LM-CMACwas observed. Representative experiment images (of two experiments) areshown. FIGO. 5 IP-9requires μ-calpain for cell migration and cell de-adhesion. (a)Antisense downregulation of μ-calpain but not M-calpain blocksIP-9-induced motility of HEKn keratinocytes in an in vitro woundhealing assay. Cells were treated in the presence or absence of EGF (1nM) or IP-9 (50 ng/ml) in the presence of antisense oligonucleotidesdirected against the initiation codon regions of M- andμ-calpain or a scrambled oligonucleotide (not shown) for24 h. Cell motility was calculated as a percentage ofEGF-induced responses in the absence of oligonucleotide exposure.Values are means ± standard errors of the means of threeindependent studies, each performed in triplicate. (b and c)siRNA downregulation of μ-calpain but not M-calpainblocks IP-9-induced motility and siRNA downregulation of M-calpain but not μ-calpain blocks EGF induced motility ofHaCaT cells 48 h after transfection, HaCaTcells were exposed to EGF or IP-9 in an in vitro wound healing assay.The values are shown as the ratio of EGF (1 nM)-induced cell motility.Values are means ± standard errors of the means of threeindependent studies, each performed in duplicate. (d) Antisensedownregulation of μ-calpain blocks IP-9 induced de-adhesion andantisense downregulation of M-calpain blocks EGF induced deadhesion inundifferentiated keratinocytes. Cells were treated with EGF (1 nM) andIP-9 (50 ng/ml) and antisense oligonucleotides specific for M-calpainor μ-calpain for 8 h, recovered in the presence ofantisense oligonucleotides for 14 h, and then stimulated withIP-9 or EGF for 2 h and 30 min, respectively. Values arecalculated as a percentage of precentrifugation cells remainingadherent. Values are means ± standard errors of the means oftwo independent studies, each performed in duplicate. Statisticalanalyses were performed with Student's tteste. FIGO. 6 IP-9and EGF induce disassembly of vinculin aggregates. HaCaTkeratinocytes were exposed to EGF or IP-9 for 60 min prior to fixingand staining for vinculin by immunofluorescence (a time coursedemonstrated loss of aggregates starting by 30 min data not shown).One subset of cells was exposed to calpain inhibitor 1 during thefactor exposure. In another series of experiments, the keratinocyteswere treated with isoform-specific siRNA to target M- orμ-calpain independently. Vinculin staining was imaged byconfocal microscopy, and representative cells are shown (threeindependent experiments were performed for each inhibitorychallenge). FIGO. 7 IP-9-inducedFAK cleavage is μ-calpain-dependent. EGF (10 nM) and IP-9 (200ng/ml) stimulation resulted in the appearance of a ≈84-kDacleavage product of FAK as detected by immunoblotting. The appearanceof this fragment was maximal at 30 to 60 min (shown are 30-minchallenges). Concomitant treatment with calpain inhibitor 1 (a) orisoform-specific siRNA (b) reduced the level of this cleavageproduct of FAK. Shown is one of three similar immunoblots for eachsituation. FIGO. 8 Calciumflux elicited by IP-9 was inhibited by intracellular calcium chelatorBAPTA-AM. (a) Intracellular calcium concentration rose in response toIP-9 stimulation in HaCaT cells. The frames shown were taken60 s after addition of IP-9 or diluent (Notx) BAPTA-AM wasadded 40 min prior to IP-9. HEKn cells demonstrated asimilar, BAPTA-AM-quenchable rise in calcium concentration upon IP-9exposure (data not shown). (b) Representative graph of a single celltrace of fluorescence showing average intracellular calcium in controlcells (middle line) and calcium traces in specific cells showingtransients in IP-9-stimulated cells (top line). No calcium fluxes wereobserved when IP-9 was added along with BAPTA-AM (bottomline). The mean intracellular calcium concentration of all IP-9-treatedcells was greater on average from the control cells (see panel a andalso the movie in the supplemental material), but the average rise incalcium concentration is not provided due to expected temporal offsetsof the peaks in intracellular calcium concentration. Shown is arepresentative experiment of three, each done in triplicate, for bothHaCaT and HEKncells. FIGO. 9 Intracellularcalcium is required for IP-9-induced calpain activity. Undifferentiatedkeratinocytes were treated in the presence orabsence of IP-9 (50 ng/ml) for 120 min or EGF (1 nM) for 10min and visualized (a) and quantitated (mean ± standard errorof the mean of >15 cells/experiment) (b) for calpainactivity. BAPTA-AM, a membrane-permeant acetoxymethyl ester of anintracellular calcium chelator, was used to determine the requirementof intracellular calcium for IP-9-induced calpain activity. BAPTA-AM (5μM) was loaded 30 min prior to Boc-LM-CMAC and in the presenceor absence of EGF and IP-9. This experiment was performed three times.Statistical analysis was performed by Student's t test.(c) A similar experiment was performed in human immortalizedkeratinocytes (HaCaT cells) to reproduce the results obtainedwith undifferentiatedkeratinocytes. FIGO. 10 ERKis required for EGF-induced cell migration. a) EGF (1 nM, 10 min) butnot IP-9 (50 ng/ml, 120 min) induces ERK MAP kinase in undifferentiatedkeratinocytes. Forskolin (25 μM, 15 min prior to ligand) servedas an independent activator of cyclic AMP. Activation of ERK wasdetermined by immunoblotting equal protein lysates for phospho-ERK. (b)Pharmacological inhibition of MAP kinase kinase with PD98059 (2μM, 30 min prior to ligand) prevents EGF-induced calpaincleavage of the Boc-LM-CMAC substrate. Images are representative ofthree experiments. (c) PD98059 (2 μm) blocked cell migration inundifferentiated keratinocytes induced by EGF (1 nM) but not IP-9 (50ng/ml) (n = 3). Statistical analysis was performed byStudent's tteste. FIGO. 11 . IP-9-inducedcell migration requires PLC-dependent calpain activation. (a)Pharmacological inhibition of all PLC isoforms by U-73122 (2μM) blocked both EGF- and IP-9-induced cell motility inundifferentiated keratinocytes. The values are shown as ratios of theEGF (1 nM)-induced cell motility. Thevalues are means ± standard errors of the means of sixindependent studies, each performed in triplicate.Statistical analysis was performed by Student'st teste. (b) Undifferentiated keratinocytes were tested forcalpain activity following stimulation by IP-9 (50 ng/ml) for 120 minor EGF (1 nM) for 10 min. The pan-PLC inhibitor ET-18-OCH3 (100 nM) andthe phospholipase D inhibitor propranolol (100 μM) (as anonspecific control in addition to molecular downregulation) were addedfor 30 min prior to the addition of ligand. Calpain activity wasmonitored by intracellular cleavage of the syntheticsubstrate Boc-LM-CMAC and subsequent fluorescence. Shown isa representative experiment of three to fiveexperiments. FIGO. 12 . PLC-β3signaling is required for IP-9 induced calpain activation and motility.Undifferentiated keratinocytes were grown in the presence orabsence of antisense oligonucleotides (20 μM) to PLC-β3(or PLC-γ1) for 48 h in quiescence medium. After thistime, cells were stimulated with IP-9 (50 ng/ml) or EGF (1nM) for 120 min or 10 min, respectively, and calpain cleavage of thesubstrate Boc-LM-CMAC was ob served. Representativeexperiment images (of three experiments) are shown (a) and quantified(mean ± standard error of the mean of >15cells/experiment) (b). Statistical analysis was performed byStudent's t teste. (c) PLC-β3 levels were assessedby immunoblotting cells exposed to specific (antisense PLC-β3)or irrelevant (trnfx control) oligonucleotides. Shown is arepresentative of at least three such immunoblots. trnfx,transfection.

Materiais e métodos

Algal culture and experimental setup

For the experiments, cultures of the unicellular photosynthetic freshwater flagellate Chlamydomonas nivalis (F. A. Bauer) Wille 1903 are used. They are grown by inoculating 1 ml of a logarithmic phase culture into 50 ml of Bold's basal medium + 5% sterilized soil extract. The culture is kept at 23.4°C under a light of about 6000 lux=8.8 W m –-2 from cool, white-tone fluorescent lights turned on for 16 h a day. Measurements are performed 2 weeks after the inoculation of the culture. Microscopic observation shows that the diameter of an individual cell in these cultures lies in the range 3–5 μm.

The experimental setup used is generally similar to the one described in Vladimirov et al. (2000), see Fig. 1A. An argon ion laser with a wavelength of 514 nm (green) and light intensity of 1400 W m –2 is the only light source in the experiments. Laser light passes through a cylindrical lens and a diaphragm, which produces a vertically oriented light sheet with a cross-section of 14 mm×1.5 mm. The laser sheet is directed along the plane of symmetry of the vertically positioned test tube of rectangular cross-section(Fig. 1B) containing medium and algal cells. A mirror is placed behind the test tube to make the cells'illumination symmetric, thus avoiding bias in their self-swimming. Images are acquired with a Kodak Megaplus 1.4 CCD camera, resolution of 1316×1034 pixels 2 . The laser, optical system and acquisition system belong to a Particle Image Velocimetry (PIV) System (TSI Inc., Shoreview, MN, USA).


Motility, the ability of an organism to move independently, using metabolic energy, [2] [3] can be contrasted with sessility, the state of organisms that do not possess a means of self-locomotion and are normally immobile. Motility differs from mobility, the ability of an object to be moved. O termo vagility encompasses both motility and mobility sessile organisms including plants and fungi often have vagile parts such as fruits, seeds, or spores which may be dispersed by other agents such as wind, water, or other organisms. [4]

Motility is genetically determined, [5] but may be affected by environmental factors such as toxins. The nervous system and musculoskeletal system provide the majority of mammalian motility. [6] [7] [8]

In addition to animal locomotion, most animals are motile, though some are vagile, described as having passive locomotion. Many bacteria and other microorganisms, and multicellular organisms are motile some mechanisms of fluid flow in multicellular organs and tissue are also considered instances of motility, as with gastrointestinal motility. Motile marine animals are commonly called free-swimming, [9] [10] [11] and motile non-parasitic organisms are called free-living. [12]

Motility includes an organism's ability to move food through its digestive tract. There are two types of intestinal motility – peristalsis and segmentation. [13] This motility is brought about by the contraction of smooth muscles in the gastrointestinal tract which mix the luminal contents with various secretions (segmentation) and move contents through the digestive tract from the mouth to the anus (peristalsis). [14]

At the cellular level, different modes of movement exist:

    , a swimming-like motion (observed for example in spermatozoa, propelled by the regular beat of their flagellum, or the E. coli bacterium, which swims by rotating a helical prokaryotic flagellum) , a crawling-like movement, which also makes swimming possible [16][17] , a form of motility used by bacteria to crawl over surfaces using grappling hook-like filaments called type IV pili. , enabling movement of the axonalgrowth cone[18]

Many cells are not motile, for example Klebsiella pneumoniae e Shigella, or under specific circumstances such as Yersinia pestis at 37 °C. [ citação necessária ]

Events perceived as movements can be directed:

  • along a chemical gradient (see chemotaxis)
  • along a temperature gradient (see thermotaxis)
  • along a light gradient (see phototaxis)
  • along a magnetic field line (see magnetotaxis)
  • along an electric field (see galvanotaxis)
  • along the direction of the gravitational force (see gravitaxis)
  • along a rigidity gradient (see durotaxis)
  • along a gradient of cell adhesion sites (see haptotaxis)
  • along other cells or biopolymers

Muscles give the ability for voluntary movement, and involuntary movement as in muscle spasms and reflexes). At the level of the muscular system, motility is a synonym for locomotion. [19] [20]

Most sperm have a single flagellum to help them swim. The cervical, uterine, and fallopian linings of the female reproductive system play a more important role in transporting sperm to ova.

The record speeds cheetahs hold are owed in large to their muscle motility.

The shoots of plants move by growing towards light. This is known as positive phototropism. The roots grow away from light. This is known as negative phototropism.

Monocytes and macrophages of the immune system engulf Bacteria by extending their pseudopodia. Note that this cartoon is not an accurate representation of phagocytosis.

Motility at the sub-cellular level. This depicts translation - a motile nanoscale molecular process using protein dynamics.


Assista o vídeo: Biologia Celular - Origem e evolução das Células (Agosto 2022).