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Circulating Tumor Cell vs Circulating Tumor DNA

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Estou um pouco confuso sobre a formulação dessas duas frases e em que contexto ocorre a transição epitelial-mesenquimal.

Por exemplo:

É a célula tumoral circulante que libera o ctDNA para que ele seja submetido à EMT?

Ou

O ctDNA do CTC de alguma forma cria novas instruções para que o fenômeno EMT ocorra?

Acho que há algo sobre o qual estou fundamentalmente confuso ou estou misturando vários ou diferentes conceitos e fenômenos e gostaria de obter alguns esclarecimentos sobre isso. Obrigado.

EDIT: Então, esta é minha nova hipótese / pensamento ...

Portanto, quando ocorre a EMT, as CTCs têm maior probabilidade de se desenvolver no contexto do câncer e, portanto, quando as CTCs circulam pela corrente sanguínea, as CTCs podem ser apoptadas ou necrosadas como um subproduto, deixando assim ctDNA na corrente sanguínea e ou possivelmente através do corpo .

Essa é uma explicação correta para minha confusão?


Não tenho certeza da relação que você está tentando construir entre a EMT e as células cancerosas.

Sim, algumas células "saudáveis" submetidas à EMT podem (devido a mutações subjacentes específicas) resultar em células cancerosas, mas tal fenômeno não é uma regra "rígida e rápida".

A maioria do ctDNA provavelmente seria (como você sugere) de células lisadas, no entanto, se ocorrerem mutações que permitam a exportação aberrante de DNA, a última pode ocorrer (eu presumo que seja raro, mas com base na literatura atualmente disponível, possibilidade não pode ser descontada).

Portanto, sua "nova hipótese" parece ser a mais provável.


DNA tumoral circulante e biópsia líquida em oncologia

As técnicas de análise de DNA tumoral circulante (ctDNA) para detectar, caracterizar e monitorar o câncer amadureceram rapidamente. Um crescente corpo de evidências clínicas está demonstrando as capacidades dessa tecnologia como um teste diagnóstico. O potencial total da biópsia líquida de ctDNA no diagnóstico, caracterização e tratamento de malignidades sólidas e hematológicas será descoberto por meio de ensaios clínicos de intervenção avaliando a utilidade clínica. Nesta revisão, discutimos o panorama atual das aplicações de biópsia líquida de ctDNA em todo o continuum do câncer e destacamos as oportunidades de investigação clínica.


Introdução

O câncer de mama é a doença maligna mais comum entre as mulheres em todo o mundo e representa a segunda principal causa de morte por câncer em mulheres americanas, superada apenas pelo câncer de pulmão. Aproximadamente 6% a 10% dos novos casos de câncer de mama estão inicialmente em estágio IV (de novo doença metastática), e o número de recorrências metastáticas é estimado entre 20% e 30% de todos os casos de tumor de mama existentes (1, 2).

Os objetivos primários do câncer de mama metastático (MBC) permanecem como paliação dos sintomas e melhora na qualidade de vida, com a esperança de que os tratamentos eficazes também produzam a remissão objetiva e o prolongamento do controle da doença, em última análise, traduzindo-se em um impacto na sobrevida.

A seleção da estratégia terapêutica sistêmica considera uma combinação de fatores moleculares e clínicos, com o objetivo de utilizar a abordagem adaptada mais eficaz e menos debilitante (3).

Em particular, em pacientes com tumores sensíveis ao hormônio, a terapia endócrina pode fornecer sobrevidas semelhantes às obtidas com quimioterapia (embora com menos respostas objetivas) e deve ser considerada como a primeira escolha na ausência de evidência clínica de doença agressiva (4-8 ) No entanto, a exposição prolongada à terapia endócrina pode resultar em resistência adquirida e subsequente progressão da doença. Evidências recentes mostraram que a ativação de mutações no domínio de ligação do ligante do receptor-α de estrogênio (ESR1) ocorrem em aproximadamente 30% dos pacientes expostos a terapias endócrinas e essas anormalidades genômicas podem representar o impulsionador da resistência endócrina (9).

Uma das principais razões para o fracasso das terapias sistêmicas do câncer é a nossa incapacidade de capturar com precisão a heterogeneidade do câncer de mama. Neste concurso, há esperança de que a Medicina de Precisão - concebida como o conjunto de testes diagnósticos e tratamentos resultantes direcionados às necessidades de pacientes individuais - pode ser uma forma de enfrentar este desafio (10, 11).

A biópsia líquida é uma ferramenta da Medicina de Precisão e fornece uma avaliação em tempo real do MBC no início e na recorrência, por meio da análise de mutações genéticas no ctDNA e CTCs.

Vários estudos (12-17) mostraram que as mutações somáticas identificadas no ctDNA são amplamente representativas do genoma do tumor e podem fornecer um método alternativo não invasivo que supera muitas dificuldades relacionadas à biópsia de tecido (por exemplo, espectro de mutações limitado a uma única região do tumor, amostragem seriada geralmente inviável ref. 17). O ctDNA permite monitorar a resposta ao tratamento para evitar terapias ineficazes e avaliar o benefício de novos medicamentos. Por exemplo, a detecção no ctDNA de mutações no domínio de ligação ao ligante de ESR1 que conferem atividade constitutiva de ER é um preditor emergente de resistência à terapia endócrina em MBC (18). Também foi demonstrado que as mudanças dinâmicas nos níveis de ctDNA refletem de perto as mudanças na carga tumoral e os aumentos nos níveis de ctDNA freqüentemente predizem a doença progressiva vários meses antes da imagem padrão. A avaliação dos níveis de ctDNA também pode ser um importante indicador de prognóstico, mas estudos prospectivos em coortes maiores de pacientes serão necessários para validar o papel do ctDNA como biomarcador prognóstico (10, 19).

CTCs são células cancerosas que foram eliminadas ou migram ativamente para a vasculatura a partir do tumor primário ou das lesões metastáticas e circulam na corrente sanguínea. Eles podem dar origem a metástases de lesões primárias ou outras (hipótese de semeadura) em órgãos distantes e ser responsáveis ​​pela grande maioria das mortes relacionadas ao câncer (20, 21). (i) Demonstramos anteriormente o valor prognóstico de uma contagem de CTC ≥5 no início do estudo e acompanhamento em pacientes com MBC (22, 23). (ii) A presença de uma ou mais CTCs prediz recidiva precoce e diminuição da sobrevida global (OS) também em pacientes quimioinais com não MBC (24). (iii) Além da enumeração, há interesse na caracterização genotípica e fenotípica de CTCs. Estudos em CTCs em nível de célula única podem ajudar a revelar o mecanismo subjacente de tumorigênese e metástases (25, 26).

Em contraste com as CTCs, um ponto de corte de ctDNA que se correlaciona com um pior prognóstico ainda não foi identificado. O objetivo do nosso estudo foi precisamente investigar o valor prognóstico de CTCs e ctDNA -% máxima (% ctDNA), número de variantes alélicas (mutações) - em termos de sobrevida livre de progressão (PFS) e OS em toda a população e no subgrupo de pacientes com doença ER +.


Circulando o DNA do tumor como um biomarcador de câncer: fato ou ficção?

Felix Leung, Vathany Kulasingam, Eleftherios P ​​Diamandis, Dave S B Hoon, Kenneth Kinzler, Klaus Pantel, Catherine Alix-Panabières, Circulating Tumor DNA as a Cancer Biomarker: Fact or Fiction ?, Química Clínica, Volume 62, Edição 8, 1 de agosto de 2016, Páginas 1054–1060, https://doi.org/10.1373/clinchem.2016.260331

A noção de utilizar DNA livre de células (cfDNA) 8 na circulação como um biomarcador substituto não é um conceito novo. Mandel e Metais identificaram a presença de cfDNA no sangue de indivíduos saudáveis ​​há quase 60 anos. Décadas depois, vários grupos foram capazes de estender o trabalho de Mandel e Metais na identificação de cfDNA derivado de tumor - também conhecido como DNA tumoral circulante (ctDNA) - no sangue de pacientes com câncer. Essas descobertas sugeriram que uma “biópsia líquida” pode ser uma ferramenta clínica viável porque os tumores parecem liberar fragmentos de DNA no sistema circulatório que são detectáveis ​​e específicos para o tumor.

Na última década, testemunhamos uma onda de novas tecnologias e melhorias nas tecnologias existentes para sequenciamento de DNA que tornaram esse processo antes trabalhoso mais barato e rápido. Em 2009, o custo de sequenciamento por genoma era de $ 100.000, enquanto em 2014, esse custo caiu para $ 5.000 (levando em conta mão de obra, administração, gerenciamento, utilidades, reagentes e consumíveis). Como resultado, o uso do ctDNA como biópsia líquida tornou-se cada vez mais viável.

Clinicamente falando, uma biópsia líquida baseada em ctDNA seria o modo ideal de tratamento do câncer devido a várias vantagens, incluindo: (uma) A recuperação de ctDNA seria minimamente invasiva, especialmente em comparação com uma biópsia de tecido (b) o ctDNA poderia fornecer uma representação completa do tumor (bem como de quaisquer metástases clonais) e (c) O ctDNA forneceria um instantâneo personalizado da doença do paciente. Embora o uso clínico de ctDNA como um biomarcador substituto ainda seja dificultado por obstáculos biológicos e tecnológicos, as implicações de uma biópsia líquida podem ser enormes, pois haveria inúmeras aplicações potenciais, incluindo (mas não se limitando a): detecção precoce, monitoramento de resíduos mínimos doença (MRD), avaliação da resposta ao tratamento e triagem com base no risco de recorrência.

Neste artigo de perguntas e respostas, 4 especialistas oferecem sua visão sobre o estado atual do ctDNA como uma ferramenta clínica para o tratamento do câncer. Especificamente, eles discutirão os desafios biológicos e analíticos que essa tecnologia ainda enfrenta, bem como os benefícios potenciais dessa área de rápido crescimento da pesquisa translacional.

Na sua opinião, qual é o principal mecanismo de liberação do ctDNA na circulação?

Dave S.B. Hoon: O principal mecanismo pode ser explicado levando-se em consideração os múltiplos eventos associados às células tumorais. O ctDNA no plasma pode originar-se de células tumorais primárias, metastáticas ou circulantes. Pode ser liberado de tumores por apoptose, necrose (programada ou não), destruição de células tumorais e / ou secreção celular. Provavelmente, vários fatores afetam a composição total do ctDNA no sangue, que depende do status do tumor, carga e histopatologia.

Kenneth Kinzler: Uma possibilidade é que o DNA seja liberado pela morte de células tumorais circulantes. A segunda possibilidade é que o DNA seja liberado pela morte de células tumorais no leito tumoral. Existem várias evidências que apóiam a última explicação como a fonte primária de ctDNA. Primeiro, a maioria dos casos com ctDNA detectável não tem células tumorais circulantes detectáveis. Em segundo lugar, nos casos em que ambos podem ser detectados, o nível de ctDNA é 1–2 ordens de magnitude maior do que o presente nas células tumorais circulantes. Terceiro, os casos avançados de câncer são frequentemente associados a concentrações aumentadas de cfDNA de células normais, provavelmente devido à morte e destruição de células normais nos leitos tumorais.

Klaus Pantel: Em princípio, o ctDNA pode ser liberado de tumores primários, células tumorais circulantes, micrometástases ou metástases evidentes em pacientes com câncer. A maior parte do ctDNA é provavelmente derivada de células tumorais apoptóticas e necróticas que liberam seu DNA fragmentado na circulação. O DNA também é liberado por células hospedeiras não malignas e esse DNA normal dilui o ctDNA em pacientes com câncer, particularmente em situações onde terapias que danificam o tecido, como quimioterapia ou radioterapia, são administradas. O comprimento do fragmento pode fornecer algumas informações sobre a origem do cfDNA. No entanto, essa questão ainda está em debate porque diferentes grupos relataram diferentes valores de corte em pacientes com câncer. Parte dessas discrepâncias pode ser devido às diferentes abordagens técnicas usadas para determinar o ctDNA e os tipos de tumor. No entanto, ainda precisamos saber mais sobre a biologia por trás da liberação de ctDNA na circulação.

Catherine Alix-Panabières: Quando as células cancerosas morrem por necrose ou apoptose, parte do DNA liberado acaba passivamente na corrente sanguínea, portanto, a liberação de cfDNA no sangue por células mortas não se restringe a pacientes com câncer; na verdade, o cfDNA pode ser detectado no sangue de pessoas saudáveis indivíduos, com quantidades ainda maiores em pacientes com doenças benignas ou inflamatórias ou quando os sujeitos estão envelhecendo. "Necrose" é causada por fatores externos às células tumorais ou tecidos cancerosos, que resultam na digestão desregulada e na liberação de componentes celulares. “Apoptose” é definida como um tipo controlado de morte celular que pode ser induzida por uma variedade de agentes fisiológicos e farmacológicos, seguida por fragmentação do DNA e lise celular. Em ambos os casos, as células tumorais moribundas liberam pequenos pedaços de seu DNA fragmentado na circulação. Como a fragmentação do ctDNA parece ser maior após apoptose do que após necrose, deve ser possível determinar como o ctDNA foi liberado em pacientes com câncer. Especificamente, o ctDNA fragmentado em 160-180 pb de comprimento corresponde ao DNA protegido por nucleossomo observado em células apoptóticas. Além da liberação de DNA pelas células tumorais que estão morrendo, estudos recentes indicam que uma quantidade muito pequena de DNA pode ser liberada em exossomos ativamente por células vivas, mas isso ainda é controverso. Como o ctDNA é liberado na circulação é uma questão chave porque para adotar o ctDNA como um biomarcador clínico em pacientes com câncer, será crucial elucidar em um futuro próximo como a liberação de ctDNA está relacionada à biologia do tumor, compreendendo: (1) de quais células é derivado, (2) quais clones específicos contribuem para o nível total de ctDNA que reflete sua carga clonal, e (3) como o nível de ctDNA muda ao longo do tempo, dependendo das terapias contra o câncer aplicadas. A fonte do ctDNA é de extrema importância, pois deve refletir a informação genética das células tumorais clinicamente relevantes. Como são principalmente as células tumorais morrendo que liberam DNA, dependendo de quando o ctDNA é detectado no sangue de pacientes com câncer, a informação que podemos obter de sua detecção pode não refletir mutações dos clones resistentes de células tumorais, mas sim aquelas de subpopulações sensíveis de células tumorais , principalmente após o início do tratamento - por exemplo, quimioterapia, terapia direcionada.

Como o ctDNA é eliminado da circulação e como isso afeta sua estabilidade?

Dave S.B. Hoon: A eliminação do ctDNA segue mecanismos fisiológicos semelhantes aos do DNA normal, que é liberado na circulação e eliminado rotineiramente por vários órgãos, como tumores que drenam para os nódulos linfáticos, rins e fígado. No microambiente tumoral, a drenagem linfática provavelmente limpará a maioria dos fragmentos de DNA que são liberados. O ctDNA é geralmente instável, exceto para algumas formas que parecem ter uma meia-vida mais longa por um motivo que não compreendemos totalmente. A forma (ou seja, exossomo), tamanho, substância da molécula ligada (ou seja, lipídio, proteína) e mecanismo de liberação desempenham coletivamente um papel na eliminação de ctDNA.

Kenneth Kinzler: A taxa de eliminação do cfDNA do sangue foi examinada usando DNA exógeno, DNA fetal e DNA tumoral em modelos humanos e animais. Todos esses estudos indicam que o DNA é rapidamente eliminado do sangue. Pela avaliação de um único sujeito cujo plasma foi amostrado várias vezes após a ressecção completa do tumor, estimamos a meia-vida do ctDNA após a cirurgia em 114 min. Dennis Lo e colegas acompanharam a depuração do DNA fetal circulante em 8 mulheres após o parto e descobriram que a meia-vida média do DNA fetal circulante é de 16,3 minutos (intervalo de 4 a 30 minutos). O mecanismo de eliminação do ctDNA não foi bem estudado, mas é provável que seja semelhante ao do cfDNA de outras fontes e pode variar com o estado fisiológico do paciente. Uma combinação de degradação da nuclease, depuração renal e captação pelo fígado e baço provavelmente desempenham um papel.

Klaus Pantel: A depuração do ctDNA não é totalmente compreendida. Relatórios anteriores indicam que o ctDNA tem meia-vida de 16 min. No entanto, um estudo recente do mesmo grupo usou o sequenciamento de última geração (NGS) para estudar a cinética do ctDNA, que revelou uma depuração bifásica com meia-vida de cerca de 1 h para a fase rápida e 13 h para a segunda fase. Presume-se que a maior parte do ctDNA seja eliminada pelos rins, o que despertou recentemente o interesse em detectar ctDNA na urina, não apenas para cânceres do trato urogenital. Pode-se imaginar que a taxa de depuração do ctDNA é afetada em pacientes com disfunção renal. Esse aspecto precisa ser mais investigado porque pode ser um importante fator de confusão modulando a quantidade de ctDNA na circulação. Além da depuração renal, o DNA pode ser eliminado da circulação por outros mecanismos. Por exemplo, o DNA é pegajoso e também pode aderir às células do hospedeiro, como as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos, não é impossível que esse DNA seja liberado novamente no sangue. Vários relatórios indicam que o ctDNA pode até ser captado por células hospedeiras e essa captação afeta a biologia dessas células. Assim, os mecanismos de depuração do ctDNA e seus efeitos na estabilidade do ctDNA ainda precisam ser investigados.

Catherine Alix-Panabières: A liberação do ctDNA, “quanto tempo leva para ser liberada e como é feita”, atualmente não é bem compreendida e ainda está sob investigação. O que se sabe é que o ctDNA tem de fato uma estabilidade limitada no sangue de pacientes com câncer, pois as DNases também presentes no sangue o digerem rapidamente. Assim, o ctDNA tem meia-vida curta de algumas horas na corrente sanguínea, sugerindo oportunidades para leituras precoces. Este material genético e fragmentado pode sofrer mudanças rápidas em pacientes com câncer e os momentos de coleta de sangue são cruciais e não são fáceis de determinar antecipadamente durante o planejamento de um ensaio clínico. Além disso, a liberação de ctDNA por células tumorais em morte é muito provavelmente bastante variável entre pacientes com câncer, dependendo do tipo de tumor, estágio do tumor, resposta dos pacientes com câncer à terapia, carga tumoral e replicação celular.

O ctDNA pode ser investigado em vários aspectos, como mutações pontuais, aneuploidia, rearranjos e metilação. Quais são as tecnologias de sequenciamento atuais capazes de investigar?

Dave S.B. Hoon: Existem várias técnicas disponíveis para investigar formas individuais de aberrações genômicas e epigenômicas de ctDNA. Cada um tem seus méritos e alguns foram verificados com mais eficiência do que outros em ensaios clínicos. O mais importante é a especificidade e sensibilidade do ensaio individual, que está altamente relacionada com a utilidade clínica do ctDNA. O sequenciamento digital de pequenas moléculas atualmente permite uma abordagem muito sensível e específica para mutação pontual e detecção de amplificação de ctDNA.

Kenneth Kinzler: Mutações pontuais somáticas, rearranjos, aneuploidia e metilação foram usados ​​para identificar ctDNA usando NGS. Essas abordagens para distinguir o DNA normal do tumoral variam em termos de sua sensibilidade, especificidade e praticidade quando aplicadas ao ctDNA. Embora a aplicação clínica específica possa determinar qual abordagem é ideal, descobrimos que o uso de mutações pontuais tem a melhor combinação de atributos para a maioria das aplicações clínicas que estudamos.

Klaus Pantel: Métodos altamente sensíveis e específicos foram desenvolvidos para detectar ctDNA, como BEAMing, Safe-SeqS, TamSeq e PCR digital para detectar mutações de nucleotídeo único no ctDNA ou sequenciamento do genoma completo para estabelecer alterações no número de cópias. Em princípio, as tecnologias podem ser divididas em abordagens direcionadas destinadas a detectar mutações em um conjunto de genes predefinidos [por exemplo, proto-oncogene KRAS, GTPase (KRAS) no contexto de bloqueio de EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) por anticorpos] ou abordagens não direcionadas (por exemplo, array-CGH (hibridização genômica comparativa), sequenciamento do genoma completo ou sequenciamento do exoma) com o objetivo de rastrear o genoma e descobrir novas aberrações genômicas , por exemplo, aqueles que conferem resistência a uma terapia direcionada específica (Murtarza et al., Nature 2013497: 108-112). Os pontos fortes e as limitações dessas tecnologias foram recentemente discutidos em análises excelentes. Em geral, as abordagens direcionadas têm uma sensibilidade analítica mais alta do que as abordagens não direcionadas, apesar dos grandes esforços para melhorar os limites de detecção. Consórcio europeu IMI (Innovative Medicines Initiative) de mais de 30 instituições acadêmicas e industriais [denominado CANCER-ID www.cancer-id.eu coordenador científico, Klaus Pantel coordenador da EFPIA (Federação Europeia de Associações e Indústrias Farmacêuticas), Thomas Schlange] está se concentrando agora em biópsias líquidas, o objetivo principal é validar as diferentes tecnologias de cfDNA lado a lado, primeiro em experimentos de anel entre diferentes instituições e, posteriormente, em ensaios clínicos multicêntricos.

Catherine Alix-Panabières: A detecção de ctDNA entre cfDNA total no plasma requer o uso de métodos moleculares e é baseada nas diferenças genéticas ou epigenéticas entre o DNA normal e o derivado de tumor. Os alvos para a detecção de ctDNA são (1) mutações com relevância funcional conhecida ou prevista (mutações ativadoras de oncogene e mutações supressoras-inativadoras de tumor), (2) mutações de relevância funcional nenhuma ou desconhecida (rearranjos cromossômicos somáticos, mutações de DNA não codificantes e variantes de DNA ), e (3) modificações epigenéticas (estado de metilação de sequências-chave e modificações de histonas). Algumas das tecnologias atuais capazes de investigar ctDNA incluem: (eu) tecnologia que combina polimerização ativada por pirofosforólise e amplificação específica de alelo durante a PCR (ii) um conjunto de métodos genômicos digitais que melhoram a identificação de alterações genéticas no ctDNA (iii) um método baseado em PCR que permite que reações de PCR de molécula única sejam realizadas em grânulos magnéticos em emulsões de água em óleo, a abordagem BEAMing (4) Outras tecnologias de PCR digital que incluem PCR digital de gotículas e sistemas microfluídicos (v) Amplificação por PCR seguida por NGS. O cfDNA do plasma analisado por NGS pode determinar (uma) a presença de uma dada mutação e estimar sua frequência alélica dentro de uma amostra e (b) a caracterização do genoma completo de todo o repertório de mutações em um câncer. Finalmente, para se ter uma ideia sobre a alta sensibilidade de tecnologias aprimoradas para detecção de ctDNA, foi relatado que PCR digital e BEAMing podem detectar mutações pontuais somáticas com sensibilidades que variam de 1% a 0,001%. Além de investigar mutações pontuais e alterações no número de cópias, a avaliação do estado de metilação dos genes supressores de tumor e supressores de metástase no ctDNA pode ser avaliada por ensaios de PCR específicos para metilação em tempo real. Todas essas tecnologias foram relatadas com várias sensibilidades in vitro usando linhas de células cancerosas, no entanto, os resultados clínicos e suas respectivas avaliações ainda estão em andamento nos ensaios clínicos.

Recentemente, vimos o surgimento de novas tecnologias de sequenciamento, como sequenciamento profundo do amplicon com tag (TAM-Seq) e perfil personalizado do CAncer por sequenciamento profundo (CAPP-Seq). Quais são as vantagens dessas tecnologias mais novas em comparação com as “mais antigas”?

Dave S.B. Hoon: As técnicas mais recentes oferecem um direcionamento mais direto, mas não são necessariamente melhores do que as abordagens mais recentes de NGS. O NGS na análise digital de pequenas moléculas é uma abordagem mais altamente sensível e específica do que o NGS convencional. O NGS paralelo tradicional é caro e limitado. As técnicas de detecção estão evoluindo e melhorando rapidamente. Abordagens mais novas só podem ser consideradas eficientes quando a utilidade clínica é demonstrada de forma robusta.

Kenneth Kinzler: Muitos métodos podem detectar ctDNA em casos avançados, onde a fração de ctDNA pode representar mais de 5% do DNA total. No entanto, maximizar a fração de casos com ctDNA detectável, especialmente no caso de doença inicial, requer métodos que podem detectar algumas moléculas mutantes quando representam & lt0,1% do DNA total. Felizmente, as abordagens digitais (por exemplo, PCR digital, BEAMing e SafeSeqS) permitem a detecção e a quantificação precisa, mesmo nesses níveis baixos.

Klaus Pantel: A principal vantagem dessas tecnologias mais recentes é sua maior sensibilidade. Tecnologias “mais antigas” têm sido usadas em estudos de prova de princípio que analisam o sangue de pacientes com câncer avançado, onde a quantidade de ctDNA é muito alta e pode ultrapassar 50% da quantidade total de cfDNA. No entanto, essas tecnologias não são capazes de detectar quantidades menores de ctDNA no “mar” de cfDNA circulante normal, o que é uma limitação clara, em particular se estendermos nossas análises a pacientes com DRM ou detecção precoce de câncer. Para essas situações, um número crescente de tecnologias muito mais sensíveis foram desenvolvidas, que podem detectar ctDNA em concentrações notavelmente baixas, como 0,00025% para a tecnologia CAPP-Seq. No entanto, agora a quantidade total de cfDNA e os números disponíveis de equivalentes do genoma podem se tornar uma limitação importante. Assim, para atingir as sensibilidades notáveis ​​desses novos ensaios, o tamanho da amostra de plasma precisa ser aumentado consideravelmente para se obter uma quantidade suficiente de ctDNA para análise. A este respeito, as análises de ctDNA em pacientes com câncer em estágio inicial enfrentam os mesmos problemas que as análises de células tumorais circulantes. Portanto, a promessa de que a análise de ctDNA detectará o câncer em uma gota de sangue é enganosa.

Catherine Alix-Panabières: Os ensaios baseados em PCR padrão têm uma sensibilidade relativamente limitada e não podem detectar mutações que representam & lt5% a 10% do pool total de alelos. Na verdade, eles produzem muitos artefatos, particularmente se as quantidades de ctDNA forem bastante baixas, enquanto as novas tecnologias são capazes de detectar quantidades muito baixas de ctDNA. A identificação de aberrações genéticas somáticas e epigenéticas agora foi facilitada pelo advento de técnicas altamente específicas e sensíveis (por exemplo, faixa de 1% a 0,001% para PCR digital e BEAMing). Isso envolve a obtenção de diferentes informações clínicas: com tecnologias mais novas e mais sensíveis, podemos imaginar a utilidade no diagnóstico de câncer, na detecção de câncer em estágio inicial e na detecção de MRD, enquanto com tecnologias mais antigas, apenas em estágio avançado e metastático doenças pudessem ser detectadas e avaliadas.

Qual é o maior desafio técnico que ainda enfrentamos no que diz respeito à genotipagem do ctDNA?

Dave S.B. Hoon: O principal problema técnico do calcanhar de Aquiles é o isolamento do ctDNA de pequenas quantidades de soro / plasma. Essa barreira de isolamento influenciará a análise posterior. Obtemos com precisão todo o ctDNA? A sensibilidade do ensaio continua sendo um grande problema. O desafio técnico mais importante é identificar qual nível de ctDNA é de utilidade clínica. Isso provavelmente irá variar entre os tipos de câncer, dependendo do estado clínico do paciente e da questão que está sendo abordada pelo biomarcador de ensaio específico ctDNA.

Kenneth Kinzler: O avanço da tecnologia tornou a detecção do ctDNA viável e os avanços futuros provavelmente tornarão esses ensaios ainda mais robustos e econômicos. No entanto, esses ensaios, como os atuais, são provavelmente limitados por questões práticas e biológicas, e não técnicas. Do lado prático, somos limitados pelo número de moléculas livres de células presentes em uma amostra de plasma. Por exemplo, 1 mL de plasma normalmente contém cerca de 3.000 cópias de qualquer gene, limitando nossa capacidade de detectar ctDNA a 1 em 15.000 cópias, dada uma amostra de plasma de 5 mL. Do lado biológico, apenas uma pequena fração de tumores benignos e alguns tipos de tumor (por exemplo, glioblastomas) liberam concentrações detectáveis ​​de ctDNA, mesmo quando testado com ensaios muito sensíveis em condições quase ideais. Algumas das limitações do uso de ctDNA como biomarcador podem ser contornadas por maiores volumes de amostra e protocolos ou locais alternativos para coleta de sangue. Finalmente, o DNA do tumor demonstrou ser um promissor biomarcador de câncer em outras amostras clínicas prontamente disponíveis, como fezes, urina, escarro, saliva e amostras de esfregaço de Papanicolaou.

Klaus Pantel: O maior desafio técnico é a identificação de quantidades muito baixas de ctDNA em amostras de sangue contendo quantidades variáveis ​​de cfDNA e a escolha do painel certo de aberrações genômicas específicas do câncer. Se as aberrações genômicas são definidas pela escolha da terapia direcionada disponível, esta tarefa parece ser factível com as tecnologias existentes. No entanto, se a análise de ctDNA for usada para triagem de MRD em pacientes com câncer ou mesmo para detecção precoce de doença primária em "indivíduos saudáveis", as aberrações genômicas em um paciente individual são desconhecidas. Em pacientes com DRM, o tumor primário (ou pelo menos uma biópsia) pode estar disponível para sequenciamento. No entanto, a qualidade dessas amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina é altamente variável. Para a detecção precoce, não há material tumoral disponível e o painel de possíveis aberrações genômicas é substancial para a maioria dos tumores sólidos. Além disso, é bem conhecido que as mutações associadas ao câncer ocorrem com o aumento da idade, mesmo em indivíduos que nunca desenvolveram câncer durante a vida. Por exemplo, um estudo recente mostrou que até 15% dos indivíduos saudáveis ​​com mais de 65 anos apresentam mutações somáticas de leucemia, mas a leucemia foi diagnosticada apenas em uma minoria desses pacientes. Assim, a detecção de mutações associadas ao câncer no cfDNA pode não indicar que o indivíduo testado já tem câncer ou desenvolverá câncer em sua vida, mas pode precipitar procedimentos diagnósticos extensos, como tomografia computadorizada e ressonância magnética para procurar um possível tumor desconhecido lesão.

Catherine Alix-Panabières: Em primeiro lugar, as etapas pré-analíticas precisam ser padronizadas antes de detectar ctDNA de uma maneira otimizada, por exemplo, volume de sangue, plasma ou soro, centrifugação de sangue, reagente específico projetado para isolar DNA de alta qualidade, preparação de DNA por meio de estratégia de extração e condições de armazenamento para definir o metodologia mais reproduzível e robusta, em seguida, uma avaliação completa do desempenho analítico (por exemplo, robustez, reprodutibilidade, sensibilidade, especificidade, controles de qualidade internos e externos), bem como o tempo de análise da coleta da amostra de sangue para o resultado de volta ao paciente com câncer é precisava. Todos esses pontos técnicos precisam ser considerados, mas, mais importante, precisamos avaliar a relevância clínica do ctDNA em diferentes momentos para responder às diferentes questões-chave relacionadas às aplicações, como estratificação de pacientes para terapia, avaliação da eficácia do tratamento, diagnóstico precoce de metástases recidiva, ou definição de resistência ao tratamento. Além disso, para o diagnóstico precoce de câncer, devemos ter em mente que (1) mutações específicas devem ser conhecidas para detectar ctDNA [por exemplo, KRAS ou proto-oncogene B-Raf, serina / treonina quinase (BRAF) mutação no câncer de cólon] e (2) muitas pessoas têm tumores benignos (por exemplo, tumores de pele) que carregam mutações que podem se sobrepor a mutações associadas ao câncer e podem causar resultados falso-positivos se ctDNA for usado para rastreamento de câncer.

Quanto tempo você acha que vai demorar até que vejamos a introdução do ctDNA na prática clínica?

Dave S.B. Hoon: No momento, estamos entrando em um momento em que os ensaios de ctDNA estão em laboratórios acreditados pela CLIA. Os ensaios de ctDNA estão sendo reembolsados ​​pelos pagadores de saúde e também por pacientes individuais. Esperançosamente, em alguns anos poderemos ver a aprovação da FDA (Food and Drug Administration) dos EUA para determinados ensaios de ctDNA para cânceres específicos.

Kenneth Kinzler: Embora seja especulativo prever quando qualquer nova tecnologia será introduzida na prática clínica, há um número crescente de estudos que indicam que o ctDNA pode superar os biomarcadores clínicos de câncer atualmente usados ​​em situações clínicas específicas. Conseqüentemente, espero e espero que as medições de ctDNA sejam usadas para auxiliar nas decisões clínicas em uma gama crescente de situações nos próximos 5 a 10 anos.

Klaus Pantel: A estratificação baseada no sangue de terapias direcionadas é provavelmente a passagem para a introdução da análise de ctDNA na prática clínica. Recentemente, o primeiro teste de ctDNA para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) mutações no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) foram aprovadas pelo FDA para a situação em que nenhum tecido tumoral pode ser biopsiado. Mais testes para mutações em genes que codificam alvos terapêuticos e / ou os genes de resistência correspondentes serão lançados em um futuro próximo. O NSCLC é uma entidade tumoral interessante para esta aplicação porque várias mutações direcionando terapias direcionadas específicas em pequenas coortes de pacientes responsivos foram recentemente identificadas e as biópsias não são facilmente obtidas em um número considerável de pacientes. No entanto, deve-se enfatizar que nem as análises de DNA do ctDNA nem do tecido tumoral garantirão que o paciente terá uma resposta durável e que prolongue a vida aos respectivos agentes terapêuticos. A utilidade clínica da análise de ctDNA (como qualquer outro teste diagnóstico) precisa ser comprovada em estudos de intervenção clínica randomizados nos quais as decisões terapêuticas são baseadas na análise de ctDNA, ou seja, a análise de ctDNA pode direcionar o tratamento em um paciente com câncer individual e isso muda levar a uma sobrevivência melhorada? Pode levar muitos anos antes que esses estudos sejam concluídos e aceitos pela comunidade médica. Os resultados recentes do estudo multicêntrico, aberto, de prova de conceito, randomizado e controlado de fase 2 SHIVA foram bastante decepcionantes, pois o uso de agentes direcionados molecularmente fora de suas indicações não melhorou a sobrevida livre de progressão em comparação com o tratamento de escolha do médico em pacientes com câncer pré-tratados pesadamente. O monitoramento de ctDNA para mutações que conferem resistência a terapias direcionadas também pode ser dificultado pelo fato de que ainda sabemos pouco sobre a biologia dinâmica da liberação de ctDNA. O ctDNA representa principalmente o genoma das células tumorais que estão morrendo, mas as células tumorais viáveis ​​conduzem a progressão do câncer e causam resistência à terapia. Assim, a seleção dos pontos de tempo apropriados para a triagem de ctDNA será crucial para detectar aquelas espécies de ctDNA que são derivadas de clones de células tumorais resistentes. Nesse contexto, a determinação paralela de células tumorais circulantes viáveis ​​como indicadores precoces de falha de terapia superior aos marcadores tumorais padrão usados ​​na clínica pode ser útil.

Catherine Alix-Panabières: O desenvolvimento de testes moleculares para tomada de decisão de tratamento, aliado ao desenvolvimento tecnológico, virou moda nestes últimos anos e ainda esperamos que a biópsia líquida em tempo real leve a formas não invasivas e sensíveis de detectar e monitorar o câncer em pacientes. No entanto, a introdução do ctDNA na prática clínica pode levar vários anos, pois precisamos definir qual será a melhor tecnologia para preparação (etapas pré-analíticas) e detecção do ctDNA, quais serão os pontos finais e se a análise do ctDNA será mais informativa e independente dos padrões atuais, como biópsias de tecidos. Conforme indicado anteriormente, precisamos avaliar a relevância clínica do ctDNA e, principalmente, sua utilidade clínica, a questão chave para a medicina personalizada. Além disso, para a triagem primária, coortes muito grandes de pacientes com câncer e indivíduos de controle pareados precisam ser analisados ​​prospectivamente, incluindo pacientes com doenças benignas como um grupo de controle. Considerando outras abordagens de triagem [por exemplo, PSA (antígeno específico da próstata) para câncer de próstata ou mamografia para câncer de mama], este esforço requer milhares de pacientes e controles e períodos de observação de 10 anos ou mais.

Nota adicionada por moderadores: Após a conclusão deste Q & ampA, a gigante do sequenciamento Illumina anunciou a formação de uma nova empresa, a Graal, com o objetivo de desenvolver exames de sangue que custariam menos de US $ 1000 e teriam a capacidade de detectar muitos tipos de câncer em estágios assintomáticos. Os testes serão baseados em “biópsias líquidas” (exames de sangue) e sequenciamento do ctDNA isolado. A empresa já arrecadou US $ 100 milhões e inclui investidores de alto nível, como Bill Gates (Microsoft) e Jeff Bezos (Amazon). O CEO da Illumina projeta que esses testes cheguem aos consumidores até 2019 e estejam disponíveis em consultórios médicos.


Células tumorais circulantes

As CTCs podem ser encontradas na corrente sanguínea de pacientes com câncer como células únicas ou, menos comumente, como agrupamentos de células, e os níveis de CTC mostraram ter associações clínicas com a sobrevivência e a resposta à terapia (7). As CTCs são presumivelmente eliminadas na vasculatura do tumor primário ou focos metastáticos distantes e são postulados como contendo subpopulações de "células culpadas", que são responsáveis ​​pela semeadura e re-propagação de metástases, eventualmente levando à morte do paciente (8). É, portanto, atraente não apenas enumerar as CTCs para medir a carga da doença e detecção de doença residual mínima, mas também caracterizar as CTCs como um meio de direcionar a terapia para essas células culpadas putativas.

Enriquecimento CTC e tecnologias de detecção

Diversas revisões discutiram as várias tecnologias de enriquecimento e detecção de CTC (7, 9–12). A Tabela 1 apresenta uma lista atualizada de ensaios CTC que foram usados ​​para testar amostras de pacientes nos últimos 5 anos, juntamente com seu status de comercialização. Os métodos de detecção ou captura de CTC podem ser amplamente categorizados como dependentes de marcadores, usando enriquecimento positivo com marcadores de superfície celular, como molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM), também usado em na Vivo técnicas de captura, ou independente de rótulo, enriquecimento para CTCs com base na seleção negativa, tamanho ou outras propriedades biofísicas, outras estratégias incluem imagens diretas de CTCs e ensaios funcionais. Um problema significativo na detecção e captura de CTCs por métodos dependentes de marcadores é a falta de marcadores imunocitoquimicamente identificáveis ​​confiáveis ​​que os distingam das células epiteliais normais. Como tal, porque as células epiteliais raramente estão presentes em amostras de sangue de indivíduos saudáveis ​​e porque as células epiteliais circulantes (CEC) em pacientes com câncer muitas vezes carregam as mesmas aberrações genéticas vistas no tumor primário (13), a definição comum de CTCs tem sido equivalente às CECs: células nucleadas na corrente sanguínea que expressam citoqueratinas epiteliais e não expressam o antígeno de superfície dos leucócitos CD45.Mais recentemente, CTCs citoqueratina-negativas foram identificadas, potencialmente representando células tumorais em transição epitelial-mesenquimal (EMT) ou, alternativamente, células-tronco cancerosas que ainda não mostraram diferenciação epitelial (14-17).

Métodos de detecção / captura de CTC com estudos clínicos publicados recentemente, 2010-2015

CTCs em ensaios clínicos

Algumas tecnologias listadas na Tabela 1 podem detectar subpopulações distintas de CTC e, portanto, podem ser usadas em diferentes cenários clínicos no futuro. No entanto, para qualquer tecnologia a ser usada na clínica, demonstração de validade analítica (a precisão do teste para medir o alvo de interesse), validade clínica (o valor do teste para prever o resultado clínico) e, em última instância, utilidade clínica ( a capacidade do teste de levar a um melhor resultado clínico quando a escolha do tratamento é informada pelos resultados do teste) é necessária (9, 18). O único sistema atualmente aprovado pelo FDA como um auxílio no monitoramento de pacientes com câncer metastático de mama, colorretal ou de próstata é o CELLSEARCH (Janssen Diagnostics refs. 19–21). Dados recentes sugerem que essa tecnologia também pode ser usada para ensaios clínicos em vários laboratórios no ambiente não metastático, desde que o treinamento contínuo e a revisão central da imagem sejam realizados (22).

Em abril de 2015, uma pesquisa no site “ClinicalTrials.gov” usando as palavras-chave “circulating tumor cell” revelou 296 estudos envolvendo CTCs. A Tabela 2 refere-se a estudos em vários tipos de tumor usando enumeração CTC ou caracterização como um critério de inclusão. A Tabela 3 refere-se a estudos para o desenvolvimento e / ou validação de ensaios CTC para uma indicação particular.

Estudos em andamento que têm detecção ou caracterização de CTC como critério de inclusão

Estudos para o desenvolvimento e / ou validação de ensaios CTC para uma indicação particular

Enumeração CTC

Uma análise agrupada recente forneceu evidência de nível um para a validade clínica de níveis elevados de CTC como um marcador de mau prognóstico no câncer de mama metastático (23). No entanto, o valor da enumeração CTC para a tomada de decisão do tratamento no câncer de mama metastático foi testado prospectivamente no ensaio clínico Southwest Oncology Group (SWOG) S0500 (24). O estudo SWOG avaliou o benefício de uma mudança precoce na quimioterapia para pacientes com CTCs aumentadas persistentemente no primeiro acompanhamento após o início da quimioterapia de primeira linha. De 595 pacientes avaliáveis, 123 pacientes com CTCs persistentemente elevados no dia 21 de terapia foram randomizados para continuar o mesmo tratamento ou para mudar para uma quimioterapia alternativa de escolha do médico. Neste ensaio, uma mudança precoce para uma quimioterapia alternativa não aumentou a sobrevida geral (OS). Embora as CTCs fossem fortemente prognósticas, a ausência de um benefício de sobrevivência na mudança de tratamento com base em contagens elevadas de CTC sugere que a detecção precoce de recidiva só pode ser importante quando um tratamento mais eficaz está disponível: a mudança de uma terapia ineficaz para outra ineficaz não muda resultado. Em vez disso, mudar o tratamento com base na caracterização molecular do CTC pode ser uma abordagem mais promissora para o teste.

No câncer de mama não metastático, a detecção de níveis elevados de CTC usando CELLSEARCH e outras plataformas (25–29) também está associada a um prognóstico adverso. O estudo em andamento Treat CTC (NCT01548677 Tabela 2) está avaliando a dinâmica do CTC como um sinal precoce da atividade do medicamento. Este estudo inscreve mulheres com risco primário HER2- câncer de mama não amplificado com CTCs detectáveis ​​após a conclusão da cirurgia e quimioterapia (neo) adjuvante. Ele avalia se seis ciclos de trastuzumabe (um anticorpo monoclonal humanizado direcionado ao receptor do fator de crescimento HER2) em comparação com a observação isolada eliminarão as CTCs persistentes. Este ensaio foi baseado em várias linhas de evidência: (i) em modelos pré-clínicos, o trastuzumabe parece ter como alvo a população de células-tronco cancerosas em um processo que não requer HER2 amplificação do gene (30) (ii) análises de subconjunto de estudos prospectivos demonstram benefícios semelhantes de trastuzumabe para mulheres com tumores HER2-positivos por teste local, mas considerados HER2-negativos por revisão patológica central (31, 32) e (iii) um único centro randomizado estudo de fase II de 75 pacientes com câncer de mama precoce HER2-negativo descobriu que o trastuzumabe de curta duração pode eliminar CTCs CK19 mRNA-positivas resistentes à quimioterapia e melhorar o desfecho do paciente em comparação com a observação (33). Estudos adicionais usando CTCs em câncer de mama estão listados nas Tabelas 2 e 3.

A enumeração de CTC também demonstrou fornecer informações prognósticas no câncer de próstata resistente à castração metastático (34, 35). No ensaio de registro COU-AA-301 que comparou abiraterona mais prednisona com prednisona sozinha, a combinação de enumeração de CTC e níveis de lactato desidrogenase (LDH) em 12 semanas pós-tratamento mostrou ser um substituto para OS em nível de paciente individual (36) . Esforços estão em andamento para validar este painel de biomarcadores.

Os estudos clínicos usando CTCs em tipos de tumor diferentes do câncer de mama e de próstata são descritos nas Tabelas 2 e 3.

Caracterização CTC

Expressão de proteínas em CTCs.

Além da enumeração de CTC, a caracterização da expressão de proteína em CTCs também foi usada para orientar a seleção de tratamento em ensaios clínicos (Tabela 2). No câncer de mama, a expressão da proteína HER2 em CTCs foi avaliada usando a tecnologia CELLSEARCH, com demonstração de que algumas mulheres com câncer de mama HER2-negativo podem ter CTCs HER2-positivas detectáveis ​​(37, 38). No entanto, um estudo de fase II de lapatinib de agente único (um inibidor da tirosina quinase anti-HER2) não encontrou respostas objetivas em pacientes com câncer de mama metastático com tumores primários HER2-negativos e CTCs HER2-positivas na entrada do estudo (39). Dos 139 pacientes HER2-negativos rastreados, apenas 96 (69%) tinham ≥2 CTCs, e apenas 7 (5%) tinham ≥50% CTCs HER2-positivos e receberam tratamento. Um paciente (1 de 139 pacientes rastreados) apresentou estabilização da doença durável, tendo recebido lapatinibe como uma terceira linha de terapia, embora a análise de eficácia não pudesse ser realizada devido ao baixo número de pacientes tratados. Digno de nota, dos 7 pacientes tratados, os 6 que progrediram receberam lapatinibe como terapia de quarta linha para doença avançada, levantando a questão de se o status HER2 das CTCs representa o status HER2 da maioria das metástases na doença em estágio muito avançado. Um estudo de fase III em andamento (DETECT III, NCT01619111) está avaliando o papel da adição de lapatinibe à quimioterapia nessa mesma população de pacientes (Tabela 2). Outros pesquisadores estão usando o CELLSEARCH para monitorar a resistência endócrina no câncer de mama metastático ER-positivo HER2-negativo. Para esse fim, uma pontuação baseada na enumeração e caracterização do CTC para o receptor de estrogênio (ER), Bcl-2, HER2 e Ki67, o Índice de Terapia Endócrina CTC (CTC-ETI ref. 40), está atualmente sendo testado no COMETI Estudo de fase II (NCT01701050 Tabela 3).

A expressão da proteína CTC também foi caracterizada em outros tipos de tumor. Em pacientes com câncer colorretal metastático, a expressão da timidilato sintase em CTCs foi estudada como um marcador potencial de resistência ao 5-fluorouracil (41). Os marcadores imunofluorescentes têm sido usados ​​para estudar a sinalização do receptor de andrógeno (AR) em CTCs de pacientes com câncer de próstata metastático para adaptar as abordagens de tratamento hormonal (42).

Expressão de RNA em CTCs.

Uma área emergente de investigação é o perfil transcricional de CTCs para ajudar a orientar a seleção de medicamentos em tempo real. Por exemplo, uma razão postulada que os pacientes com câncer de próstata resistente à castração (CRPC) podem não responder a drogas que inibem ou prejudicam a sinalização de AR pode ser a presença de variantes de splice de AR em suas células tumorais. Isso foi demonstrado pelo exame de mRNA de CTCs coletados prospectivamente de pacientes com CRPC metastático que foram inscritos em um ensaio clínico de tratamento com abiraterona ou enzalutamida. Quando o mRNA de CTC foi testado para a variante de splice AR-V7, uma isoforma constitutivamente ativa do AR que não possui o domínio de ligação ao ligante, houve uma associação significativa com a resistência terapêutica à abiraterona e enzalutamida, drogas que indiretamente (abiraterona) ou diretamente ( enzulatamida) direcionar o AR, onde este domínio de ligação ao ligante está presente (43).

No entanto, um desafio importante com a análise de expressão de RNA de frações celulares enriquecidas com CTC é o sinal potencialmente confuso de leucócitos contaminantes. Para enfrentar esse desafio, a PCR multiplex com mRNAs específicos de CTC (44-46) e abordagens de célula única estão sendo exploradas. O perfil transcricional de célula única de alta dimensão de CTCs purificados usando o MagSweeper, uma tecnologia de enriquecimento imunomagnético (47), revelou heterogeneidade CTC significativa, mesmo dentro da mesma coleta de sangue, sugerindo a necessidade de terapia multidroga para abordar a diversidade molecular do tumor (8). É importante ressaltar que as CTCs também mostraram perfis de expressão gênica marcadamente diferentes em comparação com aqueles em células únicas de linhas de células de câncer de mama, sugerindo que a análise de CTC pode complementar a análise de linha celular no desenvolvimento de drogas. Da mesma forma, o câncer de próstata também parece ser caracterizado pela heterogeneidade de CTC, com diferenças distintas na expressão de uma única célula de genes relacionados a EMT entre CTCs de cânceres sensíveis à castração e resistentes à castração (48).

Aberrações de DNA em CTCs.

Vários estudos de prova de conceito demonstraram a viabilidade de detectar mutações somáticas específicas ou outras alterações genéticas em CTCs agrupadas ou únicas de pacientes com vários tipos de tumor (49–54). Além disso, as abordagens não direcionadas estão agora sendo usadas para analisar aberrações de número de cópias do genoma inteiro em CTCs individuais por hibridização genômica comparativa de matriz (aCGH) e técnicas de NGS (55-57), incluindo sequenciamento de todo o exoma de CTCs únicos (58).

Um desafio ao analisar CTCs individuais usando métodos Sanger ou NGS é excluir achados falso-positivos e falso-negativos devido a vieses introduzidos pela amplificação do genoma inteiro. Além disso, ainda não está claro quantas CTCs precisam ser analisadas para capturar a heterogeneidade do tumor o suficiente para prever a eficácia do tratamento.

CTC em vitro e na Vivo modelos para resposta a drogas

CTCs de pacientes foram propagados em vitro por vários grupos. Isso inclui culturas de curto prazo (28 dias ou menos) de CTCs de pacientes com câncer de mama, colorretal, mesotelioma pleural, próstata, urotelial, bexiga, esofágico, pancreático, gástrico e de pulmão (59-70) e culturas de longo prazo ( 6–24 meses) de CTCs de pacientes com câncer de mama, próstata e colorretal (71–74). O propósito de tais sistemas modelo seria estudar a resposta ao medicamento ou, em um estudo, identificar clusters de multicamadas, que se aparecerem em cultura no dia 14, podem ser um preditor precoce de resistência à terapia (70).

Vários estudos recentes relataram o desenvolvimento de xenoenxertos de camundongos gerados diretamente de CTCs ou de culturas de CTC de pacientes com câncer de mama avançado, colorretal, de próstata, hepatocelular, pulmão de pequenas células e gástrico (68, 72, 74-79). Alguns desses ensaios exploram subpopulações metastáticas de CTCs e outros geram modelos específicos do paciente para orientar o tratamento.

Em um ensaio de xenoenxerto de CTCs de câncer de mama luminal, foi demonstrado que, em contraste com EPCAM + CTCs em massa, uma subpopulação EPCAM + CD44 + CD47 + MET + CTC é altamente enriquecida em células iniciadoras de metástase quando injetada na medula óssea de imunocomprometidos camundongos (75). Em outro estudo, um subconjunto de CTCs EpCAM-negativas retiradas do sangue periférico de pacientes com câncer de mama (EpCAM - / ALDH1 + / CD45 -) foi cultivado em vitro. Enquanto todas as CTCs EpCAM-negativas cultivadas em cultura causaram metástases pulmonares após a veia da cauda ou injeção intracardíaca, apenas as células enriquecidas por uma assinatura de "marcador selecionado de metástase cerebral (BMSM)", HER2 + / EGFR + / HPSE + / Notch1 +, mostraram potencial aumentado para metástases pulmonares e cerebrais (71).

As CTCs enriquecidas com sangue de pacientes com câncer de pulmão de pequenas células foram implantadas por via subcutânea em camundongos imunocomprometidos como explantes derivados de CTC (CDX). As CTCs eram tumorigênicas quando havia mais de 400 CTCs em 7,5 mL de CDX gerado pelo sangue, não apenas exibindo perfis genômicos semelhantes aos das CTCs dos pacientes, mas refletindo com precisão a resposta do paciente doador à quimioterapia com cisplatina / etoposídeo (78). Xenoenxertos derivados de linhas de células CTC também podem ser usados ​​para testar a eficácia de diferentes combinações de drogas (68, 72). Esses estudos abrem possibilidades estimulantes para o uso da genotipagem CTC e testes funcionais para identificar combinações racionais de medicamentos para avaliação clínica.

Limitações potenciais, no entanto, de em vitro e na Vivo modelos são que eles são geralmente gerados a partir de subclones tumorais altamente agressivos que podem não refletir com precisão o espectro de heterogeneidade das células tumorais e, talvez mais importante na era atual da crescente imunoterapia contra o câncer, na Vivo os modelos de xenoenxerto não recapitulam as interações tumor-hospedeiro que podem desempenhar um papel na resistência aos medicamentos. Trabalho adicional é necessário para otimizar as condições experimentais para geração eficiente desses modelos da maioria dos pacientes com câncer metastático e para demonstrar que os resultados desses modelos refletem com precisão os resultados no ambiente clínico.

CTCs e propensão para colonização metastática

Uma variedade de marcadores mesenquimais foram identificados em CTCs, sugerindo um fenótipo EMT (8, 80-82) que pode contribuir para a progressão metastática. Plastin3 (codificado por PLS3 gene), uma proteína de ligação / empacotamento de actina, foi identificada em tumores e CTCs de pacientes com câncer colorretal primário e metastático, com maior expressão em tumores avançados e metastáticos. CTCs que expressam plastina 3 mostram um fenótipo EMT e estão associadas a prognóstico ruim (83).

Embora a maioria das CTCs sejam únicas, grupos de CTC também foram identificados em amostras de sangue de pacientes com câncer metastático. Também conhecidos como microêmbolos tumorais circulantes, aglomerados capturados imunomagneticamente usando a plataforma CELLSEARCH foram identificados em mais de 30% dos pacientes com câncer de pulmão de células pequenas e parecem não ter células apoptóticas ou em proliferação, talvez oferecendo uma vantagem de sobrevivência (84). O uso de um novo dispositivo, o Cluster-Chip, oferece isolamento sem etiqueta de clusters CTC com o uso de pilares triangulares que atuam como “armadilhas de cluster” microfluídicas (85). Este método mostrou que os clusters foram identificados em 30% a 40% dos pacientes com melanoma metastático, câncer de mama e câncer de próstata, com a maioria dos clusters contendo 2 a 10 células, embora às vezes até 19 células. No entanto, em contraste com os clusters CTC isolados por CELLSEARCH em câncer de pulmão de pequenas células metastático, cerca de metade das CTCs dentro dos clusters isolados pelo Cluster-Chip no câncer de mama metastático estavam proliferando.

Semelhante a CTCs de tipo mesenquimal migratório único, os agrupamentos de CTC parecem ser enriquecidos para marcadores mesenquimais (82, 86). Postula-se que os agrupamentos CTC podem surgir de grupos de células tumorais oligoclonais com alto potencial metastático e que a EMT nos agrupamentos CTC pode ser mediada através da sinalização de TGFβ por plaquetas anexadas a esses agrupamentos (refs. 82, 87, 88 Fig. 1).

CTCs únicos versus diferentes tipos de clusters CTC. Seu potencial para colonização permanece uma questão de pesquisa aberta.

Além das CTCs, um interesse crescente tem sido expresso no papel das células estromais circulantes e macrófagos na progressão metastática. Em modelos de camundongo, as células tumorais que entram na circulação junto com as células estromais derivadas de tumor primário têm uma vantagem de sobrevivência em comparação com CTCs individuais e são mais eficientes na formação de metástases pulmonares (89). Da mesma forma, as células semelhantes a macrófagos associados ao câncer circulante de pacientes com cânceres de mama, próstata e pancreáticos metastáticos podem se disseminar para a circulação e interagir com CTCs (90), com algumas observadas a migrar ligadas a CTCs, potencialmente facilitando a colonização distante e a neovascularização. Os agrupamentos de CTC podem expressar marcadores associados a transcritos de plaquetas e / ou macrófagos derivados de tecidos, mas não células T / B / natural killer (NK) (85). Refinamentos em nossa capacidade de interrogar CTCs e células associadas podem permitir o desenvolvimento clínico mais rápido de agentes direcionados que podem afetar a cascata metastática.


Circulating Tumor Cell vs Circulating Tumor DNA - Biology

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Conclusão

Demonstramos que as alterações iniciais no ctDNA estão associadas a respostas tumorais radiológicas posteriores e que a medição serial do ctDNA tem um potencial significativo para antecipar a avaliação da doença baseada no RECIST padrão, levando a um impacto clínico imediato. Além disso, a detecção e a dinâmica do ctDNA, no dia 30, são fatores prognósticos para PFS. As conclusões tiradas neste estudo exploratório precisam ser confirmadas em coortes maiores. Um grande ensaio randomizado, PADA-1 (NCT03079011), está testando atualmente a utilidade da detecção de subclones resistentes em tempo real em ctDNA de ER + HER2− MBC tratado com palbociclib e inibidor de aromatase. A amostragem em série para análise de ctDNA deve, portanto, ser incorporada em futuros ensaios clínicos para fornecer uma avaliação mais robusta deste biomarcador promissor.


Informação prognóstica

As CTCs podem ser consideradas as sementes para a disseminação à distância de vários tipos de câncer. É relatado que apenas cerca de 2,5% das CTCs resultariam em micrometástases e apenas 0,01% finalmente se desenvolveriam em macrometástases que levariam à recorrência da doença e mortalidade [81, 82]. Portanto, a sobrevivência livre de progresso seria um indicador direto da função dessas CTCs [83].Alguns estudos encontraram relação entre a enumeração de CTC e as informações de prognóstico do câncer pancreático [31, 32, 63, 84], enquanto outros não [57, 60, 62]. Uma meta-análise recente incluindo 623 pacientes com câncer de pâncreas revelou que os pacientes com CTC positivo tiveram pior sobrevida livre de progresso (HR = 1,23, IC 95% = 0,88-2,08, P & # 600,001) e sobrevida geral (HR = 1,89, 95% CI = 1,25-4,00, P & # 600,001) [85]. As discrepâncias nas informações de prognóstico levantam a questão de saber se essas células isoladas têm características biológicas malignas ou se são apenas a ponta do iceberg [10]. Por exemplo, um pequeno estudo piloto validou que EpCAM + CTCs indicaram um resultado ruim entre pacientes com câncer, enquanto que EpCAM - CTCs não foi associado a uma sobrevida global pobre, portanto, uma série de análises deve ser realizada para estudar a tumorigeneidade dessas células isoladas em vários níveis para fornecer explicações detalhadas de informações prognósticas [86, 87].


1. INTRODUÇÃO

O câncer de cabeça e pescoço continua a representar um significativo fardo global de doenças. 1, 2 É preocupante o aumento da incidência e mortalidade do câncer de cabeça e pescoço, com um aumento maior nos países em desenvolvimento e um aumento contrastante do câncer de orofaringe nos países desenvolvidos. 1, 2 Embora vários cânceres tenham biomarcadores que podem diagnosticar a doença e monitorar a carga tumoral pré-tratamento e pós-tratamento, por exemplo, antígeno específico da próstata no câncer de próstata ou antígeno carcinoma (CA19-9) no câncer de pâncreas, o câncer de cabeça e pescoço não tem tal teste . Assim, a vigilância do câncer de cabeça e pescoço depende de achados clínicos e radiológicos. 3 Os pacientes frequentemente apresentam doença em estágio avançado e as características de invasão e metástase precoces criam morbidade significativa e impacto na qualidade de vida. 4 Por essas razões, apesar dos avanços no tratamento, a sobrevida em 5 anos do câncer de cabeça e pescoço permanece em torno de 60%, o que só melhorou ligeiramente nas últimas décadas. 5

Usando um exame de sangue, os marcadores bioquímicos moleculares circulantes no câncer de cabeça e pescoço prometem melhorar o diagnóstico, o planejamento, o monitoramento do tratamento e a vigilância. 6 Um exame de sangue apresenta pouca morbidade, pode ser repetido em vários momentos durante o tratamento e tem boa relação custo-benefício. Um desses biomarcadores sugeridos é o nível de DNA tumoral circulante (ctDNA). 7 A descoberta de que uma proporção do DNA circulante em pacientes com câncer pode ser derivada de tumor criou o potencial para uma chamada “biópsia líquida”, como uma alternativa à biópsia de tecido, para caracterizar as características genéticas do tumor. 8, 9

Esta revisão fornece uma introdução à estrutura biológica e função do DNA circulante. Discutimos seu uso como um biomarcador de carga tumoral e a utilização potencial de ctDNA como uma biópsia líquida em carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (CECP) para identificar a heterogeneidade genética do tumor. Nós nos concentramos deliberadamente em HNSCC e uma biópsia líquida baseada em ctDNA. Embora esteja além do escopo deste artigo, os autores devem estar cientes de outros componentes circulantes que estão sob investigação para uso como uma potencial biópsia líquida no câncer de cabeça e pescoço. Por exemplo, células tumorais circulantes (CTCs) 8 ou DNA viral circulante, tais como DNA do vírus do papiloma humano no carcinoma orofaríngeo 10 e DNA do vírus Epstein-Barr plasmático no carcinoma nasofaríngeo. 11

1.1 DNA circulante do tumor

O DNA circulante é o DNA extracelular encontrado no sangue circulante, identificado pela primeira vez em 1948. 12 Esse DNA é liberado na circulação por mecanismos patogênicos e fisiológicos, incluindo apoptose, necrose celular, fagocitose ou exocitose. 13 Normalmente, o DNA circulante é rapidamente degradado pelas nucleases do sangue e eliminado pelo fígado, baço e rins e tem meia-vida curta, de cerca de 10 a 15 minutos. 13 Portanto, doenças sistêmicas, como doenças hepáticas ou renais, podem impactar os níveis de ctDNA e, potencialmente, influenciar a interpretação dos resultados sanguíneos. 14 O CtDNA está presente em muitas formas: DNA livre, ligado a complexos de proteínas, ligado à superfície celular ou em vesículas (corpos apoptóticos, microvesículas e exossomos). 13

Em 1977, Leon e cols. 15 foram os primeiros a identificar que pacientes com câncer apresentavam níveis elevados de fragmentos de DNA circulantes, levantando a hipótese de que os tumores liberavam DNA para a corrente sanguínea. Em 1989, Stroun e cols. 16 conseguiram demonstrar que uma porção desses fragmentos de DNA era de fato de origem tumoral devido à presença de instabilidade do genoma, e então, em 1994, Sorenson e cols. 17 demonstraram a presença de ponto tumor-específico mutações no KRAS gene em ctDNA. A presença de alterações genômicas específicas do câncer (por exemplo, mutações pontuais) permite a diferenciação entre ctDNA e DNA de células saudáveis ​​normais. 9, 13 Um fator discriminante adicional é a diferença no comprimento do par de bases do fragmento de DNA. A apoptose celular cria fragmentos de DNA de cerca de 100 a 200 pares de bases, enquanto a necrose, devido à digestão mais irregular, cria fragmentos maiores, às vezes com muitos pares de quilo-bases. 13, 18

A concentração de DNA circulante em pacientes de controle saudáveis ​​é geralmente muito baixa, na região de & lt5 ng / mL, enquanto os pacientes com câncer podem ter níveis elevados de várias centenas de ng / mL. 13, 18 O aumento do ctDNA em pacientes com câncer e a origem exata do ctDNA permanecem controversos. À medida que o tamanho do tumor aumenta, ultrapassando o suprimento metabólico, a hipóxia do tecido causa necrose celular, descamação de células tumorais e, portanto, liberação de ctDNA. 13, 18 As CTCs não são discutidas nesta revisão, mas, em teoria, a lise dessas células na circulação também pode contribuir para o ctDNA, embora as evidências sejam contraditórias. 10

Não está claro se o ctDNA tem um papel ativo na carcinogênese ou se é apenas um subproduto da eliminação do tumor. García-Olmo e cols. 19 foram um dos primeiros grupos a descrever o conceito de que o ctDNA poderia causar metástases de câncer por transfecção de células saudáveis. Eles foram capazes de induzir tumores em ratos saudáveis ​​usando plasma de ratos com tumor. O mesmo grupo demonstrou posteriormente que o soro de pacientes com câncer colorretal induziu a formação de tumor em células cultivadas in vitro. 20

Os métodos laboratoriais de detecção e análise de ctDNA mudaram muito nas últimas décadas, com o desenvolvimento do sequenciamento digital de próxima geração (NGS). O método predominante para a análise de ctDNA é através da amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) de alvos genéticos de ctDNA seguida por análise downstream. Uma variedade de métodos é usada para a detecção sensível de mutações pontuais, incluindo PCR em tempo real, PCR digital de gotículas e sequência do tipo Sanger. Para um perfil molecular mais abrangente do genoma do tumor circulante, métodos de amplificação do genoma completo (como a amplificação de deslocamento múltiplo ou amplificação de hexâmero aleatório) podem ser usados ​​para amplificar a entrada de ctDNA limitada seguida pela preparação da biblioteca e sequenciamento. 21 Como pode ser visto, o protocolo para a coleta e análise de um ensaio de biópsia líquida é complexo e ainda não padronizado em sua abordagem, com um grande obstáculo sendo a sensibilidade e a taxa de erro do NGS para ctDNA. 14, 21

1.2 Aplicações clínicas do DNA tumoral circulante

Com vários pontos finais de dados descritos em estudos de ctDNA, é útil esclarecer como cada um deles teria impacto na prática clínica. Na literatura anterior, os termos “biomarcador” e “biópsia líquida” às vezes foram usados ​​indistintamente. Nesta revisão, separamos deliberadamente os termos biomarcador e biópsia líquida para evitar confusão. Ao contrário de uma biópsia estática que determina as características do tumor, um biomarcador deve ser um teste objetivo e quantitativo de progressão e resultado da doença. 22 Discutimos a aplicação clínica da análise de ctDNA em 2 grandes categorias: (1) um biomarcador para avaliar a carga tumoral e (2) uma biópsia líquida para determinar a heterogeneidade genética do tumor (Tabela 1).

Biomarcador Biópsia líquida
Pré-tratamento
Ferramenta de triagem de diagnóstico Genotipagem de tumor para determinar mutações condutoras e facilitar a terapia anticâncer molecular direcionada
Diagnóstico em casos incertos
Justificativa para o protocolo de tratamento (ou seja, esvaziamento cervical em pescoço com nódulo negativo)
Avaliação inicial da carga tumoral para comparação pós-tratamento
Pós tratamento
Avalie a doença residual na fase de pós-tratamento imediato Monitore a evolução clonal e avalie as mutações do driver de resistência em câncer recorrente
Fornecer análise de risco para a decisão de administrar quimiorradioterapia adjuvante
Vigilância para recorrência loco-regional

1.3 Biomarcador de carga tumoral

Até o momento, o uso de ctDNA para avaliar a carga tumoral de HNSCC tem se concentrado em 2 áreas: concentração total de ctDNA e a detecção de ctDNA como uma ferramenta no diagnóstico e marcador de prognóstico. O uso de uma biópsia líquida de ctDNA como uma ferramenta de triagem não invasiva é uma proposta interessante e está atualmente sob investigação. Como acontece com todas as ferramentas de triagem, as demandas técnicas e clínicas de criar um teste sensível e específico baseado em ctDNA são imensas. No entanto, o desenvolvimento da tecnologia NGS de baixo custo e a análise de dados de bioinformática complexa tornam este conceito uma potencial realidade futura. 23 A aplicação imediata de ctDNA como biomarcador na fase de pré-tratamento provavelmente será para aqueles pacientes nos quais há alto risco ou incerteza diagnóstica. Por exemplo, o monitoramento de lesões pré-malignas nas quais o melhor curso de tratamento ainda é debatido ou quando uma biópsia pode ignorar a malignidade potencial em uma lesão displásica grave. 24 Na fase pós-tratamento, a alta sensibilidade do ctDNA representa uma oportunidade real para o primeiro biomarcador em HNSCC avaliar a presença de doença residual ou recorrência loco-regional.

1.4 Níveis circulantes de DNA tumoral e detecção em pacientes com câncer

Conforme discutido, a descoberta de que a concentração total de DNA circulante foi aumentada em pacientes com câncer foi a base da hipótese de que parte desse DNA pode ser de origem tumoral. No entanto, a concentração total de ctDNA, independentemente da análise genômica do ctDNA subsequente, também pode ser usada como uma ferramenta de diagnóstico e prognóstico. Mazurek e cols. 25 avaliaram os níveis de DNA circulante total em 200 pacientes com CECP quando comparados a um grupo controle de 15 pacientes. Os níveis médios de DNA total foram maiores no grupo HNSCC, mas não até níveis significativos. De interesse, SCCs orofaríngeos tinham níveis significativamente mais elevados de ctDNA (P = 0,011) do que outros HNSCCs (nasofaringe, hipofaringe e laringe). Eles também demonstraram uma relação significativa entre o estado nodal (N0-1 vs N2-3), estágio (I-III vs IV) e idade (& lt63 e & gt63) com o aumento das concentrações de ctDNA.

Para ser usado como um biomarcador, a detecção de ctDNA deve ser um teste sensível para HNSCC e se correlacionar com a gravidade da doença. No maior estudo até o momento, Bettegowda e cols. 26 avaliaram a detecção de ctDNA em 359 pacientes com 15 vários tipos de câncer. Eles dividiram os pacientes em aqueles com doença localizada (n = 136) e aqueles com doença metastática (n = 223), infelizmente, o número de casos de câncer de cabeça e pescoço foi relativamente baixo (n = 12). No grupo de doença metastática, o ctDNA foi detectado em 82% dos pacientes, em contraste com 55% no grupo de doença localizada. Ao avaliar o ctDNA como uma ferramenta de prognóstico, comparando os grupos metastático e localizado em cânceres com números suficientes (colorretal, gastroesofágico, pâncreas e mama), houve uma relação significativa (P & lt .001) e também uma tendência clara em relação ao estágio avançado da doença e ao aumento da quantidade de ctDNA.

1.5 Vigilância pós-tratamento

A capacidade de usar ctDNA como um biomarcador de recorrência da doença na fase de vigilância pós-tratamento é indiscutivelmente mais valiosa do que seus méritos diagnósticos. 27 Dada a dependência de testes clínicos e radiográficos pouco sensíveis, um biomarcador da carga tumoral pós-tratamento seria uma ferramenta valiosa. 3 O estudo de van Ginkel e cols. 27 discutiu o papel do ctDNA na vigilância do câncer de cabeça e pescoço e propôs um fluxo de trabalho de como isso seria aplicado à prática clínica. Estudos em câncer de mama, colorretal, pulmão e vários outros cânceres demonstraram a aplicação clínica do ctDNA. 8, 9, 13 Em um estudo com 18 pacientes com câncer colorretal, Diehl e cols. 28 foram capazes de correlacionar diretamente a detecção de ctDNA e os níveis flutuantes com o tratamento pós-cirúrgico de sobrevida livre de recorrência (P = 0,006). Todos, exceto 1 dos pacientes que tinham ctDNA detectável no pós-operatório experimentaram recorrência e nenhum dos pacientes com ctDNA indetectável experimentou recorrência. Eles foram capazes de representar graficamente representações gráficas dos níveis de ctDNA ao longo do tempo para fornecer uma representação precisa da "carga dinâmica do tumor pessoal". Em um estudo semelhante, Dawson e cols. 29 compararam ctDNA a CTCs e antígeno de carcinoma (CA15-3) em 30 pacientes com câncer de mama metastático em tratamento. O ctDNA foi estatisticamente mais sensível do que CTCs ou antígeno de carcinoma (CA15-3) para medir a resposta ao tratamento (P & lt .002) e foi um marcador significativo de sobrevivência (P & lt .001).

Em um estudo com 47 pacientes com CECP, Wang e cols. 30 conseguiram coletar amostras de tratamento pós-cirúrgico de 9 pacientes. Em 3 pacientes que desenvolveram doença recorrente, a presença de ctDNA no plasma antecedeu a evidência clínica / radiográfica de recorrência em 15 meses, 9 meses e & lt1 mês. Dos 5 pacientes com resultados de ctDNA negativos, todos estavam sem recorrência em um seguimento médio de 12 meses. 30 Hamana e cols. 31 compararam a detecção de ctDNA em 64 pacientes com CEC oral no pré e pós-operatório. Quarenta e quatro por cento dos pacientes (28/64) demonstraram ctDNA com alterações de microssatélites tumor-específicas no pré-operatório e isso caiu para 20% (13/64) no pós-operatório. Dos 28 pacientes pré-operatórios com ctDNA detectável, 20 não tinham ctDNA detectável no pós-operatório e todos esses pacientes estavam livres de doença e sem recorrência. Quatro dos pacientes com ctDNA detectável em 4 semanas na fase pós-operatória imediata desenvolveram metástases à distância. Neste estudo, a presença de cDNA foi estatisticamente correlacionada à doença em estágio inicial (I / II) versus estágio tardio (III / IV) (P = .0378).

1.6 Biópsia líquida para avaliar a heterogeneidade genética do tumor

A capacidade de identificar mutações condutoras e modificações epigenéticas de um tumor é uma etapa importante na implementação da terapia direcionada e na melhoria dos resultados em pacientes com câncer de cabeça e pescoço. Como o HNSCC mostra considerável heterogeneidade genética do tumor, isso significa que diferentes partes do tumor podem ter diferentes mutações. 32 O conhecimento de todas as importantes mutações “condutoras” de um tumor é necessário para poder fornecer o tratamento direcionado para aquele tumor. O uso atual da biópsia de tecido como técnica diagnóstica é uma grande deficiência a esse respeito. Uma biópsia de tecido captura 1 ou 2 partes de um tumor e, portanto, apresenta alto risco de viés e perda de mutações importantes devido à heterogeneidade intratumoral, juntamente com a natureza invasiva e morbidade do próprio procedimento. 27 Em contraste com a “biópsia estática” obtida de amostras de tecido, a capacidade de coletar várias biópsias líquidas em diferentes momentos durante o tratamento cria a realidade de uma “biópsia dinâmica” para detectar a evolução clonal do tumor e identificar recorrência ou resistência ao tratamento. Isso permitiria o potencial de monitoramento em tempo real da progressão mutacional genética do câncer e a adaptação da terapia molecular direcionada personalizada. Estudos recentes em câncer de cabeça e pescoço têm se concentrado na identificação de alterações genômicas específicas de tumor no ctDNA. Discutimos cada alteração genômica aplicável, por sua vez.

1.7 Mutações

Lebofsky e cols. 33 investigaram mutações tumor-específicas no ctDNA de 34 pacientes com 18 vários tipos de câncer metastático (câncer de cabeça e pescoço = 5). Em 27 pacientes, as mutações do ctDNA foram semelhantes às das biópsias de tumor sólido. No estudo já citado com 47 pacientes com CECP por Wang et al, 30 eles foram capazes de detectar ctDNA plasmático com mutações pontuais tumorais em 87% dos casos. Eles avaliaram a presença de mutações em 6 genes (TP53, PIK3CA, CDKN2A, FBXW7, HRAS, NRAS, e E7 DNA [papilomavírus humano]) frequentemente associado a HNSCC (& gt85% tinha mutações TP53). A maioria dos pacientes tinha doença avançada (estágio III ou IV). Quando eles combinaram os achados do plasma com a detecção de fragmentos de DNA descamados na saliva, isso aumentou a sensibilidade diagnóstica para 96%. Digno de nota, houve pouca variação nas taxas de detecção de plasma entre os locais (80% cavidade oral, 91% orofaringe, 86% laringe e 100% hipofaringe). Como esperado, a detecção de DNA salivar foi significativamente maior em tumores da cavidade oral (100%) quando comparada com outros locais (47% -70%). Embora a frequência de mutação tenha sido maior com a doença em estágio avançado (70% vs 92%), isso não teve significância estatística. Eles concluíram que a combinação de detecção de DNA em 2 compartimentos (plasma e saliva) foi uma ferramenta valiosa para aumentar a sensibilidade.

1.8 Alterações de microssatélites

As alterações de microssatélites incluem instabilidade de microssatélites (MSI) e perda de heterozigosidade (LOH). Microssatélites são seções de DNA com motivos de pares de bases curtos (geralmente 1-6 pares de bases de comprimento) repetidos de 5 a 100 vezes. Em resumo, eles significam um sistema de reparo de incompatibilidade defeituoso, que por sua vez é um marcador de mutações em genes de reparo de DNA. 34 Existem fortes evidências do papel do MSI no câncer colorretal como um marcador de prognóstico e sobrevida, mas o papel do MSI no câncer de cabeça e pescoço não está claro. 34 Alguns estudos não relatam nenhuma relação, enquanto outros relataram um MSI positivo conferindo um melhor prognóstico. O LOH é o resultado da perda de uma cópia de um gene diplóide e é um mecanismo comum de inativação de genes supressores de tumor. Em uma revisão recente de De Schutter et al.34, eles destacaram o LOH como um marcador preditivo prognóstico mais útil do que o MSI, devido em parte a uma maior frequência de LOH em comparação com o MSI em HNSCC. O LOH está associado à doença avançada de alto grau e é um indicador prognóstico negativo de sobrevida, 35 com evidências sugeridas de uma correlação com a resistência à quimioterapia. 36

Alguns dos primeiros trabalhos para identificar alterações genômicas específicas do tumor HNSCC no ctDNA foram realizados por Nawroz et al. 37 Em uma coorte de 21 pacientes, eles identificaram alterações de microssatélites no ctDNA de 6 pacientes com CECP. Todos os 6 pacientes tinham doença avançada (estágio III-IV) e 5 tinham metástases nodais. O mesmo grupo acompanhou esses achados preliminares com um estudo maior de 152 pacientes com HNSCC. 38 Quarenta e cinco por cento dos pacientes (68/152) tinham alterações de microssatélites tumor-específicas no ctDNA, com 84% da coorte apresentando doença em estágio avançado ou recorrente (127/152). Aqueles com doença em estágio avançado e metástases nodais tiveram uma taxa positiva maior de alterações de microssatélites do que aqueles com câncer em estágio inicial. Digno de nota, houve um salto óbvio na detecção da doença em estágio I para II (17% vs 47%) quando comparada com a doença em estágio III e IV (52% e 44%).Com um período de acompanhamento médio de 27 meses, a sobrevida livre de doença diminuiu no grupo de detecção de ctDNA positivo, mas não com significância estatística.

1.9 Hipermetilação do gene supressor de tumor

O silenciamento de genes supressores de tumor por meio da hipermetilação de suas regiões promotoras é um mecanismo de supressão gênica envolvido na carcinogênese. 39 Esse fenômeno epigenético de hipermetilação foi investigado e validado no CECP, com uma série de genes supressores de tumor implicados como alvos potenciais. 39 A detecção de hipermetilação do ctDNA é, portanto, outra potencial aplicação prognóstica no CECP.

Mydlarz e cols. 40 avaliaram o estado de metilação de 100 pacientes com CECP quando comparados a um grupo controle de 50 pacientes. Eles examinaram especificamente a hipermetilação do EDNRB, DCC, e p16 (CDKN2A) genes. Dez pacientes (10%) exibiram EDNRB hipermetilação, 2 desses pacientes tinham DCC hipermetilação, e 1 desses 2 pacientes também tinha hipermetilação de p16. Foi estatisticamente significativo que as amostras de HNSCC tinham EDNRB amplificação quando comparado ao grupo de controle (P = .02) mas não com o DCC ou genes p16. É difícil determinar a utilidade clínica desses dados. A detecção de regiões hipermetiladas no ctDNA é altamente específica para o diagnóstico de HNSCC, mas a sensibilidade é baixa. Além disso, com dezenas de genes supressores de tumor implicados no HNSCC, 39 um ensaio com a especificidade diagnóstica a ser usado como ferramenta de triagem diagnóstica precisaria avaliar cada um desses genes individualmente. Uma solução é realizar uma análise genômica da metilação do DNA, que é uma técnica sob investigação. 41

1.10 Futuras perguntas a serem respondidas sobre o DNA tumoral circulante

Para que o ctDNA seja usado como biomarcador e biópsia líquida, a quantificação dos níveis de ctDNA por meio da detecção de alterações genômicas deve ser padronizada e validada no HNSCC. Uma investigação padrão-ouro precisaria levar em consideração fatores do paciente, tumor, procedimento e tratamento para produzir uma determinação ajustada ao risco do prognóstico e heterogeneidade do tumor (Figura 1). Infelizmente, cada um desses fatores tem perguntas de pesquisa sem resposta.

Um desafio significativo é a harmonização da metodologia usada para detectar e analisar ctDNA. 8, 9 Aqui reside o problema de criar um biomarcador / ensaio de biópsia líquida validado e universalmente aceito com parâmetros definidos que podem ser reproduzidos por diferentes instituições. Além disso, a carga de ctDNA mutacional parece variar muito entre o tipo e o local do tumor, 18, 26, 33 e o estágio da doença ou terapia pode nem sempre se correlacionar com os níveis de ctDNA. 18 Por exemplo, Mazurek e cols. 25 observaram que o SCC orofaríngeo tinha níveis significativamente maiores de ctDNA do que outros locais de HNSCC; a causa disso é desconhecida, mas presumivelmente a biologia tumoral individual tem um impacto. Thierry e cols. 13 observaram que a cinética de crescimento do tumor e a variação na proliferação celular e nos fatores de perda celular terão impacto sobre os níveis de ctDNA. Além disso, o impacto de fatores sistêmicos (comorbidades, idade e tabagismo) sobre os níveis e depuração do DNA circulante não é totalmente compreendido. A capacidade de quantificar os fatores acima e aplicar esses cálculos a amostras individuais de pacientes permanece uma tarefa sem resposta.


Contribuições do autor

Concepção / Design: Melody J. Xu, Jay F. Dorsey, Ravi Amaravadi, Giorgos Karakousis, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Lynn Schuchter, Gary D. Kao

Fornecimento de material de estudo ou pacientes: Melody J. Xu, Jay F. Dorsey, Lynn Schuchter

Coleta e / ou montagem de dados: Melody J. Xu, Jay F. Dorsey, Ravi Amaravadi, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Wei Xu, Erica L. Carpenter, Lynn Schuchter, Gary D. Kao

Análise e interpretação dos dados: Melody J. Xu, Jay F. Dorsey, Ravi Amaravadi, Giorgos Karakousis, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Wei Xu, Erica L. Carpenter, Lynn Schuchter, Gary D. Kao

Redação do manuscrito: Melody J. Xu, Ravi Amaravadi, Giorgos Karakousis, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Erica L. Carpenter, Gary D. Kao

Aprovação final do manuscrito: Melody J. Xu, Jay F. Dorsey, Ravi Amaravadi, Giorgos Karakousis, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Wei Xu, Erica L. Carpenter, Lynn Schuchter, Gary D. Kao