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Os experimentos em kits ELISA podem ser monitorados por fluorometria e fotometria?

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Em meus slides do curso de bioanalítica, o professor escreveu em um ponto que em um imunoensaio heterogêneo como o ELISA, usamos fluorimetria para medir a concentração de um analito. Em outro slide, é mencionado que usamos fotometria para medir a absorção de UV-vis. Estou confuso ... é um ou outro, ou podemos usar os dois métodos dependendo se a enzima marcadora no anticorpo recebe um substrato fluorescente ou cromogênico?


podemos usar os dois métodos dependendo se a enzima marcadora no anticorpo recebe um substrato fluorescente ou cromogênico?

Isso é essencialmente correto.

Você pode fazer com que o mesmo ELISA funcione em diferentes métodos de detecção. O ELISA mais comum é colorimétrico e funciona ligando um anticorpo secundário conjugado a alguma enzima ao seu anticorpo primário. As plataformas fluorescentes de ELISA são menos difundidas, mas apenas porque o ELISA colorimétrico é conhecido e "padrão ouro".

A peroxidase de rábano (hrp) é um sistema conjugado comum utilizado em ELISAs sanduíche e, ao adicionar solução de TMB aos poços de reação, a reação resultante produz uma diimina que torna o líquido no poço azul, e o faz em proporção à quantidade de analito capturado. Você interrompe a reação adicionando um ácido, que torna o poço amarelo, e você lê a DO a 450 nm (eles também recomendam que você subtraia a DO a 510 nm para contabilizar a dispersão de luz da microplaca).

Figura 1. Ensaios R&D Systems Quantikine, detecção de HRP-estreptavidina. https://www.rndsystems.com/products/quantikine-hs-colorimetric-sandwich-elisas-high-sensitivity

Por outro lado, sabemos que também podemos conjugar o anticorpo com uma molécula fluorescente se quisermos, como FITC ou PE. Tudo o que precisamos fazer é excitar a molécula com uma fonte de luz apropriada ou laser para obter uma emissão fluorescente e ler com um sistema apropriado para ler esses sinais. A intensidade fluorescente seria então proporcional ao analito capturado, com base em uma curva padrão como qualquer ELISA.

Portanto, a verdadeira resposta é que podemos usar um, o outro ou ambos, mas não ao mesmo tempo.

Esteja ciente de que plataformas diferentes podem produzir resultados diferentes, portanto, você deve validar suas duas plataformas e correlacionar as duas para garantir a reprodutibilidade. A maioria dos laboratórios apenas tenta ficar com um ou outro, no entanto.


Estresse oxidativo do ponto de vista de uma célula

A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é uma consequência natural do metabolismo energético aeróbio. O estresse oxidativo ocorre quando a capacidade antioxidante da célula é incapaz de acompanhar a produção de ROS. O estresse oxidativo pode causar danos ao DNA, proteínas e lipídios na célula, e esse dano tem sido relacionado ao envelhecimento, bem como à progressão de doenças como aterosclerose, distúrbios neurodegenerativos e câncer.

Este artigo destaca três produtos fáceis de usar para medir várias formas de estresse oxidativo por microscopia de fluorescência, microscopia de fluorescência quantitativa (ou seja, imagem de alto conteúdo ou HCI), fluorometria de microplaca automatizada e citometria de fluxo. Os reagentes CellROX® são indicadores fluorogênicos para a detecção direta e quantificação de ROS nas células (Tabela 1). O kit de peroxidação lipídica Image-iT® fornece os reagentes e o protocolo para detecção de peroxidação lipídica em tempo real em células vivas. Da mesma forma, o kit de imagem de peroxidação lipídica Click-iT® permite detectar modificações de proteínas derivadas da peroxidação lipídica em células fixas.

Tabela 1. Comparação dos reagentes CellROX® com sensores convencionais de estresse oxidativo fluorogênico.

RecursosCellROX® Green *CellROX® Orange *CellROX® Deep Red *H2DCFDADHE
Ex / Em max (nm) †508/525545/565644/665504/529518/605
Pode ser adicionado à mídia completasimsimsimNãosim
Aldeído corrigívelsimNãosimNãoNão
Resistente ao detergentesimNãoNãoNãoNão
Fotoestável+++++++++N / D
MultiplexávelsimsimsimsimNão‡
Compatibilidade com GFP ou RFPRFPGFPGFP e RFPRFPNem GFP nem RFP
Reagente autônomo - para aplicações de imagem, microplaca e citometria de fluxoC10444
5 x 50 μL
C10443
5 x 50 μL
C10422
5 x 50 μL
D399
100 mg
D23107
1 mL
Kit de citometria de fluxoC10492C10493C10491
* Os três reagentes CellROX® estão disponíveis individualmente ou em embalagens variadas, que fornecem 50 μL de cada reagente. † Excitação e emissão máxima em nm para o reagente oxidado, em alguns casos ligado ao dsDNA. ‡ O espectro de emissão de fluorescência de DHE oxidado ligado ao DNA é muito amplo, tornando difícil a multiplexação com outras sondas fluorescentes. H2DCFDA = diacetato de 2 ', 7' -diclorodi-hidrofluoresceína. DHE = dihidroetídio. NA = dados não disponíveis.

Detectar ROS diretamente em células vivas com reagentes CellROX®

Os reagentes CellROX® que permeiam as células são não fluorescentes (ou muito fracamente fluorescentes) enquanto estão em um estado reduzido e exibem forte fluorescência quando oxidados, tornando-os indicadores diretos e confiáveis ​​de ROS em células vivas (Figura 1). CellROX® Green Reagent é um corante de ácido nucléico modificado que, após oxidação, se liga ao DNA, produzindo um sinal verde fluorescente localizado principalmente no núcleo e na mitocôndria. Em contraste, os sinais fluorescentes dos reagentes CellROX® Deep Red e CellROX® Orange oxidados estão localizados no citoplasma. Os padrões de coloração dos reagentes CellROX® Green e CellROX® Deep Red sobrevivem à fixação de aldeído e todos os três reagentes são mais fotoestáveis ​​do que os indicadores ROS tradicionais (por exemplo, H2DCFDA) (Tabela 1).A disponibilidade de três cores fluorescentes diferentes permite multiplexar os reagentes CellROX® com uma infinidade de outras manchas de células e reagentes de rotulagem.

Os reagentes CellROX® independentes são fornecidos como soluções DMSO prontas para uso. Esses sensores ROS podem ser adicionados diretamente às células em meio de crescimento completo ou tampão. Após uma incubação de 30 minutos e uma breve lavagem, as células estão prontas para análise. A coloração CellROX® é compatível com múltiplas plataformas de análise - incluindo microscopia de fluorescência [1,2], microscopia de fluorescência quantitativa (HCI), fluorometria baseada em microplaca e citometria de fluxo [3,4] - bem como com a família de células EVOS® estações de imagem, o Tali® Image-Based Cytometer e o Attune® Acoustic Focusing Cytometer.

Figura 1. Detecção de ROS com CellROX® Deep Red Reagent. As células BPAE eram (UMA) deixado sem tratamento ou (B) tratado com 100 μM de menadiona, que causa estresse oxidativo, por 1 hora a 37 ° C. (C) O eliminador de superóxido MnTBAP (100 μM) foi adicionado a alguns poços tratados com menadiona nos últimos 30 minutos de incubação. Todas as células foram coradas com CellROX® Deep Red Reagent durante 30 min em meio de crescimento completo a 37 ° C, lavadas com PBS e analisadas num Thermo Scientific® Cellomics® ArrayScan® VTI. A redução do sinal em células tratadas com antioxidantes confirma a detecção de ROS pelo CellROX® Deep Red Reagent.

Novos kits CellROX® validados para citometria de fluxo

Além dos reagentes independentes, desenvolvemos três kits CellROX® validados para uso em citometria de fluxo. Esses kits fornecem um conjunto completo de reagentes para distinguir células com estresse oxidativo, células sem estresse e células mortas (Figura 2), Incluindo:

  • CellROX® Green, CellROX® Orange ou CellROX® Deep Red Reagent
  • Um antioxidante, N-acetilcisteína (NAC), para servir como um controle negativo
  • Um oxidante, tert-butil hidroperóxido (TBHP), para servir como um controle positivo
  • Uma coloração de células mortas SYTOX®, com cor correspondente ao reagente CellROX®

Os kits de ensaio de citometria de fluxo CellROX® contêm reagentes que foram formulados para funcionarem bem em conjunto e exibirem sobreposição mínima com fluoróforos estimulados por outras linhas de laser. Você pode usar esses kits de citometria de fluxo para multiplexar a detecção de estresse oxidativo com outras medidas de estrutura ou função celular, como sondas para potencial de membrana mitocondrial, integridade do citoesqueleto ou apoptose.

Figura 2. Detecção de ROS por citometria de fluxo. (UMA) Os níveis de ROS detectados pelo reagente CellROX® Deep Red (fornecido no kit de ensaio de citometria de fluxo CellROX® Deep Red) são diminuídos em células Jurkat tratadas com oxidante com pré-tratamento de culturas usando N-acetilcisteína (NAC). As células tratadas com o oxidante TBHP (vermelho) mostram aumento da coloração com o CellROX® Deep Red Reagent em comparação com as células pré-tratadas com NAC antes do tratamento com TBHP (azul) e com células de controle não tratadas (verde). (B, C) CellROX® Deep Red Reagent pode ser usado em conjunto com o SYTOX® Blue Dead Cell Stain para diferenciar células vivas estressadas de células mortas. As células Jurkat foram tratadas com (B) PBS ou (C) 200 μM de TBHP por 30 min antes da marcação com o kit de ensaio de citometria de fluxo CellROX® Deep Red. Observe que as células tratadas (C) têm uma porcentagem maior de células sob estresse oxidativo do que o nível basal de ROS observado nas células controle (B).

Monitore células vivas para peroxidação lipídica em tempo real

O kit de peroxidação lipídica Image-iT® fornece um método raciométrico simples para detectar a degradação oxidativa de lipídios celulares em células vivas (Figura 3). Este kit fornece o BODIPY® 581⁄591 C hidrofóbico11 reagente, que atua como um repórter de peroxidação lipídica sensível, bem como hidroperóxido de cumeno para induzir a peroxidação lipídica. BODIPY® 581/591 C11 reagente se localiza nas membranas celulares e exibe uma mudança de emissão de fluorescência de

510 nm após oxidação por hidroperóxidos lipídicos. A proporção de fluorescência vermelha para fluorescência verde fornece uma medida de peroxidação lipídica que é independente de fatores como a densidade lipídica que pode influenciar a medição com sondas de emissão única.

O kit de peroxidação lipídica Image-iT® é fácil de usar - basta adicionar o reagente (fornecido pronto para uso em DMSO) às células vivas em meio completo, incubar por 30 minutos e medir o sinal. Este kit é compatível com microscopia de fluorescência [5,6] incluindo HCI, bem como com citometria de fluxo [7,8].

Figura 3. Quantificação da peroxidação lipídica em células vivas usando o kit de peroxidação lipídica Image-iT®. As células U2OS foram semeadas em placas de fundo de vidro de 35 mm (MatTek) e coradas com 10 μM de BODIPY® 581/591 C11 (fornecido no kit de peroxidação lipídica Image-iT®) por 30 min em meio de crescimento completo a 37 ° C. Quando especificado, as células foram pré-tratadas com 150 μM α-tocoferol (um antioxidante lipossolúvel) por 30 min. As células foram então tratadas com DMSO (controle), 100 μM de menadiona, 200 μM tert-butil hidroperóxido (TBHP), ou 200 μM de hidroperóxido de cumeno (CH) por 2 horas a 37 ° C, todas as células foram coradas com o corante Hoechst® 33342 durante os últimos 30 minutos de incubação. As células foram então lavadas três vezes com PBS e fotografadas em um microscópio invertido Zeiss® Axiovert® usando uma objetiva de 40x e filtros ópticos apropriados. A intensidade do sinal foi quantificada em 510 nm e 590 nm usando o software SlideBook ™ 5.0. Em células de controle, baixos níveis de peroxidação lipídica são indicados por uma proporção relativamente alta de 590/510, refletindo a predominância do corante reduzido. Após o tratamento com menadiona, TBHP e CH, as razões 590/510 diminuíram dramaticamente, indicando oxidação significativa do corante e níveis mais elevados de peroxidação lipídica com α-tocoferol pré-tratamento diminuíram a peroxidação lipídica nas células.

Quantificar modificações de proteínas derivadas de peroxidação lipídica usando química de clique versátil

O kit de imagem de peroxidação lipídica Click-iT® fornece um método baseado em química de clique para detectar e quantificar modificações de proteínas derivadas da peroxidação lipídica em células fixas (Figura 4). Quando incubado com células vivas, Click-iT® LAA (linoleamida alquino, incluído no kit) incorpora-se às membranas celulares. Após a peroxidação lipídica, o LAA ligado à membrana é oxidado e produz ácido 9- e 13-hidroperoxi-octadecadienóico (HPODE). Esses hidroperóxidos se decompõem em aldeídos α, β-insaturados que modificam prontamente as proteínas que os cercam. Uma vez que as células são fixadas, as proteínas contendo alcino resultantes podem ser detectadas por meio de uma reação química de clique com Alexa Fluor® 488 azida (incluída no kit).

Click-iT® LAA também é vendido como um reagente autônomo para permitir a detecção de proteínas contendo alcino em células fixas com qualquer um de vários reagentes de detecção contendo azida. Se a azida Alexa Fluor® 488 fluorescente verde não for compatível com seus experimentos multiplex, você pode escolher uma azida Alexa Fluor® de comprimento de onda mais longo, uma azida de tetrametilrodamina ou uma azida de biotina para detecção. As células coradas podem ser analisadas usando microscopia de fluorescência tradicional ou quantitativa.


Fundo

Vários estudos pré-clínicos nos últimos anos demonstraram sinergia terapêutica entre vetores virais e quimioterapia [1, 2]. Conforme relatado anteriormente, os compostos químicos podem atuar como adjuvantes para as vacinas genéticas aplicadas [3] e / ou podem aumentar a infecciosidade e a eficiência de transferência de genes do vetor viral [4]. Entre os vírus terapêuticos potenciais, os vetores alfavirais são bons candidatos para a terapia do câncer devido ao alto nível de expressão do transgene e sua capacidade de mediar fortes efeitos citotóxicos através da indução de apoptose independente de p53 [5, 6]. As vantagens dos vetores alfavirais também incluem uma baixa resposta imunológica específica contra o próprio vetor, a ausência de pré-imunidade do vetor e um alto nível de biossegurança [7, 8].

Alfavírus são vírus envelopados que pertencem ao Togaviridae família e contêm um genoma de RNA de fita positiva. Os vetores clássicos para a expressão de genes heterólogos foram desenvolvidos principalmente com base nos replicons do vírus Semliki Forest (SFV) e do vírus Sindbis (SIN). Nestes vetores, uma inserção heteróloga substitui os genes estruturais sob o controle do promotor subgenômico viral 26S [9, 10]. O vetor de RNA pode ser empacotado em partículas alfavirais recombinantes em células por meio de co-transfecção com um RNA auxiliar que codifica genes estruturais (capsídeo e envelope). Após a infecção, o vetor de RNA se replica e gera um alto nível de expressão do gene heterólogo. O vetor não pode se propagar porque não possui os genes que codificam as proteínas estruturais virais necessárias. A replicação do genoma alfaviral recombinante, que ocorre na membrana citoplasmática, causa apoptose celular, mesmo na ausência de expressão do gene estrutural viral [11].

Devido à rápida indução de apoptose em células infectadas, o tratamento com vetores alfavirais oncolíticos naturais resulta na regressão do tumor [12-15]. A administração de vetores deficientes em replicação que codificam genes repórter ou imunomoduladores, como citocinas ou fatores de crescimento, também foi demonstrada. Isso leva a uma inibição tumoral bem-sucedida ou regressão completa em modelos animais [16-19]. No entanto, a aplicação da terapia imunogênica alfaviral em um estudo clínico usando o vírus da encefalite equina venezuelana (VEE) (VEE / CEA) na fase I / II demonstrou eficácia antitumoral insuficiente em pacientes, provavelmente devido à indução ineficiente de antitumoral respostas imunes em pacientes com doença em estágio terminal [20]. Além disso, os vetores alfavirais foram administrados a pacientes após o tratamento padrão (geralmente quimioterapia), o que pode reduzir significativamente a eficiência da infecção por alfavírus e expressão do transgene. Notavelmente, a maioria dos estudos pré-clínicos bem-sucedidos usando vetores alfavirais foi realizada em modelos de câncer em animais que não envolviam pré-tratamento com drogas químicas. Portanto, o efeito da quimioterapia combinada e da terapia alfaviral não foi estudado de forma abrangente.

A eficácia da viroterapia depende do direcionamento específico do tumor e do nível de replicação viral [21]. Foi relatado que a aplicação de drogas químicas clássicas, por exemplo, 5-fluorouracil (5-FU) e gencitabina, em combinação com herpes oncolítico ou vetores adenovirais tornam as células cancerosas mais propensas à infecção e replicação do vírus [4, 22], portanto aumentando os efeitos terapêuticos do vetor viral. Alternativamente, os vírus podem melhorar os resultados da quimioterapia. Por exemplo, o vírus da doença de Newcastle demonstrou auxiliar na superação da resistência à cisplatina em um modelo de camundongo com câncer de pulmão [23]. Além disso, o uso do vírus herpes simplex após o tratamento com doxorrubicina demonstrou erradicar as células-tronco cancerígenas quimiorresistentes em um modelo de câncer de mama murino [24]. Também a co-administração de reovírus com quimioterapia intensificada de docetaxel em um modelo de câncer de próstata humano [25], permitindo o uso de doses reduzidas de quimioterápicos. Além disso, a combinação de uma dose baixa assintomática de 5-FU com adenovírus recombinantes produz um efeito sinérgico em várias linhas celulares e na Vivo modelos de tumor [26-30]. Embora o mecanismo molecular detalhado subjacente aos benefícios terapêuticos do tratamento combinado permaneça desconhecido, tal tratamento já demonstrou resultados promissores em um ambiente clínico [31, 32].

Se o efeito antitumor sinérgico pode ser alcançado usando uma combinação de drogas que inclui vetores alfavirais, foi pouco investigado. Um estudo mostrou que a aplicação de um vetor Sindbis com propriedades oncolíticas em combinação com o inibidor da topoisomerase irinotecano em camundongos SCID com câncer de ovário humano resultou em sobrevivência animal prolongada [33]. Os autores destacam o papel das células natural killer na indução do efeito anticâncer pelo tratamento combinado. O direcionamento de diferentes mecanismos anticâncer envolvendo a ativação de células imunes pode levar a terapias combinatórias eficazes, embora estas tenham que ser avaliadas em modelos de tumor imunocompetentes.

Usando um modelo de tumor mamário de camundongo 4 T1, investigamos a eficiência do tratamento combinado de 5-FU e vetor SFV. Nós nos concentramos na inibição da proliferação celular e na eficiência da entrega do transgene sob tratamento combinado em vitro e na Vivo.


Impacto do estradiol, agonistas específicos do subtipo ER e genisteína na homeostase energética em um modelo de rato de obesidade induzida por nutrição

Os estrogênios são conhecidos por estarem envolvidos no controle da homeostase energética. Aqui nós investigamos o papel de ER alfa e ER beta em um modelo de obesidade induzida por nutrição. Ratas Wistar ovariectomizadas foram alimentadas com dieta rica em gordura e receberam veículo, E2, agonistas seletivos do subtipo ER (Alfa e Beta) ou genisteína. Após 10 semanas, peso corporal, gordura visceral, leptina sérica, lipídios sanguíneos e marcadores anabólicos no músculo sóleo foram determinados. O tratamento com E2 e Alpha diminuiu o peso corporal, o colesterol total e o VLDL. A massa de gordura visceral, o tamanho dos adipócitos e a leptina sérica foram reduzidos por E2, Alfa e Beta. No músculo sóleo, o tratamento com E2 e Beta modulou a expressão dos genes Igf1 e Pax7 e resultou em fibras musculares maiores.

Nossos dados indicam que os lipídios do sangue são afetados via ER alfa, enquanto a ativação do ER beta resulta em um aumento da massa do músculo sóleo. A homeostase do tecido adiposo parece ser afetada por meio de ambos os ERs.

Destaques

► Os agonistas seletivos para ER alfa e ER beta reduzem a massa de gordura visceral. ► Os efeitos do E2 nos lipídios séricos são predominantemente mediados por meio do ER alfa. ► A genisteína dietética não afeta a massa de gordura visceral e os lipídios do sangue. ► Os agonistas seletivos de ER beta modulam a expressão de mRNA do músculo sóleo de Igf1 e Pax7. ► Os agonistas seletivos do ER beta possuem atividade anabólica.


"Então, o que eu preciso para começar a testar?"

Começar com a demanda química de oxigênio requer apenas alguns equipamentos. Como o método mais comum, vamos nos concentrar no método colorimétrico para COD. Aqui está o básico do que você precisa:

1. Bloco de aquecimento

Ambos os métodos de teste de COD requerem a etapa de digestão, portanto, um bloco de aquecimento para suas amostras é crucial para garantir resultados precisos e repetíveis. Para obter melhores resultados, procure um bloco de aquecimento que apresenta várias temperaturas para que você tenha utilidade para outros testes, como fósforo total. A maioria dos blocos de aquecimento também tem temporizadores, que são essenciais para manter os tempos de digestão consistentes em várias execuções.

Para maior segurança, procure modelos que tenham uma blindagem opcional que cubra o bloco de aquecimento em caso de acidente.

2. Colorímetro ou espectrofotômetro

O colorímetro ou espectrofotômetro é o aparelho que fará a leitura da absorbância das amostras após a digestão para correlacioná-la com a concentração de DQO. Ambos os instrumentos podem ser usados ​​para medir COD, mas os dois dispositivos são um pouco diferentes um do outro.

Os colorímetros usam filtros para medir a luz como comprimentos de onda específicos, mas os espectrofotômetros usam um dispositivo que permite a medição em um amplo espectro. Independentemente de qual instrumento você escolher, procure modelos que apresentam métodos pré-programados para COD para facilidade de uso.

3. Reagentes

Os reagentes são um dos componentes mais importantes do sistema de teste COD. Esses produtos químicos são responsáveis ​​pela oxidação do material orgânico. É possível preparar reagentes internamente, mas é mais fácil comprar reagentes para minimizar o contato com cromo hexavalente e ácidos fortes. Esses frascos COD são pré-misturados e prontos para uso. Existem vários tipos de reagentes disponíveis comercialmente:

    : Estes frascos estão em conformidade com o método EPA 410.4 e Métodos Padrão 5220D. Esses reagentes usam a formulação para este método, que contém sulfato de mercúrio, dicromato de potássio e ácido sulfúrico. Escolha esses frascos se seu trabalho exigir que você relate os resultados de COD a uma agência reguladora que exija metodologias da EPA.

: Em conformidade com os métodos ISO 15705: 2002 no que diz respeito à sua composição. A composição desses frascos COD é semelhante à dos padrões da EPA, portanto, eles também contêm mercúrio.


Materiais e métodos

Tabela de recursos chave

Tipo de reagente
(espécie) ou
recurso
DesignaçãoFonte
ou referência
IdentificadoresAdicional
em formação
Tensão, fundo de tensão (Mus musculus macho)C57BL / 6JJackson LaboratoriesB6 / JEstoque # 000664
Tensão, fundo de tensão (Mus musculus macho)Pdyn IRES-CreJackson LaboratoriesB6129S-Pdyn tm1.1 (cre) Mjkr / LowlJEstoque # 027958
Tensão, fundo de tensão (Mus musculus macho)EGFP-L10aJackson LaboratoriesB6129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm9 (EGFP / Rpl10a) Amc / JEstoque # 024750
Tensão, fundo de tensão (Mus musculus macho)Pdyn lox / loxBloodgood et al., 2020
Anticorpoanti-c-Fos (policlonal de coelho)MilliporeCat # ABE457, RRID: AB_2631318(1:3000)
AnticorpoIgG anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (cabra policlonal)PerkinElmerCat # NEF812001EA, RRID: AB_2571640(1:200)
Anticorpoanti-mCherry (policlonal de frango)AbcamCat # ab205402, RRID: AB_2722769(1:500)
AnticorpoAlexa Fluor 488 anti-frango (policlonal de burro)Jackson Immuno Research LaboratoriesCat # 703-545-155, RRID: AB_2340375(1:200)
Deformação, fundo de deformação (AAV)AAV5-CamKII-Cre-eGFPUNC Vector CoreLote 6450
Deformação, fundo de deformação (AAV)AAV5-CamKII-eGFPUNC Vector CoreLote 4621B
Deformação, fundo de deformação (AAV)AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -mCherry-WPRE-hGHAddgeneLote CS1096
Deformação, fundo de deformação (AAV)AAV8-hSyn-DIO-hM4D (Gi) -mCherryAddgeneLote 6048
Deformação, fundo de deformação (AAV)AAV2retro-SL1-CAG-CreJaneliaPreparação Personalizada
Reagente baseado em sequênciaMm-Oprk1ACDbio316111
Reagente baseado em sequênciaMm-PdynACDbio318771
Ensaio comercial ou kitKit de amplificação TSA com Cy3PerkinElmerCat # NEL744001KT(1:50)
Ensaio comercial ou kitEnsaio Multiplex Fluorescente RNAscopeACDbio
Ensaio comercial ou kitKit ELISA de corticosteronaEnsaios de árvore
Composto químico, droganorBNITocrisCat # 0347
Composto químico, drogaCNOOlá biografiaCat # HB6149
Software, algoritmoPrisma 8GraphPad
Software, algoritmoClampFit 10.7Dispositivos Moleculares
Software, algoritmoEthovision XTNoldus
Software, algoritmoBORISFriard e GambaDOI: 10.1111 / 2041-210X.12584
De outrosTMTBioSRQCat # 1G-TMT-97
De outrosÓleo de amendoimHarris Teeter

Animais

Camundongos C57BL / 6J machos de oito semanas de idade (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) foram usados ​​para experimentos de farmacologia comportamental. Para visualizar neurônios que expressam Pdyn, geramos uma linha repórter Pdyn-GFP cruzando préprodinorfinaCamundongos -IRES-Cre (Crowley et al., 2016 Bloodgood et al., 2020 Al-Hasani et al., 2015) (Pdyn IRES-Cre , B6129S-Pdyn tm1.1 (cre) Mjkr / LowlJ, Jackson Laboratories Stock # 027958) e camundongos repórter Rosa26-flox-stop-L10a-EGFP (EGFP-L10a B6129S4-Gt (ROSA) 26Sor tm9 (EGFP / Rpl10a) Amc / J, Jackson Laboratories Stock # 024750). Para o nocaute condicional do BNST Pdyn, usamos o Pdyn lox / lox linha de rato (Bloodgood et al., 2020). Esses ratos foram criados nas instalações da UNC. Todos os camundongos foram alojados em grupo por pelo menos 3 dias antes de serem alojados individualmente em gaiolas de policarbonato (GM500, Tecniplast, Itália) com um ciclo de luz-escuro invertido 12:12 h com luzes apagadas às 7h00. Os camundongos tinham acesso irrestrito a alimentos (Prolab Isopro RMH 3000, LabDiet, St. Louis, MO) e H2O. O Comitê Institucional de Uso e Cuidado com Animais da Escola de Medicina da UNC aprovou todos os experimentos. Os procedimentos foram conduzidos de acordo com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

Beber EtOH intermitente

Os camundongos tiveram acesso 24 horas a uma solução de EtOH a 20% (p / v) e água em um cronograma intermitente (Hwa et al., 2011). Duas garrafas foram mantidas em bicos de bebida modificados de tampas de gaiolas de plástico e pesadas antes e depois do acesso diário ao EtOH. Uma gaiola fictícia sem animal foi usada para simular a perda de fluido durante o posicionamento das garrafas, de modo que o gotejamento médio de fluido foi subtraído de cada rato bebendo diariamente. Os camundongos foram testados para reações de estresse ao TMT durante 7 & # x0201310 dias de abstinência prolongada após 6 semanas de consumo intermitente. As concentrações de EtOH no sangue foram medidas em um subconjunto de camundongos. O sangue da cauda foi coletado após 2 horas de ingestão intermitente de EtOH e, em seguida, centrifugado a 3.000 rpm a 4 & # x000b0C. O plasma sanguíneo separado foi armazenado em & # x0221220 & # x000b0C antes da análise usando o AM1 Analox Analyzer (Analox Intstruments Ltd., Lunenberg, MA).

Ensaios comportamentais após beber EtOH

Exposição ao odor de predador TMT

A exposição ao odor predador sintético derivado da raposa, trimetiltiazolina (TMT), foi realizada na gaiola doméstica, conforme descrito anteriormente para provocar reações de estresse em camundongos (Hwa et al., 2019). Os animais foram transferidos para uma sala experimental separada para teste, que incluía uma coifa e um grande ventilador. Os camundongos foram testados um de cada vez para remoção de odores entre os ensaios. A tampa da gaiola foi removida para gravação de vídeo. Os testes foram conduzidos em condições de pouca iluminação, 15 & # x0201320 lux. Por um período pré-teste de linha de base, os camundongos habituaram-se a um aplicador de ponta de algodão mantido verticalmente no lugar por 10 min na gaiola doméstica. O teste TMT ocorreu quando 2,5 & # x000b5l TMT foi aplicado à ponta do algodão seguido por 10 min de observação comportamental. Como um odor de controle, 2,5 & # x000b5l de óleo de amendoim (Harris Teeter, Carrboro, NC) foi aplicado à ponta do algodão em um grupo separado de camundongos. A duração do contato com o objeto TMT, o tempo gasto nos cantos mais distantes da gaiola e a distância percorrida (seg) foram registrados e quantificados com o Ethovision XT13 (Noldus, Holanda). Os mapas de calor foram gerados por meio do Ethovision XT13. O enterro foi pontuado manualmente usando BORIS (Behavioral Observation Research Interactive Software) por um observador cego. O software BORIS também gerou etogramas / gráficos de Gantt representativos de comportamentos exploratórios e relacionados ao estresse, incluindo duração e frequência de enterramento, congelamento, limpeza, criação, alongamento e caminhada.

Ensaio de corticosterona plasmática

Para medir a corticosterona plasmática 30 minutos após a exposição ao odor de predador TMT, as amostras de plasma 5 & # x000b5l foram processadas com um kit ELISA colorimétrico comercialmente disponível (Arbor Assays, Ann Arbor, MI), de acordo com as instruções do fabricante e # x02019s. Todas as amostras foram executadas em duplicado.

Labirinto em cruz elevado

Os camundongos foram colocados no centro de um labirinto em cruz elevado (75 cm) e autorizados a explorar por 5 min (Bloodgood et al., 2020 Crowley et al., 2016 Mazzone et al., 2018). Os níveis de luz nos braços abertos eram de aproximadamente 15 lux. A duração do tempo gasto nos braços abertos e fechados foi registrada e calculada pelo Ethovision XT13. O intervalo de tempo entre o TMT e os testes de labirinto em cruz elevado foi de 3 dias.

Cirurgia estereotáxica

Camundongos adultos (& # x0003e8 semanas) foram profundamente anestesiados com 3 & # x020134% de isoflurano em oxigênio e colocados em uma estrutura estereotáxica (Kopf Instruments, Tujunga, CA) enquanto em uma almofada aquecida. A anestesia com isoflurano foi mantida em 1 & # x020132% durante o restante da cirurgia. Após a esterilização com etanol 70% e betadine, uma incisão no couro cabeludo foi feita e orifícios de trepanação foram perfurados acima do alvo. Uma seringa 1 & # x000b5l Neuros Hamilton (Hamilton, Reno, NV) microinjetou o vírus ou droga a uma taxa de 0,1 & # x000b5l / min. As coordenadas para o BNST dorsal foram AP +0,30 mm, ML +/- & # x000a00,95 mm, DV & # x022124,35 mm do bregma. As coordenadas para o mPFC foram AP +1,70 mm, ML +/- & # x000a00,30 mm, DV & # x022122,50 mm de bregma. As coordenadas para o BLA foram AP & # x022121,30 mm, ML +/- & # x000a03,25 mm, DV & # x022124,95 mm de bregma. Os camundongos se recuperaram por 1 semana antes do teste.

Drogas e vetores virais

5 mg / kg de norBNI (Cat no. 0347, Tocris) ou solução salina foi administrada i.p., 1 ml / 100 g, 16 h antes do teste para EtOH e H2O camundongos. Para microinfusões de norBNI intra-BNST, 5 & # x000b5g / & # x000b5l norBNI ou PBS foi injetado com 50 nl de AAV5-CamKII-eGFP para marcar o local da injeção. A administração intra-BNST de norBNI ou PBS foi uma infusão única e bilateral de medicamento. Uma vez que os animais foram submetidos à cirurgia estereotáxica para administração do medicamento, 7 dias foi o tempo mínimo para recuperação pós-operatória antes do teste comportamental de TMT. O pré-tratamento com drogas de 16 horas e 7 dias minimizou o estresse de manipulação antes da exposição ao odor de predador e permitiu o antagonismo de KOR em vez do antagonismo de opióide mu inespecífico que ocorre inicialmente após a injeção. norBNI é conhecido por sua duração de ação ultralonga (Munro et al., 2012). Embora não tenhamos testado diretamente para ver se o antagonismo de KOR ainda era farmacologicamente eficaz no momento do teste de TMT e EPM, estudos anteriores mostraram os efeitos do norBNI no teste de sacudidela da cauda de camundongo até 28 dias após a administração (Horan et al., 1993) e limiares de autoestimulação intracraniana de rato por pelo menos 86 dias após a administração (Potter et al., 2011). Portanto, é provável que norBNI estivesse a bordo no momento do teste de TMT.

Pdyn lox / lox os camundongos receberam 300 nl AAV5-CamKII-Cre-eGFP (UNC Vector Core, Lote 6450) e controle AAV5-CamKII-eGFP (Lote 4621B) no BNST. 300 nl AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -mCherry-WPRE-hGH (Addgene, Lote CS1096) foi injetado no mPFC ou BLA de camundongos Pdyn-GFP para experimentos de conectividade sináptica no BNST. Camundongos C57BL / 6J foram injetados com 300 nl AAV8-hSyn-DIO-hM4D (Gi) -mCherry (Addgene, Lote 6048) no mPFC e AAV2retro-SL1-CAG-Cre no BNST para inibição de mPFC-BNST. Todas as injeções intracranianas foram bilaterais.

Para testar a inibição mediada por DREADD no consumo de EtOH, solução salina e CNO foram administrados 20 min antes de beber EtOH em dois dias de teste finais. EtOH e H2O consumo de fluido foi medido após 1, 4 e 24 horas. Durante a retirada prolongada 7 dias depois, o CNO foi administrado 20 minutos antes do teste de TMT e novamente 20 minutos antes do teste no EPM, o que ocorreu após 3 dias. 3 mg / kg de N-óxido de clozapina (CNO Hello Bio, Princeton, NJ) foi dissolvido em solução salina antes da injeção i.p. administração, 1 ml / 100 g, 20 min antes do teste.

Imuno-histoquímica de c-Fos, histologia e microscopia

Para c-Fos e verificação histológica, os camundongos foram profundamente anestesiados com Avertin antes da perfusão transcardial com solução salina tamponada com fosfato e paraformaldeído a 4%. Os cérebros foram extraídos 90 minutos após a exposição TMT para c-Fos, crioprotegidos e, em seguida, cortados a 45 & # x000b5m em um vibratome Leica 1200S. As seções coronais dos camundongos Pdyn-GFP foram coradas para c-Fos imunofluorescência para visualizar a co-localização de Pdyn contendo (GFP) e c-Fos expressando células. O protocolo de imunofluorescência para c-Fos foi realizado de acordo com estudos anteriores (Hwa et al., 2019) usando amplificação do sinal de tiramina (TSA). Após as lavagens com PBS, 50% de metanol e 3% de peróxido de hidrogênio, o tecido foi incubado em tampão de bloqueio com 0,3% de Triton X-100% e 1% de albumina de soro bovino por 60 min. As fatias foram então incubadas a 4 & # x000b0C por 48 horas em tampão de bloqueio contendo um anti-c-Fos anticorpo (1: 3000, ABE457, Millipore, Bellerica, MA). Após lavagens em TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 3% TritonX-100) e TNB (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,5% de reagente de bloqueio de Elmer), as fatias foram incubadas em um anti de cabra - IgG conjugada com peroxidase de rábano bravo (1: 200, NEF812001EA, PerkinElmer, Waltham, MA) por 30 min. Após as lavagens com TNT, o tecido foi processado usando um kit TSA com Cy3-tyramide (1:50, PerkinElmer, Waltham, MA) por 10 min. Para o experimento de inibição quimiogenética de mPFC-BNST, aumentamos o sinal de mCherry nos corpos celulares de mPFC e terminais BNST usando um protocolo de imunofluorescência semelhante. Após as lavagens com PBS, 3% de peróxido de hidrogênio, lavagens com PBS e 30 min em 0,5% de Triton X-100, o tecido foi incubado em 0,1% de Triton X-100, 10% de soro normal de burro e 1% de albumina de soro bovino por 60 min. As fatias foram então incubadas a 4 & # x000b0C durante 24 horas em tampão de bloqueio contendo um anticorpo anti-mCherry de galinha (1: 500, ab205402, Abcam, Cambridge, MA). Após as lavagens com PBS, o tecido foi submetido a incubação secundária durante 2 horas à temperatura ambiente em PBS contendo anti-galinha de burro Alexa Fluor 488 (1: 200, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc West Grove, PA).

Para verificação da colocação, os locais de injeção viral foram verificados usando um microscópio epifluorescente de campo amplo (BX-43, Olympus, Waltham, MA). Para quantificação de c-Fos imunofluorescência, as fatias foram fotografadas em um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss 800 (Carl Zeiss, Alemanha) e analisadas com o software Zeiss Zen 2 Blue Edition. Usando o Image Analysis Wizard no software Zen Blue, as células Pdyn-GFP foram identificadas como o classificador pai e as células marcadas com c-Fos Cy3 foram identificadas como o classificador filho. Os parâmetros de segmentação automática eram idênticos para cada imagem dentro de cada novo quadro desenhado para delinear o BNST dorsal. As células Pdyn-GFP, células c-Fos e células c-Fos aninhadas nas células Pdyn-GFP foram contadas automaticamente para cada imagem. Quatro seções coronais do cérebro contendo o BNST bilateral foram coradas, fotografadas e analisadas para cada animal.

Para a hibridização in situ, os cérebros foram extraídos 30 minutos após a exposição ao TMT sob anestesia com isoflurano. O tecido foi congelado rapidamente em gelo seco por 15 min e armazenado a & # x0221280 & # x000b0C até seccionado para hibridização in situ. Cortes coronais 18 & # x000b5m contendo o BNST foram feitos no criostato Leica CM 3050S (Leica Biosystems, Nussloch, Alemanha) em & # x0221220 & # x000b0C, montados diretamente em lâminas de microscópio e armazenados em & # x0221280 & # x000b0C. In situ foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante & # x02019s para seções de tecido congeladas frescas (RNAscope Fluorescent Multiplex Assay ACDbio, Newark, CA) com as seguintes exceções. As lavagens com PBS após a fixação do tecido foram estendidas para 5 min cada e o tratamento com protease foi reduzido para 15 min. As sondas utilizadas foram RNAscope Probe-Mm-Oprk1 (Cat no 316111) e RNAscope Probe-Mm-Pdyn (Cat no 318771). As lâminas foram incubadas com DAPI, lamínulas com ProLong Gold (Life Technologies) e fotografadas em um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss 800. ImageJ foi usado para contar a intensidade média de fluorescência para Pdyn (Canal 550) e Oprk (647 canais), e o plug-in do contador de células foi usado para contar neurônios positivos para Pdyn manualmente. Após verificação com DAPI, as células marcadas com pelo menos três pontos foram contadas como contendo mRNA de Pdyn. A contagem das mãos foi tabulada por um observador cego.

Eletrofisiologia de corte

Noventa minutos após o TMT, durante a retirada prolongada de 7 & # x0201310 dias, os camundongos foram sacrificados por meio de anestesia profunda com isoflurano, e fatias coronais do cérebro contendo o BNST foram coletadas de acordo com protocolos de laboratório padrão (Hwa et al., 2019 Crowley et al., 2016 Bloodgood et al., 2020). Registros eletrofisiológicos de braçadeira de voltagem de célula inteira foram realizados em células BNST PDYN dorsais. As células contendo Pdyn-GFP foram selecionadas com base na visualização usando um LED de 470 nm e filtro GFP. Os efeitos de EtOH e TMT na transmissão sináptica basal foram avaliados em pinça de voltagem ajustando o potencial de membrana e usando uma solução intracelular à base de metanossulfonato de césio (metanossulfonato de césio 135 mM, KCl 10 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 0,2 mM , MgATP 4 mM, GTP 0,3 mM, fosfocreatina 20 mM, pH 7,3, 285 & # x02013290 mOsmol). Brometo de lidocaína n-etil (1 mg / ml) foi incluído na solução intracelular para bloquear as correntes pós-sinápticas de sódio. Os neurônios foram mantidos em & # x0221255 mV para avaliar a transmissão sináptica glutamatérgica. Na mesma célula, os neurônios foram mantidos em +10 mV para avaliar a transmissão sináptica GABAérgica. Flutuações na corrente foram usadas para determinar a frequência e amplitude da corrente pós-sináptica espontânea (sEPSC ou sIPSC), bem como para calcular as razões sEPSC / sIPSC. As experiências de transmissão sináptica em células BNST PDYN também foram realizadas em animais que receberam 5 mg / kg de norBNI i.p. 16 horas antes do TMT. Os registros eletrofisiológicos foram então analisados ​​usando o software Clampfit 10.7 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Para experimentos optogenéticos ex-vivo, o tecido foi avaliado para potenciais de ação evocados por luz no mPFC. Cérebros eram descartados e não usados ​​para experimentação adicional se os locais de injeção fossem perdidos ou se os potenciais de ação não estivessem presentes. Um LED azul (470 nm, CoolLed) foi usado para estimular opticamente a liberação de fibras contendo canal-rodopsina (ChR2) (Crowley et al., 2016).Picrotoxina (25 & # x003bcM), tetrodotoxina (500 nM) e 4-AP (200 & # x003bcM) foram adicionados ao aCSF para isolar oEPSCs monossinápticos com células mantidas em & # x0221270 mV. A solução intracelular foi gluconato de césio (117 mM ácido D-glucônico e hidróxido de césio, 20 mM HEPES, 0,4 mM EGTA, 5 mM tetraetil amônio cloreto, 2 mM MgCl26H2O, 4 mM Na2ATP, 0,4 Na2GTP, pH 7,3, 287 & # x02013292 mOsmol) . oEPSC amplitude (pA) foi o primeiro pico da relação de pulso emparelhado com um intervalo interestímulo de 50 ms. A razão de pulso emparelhada foi calculada como a amplitude do segundo pico dividida pela amplitude do primeiro pico. As células foram mantidas a & # x0221270 mV para isolar a corrente mediada por AMPAR e a +40 mV para a corrente mediada por NMDAR. Em fatias separadas, dez trens de pulsos de 1, 5 e 10 Hz foram realizados no grampo de tensão & # x0221255 mV sem a presença de inibidores ionotrópicos com a solução interna de metanossulfonato de césio. As nove amplitudes subsequentes no trem de pulso foram normalizadas para o primeiro pico.

Para validação DREADD em fatia, os corpos celulares de mPFC foram identificados com a expressão de mCherry. 10 & # x000b5M CNO (Hello Bio, Princeton, NJ) foi aplicado em banho por 10 min, e o potencial de membrana em repouso foi monitorado no grampo de voltagem. O potencial de ação do disparo foi avaliado antes e após a aplicação de CNO usando um protocolo de rampa crescente na pinça de corrente.

Estatisticas

O tempo gasto em contato com o TMT, cantos distantes e comportamento de enterrar em segundos (s) e distância percorrida (cm) foram analisados ​​com ANOVA de duas vias com droga / vírus e EtOH como fatores. Os testes t post-hoc pareados e não pareados eram bicaudais e usados ​​quando apropriado. Em experimentos em que o vírus foi injetado antes do EtOH, a ingestão cumulativa de álcool de 6 semanas e a preferência média de etanol foram comparadas por meio do teste t. BNST c-Fos, Contendo Pdyn, e c-Fos e a co-localização de Pdyn foram analisadas com ANOVA de duas vias com exposição a TMT e EtOH como fatores. Com a fisiologia norBNI, camundongos estressados ​​injetados com solução salina e norBNI foram comparados em ANOVA de duas vias separada com droga e EtOH como fatores. Para comparar a proporção de células responsivas à luz por condição, foi realizado um teste & # x003a7 2. Além disso, os experimentos evocados opticamente (por exemplo, amplitude oEPSC) foram analisados ​​com ANOVAs de duas vias comparando a exposição a TMT e EtOH. Os trens de pulso foram analisados ​​com ANOVA bidirecional de medidas repetidas ao longo do tempo de estímulo e condição. Alpha foi definido como 0,05. Replicações biológicas ao longo de estudos comportamentais, imunohistoquímicos e eletrofisiológicos foram combinados. Os testes estatísticos foram analisados ​​com GraphPad Prism 8 (La Jolla, CA, EUA).


Os experimentos em kits ELISA podem ser monitorados por fluorometria e fotometria? - Biologia

Os sistemas repórter também são freqüentemente usados ​​como um padrão para comparar a eficiência de transfecção de diferentes experimentos de transfecção. Nesse caso, o sistema repórter de controle geralmente contém um promotor constitutivo e um gene repórter, que é diferente do gene repórter usado pelo elemento em exame. Esse sistema repórter também pode ser usado para otimizar os parâmetros de eletroporação.

Cloranfenicol acetiltransferase (CAT)

Cloranfenicol acetiltransferase (CAT) Esta enzima vem de microrganismos e catalisa a transferência de grupos acetil da acetil coenzima A para o cloranfenicol. Com o ensaio CAT, os lisados ​​contendo CAT de células transfectadas são incubados com 14C-cloranfenicol, que é então acetilado. O 14C-cloranfenicol acetilado e não acetilado é então separado por cromatografia em camada fina e visualizado por autorradiografia. Se necessário, a distribuição da radioatividade pode ser quantificada por um sistema de varredura.

Como uma alternativa não radioativa cada vez mais comum, a expressão de CAT é quantificada por um ELISA por meio da detecção imunológica da enzima CAT que foi expressa.

A -galactosidase procariótica catalisa naturalmente a hidrólise de -galactosídeos (por exemplo, lactose). No entanto, o uso de substratos não fisiológicos também permite a quantificação da atividade -galactosidase em lisados ​​de células transfectadas por meio de espectrofotometria (por exemplo, com 0-nitrofenil - D-galactosídeo = ONPG), fluorometria (por exemplo, com um 4-metil-umbeliferil- -galactopiranosídeo composto = MUG) ou via quimioluminescência. A detecção por quimioluminescência (por exemplo, com 1,2 derivados de dioxetana-galactopiranosídeo) é 1001.000 vezes mais sensível do que os outros dois métodos de detecção e, portanto, ainda mais sensível do que o ensaio de luciferase (ver abaixo). Uma grande vantagem deste sistema é o fato de que a atividade da -galactosidase também pode ser medida in situ.

O gene repórter -galactosidase é freqüentemente co-transfectado junto com outros sistemas repórter como um controle interno. As atividades de -galactosidase podem ser usadas para comparar e padronizar diferentes experimentos de transfecção (por exemplo, ensaios de luciferase).

Hormônio de crescimento humano (hGH)

Com o sistema repórter de hormônio de crescimento humano (hGH), em contraste com a maioria dos outros sistemas, a proteína repórter é segregada para o meio de cultura pelas células transfectadas. Isso significa que a lise celular não é necessária para quantificar a proteína repórter. A detecção do hGH secretado é geralmente realizada usando anticorpos marcados com 125 I contra o hormônio do crescimento. Vários fabricantes fornecem uma alternativa não radioativa na forma de kits ELISA, com anticorpos anti-hGH ligados à superfície de uma placa de microtitulação. Primeiro, o hGH do sobrenadante do meio de cultura liga-se ao anticorpo na placa. Subsequentemente, o hGH ligado é detectado em duas etapas por meio de um anticorpo anti-hGH acoplado a digoxigenina e um anticorpo anti-digoxigenina acoplado a peroxidase. A peroxidase ligada é quantificada por incubação com um substrato.

Outra proteína repórter secretada é a SEAP (fosfatase alcalina secretada). Esta proteína é quantificada diretamente medindo a atividade da enzima no sobrenadante do meio de cultura. Os ensaios de fluorescência e quimioluminescência estão disponíveis para esse fim.

A enzima do vaga-lume norte-americano (Photinus pyralis) catalisa uma reação de bioluminescência. No ensaio de luciferase, os lisados ​​de células transfectadas são incubados com luciferina, oxigênio molecular, ATP e Mg 2+. Na reação seguinte, a luciferase catalisa a oxidação da luciferina em oxiluciferina e CO 2. Nesta reação, a luz com comprimento de onda de 562 nm é emitida, que então se desvanece rapidamente. A luz emitida pode ser medida em um luminômetro ou em um contador de cintilação líquida. A emissão de luz é proporcional à quantidade de luciferase no lisado, permitindo assim a quantificação indireta da taxa de transfecção do gene repórter. A sensibilidade do ensaio da luciferase é ainda aumentada pela adição da coenzima A à preparação da reação, tornando-a 1020 vezes mais sensível do que o ensaio CAT.

Em um desenvolvimento posterior do ensaio de luciferase, as células são co-transfectadas com um plasmídeo de controle de uma luciferase diferente de renilla (Renilla reniformis). As atividades do vagalume e da luciferase do renilla podem ser medidas separadamente em uma amostra. A atividade da renilla luciferase pode, portanto, ser usada como um controle interno para comparar diferentes experiências de transfecção. Ambas as luciferases também são usadas em experimentos de co-transfecção para o exame paralelo de dois elementos cis.

Proteína fluorescente verde (GFP)

Ao contrário de outros repórteres bioluminescentes, a proteína fluorescente verde da água-viva Aequorea victoria não requer proteínas, substratos ou cofatores adicionais para emitir luz. Quando irradiado com luz ultravioleta ou luz azul, ele emite luz verde, que permite o exame da expressão gênica e localização da proteína in situ e in vivo. Além disso, a expressão do gene pode ser observada em tempo real. No entanto, o sistema é menos adequado para quantificar a expressão gênica.

Variações de GFP com diferentes níveis de absorção e emissão também permitem experimentos de dupla marcação, como o exame simultâneo da expressão gênica de dois promotores em uma célula ou a localização de duas proteínas de fusão diferentes em uma célula. Outras variações de GFP são particularmente projetadas para expressão em células de mamíferos ou têm uma fluorescência até 35 vezes maior. Com a ajuda de um sistema GFP com meia-vida drasticamente reduzida, os processos dinâmicos também podem ser examinados in vivo na célula.

Fonte:


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Tecnologia de biologia relacionada:


Resumo

Recentemente, o interesse na aplicação de ensaios de viabilidade celular tem aumentado em diversos campos. Os ensaios de viabilidade celular podem ser amplamente classificados como (a) ensaios de exclusão de corante, (b) ensaios colorimétricos, (c) ensaios fluorométricos, (d) ensaios luminométricos e (e) ensaios de citometria de fluxo. Os ensaios de exclusão de corante incluem azul de tripano, eosina, vermelho de congo e ensaios de coloração de eritrosina B, enquanto 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5 brometo de difenil tetrazólio (MTT), 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS), 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) - 2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT), 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-dissulfofenil) -2H tetrazólio, sal monossódico (WST-1), 2- (2-metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-dissulfofenil) -2H-tetrazólio, sal monossódico (WST-8), lactato desidrogenase (LDH), sulforhodamina B (SRB ), absorção de vermelho neutro (NRU) e ensaios de coloração com violeta de cristal (CVS) estão entre os ensaios colorimétricos. Da mesma forma, os ensaios da resazurina e do éster acetoximetílico do diacetato de 5-carboxifluoresceína (5-CFDA-AM) são baseados em medições fluorométricas, enquanto os ensaios luminométricos compreendem trifosfato de adenosina e ensaios de viabilidade em tempo real. Os principais ensaios de citometria de fluxo incluem assimetria de membrana, permeabilidade de membrana e ensaios de mitocôndria. Nesta diretriz, os mecanismos e a prática de avaliação dos ensaios de viabilidade celular mais comuns aplicados em laboratórios de pesquisa são discutidos em detalhes. Um ensaio de viabilidade celular ideal deve ser seguro, rápido, confiável, eficiente e eficaz em termos de tempo e custo e não deve interferir com o composto de teste. No geral, pode-se concluir que mais de um ensaio de viabilidade celular deve ser aplicado para se obter resultados confiáveis.


Os experimentos em kits ELISA podem ser monitorados por fluorometria e fotometria? - Biologia

Na Stevens, estamos fortalecendo uma tradição orgulhosa de conduzir pesquisas de alta qualidade, desenvolvendo maneiras de garantir que as descobertas laboratoriais e as novas tecnologias sejam traduzidas em produtos e processos bem-sucedidos e comercialmente viáveis. Acreditamos que o futuro está na Tecnogênese e na benéfica colaboração universidade-indústria-governo.

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O Centro de Excelência em Inovação de Processos de Negócios foi fundado em 2004 e pertence a um grupo de sete centros de pesquisa sob a égide do Instituto SAP / IDS Scheer para Inovação de Processos de Negócios. Estudamos a interação entre os processos de negócios e a organização e nossos projetos se concentram em dois temas principais:

Como a tecnologia pode facilitar processos de negócios inovadores?

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Laboratório Ambiental James C. Nicoll (JNEL)

Esta instalação de última geração, administrada pela CEE, fornece serviços de pesquisa diversificados para o desenvolvimento, teste, transferência e implementação de tecnologias ambientais inovadoras. Ele tem recursos de multimídia para estudos de águas residuais, resíduos líquidos, resíduos sólidos e ar. Sua função é oferecer serviços à indústria, governo e organizações profissionais ambientais, desde testes altamente especializados de curta duração até estudos de pesquisa aplicada de longo prazo. As capacidades da JNEL cobrem uma ampla gama, incluindo caracterização do fluxo de resíduos, viabilidade de processos e estudos de minimização de resíduos, testes de aceitação regulatória para certificação de produtos e testes de compatibilidade ambiental de novos produtos.

O laboratório inclui um grande laboratório de teste de processo de alta baía para a realização de experimentos de processo e um laboratório analítico equipado com instrumentação totalmente automatizada, incluindo cromatografia de gás / espectroscopia de massa de armadilha de íons, cromatografia líquida de alto desempenho com detecção de arranjo de diodos e espectrofotometria de absorção atômica com forno de grafite e capacidade de chama.

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O Centro para Gestão de Tecnologia Global (CGTM) é o ponto focal da Escola Wesley J. Howe para programas de pesquisa e educação em estudos globais. Na pesquisa, o centro se concentra em questões relacionadas a práticas e teorias de inovação global. O programa educacional do centro inclui uma variedade de cursos que levam a uma "concentração global" em vários programas de pós-graduação da Howe School. O centro também planeja uma série de cursos executivos, bem como programas de intercâmbio de alunos, em nível de graduação e pós-graduação, com empresas globais e escolas internacionais de negócios.

Centro de Inovação em Engenharia e Educação Científica (CIESE)

O Centro de Inovação em Engenharia e Educação Científica (CIESE), www.ciese.org, parte da Escola de Engenharia e Ciência Charles V. Schaefer Jr., foi fundado em 1988 para emprestar a experiência de Stevens na integração de computadores em seu currículo para melhorar o ensino fundamental e médio de ciências, matemática, engenharia e tecnologia. A missão do CIESE é aumentar o pool e melhorar as capacidades de todos os alunos para buscar o ensino superior e carreiras em áreas tecnológicas e apoiar a educação Stevens catalisando e promovendo a inovação no ensino e aprendizagem de engenharia, ciências e matemática. Os esforços de divulgação do CIESE impactam educadores e alunos pré-universitários, a fim de melhorar a qualidade dos alunos e promover as práticas de engenharia, ciência aplicada e gerenciamento de tecnologia.

Na prossecução da sua missão, o trabalho do CIESE abrange educadores pré-universitários e pós-secundários. O Centro auxilia educadores K-12 a explorar o poder da tecnologia para melhorar o ensino e a aprendizagem em engenharia, ciências, matemática e outras disciplinas. Essas atividades complementam os objetivos de Stevens, ajudando os alunos a adquirir os fundamentos necessários para se destacar em ciências, matemática e outras disciplinas. A realização nessas disciplinas de "porta de entrada" permite que os alunos prossigam para o estudo avançado exigido em engenharia e outros campos tecnologicamente ricos.

O CIESE trabalha em colaboração com professores, administradores de sistema escolar e professores universitários para fornecer treinamento intensivo e prático, suporte e aconselhamento para inserir tecnologia de maneiras significativas no currículo. A tecnologia é vista tanto como uma ferramenta para professores quanto como um novo modo de levar conteúdo empolgante aos alunos. No passado, os alunos podem ter lido em um livro sobre terremotos que aconteceram há vários anos hoje, é possível para eles fazerem logon em um site e ver a localização e intensidade dos terremotos que ocorreram nas últimas 24 horas. Trazer esses fenômenos do mundo real para a sala de aula tanto motiva quanto envolve os alunos a aprender de maneiras que não seriam possíveis com ferramentas mais tradicionais. Por meio de parcerias com distritos escolares, bem como faculdades, universidades e outras organizações em Nova Jersey e quatro outros estados, o CIESE treinou mais de 20.000 professores e impactou mais de meio milhão de alunos. Os materiais curriculares do CIESE baseados na Internet foram reconhecidos por organizações como o Escritório de Política de Ciência e Tecnologia da Casa Branca, o Departamento de Educação dos Estados Unidos, a Associação Americana para o Avanço da Ciência, o Conselho Nacional de Professores de Matemática e outros organizações. Mais de 100.000 alunos participam dos dados em tempo real do CIESE e dos projetos globais de telecolaboração a cada ano. O CIESE está atualmente implementando uma doação de US $ 1,5 milhão do Departamento de Educação dos Estados Unidos para transformar o ensino e a aprendizagem em educação de ciências e matemática para professores em formação por meio de parcerias com 33 faculdades comunitárias. O CIESE também implementou programas de treinamento em tecnologia em grande escala, incluindo um subsídio de cinco anos no Departamento de Educação dos EUA de US $ 9,28 milhões e um subsídio de três anos da Fundação AT&T de US $ 750.000, um subsídio de três anos no Departamento de Educação de Nova Jersey de US $ 600.000 e um Programa de US $ 1 milhão de três anos para fortalecer a educação científica para as escolas mais carentes de Nova Jersey, bem como vários programas específicos de treinamento de professores com escolas e distritos de Nova Jersey e Nova York.

No centro das atividades do CIESE estão os materiais curriculares baseados na Internet exclusivos e atraentes para o ensino de ciências e matemática do ensino fundamental e médio. A série de workshops Savvy Cyber ​​Teacher (SCT) é um programa de treinamento de professores de 30 horas em 10 partes que fornece aos educadores experiência prática usando aplicativos baseados na Web para envolver os alunos em investigações científicas autênticas e atividades de resolução de problemas usando dados em tempo real e telecolaboração global. Os materiais de SCT e outros programas de treinamento estão disponíveis para escolas e professores por meio de programas financiados por doações ou acordos de taxa de serviços com o CIESE.

Centro de Excelência Nacional do Departamento de Segurança Interna - Segurança Portuária

O Centro Nacional para Comércio Marítimo Seguro e Resiliente (CSR) reúne um conjunto exclusivo de instituições acadêmicas de todo o país e parceiros do setor público e privado com diversos conhecimentos e experiência significativa no desenvolvimento de novos conhecimentos, produtos de tecnologia, modelos, ferramentas, políticas e procedimentos e treinamento relacionados à proteção marítima global e à proteção costeira. Esses recursos serão aplicados a:

  • Melhorar a segurança do Sistema de Transporte Marítimo (MTS) e das operações costeiras e offshore, aproveitando os investimentos em segurança para também melhorar o desempenho econômico
  • Melhorar a resposta de emergência a eventos no domínio marítimo e
  • Melhore a resiliência do MTS, das operações offshore e dos ambientes costeiros.

As capacidades e experiência da equipe do Centro, juntamente com uma variedade de instalações experimentais e computacionais existentes nas instituições membros, criarão uma empresa que está exclusivamente equipada para desenvolver, avaliar e implementar novas tecnologias, políticas e sistemas, começando com design colaborativo e movendo-se rapidamente para a experimentação e implementação real no ambiente do mundo real.

Centro de Sistemas Marítimos (CMS)

O Centro de Sistemas Marítimos trabalha para preservar e proteger os recursos marítimos de nossa nação por meio do desenvolvimento colaborativo de conhecimento, inovação e invenção, educação e treinamento. Este centro se tornou o líder mundial no fornecimento de novos conhecimentos, tecnologia avançada e educação em apoio à comunidade marítima. Integra com exclusividade os campos da arquitetura naval, engenharia costeira e oceânica, oceanografia física e hidrodinâmica marinha para criar uma empresa transdisciplinar que pode abordar tanto as questões altamente especializadas enfrentadas por cada disciplina, quanto as questões mais complexas e integradas enfrentadas sistemas marítimos naturais e artificiais. A inclusão de alunos de graduação e pós-graduação neste esforço de pesquisa colaborativa dá continuidade à tradição Stevens de Technogenesis - onde alunos, professores e indústria, juntos, cultivam novas tecnologias para o benefício da sociedade. O Centro envolve aproximadamente 60 pessoas, das quais 80% são estudantes, engenheiros pesquisadores e pós-doutores. O corpo docente é de mais de 8 departamentos diferentes.

O Centro é composto por três instalações integradas apoiadas pelo Instrumentation and Design Group que projeta e fabrica os equipamentos especializados necessários para apoiar as atividades de pesquisa e pelo Computation Support Group que garante a disponibilidade de computador de ponta e poder de visualização:

Laboratório Davidson

O Laboratório Davidson, fundado em 1935, é uma das maiores e mais renomadas instalações de pesquisa de engenharia hidrodinâmica e oceânica do país. Os estudos hidrodinâmicos marítimos pioneiros em modelagem física e simulação computacional de projetos de embarcações marítimas (variando de barcos de planejamento de alta velocidade a submarinos) contribuíram para a reputação internacional do Laboratório. As principais instalações de pesquisa são dois tanques de ondas exclusivos. O primeiro é um tanque de reboque de alta velocidade com comprimento de 320 pés, largura de 16 pés e uma profundidade de água variável de até 8 pés, resultado de uma grande reforma recentemente concluída. Um carro acionado por cabo com suporte de monotrilho é capaz de velocidades de até 100 pés / s. O tanque também contém um criador de ondas programável capaz de gerar campos de onda monocromáticos e aleatórios, bem como vários tipos de espectros de onda. As condições de águas rasas podem ser simuladas no tanque com a instalação de um fundo falso com declive ajustável. As condições da praia próxima à costa são estudadas colocando 40 toneladas de areia de quartzo em um fundo falso de 65 pés de comprimento e inclinado de 1 em 20. A instrumentação aprimorada do tanque, as paredes de vidro para visualização e fotografia e as melhorias no acesso do público aumentam ainda mais as contribuições do Laboratório para a pesquisa fundamental e aplicada em design de navios, hidrodinâmica e engenharia oceânica. O segundo tanque é um braço giratório e uma bacia marítima oblíqua, com dimensões de 75 pés de comprimento por 75 pés de largura e uma profundidade de água variável de até cinco pés. A instalação foi designada um marco histórico internacional da engenharia mecânica, uma das duas únicas de seu tipo no país, e foi apresentada na edição de fevereiro de 1996 da Sea Technology.

Laboratório de Observação e Previsão Marinha

O Laboratório de Observação e Previsão Marinha aborda os muitos desafios enfrentados pelas comunidades estuarinas e costeiras - incluindo perigos naturais e provocados pelo homem, melhorando nossa capacidade de detectar, compreender, prever e responder às mudanças no ambiente marinho. A pesquisa de campo estuarina e costeira é realizada por meio da utilização das duas embarcações de pesquisa do Laboratório. O mais novo é um navio de pesquisa de 45 pés totalmente equipado para estudos ambientais no estuário de Hudson e no oceano costeiro adjacente. O navio é movido por um motor diesel Cummins de 6 cilindros com 400 HP e 400 galões de combustível. Ele navega a 12 kt com uma velocidade máxima de cerca de 14 kt. Os recursos a bordo incluem um conjunto completo de eletrônicos, incluindo GPS, radar e plotter cartográfico, um tanque de água doce de 50 galões, berços para 3 e um guincho A-frame com capacidade para 1.500 libras. A instrumentação de pesquisa inclui equipamentos de levantamento topográfico e batimétrico, um sistema de radar CODAR de alta frequência, medidores de corrente acústica Doppler, medidores PUV, medidores de distribuição de tamanho de partículas de sedimentos suspensos baseados em laser e um sistema de fluorometria de design Turner. O estado de Nova Jersey financia o Laboratório para administrar o Serviço de Assistência Técnica de Proteção Costeira do Estado de Nova Jersey (CPTAS), um recurso exclusivo criado para informar e aconselhar cidadãos de Nova Jersey e funcionários do governo com relação à tecnologia de proteção costeira.

Os sistemas de modelagem de previsões e previsões de estuários e oceanos costeiros estão sendo constantemente refinados para fornecer as percepções mais precisas possíveis do ambiente marinho. A base dos sistemas de modelagem é o Princeton Ocean Model (POM) e seu modelo derivado de águas rasas, ECOMSED (Estuarine and Coastal Ocean Model with Sediment Transport). Eles são o componente central de modelagem do Sistema de Observação e Previsão do Porto de Nova York do Laboratório. NYHOPS é um sistema de previsão e observação em tempo real que fornece informações contínuas sobre as condições atuais do oceano e do clima em toda a região e previsões de condições em até 48 horas. Os dados em tempo real e as previsões dos modelos são divulgados ao público pela Internet em www.stevens.edu/maritimeforecast.

Laboratório de Segurança Marítima

O Laboratório de Segurança Marítima facilita avanços em métodos e tecnologias relevantes para a segurança marítima. O Laboratório foi projetado para permitir experimentos em nível de sistema e modelagem baseada em dados no ambiente complexo de um estuário urbano de marés. O foco do laboratório está nas ameaças subaquáticas e nas ameaças de pequenas embarcações com intenções hostis. O laboratório está trabalhando constantemente para lidar com ameaças futuras à medida que são identificadas. Ele criou e demonstrou um conjunto de tecnologias e metodologias de sensoriamento inovadoras e um conjunto de integração de dados e metodologias de destilação de dados complementares, que, quando usadas em conjunto, mostram um alto potencial para proteger navios de forma confiável. Tipos adicionais de sensores de protótipo de pesquisa, sistemas de detecção, metodologias de detecção e metodologias de aprimoramento de detecção refinadas estão atualmente sendo modelados e testados experimentalmente. Uma infraestrutura de laboratório foi estabelecida no rio Hudson, conectada ao campus Stevens em Hoboken. Esta infraestrutura de laboratório está sendo aumentada com plataformas adicionais na água, incluindo veículos subaquáticos não tripulados (UUV s) e recursos adicionais de integração de dados em terra e destilação de dados para suportar uma gama mais ampla de tecnologias de detecção, sistemas de detecção e metodologias de aprimoramento de detecção.

O Laboratório fornece aos pesquisadores, e outros que desejam usar o laboratório, um ambiente de teste do mundo real e uma infraestrutura de plataformas na água, links de comunicação e integração de informações e sistemas de destilação (computadores, processamento baseado em software associado algoritmos e dados armazenados): que estão sendo aproveitados para testar de forma rápida e fácil novos tipos de tecnologias de detecção, sistemas de detecção e metodologias de detecção / detecção, incluindo metodologias que combinam vários tipos de sensores e sistemas de detecção.

Centro de espectrometria de massa

A espectrometria de massa, uma disciplina científica que avança rapidamente com tremendo potencial de emprego, tem aplicações qualitativas e quantitativas de longo alcance nos campos ambiental, biológico, bioquímico, farmacológico, forense e geoquímico.

Como uma das instalações acadêmicas mais bem equipadas dos Estados Unidos, o Centro recebe projetos de pesquisa colaborativa da comunidade Stevens e de fontes externas. Os programas de pesquisa de nível de fronteira incorporam os esforços daqueles que gostariam de ganhar experiência com espectrometria de massa, bem como pesquisadores de nível avançado envolvidos com os mais recentes desenvolvimentos na área. Nossos instrumentos são adequados para uma ampla variedade de compostos orgânicos, incluindo proteínas, peptídeos, aminoácidos, alcalóides, esteróides, flavanoides, sacarídeos, lipídeos, ácidos nucléicos, polímeros, produtos de petróleo e organometálicos. Nossos analisadores de massa são baseados em técnicas de tempo de vôo e quadrupolar. Um dos novos instrumentos apresentados neste centro é um espectrômetro de massa Q-TOF API-US. Este instrumento híbrido incorpora dois analisadores de massa em tandem: um filtro quadrupolo de alto desempenho como o primeiro estágio e um analisador de tempo de vôo de aceleração ortogonal com um poder de resolução de massa de 17.500 como o segundo.

Centro de Gerenciamento do Ciclo de Vida do Produto (CPLM)

Outra unidade de pesquisa é o Centro de Gerenciamento do Ciclo de Vida do Produto (CPLM), um ponto focal para informações e tecnologia em produtos plásticos ao longo de seu ciclo de vida: design, fabricação, uso e descarte. Trabalhando com a indústria e o governo, a CPLM enfatiza o desenvolvimento de produtos e processos de fabricação que reduzem o potencial de riscos e problemas ambientais significativos e promovem o crescimento sustentável. As atividades da CPLM incluem pesquisa de produtos e processos de contrato, estudos de engenharia, programas educacionais e de treinamento e serviços de extensão industrial de transferência de tecnologia. O centro usa três outras instalações:

  • o Laboratório de Qualidade de Água Blandford está equipado para todas as determinações químicas e microbiológicas padrão usadas no campo de água e esgoto. Isso inclui espectroscopia de absorção atômica, cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alto desempenho.
  • o Waterfront Tower Facility, uma torre de dez andares e 3.000 pés quadrados, é usada para conduzir o tratamento de resíduos em escala piloto e o desenvolvimento e teste de tecnologia de destruição. Esta instalação única pode acomodar a construção de instalações de tratamento muito altas. Várias configurações em escala piloto estão em operação, incluindo uma coluna estacionada de remoção de vapor de 12 metros de altura.
  • o Navio de Pesquisa, Phoenix, é usado para a realização de estudos de poluição em águas estuarinas e costeiras. Este navio de 25 pés de comprimento foi equipado para realizar experimentos com traçadores de tinta, coletar amostras de qualidade da água e obter observações de velocidade, salinidade e temperatura da água. O Phoenix tem o nome de um barco a vapor do início do século 19 construído pela família Stevens.

Centro de Pesquisa em Gestão de Tecnologia (CTMR)

O CTMR realiza pesquisas sobre questões relacionadas à inovação e à gestão de tecnologias em um contexto global. Nossa missão é desenvolver conceitos e estruturas para ajudar os executivos a enfrentar os desafios de um mundo baseado em tecnologia que muda rapidamente. Os resultados da pesquisa são disseminados por meio de publicações, livros, papéis de trabalho, uma conferência anual e fóruns de patrocinadores. O CTMR apóia o tema Tecnogênese do Stevens Institute of Technology - a fronteira educacional em que professores, alunos e colegas da indústria alimentam conjuntamente o processo de concepção, design e realização de mercado de novas tecnologias.

Laboratório de Visão Computacional

O objetivo principal da pesquisa realizada no Laboratório de Visão Computacional é aplicar princípios físicos e matemáticos rigorosos à interpretação de imagens. O trabalho realizado no laboratório é multidisciplinar, combinando diversas disciplinas acadêmicas, incluindo física, matemática, engenharia e, principalmente, informática. Algumas das principais investidas no laboratório incluem fotometria, reconstrução de formas 3-D, análise de formas, reconhecimento de objetos e imagens multiespectrais.

O Laboratório oferece aos alunos uma experiência prática com equipamentos de captura e processamento de imagens. Uma estação de trabalho dedicada é usada principalmente para a captura de imagens estáticas e filmes. O filtro sintonizável eletronicamente do laboratório, capaz de gerar imagens multiespectrais rápidas, densas, é único entre os laboratórios de visão por computador em instituições acadêmicas. As condições ambientais no laboratório são rigorosamente controladas. Se necessário, o laboratório pode se tornar uma sala escura. Uma mesa óptica permite o posicionamento preciso do equipamento. Uma coleção de componentes ópticos permite a experimentação com captura de imagem aprimorada. O laboratório possui seu próprio servidor e várias estações de trabalho Unix para armazenamento, processamento e análise de imagens.

O Consórcio para Empreendedorismo Corporativo

O Consórcio para Empreendedorismo Corporativo (http://www.ceconsortium.org) continua a focar sua pesquisa em três áreas: otimizar o front-end da inovação, abordagens e estruturas organizacionais para chegar a avanços e criação de conhecimento e fluxo de conhecimento na frente -fim.

Por meio de sua declaração de missão - entender melhor o front-end da inovação a fim de aumentar o número, velocidade e probabilidade de sucesso de produtos altamente lucrativos que entram em desenvolvimento - o Consórcio oferece um ambiente colaborativo, onde a academia e a indústria se dedicam à parte da descoberta do front-end levando a uma inovação revolucionária.

Embora esses sejam tópicos de interesse crescente dentro da comunidade criativa corporativa, pouco foi estabelecido anteriormente. Em um mundo de tecnologias em rápida evolução, o sucesso das relações interdependentes geradas entre criadores-inovadores e seus ambientes corporativos é baseado em um conjunto cada vez mais sincronizado de eventos. O Consórcio e seus patrocinadores da indústria procuram reconhecer comportamentos e atividades que podem ser aplicados como ferramentas poderosas para aumentar a criatividade, produtividade e lucratividade. Os patrocinadores da indústria incluem: ExxonMobil Ethicon, uma franquia Johnson & Johnson e Aventis.

Instituto de Design e Fabricação (DMI)

O Design & amp Manufacturing Institute (DMI) (http://www.dmi.stevens-tech.edu/index.php) é um centro interdisciplinar que integra processamento de materiais, design de produto e experiência em fabricação com simulação e modelagem utilizando o estado da tecnologia de software de computador de última geração. Localizado no histórico Carnegie Laboratory, o DMI preenche a lacuna entre a pesquisa e o desenvolvimento orientado para a aplicação e acadêmico. A DMI faz parceria com a indústria e o governo para criar soluções práticas para os desafios de design de produto que tratam de custo, desempenho e produtibilidade ao longo do ciclo de vida do produto. A experiência da DMI abrange estudos de processamento e modelagem, desenvolvimento de produtos competitivos, multi-componentes, design de sistemas multi-processos e otimização, análise de ciclo de vida, caracterização de materiais e testes e prototipagem e manufatura rápidas.

Com base em mais de uma década de experiência em soluções de design de produtos de ponta, o Design & amp Manufacturing Institute continua a liderar o desenvolvimento de soluções de & quotpróxima geração & quot para os desafios atuais de desenvolvimento de produtos. A experiência da DMI em processos de manufatura e software baseado em conhecimento é resumida em seu sistema e desenvolvimento de metodologia Automated Concurrent Engineering Software (ACES). O sistema ACES oferece aos designers de produto desempenho e modelagem de processos e otimização do ciclo de vida para sistemas de múltiplos componentes e processos. Em seu contínuo refinamento das metodologias e ferramentas de desenvolvimento de produtos da "próxima geração", como o ACES, a DMI está projetando o futuro dos produtos à base de polímeros e metais.

A DMI tem especialização particular com polímeros e compostos e mantém amplos recursos de modelagem e bancos de dados sobre materiais, processamento, ferramentas e maquinário. A Learning Factory at DMI, uma instalação de 6.000 pés quadrados, oferece um ambiente de manufatura de última geração controlado por computador. Ele oferece a representantes da indústria e estudantes a pesquisa, teste e treinamento para design e teste de produto, caracterização de materiais, prototipagem rápida e produção. Parte do DMI é o Laboratório de Manufatura Avançada, que contém máquinas NC em escala industrial com software CAD / CAM.

Laboratórios de Engenharia Elétrica e de Computação (ECE)

As instalações laboratoriais do Departamento de Engenharia Elétrica e de Computação são usadas para o ensino relacionado ao curso e problemas especiais, projetos de design e pesquisa. Os alunos são expostos a uma variedade de problemas práticos em trabalhos de laboratório. Os laboratórios de pesquisa também estão fortemente envolvidos na educação de graduação e pós-graduação.

  • Centro de Sistemas Inteligentes em Rede (iNetS)
    Uma parte significativa do programa de pesquisa ECE é entregue por meio do Centro de Sistemas em Rede Inteligentes (iNetS), um centro do Instituto que promove os princípios e práticas de sistemas em rede de geração futura. O INetS busca dotar os sistemas em rede com a inteligência para fornecer uma base para futuros sistemas em rede para avançar os objetivos de desempenho, segurança e interoperabilidade.

O Departamento de ECE também oferece uma série de laboratórios temáticos focados em tópicos de pesquisa específicos. Esses laboratórios, resumidos a seguir, apóiam os grandes temas de sistemas sem fio, sistemas multimídia, sistemas de informação e plataformas móveis, como robôs autônomos.

  • Laboratórios de sistemas embarcados
    Os sistemas incorporados baseiam-se em tópicos de engenharia elétrica, engenharia da computação e ciência da computação para criar sistemas inteligentes que integram princípios de co-design de hardware / software, co-design de hardware analógico / digital (técnicas de sinais mistos), sistemas operacionais em tempo real e programáveis componentes computacionais (microprocessadores, processadores de sinais digitais, etc.). O Laboratório de Sistemas Embarcados e Robótica, o Laboratório de Automação e o Laboratório de Sistemas Inteligentes Reconfiguráveis ​​exploram os princípios de design e realização de sistemas embarcados, incluindo extensão para aplicativos representativos, como robôs autônomos.
  • Laboratórios de sistemas sem fio
    O Wireless Information Systems Engineering Lab, o Wireless Research Lab e o Wireless Networks Lab destacam o projeto e a engenharia de sistemas sem fio avançados, incluindo telefonia celular e PCS, LANs sem fio, comunicações por satélite e links sem fio específicos para aplicativos. A pesquisa inclui a aplicação de algoritmos e tecnologias avançadas de processamento de sinal a sistemas de comunicação sem fio. A principal motivação das comunicações sem fio é a eliminação de um fio físico conectado ao sistema do usuário. No caso de comunicações de computador (por exemplo, capacidades de LAN e modem), a transição para conexões sem fio permite a realização da verdadeira conectividade de & quot em qualquer lugar & quot para serviços de comunicação de dados.
  • Laboratório de Comunicações e Processamento de Sinais
    Os sistemas de comunicação contam com amplo processamento de sinal, em preparação para sua transmissão, para corrigir as distorções do sinal durante a transmissão e para extrair o sinal original do sinal recebido. O processamento digital de sinais é um facilitador importante dos sistemas de comunicação contemporâneos, fornecendo a flexibilidade e confiabilidade dos algoritmos computacionais para fornecer uma ampla variedade de operações em sinais. Os Laboratórios de Processamento de Sinais e Comunicações se concentram nos avanços nos princípios básicos do processamento de sinais e na aplicação do processamento de sinais aos sistemas de comunicação contemporâneos.
  • Laboratórios de processamento de imagem e multimídia
    O alto poder de computação e os grandes recursos de armazenamento de dados dos sistemas de computador contemporâneos, junto com as altas taxas de dados das redes atuais, tornaram práticas muitas técnicas sofisticadas usadas para imagens e vídeos bidimensionais e tridimensionais. O Visual Information Environments Lab destaca os avanços no processamento de imagem subjacente e algoritmos de visão por computador que servem como base para uma ampla gama de aplicações. Relacionada a esses ambientes visuais está a área geral de multimídia, combinando informações visuais, de áudio e outras informações sensoriais em uma estrutura integrada. O Laboratório de Comunicação e Rede de Sistemas Multimídia explora as várias questões relacionadas às comunicações confiáveis ​​e seguras de informações multimídia em redes. Temas relacionados a informações seguras também são explorados.
  • Laboratório de design de sistemas de rede segura
    O uso extensivo atual de sistemas de informação eletrônicos (incluindo redes de dados, sistemas de armazenamento de dados, computadores digitais, etc.) revolucionou o acesso comercial e pessoal a informações e a troca de informações. No entanto, surgem problemas sérios na segurança da informação, garantia da identidade do usuário final, proteção do sistema de informação, etc. O Laboratório de Design de Sistemas de Rede Segura fornece testes físicos e sistemas / recursos de computador para a exploração deste amplo problema.

Laboratório de materiais engenheirados

O Laboratório de Materiais de Engenharia concentra-se nos aspectos de projeto e fabricação de materiais compostos de alto desempenho. Os impulsos do projeto atual incluem o desenvolvimento e validação de um sistema de simulação de fabricação de compósitos multifísicos, estudos sobre tensões residuais induzidas por processo e comportamento dos compósitos em ambientes termicamente agressivos. O laboratório possui um enrolador de filamento de dois eixos, um molde de transferência de resina instrumentado e um sistema de laminação robótico.

Instituto de Materiais Altamente Preenchidos (HFMI)

O Highly Filled Materials Institute (HFMI) (http://www.hfmi.stevens.edu/) foi estabelecido no Stevens Institute of Technology em 1989 para investigar, tanto experimentalmente quanto teoricamente, o comportamento reológico, microestrutura, processabilidade e propriedades finais de materiais altamente preenchidos, incluindo suspensões e dispersões concentradas de líquidos geralmente poliméricos incorporados com partículas rígidas em concentrações que visam se aproximar da fração de empacotamento máxima da fase sólida.

Materiais altamente preenchidos são encontrados em vários setores relacionados às ciências da vida, produtos de cuidados pessoais, produtos alimentícios intermediários e finais, baterias, masterbatches poliméricos e compostos, produtos de construção, energéticos, compostos, magnéticos e cerâmicos.

O foco do Centro se ampliou consideravelmente ao longo dos anos e abrange a síntese, composição, caracterização, simulação e processamento de uma miríade de fluidos complexos, incluindo polímeros biodegradáveis, nanossuspensões, géis / hidrogéis, surfactantes vesiculares e outros fluidos estruturados.

Uma das principais áreas de foco atuais do HFMI é o desenvolvimento de biomateriais, especialmente andaimes biodegradáveis ​​para aplicações de engenharia de tecidos e construções para liberação controlada de medicamentos. Por exemplo, a HFMI desenvolveu uma série de novos métodos para fabricar com precisão andaimes tridimensionais funcionalmente graduados que permitem mudanças na composição, porosidade, propriedades mecânicas e taxas de biodegradação para variar em função da localização no andaime. A HFMI também desenvolveu um processo híbrido que combinou extrusão de parafuso duplo com eletrofiação para permitir a geração de nanofibras com perfis de concentração de nanopartículas sob medida. As áreas de pesquisa de longo prazo incluem a compreensão do comportamento de escorregamento da parede, desenvolvimento de instabilidades de fluxo, soluções de problemas inversos para determinação de parâmetros, modelagem matemática usando métodos analíticos e numéricos e processamento de fluidos complexos, especialmente fluidos viscoplásticos sujeitos a escorregamento.

O HFMI realizou mais de 120 concessões e contratos para empresas e organizações governamentais. Este alto nível de atividade de financiamento mantém o HFMI em contato próximo com várias indústrias concomitantemente e permite que o HFMI defina melhor seus objetivos de pesquisa. Um conselho consultivo industrial orienta o HFMI na realização de pesquisas de contrato de curto e longo prazo para agências governamentais e corporações. A pesquisa patrocinada é realizada pela equipe profissional do HFMI, juntamente com assistentes de pesquisa.

Além disso, o HFMI realiza pesquisas em nível de doutorado por meio de mecanismos de supervisão colaborativa estabelecidos pelos professores Kalyon, Fisher, Yu, Wang e Ritter.

As instalações do HFMI são equipadas com equipamentos de última geração, incluindo um minissupercomputador e estações de trabalho gráficas para simulação numérica de processamento contínuo e em lote de tamanho industrial, incluindo extrusoras de duplo parafuso co-rotativas e contra-rotativas cisalhamento e reômetros extensionais sistemas computadorizados de aquisição de dados e controle de processos calorimetria de varredura diferencial análise termogravimétrica e equipamentos para caracterização de distribuições microestruturais, propriedades magnéticas e elétricas, molhabilidade e análise de imagens. As tecnologias proprietárias de HFMI incluem métodos de blindagem magnética, reometria on-line, métodos de descarte de munições químicas, grau quantitativo de mistura baseado em raios-X e técnicas de análise de distribuição de tamanho de partícula e códigos-fonte tridimensionais baseados em FEM para simulação de EMF mitigação, extrusão, moldagem e fluxos de matriz.

Howe School Alliance for Technology Management

A Howe School Alliance for Technology Management é uma colaboração entre empresas, governo e academia que ajuda suas organizações parceiras a gerenciar melhor a tecnologia para obter vantagens estratégicas. Tem transferido as melhores práticas por meio de seminários, conferências, reuniões de mesa redonda e publicações desde 1991. Os parceiros têm a oportunidade de trocar idéias em um ambiente colegial com o corpo docente da Howe School of Technology Management e com uma rede de pessoas em outras organizações que lidam com questões semelhantes.

A Aliança lida com um grupo muito diverso de questões sob o amplo guarda-chuva do gerenciamento de tecnologia. Os tópicos abordados incluem inovação como estratégia contínua, redesenho de processos de negócios, realização de avanços radicais, gerenciamento de propriedade intelectual, processos para concepção de produtos, seleção de projetos, métricas para medir a eficácia de pesquisa e desenvolvimento, gerenciamento de portfólio de pesquisa e desenvolvimento, gestão de conhecimento, gestão inovação, gerenciamento de projetos, desempenho da equipe de novos produtos e terceirização do desenvolvimento de tecnologia.

Os atuais parceiros da aliança são AT&T Infineum ISO Lucent Technologies Teknor Apex, o Centro de Pesquisa, Desenvolvimento e Engenharia do Exército dos EUA e o Programa de Sistemas Estratégicos da Marinha dos EUA. Por meio de seus programas educacionais, sua pesquisa e sua transferência efetiva de práticas de gestão, a Howe School Alliance ajudou várias organizações e contribuiu para o desenvolvimento profissional de milhares de profissionais e executivos de tecnologia ao longo de um período de 15 anos.

Tecnologia da Informação

A Tecnologia da Informação (http://www.stevens.edu/it/) oferece suporte a sistemas de computação acadêmica e administrativa, tecnologia educacional, rede de campus e instalações de telecomunicações, servidores Web e muitos recursos de computação e rede localizados em todo o campus. Os serviços de servidor de infraestrutura são baseados em plataformas UNIX de vários fornecedores e Microsoft Windows.

Uma extensa rede oferece suporte à comunicação de todos os edifícios acadêmicos e administrativos e residências universitárias para todos os sistemas. Mais de 6.500 nós são suportados na rede do campus com velocidades de acesso de até 100 Mbps e velocidades de rede central de 1 GBps. A conectividade fora do campus com a Internet e Internet2 é fornecida por um circuito de alta velocidade de 100 MBps (OC3). Uma rede sem fio fornece acesso à rede do campus e à Internet de locais ao redor do campus. O acesso remoto à rede do campus é suportado por um pool de modems dial-in, bem como VPNs. Com um alto nível de conectividade e funcionalidade avançada acessível de locais dentro e fora do campus, nossa rede foi reconhecida como um ambiente modelo premiado para outras instituições acadêmicas e organizações comerciais.

Um laboratório de PC operado pela Tecnologia da Informação está disponível para dar suporte ao acesso de membros da comunidade do campus sete dias por semana, exceto feriados. Inclui um grande cluster de computadores pessoais, impressoras, um scanner e acesso com e sem fio à rede do campus. Laboratórios de informática adicionais são mantidos por alguns departamentos acadêmicos para atender às suas necessidades.

A Tecnologia da Informação fornece uma variedade de serviços. A equipe de Serviços ao usuário auxilia os usuários fornecendo um help desk com equipe, seminários e workshops de treinamento, documentação, atualizações de notícias oportunas e conselhos sobre acesso e uso de sistemas. A equipe coordena uma série de seminários com o objetivo de auxiliar no uso de recursos em rede. Os usuários podem solicitar assistência individual ou departamental no planejamento, implementação e uso de recursos de informação, bem como ajuda com informações gerais do sistema, conexão e interação com a rede, uso de estações de trabalho e acesso a recursos da Internet.

A Tecnologia da Informação auxilia os membros da comunidade na avaliação, aquisição e suporte de recursos em rede. Isso inclui ajuda no planejamento de novas instalações, implementação de novas tecnologias e estabelecimento de programas de suporte. A equipe de rede auxilia os usuários e departamentos no projeto e implementação de redes locais, planos de expansão de rede e aplicativos de rede. A assistência ao usuário pode ser obtida ligando para (201) 216-5500. Ajuda na compra de computadores pode ser obtida pelo telefone (201) 216-5108.

A equipe de Tecnologia da Informação tem uma longa tradição de cooperação estreita com os alunos. Estudantes de graduação e pós-graduação são empregados como consultores de usuário em tempo parcial (help desk), assistentes técnicos de residências, assistentes de laboratório de computador pessoal e técnicos de suporte de rede. Todos esses alunos trabalham em estreita colaboração com a equipe de Tecnologia da Informação, ganhando valiosa experiência prática enquanto buscam seus diplomas.

Laboratório Geoambiental W. M. Keck

O Laboratório de Engenharia Geoambiental Keck é uma nova instalação totalmente equipada para geotécnica automatizada por computador de última geração, bem como para testes ambientais de solo e meios hídricos. Alguns dos principais equipamentos disponíveis incluem: recursos de difração de raios-X para caracterizações mineralógicas, microscópio eletrônico de varredura para estudos morfológicos de superfície, medidor de potencial zeta para análises de carga de superfície sólida, instalações de química úmida integradas para acomodar qualquer tipo de teste físico-químico e ambiental do solo, como partículas e distribuição de tamanho de poro, área de superfície, capacidade de troca catiônica, extração em lote e sequencial, teor de óxido, consolidação, teste de resistência ao cisalhamento triaxial e direto, permâmetros de parede rígida e flexível e câmaras de durabilidade CBRs para simular tensões ambientais, como congelamento e descongelamento, umidificação e secagem, névoa salina e exposição à chuva ácida, bem como outras condições de campo de intemperismo acelerado e coleta de amostra completa e configurações de preparação de amostra.

Alguns de nossos estudos atuais envolvem: teste das propriedades ambientais e de engenharia de cinzas volantes, cinzas de incineração e outros resíduos industriais subprodutos materiais para avaliar seu uso em aplicações de construção avaliar as propriedades de materiais dragados para reutilização em projetos de transporte, tratamento e gerenciamento de resíduos perigosos, com foco na imobilização de metais pesados ​​e hidrocarbonetos de petróleo em geoambientes, estudo do destino e transporte de contaminantes na melhoria da superfície subsuperficial de meios de filtração de águas residuais industriais atualmente usados, desenvolvimento de protocolos de lixiviação, etc.

Laboratório de Sistemas Seguros

A missão do Laboratório é ser o pioneiro em novas tecnologias para sistemas de alta garantia e segurança e ferramentas de protótipo que podem fornecer garantias de que um sistema não exibirá um comportamento imprevisível em um ambiente hostil. O objetivo é consolidar e organizar os esforços de pesquisa e construção de ferramentas já em andamento na Stevens. O Laboratório é financiado por doações da Comissão de Ciência e Tecnologia de Nova Jersey, da National Science Foundation e do Stevens Institute of Technology Technogenesis Fund. As instalações do Laboratório incluem várias máquinas desktop, PDAs com Ethernet sem fio e dispositivos Bluetooth para experimentação. O laboratório é afiliado ao New Jersey Institute for Trustworthy Enterprise Software.

Parte do trabalho de pesquisa concentra-se na construção de melhores modelos de confiança para componentes. Parte deste trabalho está usando técnicas de análise estática para verificar o controle de acesso e as propriedades do fluxo de informações para componentes não confiáveis. Também há trabalho para levar a segurança de tipo das linguagens de alto nível para o nível da linguagem assembly e, no processo, verificar as propriedades de uso do espaço de heap. Outro trabalho foi em sistemas de tipos para links dinâmicos e atualizações "quentes" de bibliotecas de programas em tempo de execução.

Outro impulso do trabalho no Laboratório tem sido a segurança de rede, especialmente para redes sem fio. O trabalho continua em ataques que podem ser montados em redes sem fio ad hoc e no projeto de novos protocolos de autenticação e estabelecimento de chaves que podem ser usados ​​para melhorar a segurança da comunicação sem fio em geral. Trabalhos recentes também examinaram abordagens baseadas em tipo para criptografia para especificar e garantir garantias de confiabilidade para canais de comunicação.

Uma nova área de pesquisa do Lab é o estudo de transações eletrônicas seguras, como operações bancárias ou votação. O trabalho consiste em usar padrões seguros de comunicação descritos usando sistemas de tipo para detectar modificações não autorizadas de dados entre partes que se comunicam de confiança.

O Laboratório tem uma série de seminários onde convidados da indústria e da academia, bem como membros da comunidade Stevens, apresentam avanços recentes em todas as áreas de segurança de computador.

Lawrence Schacht Management Laboratory

Hoje, educar engenheiros, cientistas e gerentes requer mais do que instalações laboratoriais tradicionais. O Lawrence Schacht Management Laboratory oferece instalações para aprender e praticar habilidades de negócios em ambientes realistas: para aprender a arte e a ciência de fazer apresentações eficazes, para compreender e melhorar as habilidades interpessoais e organizacionais, para desenvolver as habilidades computacionais necessárias no mundo competitivo de hoje, e realizar pesquisas em gestão e gestão de tecnologia.

O laboratório é composto por uma sala de seminários e cinco salas de conferências, um laboratório de computação e um centro de rede e controle de vídeo. Câmeras de vídeo e telas em cada uma das salas de conferência podem ser operadas e controladas remotamente a partir do centro de controle. Conexões de rede e vídeo são instaladas em todo o laboratório, permitindo que as atividades do laboratório combinem o uso de áudio, vídeo e técnicas de computação.

Essas instalações são adequadas para uso em muitos programas acadêmicos. Por exemplo, os alunos praticam as habilidades de apresentação na sala de seminário, e os alunos de graduação e pós-graduação simulam uma variedade de situações gerenciais nas salas de conferência enquanto aprendem a dinâmica de pequenos grupos. Os exercícios podem ser monitorados e filmados por um gestor experiente que pode tanto intervir no processo quanto orientá-lo, ou oferecer críticas e feedback imediatamente após sua conclusão.

Além de fornecer aos alunos experiências educacionais valiosas, o laboratório é usado em gerenciamento e outras pesquisas em pequenos grupos. O laboratório é projetado para acomodar experimentação controlada em funções e processos gerenciais. Nosso objetivo final na pesquisa em gestão é compreender o mecanismo de gestão no que se refere aos indivíduos envolvidos, sua organização e a comunidade em geral.

A parte do centro de computação do laboratório inclui trinta computadores pessoais avançados, todos conectados à rede de todo o campus. O equipamento complementa o treinamento de estudantes de administração, permitindo-lhes acessar e treiná-los no uso de ferramentas analíticas totalmente suportadas em contabilidade, estatística e simulações. A partir dos computadores do Schacht Lab, os alunos podem acessar e usar os recursos mundiais disponíveis pela Internet em seus projetos e tarefas.

Laboratório de Materiais / Estruturas

O Laboratório de Materiais / Estruturas está equipado para testes de materiais de última geração. O equipamento inclui uma máquina de teste de tensão de compressão universal de 400.000 lb. / 200.000 lb., um sistema de aquisição de dados computadorizado, aparelho de teste de congelamento-descongelamento de quadro de carregamento de feixe, máquina de compressão de teste Versa, permeâmetros de parede flexível de alta pressão e câmaras de teste ambiental. Os estudos atuais incluem concreto de alta resistência, concreto reforçado com fibra, uso de subprodutos na produção de concreto e durabilidade de materiais na construção.

Laboratórios de Engenharia Mecânica

  • Alfred W. Fielding Computer-Aided Design Laboratory
    Este laboratório contém várias estações de trabalho de alta velocidade e periféricos atendidos por redes locais. O software instalado inclui o pacote CAD / CAM de uso geral Pro-Engineer e Solid Works, bem como códigos de elemento finito ABAQUS, ALGOR, ANSYS e Pro-Mechanica.Também estão instalados vários pacotes de design, análise e educacional para fins especiais.
  • Instalação de veículos aéreos limpos
    O Clean Air Vehicle Facility concentra-se em métodos para reduzir as emissões de poluentes automotivos. O laboratório abriga um dinamômetro de chassi de eixo único de 50 HP e um dinamômetro de motor de 1000 HP com instrumentação totalmente computadorizada. Os sistemas de amostragem e análise de emissões permitem a determinação precisa de CO, CO2, Boi, NOx, hidrocarbonetos totais, metano e hidrocarbonetos não metânicos em amostras de gases de escape brutas ou de volume constante.
  • Laboratório de Mecânica dos Fluidos
    Este laboratório inclui um túnel de vento subsônico de baixo ruído com várias seções de teste fabricadas sob medida, uma plataforma de teste de desempenho de bomba, um soprador e uma plataforma de teste de fluxo interno, uma bancada hidráulica e configurações experimentais para medição de fluxo, força de um jato, e análise dimensional / semelhança. O laboratório está totalmente conectado em rede e inclui espaço para apoiar projetos de graduação e pós-graduação e projetos de pesquisa em aerodinâmica e hidráulica com instrumentação de fluxo moderna e sistemas de aquisição de dados auxiliados por computador.
  • Laboratório de design sênior Kenneth A. Roe
    Esta instalação oferece espaço de trabalho e suporte (instrumentação, ferramentas, etc.) para o design, construção e teste de projetos de design de ponta em Engenharia Mecânica. O laboratório serve de base para todas as equipes de design sênior. Possui bancadas de trabalho para pelo menos dez equipes de design para construir e montar protótipos.
  • Laboratório de Sistemas Mecânicos
    Este laboratório abriga 10 configurações experimentais em mecanismos, sistemas de máquinas e robótica, incluindo aparelhos para experimentos em vibrações de sistemas de máquinas (resposta natural, resposta ao degrau, resposta de frequência, ressonância, etc.), mecanismos de engrenagem (valor do trem, rígido vs . máquina flexível, etc.) e balanceamento de rotores, bem como os experimentos com vários sensores de deslocamento para medir a deflexão do feixe e calcular a rigidez do feixe, para medir a folga existente em juntas mecânicas e sistema de movimento, e para medir erros de movimento em sistemas mecânicos de vários componentes. Vários manipuladores de robôs educacionais e plataformas móveis baseadas em Lego estão incluídos.
  • Laboratório de Formação de Metais (MFL)
    Este laboratório se concentra no avanço do estado da arte em modelagem computacional de processamento termo-mecânico de metais. Os resultados das simulações em computador são verificados por meio de técnicas experimentais. Os processos de fabricação investigados incluem forjamento, laminação, extrusão e estampagem. Projetos recentes exploraram as mudanças na microestrutura em metais durante o forjamento a quente de componentes aeroespaciais, em que o tamanho de grão resultante é previsto em função dos parâmetros de processamento usando modelos heurísticos e abordagens numéricas em múltiplas escalas de comprimento.
  • Laboratório de MicroDispositivos
    O MicroDevice Laboratory (MDL) é uma sala limpa classe 100 alojada no Design and Manufacturing Institute em Stevens. O MDL abriga uma variedade de equipamentos de pesquisa de última geração para pesquisa e desenvolvimento de nano e microdispositivos, incluindo software e ferramentas de simulação necessárias para o projeto e análise inicial de microdispositivos, fotolitografia e recursos de corrosão / deposição para fabricação de dispositivos e várias ferramentas e instrumentação para caracterização e teste de dispositivos. Os principais equipamentos disponíveis na instalação incluem: SF-100 Auto Stage (Sistema de Litografia Sem Máscara), Spin Coater (Laurell), Spin Rinse Drier (STI), Polimento Químico-mecânico, Microscópio, Estação de Sonda (Signatone), Medição de Filme Fino (Prometrix ) e um microscópio de força atômica Nano-R2 do Pacífico (AFM). Duas concessões recentes de Instrumentação de Pesquisa Principal da National Science Foundation (NSF) forneceram recursos adicionais: um sistema de gravação de plasma indutivamente acoplado (ICP) SAMCO RIE-101iPH de última geração fornecerá a capacidade de gravar anisotropicamente todos os tipos de semicondutores, isolantes e filmes metálicos, enquanto um sistema Zyvex KZ100 com microscópio eletrônico de varredura FEI XL-40 (SEM) dedicado permitirá nanomanipulação in situ e recursos de nanocaracterização inigualáveis.
  • Laboratório de Nanomecânica e Nanomateriais
    Este laboratório estuda o comportamento de sistemas de materiais avançados em nanoescala, incluindo polímeros e nanocompósitos poliméricos e filmes finos e materiais piezoelétricos de interesse em aplicações de MEMS. Os esforços de pesquisa atuais incluem micro / nanomecânica, propriedades de estrutura de processamento de nanocompósitos de polímero e abordagens piezoelétricas para aplicações de coleta de energia. Um analisador mecânico dinâmico TA Instruments RSA III permite a caracterização mecânica dependente do tempo, frequência e temperatura em temperaturas de 150 C a 600 C. A detecção de força de alta resolução é realizada por um transdutor de rebalanceamento de força patenteado com uma faixa de 0,01 a 35 N. Os acessórios especiais permitem uma variedade de configurações de teste, incluindo filme e tensão de fibra, flexão fixada, compressão de placa paralela e uma braçadeira de tensão de imersão permitindo testes mecânicos em um meio líquido.
  • Laboratório de Nano e Microfluídica
    Estudos de pesquisa multidisciplinares são conduzidos neste laboratório, incluindo: 1) Nano-padronização e nanofabricação, 2) Mecânica de fluidos e transferência de calor em escala múltipla (nano, micro, a macroescala), 3) Dispositivos optofluídicos integrados e 4) Interações Célula-Material. O laboratório está equipado com um sistema de litografia de interferência a laser de espelho Lloyd capaz de nano-padronização de grandes áreas (até 6 6 ) com controle de padrão superior (grade bem ordenada e padrões de pós de mícrons a 200 nm em periodicidade) , que é operado em uma sala limpa modular (Classe 10.000, 8 12 8 ). O laboratório também possui o aparato necessário para várias caracterizações e testes de propriedades de superfície, incluindo uma câmara ambiental de condensação / congelamento feita sob medida, um microscópio invertido, uma câmera CCD, um limpador de plasma e uma coifa sem dutos.
  • Laboratório de Engenharia de Nano / Micro Estruturas e Dispositivos
    Este laboratório explora 1) fundamentos e aplicações de dispositivos nanoeletrônicos para memória, navegação, conversão de energia e detecção, 2) processos de montagem de alto rendimento registrados para nanomateriais e 3) dispositivos piezoelétricos de alto desempenho. O laboratório está equipado com um galvanostato / potenciostato com uma estação de galvanoplastia, um sistema de deposição de vapor químico, um microscópio digital (Hirox), um evaporador térmico (compartilhado), um sistema de deposição de laser pulsado com laser Nd: YAG (comprimento de onda: 355nm) acoplado com câmara de vácuo, placas quentes, ferramentas de medição elétrica (analisador de espectro, gerador de sinal, osciloscópio digital, fonte de alimentação programável, instrumento medidor de fonte) e duas bancadas úmidas com capela.
  • Laboratório de controle de ruído e vibração
    Neste laboratório são realizadas atividades de pesquisa nas áreas de engenharia acústica, vibrações e controle de ruído. O laboratório possui uma câmara anecóica com dimensões internas de 4,52 m x 5,44 m x 2,45 m. Além disso, o Laboratório abriga instrumentação sofisticada, como analisador de sinal multicanal e transdutores de som e vibração, transdutores com adaptadores para montagem em um efetor final de robô e uma série de garras projetadas e construídas por alunos.
  • Laboratório de Engenharia de Precisão
    A instalação se concentra no avanço do estado da arte nas áreas de projeto de máquina de precisão, projeto de robô de precisão e manufatura de precisão. Sensores e atuadores de nanoprecisão, bem como máquinas de medição por coordenadas de precisão, fornecem ferramentas poderosas para pesquisa, desenvolvimento e educação. Os estudos experimentais atuais incluem o desenvolvimento de um processo inovador de afiação de roda de diamante em alta velocidade, um sistema de medição robótico de seis graus de liberdade, projeto de robô industrial de precisão e técnicas de avaliação de desempenho, robôs de serviço e sistemas de posição fina de ultraprecisão para robôs industriais.
  • Laboratório de Robótica e Automação Multi-Escala (MSRAL)
    O MSRAL realiza pesquisas de ponta em sistemas robóticos e de automação em várias escalas de comprimento: macroescala (cm a m), mesoescala (

Centro de Sistemas Microquímicos de Nova Jersey (NJCMCS)

O New Jersey Center for MicroChemical Systems foi recentemente estabelecido sob os auspícios da New Jersey Commission on Science and Technology e com doações de várias agências governamentais federais importantes, como o Departamento de Energia dos EUA e a Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA). O NJCMCS exemplifica a abordagem de Stevens à educação de doutorado - alunos, professores e parceiros industriais trabalham juntos, compartilhando ideias e fomentando a tecnologia desde a inovação até a implementação.

O NJCMCS usa uma abordagem de sistemas para projetar, manipular e controlar a reação química e os processos de separação que ocorrem em ambientes de microvolumes. Esta área de pesquisa inclui uma ampla gama de novas tecnologias, como biochips microfluídicos para descoberta de medicamentos, avaliação de catalisadores combinatórios, sistemas de micro-reatores para produção sob demanda de produtos químicos e farmacêuticos industriais e sistemas de micro-potência. A visão do Centro é se tornar um líder global no desenvolvimento de testes micro-cinéticos inovadores e metodologias de projeto para o rápido desenvolvimento, demonstração e comercialização de sistemas microquímicos. Em parceria com a indústria e o governo, o Centro desenvolve sistemas microquímicos que podem ser usados ​​em dispositivos elétricos em miniatura, em instalações de produção de produtos químicos sob demanda e em dispositivos biomédicos.

Centro de Engenharia de Software de Nova Jersey (NJCSE)

Os membros do Departamento de Ciência da Computação possuem uma grande bolsa da Comissão de Ciência e Tecnologia de Nova Jersey (NJCS & T), com foco na pesquisa em aspectos de engenharia de software de redes e programação distribuída. Este subsídio é realizado em conjunto com o New Jersey Institute of Technology (NJIT) e a Rutgers University, New Brunswick.

O Centro de Engenharia de Software de Nova Jersey (NJCSE) foi fundado em meados de 2000 como o braço corporativo (transferência de tecnologia) dessa atividade de pesquisa. NJCSE é baseado em Stevens.

As instituições acadêmicas afiliadas ao NJCSE são o Stevens Institute of Technology, o New Jersey Institute of Technology, a Rutgers University em New Brunswick e a Monmouth University.

As atividades do NJCSE incluem reuniões técnicas regulares com Stevens, Rutgers e pesquisadores do NJIT e representantes da indústria. Outras atividades incluem uma Mostra de Projeto do Aluno e um Programa de Oportunidades de Carreira. Desde 1o de janeiro de 2001, as afiliadas do setor incluíam Avaya, Telcordia, Rational e IBM. A NJCSE oferece às empresas programas técnicos de última geração e acesso antecipado a alguns dos melhores graduados em Ciências da Computação em Nova Jersey.

Instituto de software empresarial confiável de Nova Jersey

O New Jersey Institute for Trustworthy Enterprise Software foi estabelecido por uma concessão da New Jersey Commission on Science and Technology. O foco do Instituto é melhorar a confiabilidade, confiabilidade e segurança do software empresarial, especialmente para aplicativos distribuídos e da Internet. O Instituto é formado por parceiros da Stevens, da Rutgers University e do New Jersey Institute of Technology. Ela está sediada em Stevens e está envolvida nas seguintes pesquisas: negócios eletrônicos seguros, programação confiável da Internet, componentes seguros e programação de componentes, processamento de documentos, processos de design de software e engenharia da Web. O Instituto é afiliado ao Laboratório de Sistemas Seguros e ao Laboratório de Engenharia de Software, e patrocinou vários simpósios de pesquisa em Software Confiável e Segurança Cibernética, realizados em Stevens.

Consórcio de Ciências Marinhas de Nova Jersey

Stevens é membro do consórcio que foi estabelecido para fornecer recursos para a realização de pesquisas de ciência marinha e engenharia nas águas costeiras de Nova Jersey. O consórcio mantém três navios de pesquisa, com comprimento de 25 a 60 pés, junto com um amplo conjunto de instrumentação oceanográfica, que está disponível para uso por professores e alunos da Stevens. Além disso, o consórcio opera estações de campo em Sandy Hook e Seaville, NJ. Finalmente, o consórcio serve como um ponto focal para reunir diversos especialistas para atacar problemas interdisciplinares substanciais no meio ambiente marinho. Nossos professores e alunos participaram de vários grandes estudos realizados pelo consórcio.

Laboratório de Comunicações Óticas

Neste laboratório são realizadas pesquisas em sistemas e componentes de comunicação óptica com instrumentação óptica e eletrônica assistida por computador. As propriedades das fibras óticas monomodo, amplificadores de fibra ótica dopados com Er, transmissores e receptores óticos de banda larga, lasers semicondutores sintonizáveis ​​de cavidade externa, diodos laser de frequência única e sensores de fibra ótica são estudados e testados usando lasers de pulsação rápida, sintetizadores de sinal , analisadores de espectro, espectrômetros e uma ampla variedade de instrumentos ópticos. Os efeitos do cabeamento e da temperatura na propagação de sinais ópticos são investigados. Os sistemas de comunicação de fibra óptica de ultra-alta frequência estão sendo projetados e testados para uso em telecomunicações e vazamentos de vídeo.

Física e Engenharia Laboratórios de Pesquisa Física

As instalações de Física e Engenharia Física incluem o seguinte:

    Centro para sistemas quânticos controlados
    O Centro de Sistemas Quânticos Controlados (CCQS) é um centro de pesquisa interdisciplinar que envolve colaborações entre vários grupos de pesquisa com foco em um dos últimos desafios da pesquisa: controlar (e, portanto, empregar para futura aplicação) o sistema quântico. Novas ondas de tecnologias estão normalmente conectadas a avanços na pesquisa que permitiram um maior controle da natureza e abriram caminhos para aproveitar o potencial recém-descoberto. O limite de controle de hoje é baseado principalmente na natureza da mecânica quântica, e embora os físicos tenham explorado os fenômenos da mecânica quântica de sistemas quânticos como átomos, moléculas e o estado sólido por décadas, apenas alguns tentaram controlar a dinâmica desses sistemas em real Tempo.

Uma das principais direções do centro é baseada em técnicas ópticas para controlar sistemas quânticos. O advento de lasers ultrarrápidos e técnicas de resfriamento a laser nos últimos anos finalmente abriu a possibilidade de controlar a dinâmica quântica. Isso pode ser alcançado usando lasers de femtossegundos ultrarrápidos para sondar os sistemas em escalas de tempo muito mais curtas do que a escala de tempo para a qual a coerência de fase da mecânica quântica é mantida, ou manipulando diretamente as fontes ambientais que destroem a coerência de fase. Por outro lado, as técnicas de resfriamento e aprisionamento a laser podem ser usadas para criar sistemas com temperaturas tão baixas e bem isoladas do ambiente circundante que os tempos de coerência de fase podem ser aumentados em muitas ordens de magnitude. A capacidade de controlar com precisão a fase e a amplitude dos pulsos de laser fornece um alto grau de personalização em sua interação com a matéria.

O trabalho neste centro irá contribuir e direcionar o desenvolvimento de novas tecnologias baseadas na mecânica quântica, como computadores quânticos, novos tipos de sensores de estado sólido e interferométricos e fontes de luz com estatísticas de fótons personalizáveis ​​e propriedades de coerência. Uma característica única deste centro é a estreita colaboração entre grupos teóricos e experimentais. Isso fornece a oportunidade para os alunos ganharem experiência de pesquisa teórica e experimental trabalhando no mesmo projeto.

    Laboratório de NanoFotônica - Prof. S. Strauf
    A pesquisa no NanoPhotonics Lab concentra-se em novos materiais funcionais, como cristais fotônicos, pontos quânticos semicondutores e nanotubos de carbono. Eles oferecem oportunidades ricas para pesquisas fundamentais de interação luz-matéria em nanoescala e novas rotas para aplicações de dispositivos semicondutores no processamento óptico de informações. Os tópicos incluem nanolasers de limiar ultrabaixo, fontes de luz não clássicas para criptografia quântica, conversores nanoplasmônicos e, além disso, dispositivos fotônicos biofuncionalizados como sensores de biomolécula e células solares híbridas de coleta de luz. Como um objetivo de longo prazo, estamos buscando combinar esses dispositivos em um chip para criar circuitos ópticos que, em última instância, substituirão nossos chips eletrônicos existentes, uma vez que têm uma funcionalidade sem precedentes, largura de banda muito maior e, ainda assim, habilidades imprevistas.

    Grupo de Dinâmica Ultra-rápida e Teoria de Controle - Prof. S. Malinovskaya
    Compreensão da dinâmica molecular ultrarrápida induzida por pulsos de laser intensos e desenvolvimento de métodos de controle de laser para manipular com a teoria de sistemas quânticos de espalhamento Raman estimulado coerente (CSRS) e espectroscopia de espalhamento Raman anti-Stokes coerente (CARS) e microscopia em aplicação à imagem biológica não invasiva e investigação da dinâmica ultrarrápida de sistemas biológicos em escala de tempo real e o projeto de novos métodos de controle quântico, incluindo escultura de pulso ótico ultrarrápido e acoplamento a outras técnicas avançadas, como algoritmos de aprendizagem adaptativos. Investigamos (1) a possibilidade de excitação seletiva de vibrações predeterminadas em sistemas químicos e biológicos, (2) dissociação de pequenas moléculas seguindo a excitação do elétron do núcleo que requer energias de fótons de raios-X e (3) reações fotoinduzidas em moléculas grandes, por exemplo , fotoisomerização na molécula de rodopsina, um intermediário chave no processo de visão.

    Óptica Teórica Quântica e Onda de Matéria - Prof. C. P. Pesquisa Investigações teóricas sobre as propriedades dinâmicas de condensados ​​de Bose-Einstein atômicos e moleculares e gases de Fermi degenerados quânticos. As áreas de interesse específicas incluem a mistura de ondas não lineares de ondas de matéria, estatísticas quânticas e propriedades de coerência de ondas de matéria bosônica e fermiônica, efeitos de recuo atômico na interação entre átomos de luz e ultracold, conversão átomo-molécula via ressonâncias de Feshbach e fotoassociação e sensibilidade de fase em interferômetros de átomo. As aplicações incluem interferômetros de precisão para navegação inercial, gradiômetros de gravidade para prospecção geofísica e litografia de onda de matéria. Outras áreas de interesse incluem sistemas quânticos abertos, controle de decoerência ambiental e eletrodinâmica quântica de cavidades.

  • Laboratório de Espectroscopia e Comunicação de Laser Ultra-rápido - Prof. R. Martini (WWW.FEMTOLAB.US)
    A realização de redes de comunicação de velocidade ultra-alta com largura de banda Terahertz (THz) e acima é um dos problemas mais desafiadores da atualidade, pois os fatores limitantes são dados por propriedades físicas e leis fundamentais. Para superar as restrições, novos conceitos e materiais devem ser inventados e utilizados. Neste laboratório, investigamos a resposta de alta velocidade de novos lasers e materiais, bem como sistemas ópticos passivos e ativos usando pulsos de laser ultracurtos (& lt100fs) para desenvolver redes de alta velocidade.Além disso, as técnicas de laser ultracurtas neste laboratório nos permitem aplicar muitas técnicas de medição diferentes, acessando o mundo do "ultra-rápido". , bem como elétricas, propriedades nesta região de frequência de ultra-alta velocidade e usá-lo para novas e fascinantes aplicações neste novo "mundo de frequência."
  • Grupo de Ciência e Tecnologia da Informação Quântica - Prof. T. Yu
    Os objetivos da ciência da informação quântica são o estudo de como usar o emaranhamento como um recurso fundamental para aplicações em várias tarefas de processamento de informação, como comunicação segura quântica e computação quântica. As informações quânticas também são importantes para fornecer uma compreensão mais profunda da física quântica de muitos corpos e da base quântica. A pesquisa neste grupo se concentra na teoria e implementação da ciência da informação quântica nos domínios da óptica quântica e da física mesoscópica. Os principais interesses de pesquisa incluem dinâmica de emaranhamento e decoerência de pequenos sistemas simulações quânticas de Monte Carlo medição quântica contínua criptografia quântica controle de feedback quântico transição de fase quântica e computação quântica topológica.

    Física e Tecnologia Quântica de Elétrons - Prof. N. J. M. Horing
    Teoria de campo quântico de sistemas de muitos corpos não-equilíbrio e métodos de função de Green térmico em estado sólido e física de semicondutores e propriedades de resposta sistemas quânticos abertos flutuações de não-equilíbrio interações de superfície plasma quântico fenômenos de campo magnético alto sistemas de baixa dimensão dinâmica, propriedades dielétricas não locais e modos coletivos em quantum poços, fios, pontos e superredes eletrodinâmica nanoestrutura e propriedades ópticas teoria de transporte quântico não linear magnetotransporte, transporte de minibanda, elétrons quentes e fônons quentes em dispositivos submicrônicos sistemas mesoscópicos spintrônica relaxamento e decoerência em sistemas mecânicos nanoelétricos de nanoestruturas semicondutores (NEMS) e análise de dispositivos para cálculos quânticos.

As técnicas experimentais para abordar o nanomundo incluem: Micro-espectroscopia de sonda de varredura construída em casa (SPMS), microscopia de força atômica (AFM), óptica quântica, espectroscopia de correlação de fótons (HBT), contagem de fótons correlacionados com o tempo (TCPC), interferometria, criogênica (4K), lasers sintonizáveis ​​e de pulso curto, novas nanossondas (SNOM, pontas de fibras cônicas piezoelétricas e pontas de campo próximo plasmônico), fotoluminescência (PL e PLE) e espectroscopia Raman, química de superfície, automontagem de camadas moleculares e pontos quânticos coloidais, elipsometria, polarimetria, tomografia de fótons e testes elétricos (fotocorrente e curvas IV).

    Laboratório de Luz e Vida - Prof. K. Stamnes
    Pesquisa Atmosférica / Espacial, incluindo sensoriamento remoto por satélite de medições ambientais de banda larga e radiação espectral, incluindo inferência de radiação ultravioleta solar (UV) de nuvem e efeitos de ozônio estratosférico na exposição UV, modelagem numérica de fenômenos geofísicos e comparação com medições e estudo de transporte de radiação em meios turvos, como o sistema atmosfera-oceano e tecido biológico.

    Laboratório de Ciência e Tecnologia de Fotônica - Prof. E. A. Whittaker
    O tema deste laboratório é o desenvolvimento e aplicação de métodos baseados em laser para sensoriamento remoto, análises químicas e comunicações ópticas. As técnicas usadas incluem espectroscopia de modulação de frequência, vibrometria a laser e comunicações ópticas em espaço livre. O laboratório está equipado com uma ampla variedade de fontes e detectores de laser, equipamentos eletrônicos de teste de alta frequência, sistemas de medição controlados por computador e um espectrômetro infravermelho com transformada de Fourier.

Nosso objetivo é compreender as propriedades interfaciais de polímeros solúveis em água e os princípios de montagem macromolecular em interfaces, e aplicar esse conhecimento para produzir superfícies com propriedades desejadas, como controle de proteína e / ou fixação de nanopartículas, ou resposta ambiental projetada de superfície filmes.

Nossa pesquisa é interdisciplinar e apresenta uma combinação de ideias físico-químicas e sintéticas envolvendo polímeros solúveis em água. As aplicações esperadas dos resultados, como o projeto de sistemas de liberação de fármacos, também a classificam como pesquisa de biomateriais. Alunos com diversas formações em química, física e ciência dos materiais trabalham juntos e formam um ambiente estimulante no grupo.

Biblioteca Samuel C. Williams

    Filosofia de serviço
    A Biblioteca S. C. Williams oferece serviço just-in-time adaptado às necessidades do corpo docente, dos alunos e da equipe de Stevens. Este modelo maximiza o uso de materiais da Biblioteca e atende às necessidades de informações individuais.

  • Visite os departamentos para obter instruções individuais ou em grupo,
  • Ensine aos alunos o uso eficaz dos recursos da biblioteca e
  • Fornece pesquisa de banco de dados personalizada com hora marcada.

Laboratório de Engenharia de Software

O Laboratório de Engenharia Quantitativa de Software, apoiado por uma concessão da Comissão de Ciência e Tecnologia de Nova Jersey e por afiliados do Centro de Engenharia de Software de Nova Jersey, possui várias estações de trabalho Windows e Linux conectadas por Ethernet e LANs sem fio. O laboratório é afiliado ao New Jersey Institute for Trustworthy Enterprise Software.

  1. Primeiro, ele é usado pelos alunos na sequência obrigatória do Projeto Sênior de dois semestres. Seus projetos são implementados de forma mais lucrativa em estações de trabalho em rede do que em laptops pessoais. Uma característica especial do curso de design sênior é que ele usa uma nova metodologia pedagógica intitulada "Histórias de caso ao vivo-Thru." New Jersey Commission on Science and Technology e a National Science Foundation, em parte com a ajuda de software customizado sendo desenvolvido no laboratório.
  2. Em segundo lugar, como afiliados do Centro de Engenharia de Software da University of Southern California do Prof. Barry Boehm e do CEBASE (Center for Experimentally-Based Software Engineering) patrocinado pelo DOD, liderado pelo Prof. Boehm e pelo Prof. Victor Basili da Universidade de Maryland , o corpo docente do Laboratório de Engenharia de Software está usando o laboratório para experimentação em tecnologias e metodologias de engenharia de software. Os assuntos desses estudos incluem software de alta confiabilidade, métodos para evitar a necessidade de realizar detecção e eliminação de defeitos em grande escala e práticas modernas de desenvolvimento ágil de software, programação em pares, refatoração, etc. Estudos específicos da teoria de confiabilidade de software em conjunto com o computador Stevens Os programas de engenharia são conduzidos com o objetivo de impedir a execução de produtos de software de executar falhas inerentes para que não se tornem falhas.

Stochastic Systems Center

O Centro pesquisa modelagem, análise e otimização de sistemas estocásticos. Nossos principais temas de pesquisa são:

  • Métodos teóricos e numéricos de otimização sob incerteza e risco.
  • Modelos matemáticos de risco e análise de risco em aplicações.
  • Modelagem estocástica e equações diferenciais estocásticas: aproximação e estimativa.

O Centro supervisiona o programa de pós-graduação Sistemas Estocásticos: Análise e Otimização, no Departamento de Ciências Matemáticas, e patrocina uma série de seminários, workshops e sessões em conferências internacionais.

Laboratório de Visualização (VLab)

A pesquisa no VLab se enquadra nas áreas gerais de visualização, computação gráfica e visão computacional com aplicativos em imagens e diagnósticos médicos, biologia celular, computação científica, robótica e finanças computacionais. Projetos de pesquisa atuais incluem o desenvolvimento de novos métodos geométricos e algoritmos computacionais eficientes para representação, reconhecimento e visualização de formas de superfície e deformações de forma, e para redução de dados de pré-compressão em comunicações de dados visuais. O VLab faz parte do grupo mV2 (visão e visualização multimídia) e tem laços estreitos com o Laboratório de Visão da Stevens.


Procedimentos experimentais

Análise da região do promotor do núcleo de HBV

O banco de dados do genoma do HBV (HBVdB: https://hbvdb.ibcp.fr, acessado em abril de 2019) foi usado para acessar 9939 sequências do promotor do núcleo do HBV de sete dos oito genótipos principais do HBV (977 genótipo A 2478 genótipo B 3313 genótipo C 1545 genótipo D 389 genótipo E 387 genótipo F e 52 genótipo H). As sequências foram baixadas como um alinhamento Clustal W (77), truncadas como a região 23-mer (nt1732 & # x020131754) e examinadas quanto à presença e frequência de polimorfismos de nucleotídeo único com a ajuda do programa Geneious Prime (2019.1.3 www .geneious.com). As sequências do genótipo G do HBV não possuem a região altamente rica em G e foram excluídas da análise (21).

Preparação quádrupla

Todos os oligômeros de DNA foram encomendados à AlphaDNA (Montreal, QC, Canadá), com purificação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pelo fabricante. Os oligômeros pré-núcleo eram os seguintes: tipo selvagem (wt), 5 & # x02032-CTGGGAGGAGCTGGGGGAGGAGA-3 & # x02032 e mutantes de substituição de nucleotídeo único (G1738A) 5 & # x02032-CTGGGA UMA GAGCTGGGGGAGGAGA-3 & # x02032, (G1748A) 5 & # x02032-CTGGGAGGAGCTGGGG UMA AGGAGA-3 & # x02032 e (G1738 / 1748A) 5 & # x02032-CTGGGA UMA GAGCTGGGG UMA AGGAGA-3 e # x02032. As amostras foram dissolvidas em tampão G-quadruplex (20 & # x000a0mM HEPES, pH 7,5, 100 & # x000a0mM KCl, 1 & # x000a0mM EDTA) a uma concentração de 5 & # x000a0 & # x003bcM, confirmado espectrofotometricamente usando coeficientes de extinção calculados para 260 & # x000a0nm (IDTA) Ferramenta OligoAnalyzer) de 237.400 & # x000a0M -1 & # x000a0cm -1 (wt), 239.300 & # x000a0M -1 & # x000a0cm -1 (G1738A e G1748A), e 241200 & # x000a0M -1 & # x000a0cm -1 (G1738 / 1748A) As amostras foram aquecidas a 95 & # x000b0C por 10 min, depois lentamente resfriadas à temperatura ambiente para permitir a montagem do G-quadruplex. As amostras foram concentradas a 500 & # x000a0 & # x003bcl usando uma coluna de filtro 3 & # x000a0kDa Vivaspin 20 (GE Healthcare, Mississauga, ON, Canadá). As misturas conformacionais foram purificadas através da SEC usando um HiLoad Superdex 75 10/300 em tampão G-quadruplex, carregado com amostra 500 & # x000a0 & # x003bcl e eluído a 0,65 & # x000a0ml / min usando G-buffer (20 & # x000a0mM HEPES, pH 7,5, 100 & # x000a0mM KCl, 1 e # x000a0mM EDTA). Apenas frações de pico (por exemplo., para G1738A, apenas frações de & # x0223c12.5 & # x0201315 & # x000a0ml, consulte a Fig. & # x000a02 UMA) foram agrupados e concentrados usando uma coluna de rotação 3 & # x000a0kDa, para uso em experimentos subsequentes.

Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD).

Todos os espectros para quadruplexes G wt e mutantes foram registrados em um espectropolarímetro Jasco J-815 calibrado (Jasco Inc, Easton, MD) de 220 a 320 & # x000a0nm em 1,0 & # x000a0mm & # x000a0cell e um tempo de integração de 32 & # x000a0s. Os oligômeros purificados por SEC foram concentrados a 20 & # x000a0 & # x003bcM em tampão G-quadruplex. As medições foram realizadas em triplicado e corrigidas na linha de base pela subtração do tampão desgaseificado sozinho.

Clonagem molecular e preparação de proteínas de DHX36

DHX36 foi preparado conforme descrito anteriormente (78). Resumidamente, os resíduos de aminoácidos 53 & # x02013105 de DHX36 humano foram amplificados por PCR a partir de um gBlock (Integrated DNA Technologies, Kanata, ON, Canadá) para adicionar locais de restrição NdeI e SalI. O produto de PCR foi inserido no vetor pET28a (+) usando as enzimas de restrição NdeI e SalI e T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e subsequentemente transformado em DH5 & # x003b1 quimicamente competente E. & # X000a0coli células (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA). Os clones positivos foram identificados e a sequência do gene foi confirmada por sequenciação Sanger (Genewiz, South Plainfield, NJ). O pET28a-DHX36 final53-105 o vetor de expressão continha um marcador de hexahistidina N-terminal codificado por vetor e um local de clivagem de trombina para remoção do marcador. O pET28a-DHX3653-105 o vetor de expressão foi transformado em competente E. & # X000a0coli células Lemo21 (DE3) (NEB) e expressão induzida através da a adição de 1 & # x000a0mM isopropil & # x003b2-D-1-tiogalactopiranosídeo. As células foram colhidas 3 & # x000a0h pós-indução por centrifugação a 5000g por 15 & # x000a0min, congelado em flash e armazenado em & # x0201380 & # x000b0C. A purificação da proteína foi realizada através da uma coluna de afinidade de níquel, seguida por SEC conforme descrito anteriormente (52, 53).

Termoforese em microescala (MST)

O MST foi usado para determinar a natureza e a força das interações entre o G-quadruplex com DHX36, onde os oligômeros G-quadruplex foram marcados com FITC e mantidos constantes, semelhante ao descrito (79, 80). Primeiro, DHX36 foi diluído de 20 & # x000a0 & # x003bcM para 0,006 & # x000a0nM em tampão MST (tampão G-quadruplex suplementado com 0,1% Tween20). Em seguida, os oligômeros dobrados e purificados por SEC foram diluídos para 50 & # x000a0nM em tampão MST e adicionados a cada um dos tubos da série de diluição DHX36. As amostras foram executadas usando capilares padrão Monolith NT.115 (Nanotemper Technologies, San Francisco, CA). Os dados foram coletados na configuração de alta excitação com a potência do laser definida em 20%. Os dados de três réplicas independentes foram analisados ​​usando o software MO Affinity Analysis v2.1.3. O software calcula a constante de dissociação, Kd usando os dados de fluorescência coletados. Resumidamente, a leitura de fluorescência é importada e plotada contra a concentração de proteína, Kd o ajuste é realizado (que usa a lei de ação da massa) assumindo uma interação de 1: 1 da proteína com o DNA (Nanotemper Monolith Technical Manual). Os dados mostrados aqui são uma média de três execuções independentes. Detalhes adicionais sobre a análise de dados MST podem ser encontrados em outro lugar (81, 82).

Espalhamento de raios-X de pequeno ângulo (SAXS)

Dados HPLC-SAXS para os oligômeros de tipo selvagem e variantes mutantes foram coletados usando a linha de luz B21 BioSAXS na instalação síncrotron Diamond Light Source (Didcot, Reino Unido), sob um protocolo previamente descrito (52). Usando um HPLC em linha Agilent 1200 (Agilent Technologies, Stockport, Reino Unido) com uma célula de fluxo especializada, os dados do oligômero foram coletados em concentrações de 100 & # x000a0 & # x003bcM em tampão G-quadruplex. Cada amostra de oligômero foi injetada em uma coluna Shodex KW403-4F (Showa Denko America, Inc) pré-equilibrada em tampão G-quadruplex. Os raios X foram expostos a cada quadro por 3s e, em média, dez quadros de cada pico de amostra individual foram integrados, seguidos pela subtração do buffer e, em seguida, mesclados usando Sc & # x000c5tter (83), conforme descrito anteriormente (80).

Os dados foram importados para o software Primus do conjunto ATSAS de programas de software versão 2.8 (84), a análise de Guinier foi realizada no conjunto de dados para verificar a qualidade dos dados e estimar o Raio de Giro (Rg) (Fig. & # X000a0S1). Para cálculo de ab initio estruturas de baixa resolução, a dimensão linear máxima (Dmax) foi estimado usando a função de distribuição de distância aos pares P (r) enredo, junto com o Rg, estimado usando GNOM (55). Usando o P (r) informações do gráfico, dez modelos foram calculados usando DAMMIN (85), selecionando uma semente aleatória diferente para cada modelo, mas mantendo parâmetros idênticos dentro de cada conjunto, garantindo que não haja simetria forçada (P1) O programa DAMAVER (86) foi usado para calcular a média e filtrar os modelos para produzir um modelo representativo, conforme descrito anteriormente (87).

Isolamento e preparação de cccDNA de HBV

Tecido hepático HBV DNA positivo foi obtido de acordo com um protocolo de ética aprovado (Conselho de Ética em Pesquisa em Saúde da Universidade de Calgary, ID # 16.636). O DNA nuclear sem proteínas foi extraído do fígado pelo método de extração de Hirt, conforme descrito anteriormente (88). As amostras foram tratadas com exonuclease T5 (NEB, Ipswich, MA, Cat # M0363) para digerir DNA circular relaxado (rcDNA) ou fragmentos genômicos restantes. Os produtos foram posteriormente limpos por purificação em coluna (E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit, Omega Bio-tek, Norcross, GA) para remover a exonuclease. O cccDNA do HBV foi amplificado por nested PCR, usando primers específicos do HBV abrangendo a região de corte do genoma do rcDNA, conforme descrito (88, 89).

Amplificação de fragmentos de DNA de HBV

Um plasmídeo de HBV de comprimento completo (genótipo C) foi usado para amplificação por PCR para produzir fragmentos de DNA de HBV do gene C e da região do promotor que incluía a região de formação quádrupla (fragmento X, & # x0201cX & # x0201d) ou não (fragmento C, & # x0201cC & # x0201d), usando primers de genes específicos de HBV que codificam para nt 1606 & # x020131974 (368 & # x000a0bp, & # x0201cX & # x0201d) e nt 1825 & # x020132286 (461 & # x000a0bp, & # x0201cC & # x0201d), conforme descrito (89). Os amplicons de PCR foram visualizados em um gel de agarose a 1,2% e purificados usando o kit de extração de DNA em gel Qiagen (Qiagen Inc, Montreal) (Ver Fig. & # X000a0S2, Tabela & # x000a0S3). Os produtos purificados em gel foram aquecidos a 95 & # x025e6 C por 5 & # x000a0min, em seguida, resfriados lentamente à temperatura ambiente para permitir o dobramento.

Ensaios de pull-down do genoma do HBV

Grânulos magnéticos (HisPur Ni-NTA, Thermo Fisher, Cat # 88.831) e suporte de tubos magnéticos (Qiagen Inc, Montreal) foram usados ​​para ensaios de pull-down do genoma de HBV usando DHX36 (com uma tag His associada) como o & # x0201cbait & # proteína x0201d. O protocolo fornecido com os grânulos magnéticos foi seguido vagamente, com modificações para o nosso sistema. Em primeiro lugar, 40 & # x000a0 & # x003bcl de solução de esferas de níquel foi adicionado a cada tubo e equilibrado com lavagens de tampão de equilíbrio / lavagem (30 & # x000a0mM de imidazol em solução salina tamponada com fosfato (PBS), 0,05% Tween, pH 7,5), por protocolo. Em segundo lugar, uma solução 1: 1 de DHX36 em tampão de equilíbrio / lavagem (concentração de proteína final de 10 & # x000a0 & # x003bcM) foi incubada com as contas (400 & # x000a0 & # x003bcl / tubo) em um rotor de ponta a ponta para 30 & # x000a0min a 4 o C. O excesso de proteína foi removido e os grânulos foram lavados com tampão até que as leituras de fluorometria mostrassem proteína indetectável por duas leituras consecutivas (quatro lavagens). Uma diluição de cccDNA (inteiro ou fragmentos) foi feita com o tampão para fornecer 400 & # x000a0 & # x003bcl da solução para cada tubo (52, 17 e 26 & # x000a0ng / & # x003bcl, respectivamente, para todo o cccDNA, C e X regiões). O DNA viral foi incubado com grânulos (+/- ligado DHX36) por 2 & # x000a0h em um agitador a 4 o C. Após a remoção do excesso de DNA, os grânulos foram lavados com tampão até que as leituras de fluorometria mostrassem DNA indetectável por duas leituras consecutivas (quatro lavagens). Os complexos de proteína & # x02013DNA foram eluídos com tampão de eluição 30 & # x000a0 & # x003bcl (250 & # x000a0mM imidazol em PBS, pH 7,5).

Detecção de cccDNA e fragmentos de cccDNA

Para confirmar a presença de cccDNA de HBV nas amostras de fígado digeridas com exonuclease T5 extraídas de Hirt, PCR aninhado foi realizado para amplificar a região & # x0201cnicked & # x0201d do rcDNA, ou dsDNA incompletamente, usando primers específicos de HBV (5 & # x02032 -ACTCCTGGACTCTCAGCAATG-3 & # x02032 (cccDNA-D-For) 5 & # x02032-GTATGGTGAGGTGAGCAATG-3 & # x02032 (cccDNA-D-Rev) 5 & # x02032-AGGCTGTAGGCACAAAT # ccc20-x3-x3-x3-x3-x032-x3-x032-AGGCTGTAGGCACAATT # ccc20-x3-x3-x032-x3-C20-x3-C20-x3-x3-C20-Rev N-3-x032-x3-Cd20-x3-x3-x3-x3-N-3-x3-Cd20-x3-C032-x3-x3-N-C032-3-xcD-ATT-0-C 0-C 0-D-Rev-Rev) 5 & # x02032-AGGCT N-0-N032-CACAATTT-ATTT-20 GCTTATACGGGTCAATGTCCA-3 & # x02032 (cccDNA-N-Rev). Os produtos obtidos a partir dos pull-downs da região X e C foram amplificados por PCR usando os mesmos primers usados ​​para sua produção (veja acima) e amplicons visualizados com géis de agarose e SafeView ( Applied Biological Materials Inc, Vancouver) coloração sob luz ultravioleta.

Plasmídeos de HBV para transfecção de células HepG2

Mutantes de HBV (G1738A, G1748A, e G1738 / 1748A) foram criados usando um plasmídeo de 1.3mer HBV (fornecido pelo Dr. Haitao Guo) (59) e kit de mutagênese dirigida (QuikChangeII, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) com os primers correspondentes (University of Calgary DNA Synthesis Lab, Calgary, AB ) (consulte a Tabela & # x000a0S2). As sequências mutantes de HBV foram confirmadas por sequenciamento de Sanger. O plasmídeo original (wt) e os mutantes principais (G1738A, G1748A e G1738 / 1748A) foram amplificados através da um E. & # X000a0coli (Top10) (Thermo Fisher, Cat # C404010) e isolado usando o kit GenElute Plasmid Miniprep (Sigma, Cat # PLN350). Além disso, uma proteína fluorescente verde interna (GFP) -pcDNA3.1 (+) plasmídeo foi usada como controle.

Transfecções de HepG2 e isolamento de ácido nucleico total e proteína

As células HepG2 (New England Biolabs) foram cultivadas até 80 & # x0201390% de confluência em Dulbecco & # x02019s Modified Enrichment Media (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina. Aproximadamente 24 & # x000a0h antes da transfecção, as células foram divididas e semeadas em placas de 6 poços em concentrações de 1 x 10 6 & # x000a0 células / poço e permitidas a reconectar durante a noite. No dia 0, o meio celular foi trocado para remover quaisquer células não ligadas. Os poços correspondentes foram transfectados com GFP sozinho, GFP & # x000a0 + HBVwt ou GFP & # x000a0 + HBVmutante (G1738A, G1748A ou G1738 / 1748A) (500 & # x000a0ng GFP plasmídeo / poço e 270 & # x000a0ng HBV plasmídeo / poço), usando Lipofectamine3000 (ThermoFisher) de acordo com o protocolo do fabricante e # x02019s. Nos dias 1, 3, 5 e 7, as células foram fotografadas para GFP para determinar a% de transfecção em relação ao sinal de GFP e, subsequentemente, o sobrenadante e as células foram colhidos para detecção de RNA de HBV, DNA de HBV total e / ou proteínas virais . O RNA total foi extraído através da TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), conforme descrito (89), o DNA total foi isolado das células através da fenol-clorofórmio (sobrenadante) ou TRIzol. Proteínas virais (HBsAg, HBeAg) foram detectadas no sobrenadante celular sem manipulação adicional e usando meios de cultura para controles (ver detalhes de ELISA abaixo). O HBcAg nas células foi detectado a partir do lisado de células lavadas com PBS tratadas com Triton X-100 a 1% em tampão TBS. Todas as extrações de ácido nucléico foram realizadas com extrações simultâneas de & # x0201cmock & # x0201d sob estritos protocolos de laboratório para evitar contaminação cruzada. Os experimentos de transfecção foram realizados em triplicata com amostras duplicadas para cada condição por dia, por experimento.

Quantificação de RNA e DNA de HBV

O RNA de HBV do sobrenadante da célula transfectada foi detectado por TaqMan qPCR seguindo os protocolos descritos anteriormente (90). DNA sobrenadante total, RNA celular e DNA foram detectados usando fluorescência SYBR Green (BioRad, Cat # 1725124). Um plasmídeo contendo HBV foi usado como um controle positivo e para produzir a série de diluição para os padrões de qPCR, água e modelo & # x0201cmock extraído & # x0201d e transfecção simulada foram usados ​​como controles negativos. Um segmento da região do promotor pré-core foi amplificado usando os primers HBV-PCP-For e HBV-PCP-Rev e posteriormente corrigido para o plasmídeo inicial usando os primers Plasmid-Guo-For e Plasmid-Guo-Rev (ver Tabela & # x000a0S2) . As amostras foram preparadas em triplicado com padrões e controles concomitantes por execução de qPCR e todas as transfecções foram realizadas em triplicado. Os amplicons qPCR do wt, vários mutantes e controles transfectados com GFP foram confirmados por visualização em gel de agarose para confirmar produtos únicos. No controle GFP, um sinal de qPCR foi observado com uma curva de fusão diferente do produto de HBV, e este foi confirmado como um único produto de 800 pb em um gel que não foi visto nas amostras transfectadas com HBV, onde apenas o esperado O tamanho do fragmento de HBV de 340 & # x000a0bp foi visto. O alinhamento do iniciador do plasmídeo GFP pcDNA3.1 (+) confirmou este tamanho de amplicon e sobreposição de sequência pobre. A detecção de ácido nucleico de HBV foi corrigida para cada condição experimental (de acordo com o controle interno GAPDH).

Detecção de HBsAg, HBeAg e HBcAg

O HBsAg foi detectado por ELISAs sanduíche através da um ensaio desenvolvido internamente. Resumidamente, usando uma placa de 96 poços (Corning Incorporated, Corning, NY, Cat # 3361), placas de ELISA foram preparadas usando HBsAg captura Ab (Fitzgerald Industries International, North Acton, MA, Cat # 10-H05H) a 1 ug / ml . Uma série de diluição de HBsAg (500 & # x000a0ng / ml - 4 & # x000a0ng / ml) foi preparada para uso como padrões (Fitzgerald, Cat # C-CP2019R). A cada poço correspondente, 100 & # x000a0 & # x003bcl de sobrenadante ou padrões foram adicionados em triplicado e incubados durante a noite. O HBsAg foi detectado usando um anticorpo anti-HBsAg conjugado com HRP (Fitzgerald, Cat # 60C-CR2100RX, diluição 1: 2000), ativado por TMB (LifeTech Novex, Cat # 00 & # x020132023), extinto por 1 & # x000a0M HCl, e ler em 450 & # x000a0nm (BioRad iMark, EUA). A proteína total por amostra foi determinada através da o kit de padrões de ensaio de proteína BCA (Biorad, Cat # 500 & # x020130006) e usado para corrigir o conteúdo variável de proteína no sobrenadante da célula. HBeAg & # x000a0 no sobrenadante foi analisado através da um imunoanalisador eletroquimioluminescente (Roche Elecsys executado no imunoanalisador Cobas e411, Roche Diagnostics, Laval, QC) usando o princípio sanduíche envolvendo uma reação com dois anticorpos monoclonais específicos para HBeAg (um biotinilado e o outro marcado com um complexo de rutênio). O complexo foi ligado à fase sólida consistindo de micropartículas magnéticas revestidas com estreptavidina (o limite de detecção do ensaio é & # x022640.30 Paul-Ehrlich-Institute U / ml, correspondendo ao índice de corte de 1,6 (COI) no ensaio & unidades de detecção # x02019s ) Além disso, o HBcAg celular foi analisado usando um kit comercial (Cell Biolabs Inc, San Diego, CA, Cat # VPK150), seguindo as instruções do fabricante e # x02019s. Todos os dados mostrados são uma média de três execuções independentes realizadas como duplicatas.

Análise estatística

Os dados foram analisados ​​com o software estatístico SPSS, versão 26 (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA) e Microsoft Excel. Análises ANOVA unilateral com uma análise post-hoc Dunnett t bilateral foram empregadas para determinar a significância dos parâmetros de transfecção. A significância estatística foi estabelecida em p valores inferiores a 0,05.


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